JPH0731206B2 - 固定化したビオチン化受容体を用いるリガンド測定のための試験装置，キットおよび方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物学的流体のような水性液中のリガンドを
測定するための装置および方法に関し、また、その装置
を包含するキットにも関する。本発明は、臨床的診断に
おいて有用である。

〔従来の技術〕

低濃度で生物学的流体中に存在する生物学的物質の迅速
かつ精確な定性または定量のための診療、調査および診
断方法は、依然として必要性がある。例えば、血液、
尿、唾液、腔分泌物、精液および他の生物学的液体中の
医薬、麻薬、ホルモン、ステロイド、ポリペプチド、プ
ロスタグランディンまたは感染性の生物の存在は、適切
な診断または処置を期するには正確な迅速な方法で測定
しなければならない。

かかる測定を提供するために、検出される物質（本明細
書では「リガンド」という）および該物質と特異的に反
応するレセプター間の特異的なバインディング反応を利
用する生物学的物質の単離および同定のための多様な方
法が案出されている。放射性または酵素標識が、得られ
る反応複合体を検出するために使用されてきた。

開発された特定様式の試験の一つは、当該技術分野でイ
ムノメトリックまたは“サンドイッチ（sandwich）”ア
ッセイとして知られている。かかるアッセイは、妨害し
ない態様でかつ別のエピトープ部位で標識化合物に結合
した２以上のレセプター分子（例えば、抗体）で“はさ
み込んだ（sandwiching）”リガンド（例えば、抗原）
を包含する。サンドイッチアッセイでは、高い親和性を
有するモノクローナル抗体を使用することが、また知ら
れている。アビジンを被覆した支持体上にビチオン化抗
体を固定する米国特許第4,496,654号明細書に記載され
るように、ほとんどのサンドイッチアッセイは、不溶性
担体、例えば、小さな粒子、膜、プレートまたは類似の
対象物上に１以上の受容体分子が適当に固定化されてい
る。

アビンは、卵白中に見い出された蛋白質である。ビオチ
ンまたはヘキサヒドロ−２−オキソ−1H−チエノ〔3,
4〕イミダゾール−４−吉草酸（また、ビタミンＨとし
て知られている）は、比較的低水溶性の分子である。こ
れらの物質は、相互に特異的に反応してアビジンの４個
のサブユニットの各々ビオチン分子を結合することによ
り非常に強くそして安定な複合体を形成することが知ら
れている。この強いバインディング性は、ビオチンかア
ビジンのいずれかか、または両者を他の物質に共有結合
したときでさえも残存する。

ヨーロッパ特許公開第201,079号公報は、溶液中でリガ
ンドと２つの受容体の複合体を形成するサンドイッチア
ッセイを記憶する。受容体（例えば、抗体）の一つが、
ビオチンかアビジンのいずれかと接合される。それ自体
に結合されているビオチンまたはアビジンを有する支持
体が、得られる三重複合体を不溶化する目的で使用され
ている。

〔発明が解決しようとする課題〕

ヨーロッパ特許公開第201,079号公報のアッセイは、主
張するところによると、不溶性担体に直節結合せしめた
抗体を使用するアッセイにより一定の利点を提供すると
はいえ、そのアッセイは、試験容器（例えば、試験管）
内のすべての反応体のそれぞれの量を組み合わせること
で実施されている。

量産用に設計されたアッセイである点では高く評価され
るが、リガンドを測定するために極微量の液体試薬の添
加と混合工程が必要である。また、アッセイを実施する
ためには、使用される試験装置中に１種類以上の試薬を
導入することが必要である。

しかしながら、この先行技術には試験装置中に試薬を導
入することだけでなく、さらに、使用しやすい試薬を提
供する必要がある。これらの試薬は、また、長期間安定
でなければならない。例えば、アッセイ用キットを使用
する前に長距離輸送したり不定期間貯蔵する場合には、
すべての貯蔵試薬がその間中多様な環境条件下で安定で
あることが必要である。患者の試料中のリガンド測定用
受容体分子として使用され得る多くの蛋白質は、一般
に、室温において長時間安定でない。特に、ビオチン化
抗体または抗原の使用については、先行技術において解
決されていない特有の課題が存在することを本発明者ら
は見い出した。いまだその理由は知られていないが、ビ
オチン化抗体は、保持される安定性が限定されている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明に従えば、水不溶性支持体を含んでなり、かつそ
の支持体の一ヶ所又はそれ以上の位置に、少なくとも50
重量％のアクリルアミドを有する一種又はそれ以上の乾
燥した水溶性アクリルアミドのホモポリマーもしくはコ
ポリマーとの混合又は該ホモポリマーもしくはコポリマ
ーによる被覆によって、乾燥状態で固定化されているリ
ガンドに対するビオチン化受容体を有する水性液中のリ
ガンドの測定に有用な装置が提供される。

本発明に従えば、また、水不溶性支持体を含んでなり、
かつその支持体の一ヶ所又はそれ以上の位置に、少なく
とも50重量％のアクリルアミドを有する一種又はそれ以
上の乾燥した水溶性アクリルアミドのホモポリマーもし
くはコポリマーとの混合又は該ホモポリマーもしくはコ
ポリマーによる被覆によって、乾燥状態で固定化されて
いるリガンドに対するビオチン化受容体を有する装置、
ならびに前記リガンドとビチオン化受容体との反応複合
体の形成を検出するための検出組成物を含んでなる水性
液中のリガンドの測定用キットが提供される。

本発明に従えば、更に、 （Ａ）液体試料を、水不溶性支持体を含んでなり、かつ
その支持体の一ヶ所又はそれ以上の位置に、少なくとも
50重量％のアクリルアミドを有する一種又はそれ以上の
乾燥した水溶性アクリルアミドのホモポリマーもしくは
コポリマーとの混合又は該ホモポリマーもしくはコポリ
マーによる被覆によって乾燥状態で固定化されているリ
ガンドに対するビオチン化受容体を有する装置と接触せ
しめ、前記リガンドと受容体との反応生成物を形成する
工程、ならびに （Ｂ）前記反応生成物の有無を検出する工程、を含んで
なる水性液中のリガンドの測定方法が提供される。

〔実施態様〕

本発明は、リガンドと受容体との間で検出可能な複合体
を得る分析方法で使用するための装置および方法を提供
する。本発明の方法を使用して、医院または家庭で直接
結果が得られるアッセイを実施することができるような
測定法を提供することができる。このアッセイを使用し
て、生物学的流体のごとき水性液中の一価もしくは多価
の、または複数決定基を有する化合物の有無を検出する
ことができる。好ましくは、hCGのごとき複数の抗原決
定基を有する化合物を検出するために使用される。

より詳細には、本発明は、受容体に特異的にバインディ
ングする天然に由来するかまたは合成的に生成される水
性液中のリガンドの測定（定性または定量法）に使用す
ることができる。この測定は、単にリガンドの有無を決
定するか、またはリガンドの量を定量的に決定すること
により実施することができる。特に、本発明は、動物、
ヒトまたは植物の生物学的な流体のアッセイに使用する
ことができるが、ヒトを対象にするものが好ましい。限
定されるものでないが、かかる流体には、全血、血漿、
血清、リンパ液、胆汁、尿、髄液、精液、涙液、膣分泌
液、喀痰および汗など、ならびに便通検体が包含され
る。また、骨格筋、心臓、腎臓、肺臓、脳、骨髄または
皮膚などのヒトまたは動物の組織の流体調製物をもアッ
セイすることが可能である。

一価のリガンドは、複合体形成用の単一のエピトープ部
位を有する。多価のリガンドは、多数の同一の特異的に
バインディングする受容体が複合体を形成する２以上の
エピトープ部位を有する。複数決定基のリガンドは、多
数の種々の受容体が複合体を形成する２以上のエピトー
プ部位を有する。

興味の対象となるリガンドは、（１）免疫担当宿主に対
して提供されるときに、その物質と結合し得る特異的な
抗体を産生するいずれかの物質、または（２）そのよう
にして産生される抗原であってもよく、かかるリガンド
は抗原抗体反応に関与する。

本発明においては、リガンドと特異的に反応する受容体
分子にビオチンまたはビオチン誘導体が適当に結合され
ている。結合方法は、当該技術分野で周知である。特定
の方法は、後述の例１に記載する。

本発明によって検出され得る代表的なリガンドには、一
級アミン、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白
質、リポ蛋白質、糖蛋白質、薬物、ハプテン、酵素、ス
テロイド、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、多糖、糖
脂質、アルカロイド、生体（細菌、プロトゾア、ファン
ジー、レトロウイルスを含むウイルスおよびリケッチア
など）ならびにそれらの成分、血液成分、組織および器
官の抗原、その他当業者に既知の物質が包含される。リ
ガンドが抗原であって受容体が抗体である場合には、モ
ノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれかを使
用することができ、それらは、その全分子または種々の
断片であってもよい。好ましくは、ビオチン化モノクロ
ーナル抗体が本発明で使用される。

好ましい態様では、本発明は妊娠初期の指標であるhCG
の検出に有用である。この態様では、後述するように、
種々のエピトープ部位でhCGと免疫複合体を形成するた
めの試薬を供給する目的で、hCGに対する１以上の種々
の抗体が試験装置中に固定化される。これらの少くとも
１つはビオチン化される。

前述したように、本発明のキットは、ここに記載される
装置、ならびにリガンドとそのビオチン化した受容体間
の反応複合体の形成を検出するための検出システムを包
含する。

一般的には、本発明の装置は、リガンド、受容体または
アッセイで使用される他の試薬と化学的にも免疫学的に
も不活性（すなわち、反応しない）な水不溶性の支持体
を含んでなる。この支持体は、１以上の試薬に適合する
ことができそして試験流体と同一の状態で接触できる、
平坦な試験スライド、紙、カップ、ペトリ皿、試験管、
プレート、膜または他の適当な形状物であることができ
る。前記流体は、試験管もしくは微量試験プレートのよ
うな装置に添加するか、あるいはその逆に装置を試験流
体に添加することができ、アッセイを実施するために十
分な時間接触される。この装置は、使い捨て性のもので
あるかまたは再利用できるものであってもよい。

ある態様では、装置を使用してリガンドと受容体を反応
せしめ、次いで、得られた複合体をリガンドの量を適当
な様式で測定する第二の装置中に入れることができる。
他方、装置は、アッセイを実施するときに、多数の試験
が実施できるウェルを有する微量試験プレートのような
装置であってもよい。種々の試験装置が、米国特許第3,
825,410号、同3,888,629号、同3,970,429号および同4,4
46,232号を含む先行技術中に知られている。一つの有用
な装置が、ヨーロッパ特許公開第280,558号公報に図示
されている。

本発明の装置は、試薬がアッセイにおいて使用された後
に別の装置または容器中で混合されるような装置であっ
てもよい。好ましくは、装置は、その装置の同一または
別々の場所のいずれかで試薬の混合手段と試験手段の両
方を備える試験装置として設計される。

より詳細には、本発明の試験装置は、水不溶性の支持体
を含んでなり、その中に１以上の試験区画を有し、その
各々が生物学的流体試料および適当な試薬と適合し得
る。

前記支持体は、ビオチン化抗体が後述するポリマー結合
剤を使用して固定化され得るすべての利用可能な水不溶
性物質、例えば、ガラス、ポリマー物質、繊維物質、セ
ルロース系の物質および当該技術分野で既知の物質から
調製することができる。

好ましい態様では、試験結果ならびに正および負の対照
を提供するように設計された３個の試験区画またはウェ
ルを有する。かかる装置は、妊娠試験キットのごとき診
断キットの一部として医院または家庭において特に有用
であろう。例えば、本発明の装置は、少なくとも１つの
液体溜ウェル（または、本明細書では、試験ウェルと称
する）、その中の区画室を大気と流動的に連接する区画
室における通気孔窓を限定する手段、およびその通気孔
窓を遮断するための手段を含んでなる。好ましくは、試
験装置は、試験試料用を第一とし、負の対照用を第二と
しそして正の対照用を第三とする３個の分離された試験
ウェルを備える。有用な試験装置の他の変型は、当業者
の範囲内でなし得る。

本発明の装置は、適当な化学的および生物学的試薬を使
用するすべてのアッセイに適合し得る。しかしながら、
リガンドに対するそれらに固定化された少なくとも１つ
のビオチン化受容体を有することが必須である。必要に
応じて、装置の１以上の試験区画は、それらに固定され
た同一または相違する受容体を有することができる。あ
る場合には、それらの受容体が相互に妨害し合わない
か、または相互に妨害し合わないような状態で固定化さ
れている限り、単一の試験区画が１より多くのそれらに
固定化された受容体を有することもできる。

ビオチン化受容体は、一定の状態で支持体に固定される
ような方法により、後述するポリマーを使用して支持体
上に固定化される。一般には、前記受容体とポリマーと
を混合して支持体に固定することができる。他方、その
表面を前記ポリマーで被覆して支持体に固定することも
できる。このポリマーおよび受容体は、必要に応じて、
交互に繰り返される数層で適用してもよい。これらの態
様のすべてにおいて、場合によりビオチン化受容体、ポ
リマーまたは両者と共に、保湿剤、界面活性剤または乾
燥剤を包含していてもよい。一般的に、ビオチン化受容
体およびポリマー状の結合剤は、一緒に導入されそして
水溶液中で装置中に固定化された後、適当な条件下で乾
燥される。

有用な水溶性ポリマー結合剤は、水性媒体に容易に溶解
し、そしてリガンドと受容体との間の複合体形成に不活
性であり、さらにアッセイにおいて生じ得る化学的また
は特異的なバインディング反応に対して不活性であるポ
リマー物質を包含する。より具体的には、有用なポリマ
ー結合剤はアクリルアミドのホモポリマーおよびコポリ
マーである。有用なコポリマーは、総モノマー重量の少
なくとも50（重量）％のアクリルアミドを含む２種以上
の重合性エチレン系不飽和モノマーから製造される。限
定されるものでないが、有用なポリマー結合剤として
は、ポリアクリルアミド、コポリ（アクリルアミド/1−
ビニル−２−ピロリドン）（重量比90:10）、 コポリ（アクリルアミド/1−ビニル−２−ピロリドン）
（重量比、50:50）、 コポリ（アクリルアミド/1−ビニルイミダゾール）（重
量比、90:10）、 コポリ（アクリルアミド/2−メチル−１−ビニルイミダ
ゾール）（重量比、90:10）、 コポリ（アクリルアミド/N−メチロールアクリルアミ
ド）（重量比、80:20）、 コポリ（アクリルアミド／アクリル酸）（重量比、90:1
0）、 コポリ（アクリルアミド/2−ビニルピリジン）（重量
比、89:11）、 コポリ（アクリルアミド/2−メチル−５−ビニルピリジ
ン）（重量比、90:10）、および コポリ（アクリルアミド/1−ビニル−２−ピロリドン／
アクリル酸）（重量比、75:15:10）が挙げられる。ポリ
アクリルアミドが好ましい物質である。必要に応じて、
１種より多くの結合剤を使用することができ、異なる受
容体または装置の異なる区画に対して種々の結合剤を使
用することもできる。

受容体に対する結合剤の比は、実施されるアッセイおよ
び供給されたリガンドにとって必要な受容体の量に応じ
て多種多様であることができる。一般に、固定化される
受容体の量は、少なくとも0.01μｇ、好ましくは１〜10
μｇを含むが、測定されるリガンドにより異なるであろ
う。一般に、結合剤と受容体との比は、1:1〜100:1であ
る。ビオチン化受容体および結合剤は、一般に、適当な
方法で混合され、装置中に供給され、次いで使用前に適
当な手段で乾燥される。ほとんどの場合に、乾燥工程は
２時間未満で実施する。例えば、結合剤および受容体を
ガラス製の試験管内の緩衝液中で混合し、試験装置の試
験ウェルの側面にのせ次いで空気乾燥する。

前記で定義したごとく、固定化されたビオチン化受容体
は、リガンドと特異的に複合する化合物である。ほとん
どの場合、この受容体は、抗原特性を有するリガンドに
対する抗体である。しかしながら、リガンドが抗体であ
る場合にはそれは抗原であることもでき、または受容体
が抗体に対する抗体であることもできる。固定化された
受容体にビオチン化物、例えば、ビオチン化抗原または
ビオチン化抗体は、既知の手段および試薬を使用して調
製される（例えば、ヨーロッパ特許公開第201,079号公
報ならびに米国特許第4,276,206号および同4,298,685号
明細書参照）。

本発明の装置は、また、適当な態様でそれらの中に他の
試薬を伴っていてもよい。例えば、試験装置のある領域
に存在する緩衝液を乾燥することによるごとく、緩衝剤
をそれらの中に固定してもよい。これらの試薬は、ま
た、ビオチン化受容体に対して使用されるような同一ま
たは相違する結合剤で固定化することもできる。いずれ
かの他に取り込まれた物質はい、アッセイの前に別の試
薬（例えば、ビオチン化受容体）から機能上分離させる
ことが重要である。これは、それらの追加の物質を固定
化された受容体の位置から離れた位置に固定化するか、
または保護剤や被覆剤など（例えば、封入または保護被
覆）を使用することによって行うことができる。それは
また、反応に対してある種の活性化剤を必要とするもの
と共に試薬を固定化することによっても達成することが
できる。

前述したように、本発明は、また、リガンド−受容体の
複合体形成を検出するための検出システムも包含する。
この組成物は、リガンドに対する第二の受容体（第二の
受容体は検出用の適当な標識を有する）のように簡単な
ものであってもよい。限定されるものではないが、有用
な検出成分には、放射性同位体、化学発光化合物、生物
発光化合物、蛍光化合物、着色ビーズ、染料、染料前駆
体および酵素が包含される。当該技術分野で有用な多く
の標識が公表されている（例えば、ヨーロッパ特許公開
第201,079号公報参照）。これらの標識は、適当な試
薬、装置、方法を使用して検出することができる。

好ましくは、前記標識は、酵素（例えば、ペルオキシダ
ーゼ、グルコース・オキシダーズ、ウレアーゼ、カタラ
ーゼまたはグルコース−６−リン酸ヒドロゲナーゼ）で
ある。かかる場合には、本発明のキットは、場合により
酵素の基質および染料供給成分を含んでいてもよい。基
質上の酵素の反応は、検出可能な種を供給できる。他
方、他の染料形成物質および反応が、染料のような検出
可能な種を供給するために必要な場合もある。

例えば、ペルオキシダーゼが標識として使用されるとき
には、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下で染料を
供給するテトラメチルベンジジンまたはロイコ染料（例
えば、米国特許第4,089,747号明細書に記載されるよう
なトリアリールイミダゾール系ロイコ染料もしくは同第
4,670,385号に記載されるようなトリアリールメタン系
ロイコ染料）のごとき適当な染料形成剤および過酸化水
素を本発明のキットが包含することもできる。他の有用
な酵素に対して役立つ基質および染料形成試薬は、当業
者に周知のものが挙げられる。

本発明の好ましい態様における試験キットは、 （ａ）アピンが結合している不溶性相を含んでなる不溶
化試薬、 （ｂ）１以上の試験区画を有し、かつ、その試験区画の
少なくとも１つに、少なくとも50重量％のアクリルアミ
ドを有する１以上の乾燥された水溶性アクリルアミドホ
モポリマーもしくはコポリマーによって乾燥状態で固定
化されたリガンドに対するビオチン化受容体を有する水
不溶性支持体を含んでなり、前記ビチオン化受容体がア
ビジンおよび第一のエピトープ部位においてリガンドと
反応し得るものである試験装置、ならびに （ｃ）標識されそして第二のエピトープ部位においてリ
ガンドと反応することができるが、アビジンとは反応す
ることができないリガンドに対する第二の受容体、を含
んでなる。

前記好ましいキットの不溶化試験は、アビジンまたはそ
の誘導体（例えば、ストレプトアビジン、スクシニル化
アビジンおよびアビジンモノマーなど）分子が結合する
不溶性相（例えば、ガラス・ビーズ、金属粒子、膜、ポ
リマー・ビーズ・ガラスまたはセルロース系の繊維、お
よび当該技術分野で既知の他の物）を有する。

アビジンまたはその誘導体は、当該技術分野で既知のい
ずれかの適当な方法により不溶性相に結合することがで
きる（例えば、米国特許第4,298,685号、同4,496,654号
および同4,582,810号明細書ならびにPCT公開第84/03358
号公報、参照）。アビジンは吸着によって結合され得る
が、好ましくは、アビジン分子中の反応性残基（例え
ば、反応性アミン基）と前記担体上の適当な反応性基
（例えば、カルボキシル基、ハロメチル基、ビニルスル
ホニル基またはクロロエチルスルホニル基）との反応に
より共有結合的に結合される。

本発明の実施に際して役立つ好ましい不溶化試薬は、後
述の例１に示す。これらの好ましい試薬は、不溶性相
（例えば、ポリマー・ビーズ）の活性化された２−置換
エチルスルホニル基、ビニルスルホニル基または活性ハ
ロゲン原子を介してアビジンを共有結合的に結合するこ
とによって調製される。

前述の好ましいキットは、１以上の試験区画を有し、か
つ、不溶化試験と反応し得る固定化されたビオチン化受
容体を有する試験装置を包含する。好ましくは、この受
容体は、ビオチン化抗原またはビオチン化抗体である。
最も好ましくは、ビオチン化抗体である。キットにおけ
る前述の第二の受容体は、リガンドとビオチン化受容体
との間の反応エピトープ部位と別のエピトープ部位にお
いてリガンドと反応すいる。この第二の受容体は、一般
に、例えば前述したような適当な標識によって標識され
る。それもまた、適当な結合剤を使用して試験装置に固
定化することもできる。なお、結合剤は、ビオチン化受
容体を固定するために使用したものと同一または相違し
ていてもよい。

例えば、hCGの測定のために有用なキットは、 （ａ）アビジンが結合している不溶性相を含んでなる不
溶化試薬、 （ｂ）複数の試験ウェルを有し、かつ、第一のエピトー
プ部位でhCGと反応するビオチン化抗体その試験ウェル
の少なくとも１つに固定されており、そして前記抗体が
乾燥状態で存在しそして少なくとも50重量％のアクリル
アミドを有する１以上の乾燥された水溶性アクリルアミ
ドホモポリマーまたはコポリマーと混合されている前記
試験ウェルを有する水不溶性ポリマー支持体を含んでな
る試験装置、ならびに （ｃ）標識されそして第二のエピトープ部位でhCGと反
応することができる、hCGに対する第二の抗体、の構成
を有する。

本発明のキットは、また、場合により洗液、緩衝液、試
薬溶液、ビン、ピペット、検体を予備濾過するための装
置およびキットの使用を容易にする当該技術分野で既知
の他の材料のような試薬および装備品を包含していても
よい。

一般に、本発明の方法は、前記試験装置のビオチン化受
容体と提供されるいずれかのリガンドとの反応生成物を
形成するような方法により、リガンドを含有することが
予期される液体試料とを接触せしめることによって実施
される。液体試料は、結合剤を可溶化し、受容体を反応
可能にする。好ましくは、液体試料は装置の形状に応じ
て、装置の試験区画かまたは試験ウェル中に適用され
る。次に、反応生成物の有無が、適当な方法（例えば、
光の散乱法、発色試験法、蛍光側定法、放射線測定法、
または他の手段）によって測定される。

本発明の方法は、標識された受容体と標識されていない
受容体とを使用する競合的バインディングイムノアッセ
イであることができる。バインディングした（すなわ
ち、複合体化した）か、またはバインディングしていな
い（すなわち、複合体化していない）物質のいずれかを
測定することができる。必要に応じて、いずれかの適当
な分離手段を使用して、バインディングした物質とバイ
ンディングしていない物質を物理的に分離してもよい。

好ましい態様では、本発明の方法は、イムノメトリック
アッセイとして当該技術分野で知られているものであ
る。このようなアッセイの詳細は、米国特許第4,486,56
0号明細書で公表されている。かかるアッセイは、前述
したような多価のまたは複数決定基のリガンドを測定す
るために使用することができ、すなわち、リガンドは、
２以上の受容体分子と反応する２以上のエピトープ部位
を有する。サンドイッチアッセイでは、第二の受容体が
試験装置とリガンドとの接触（すなわち、第一の受容体
との接触）の前後かまたは同時にリガンドと接触せしめ
られる。結果は、リガンドと２つの別個の受容体との免
疫学的な複合体である。受容体の少なくとも１つは、ビ
オチン化されている。第一の受容体がビオチン化されて
いることが最も好ましい。不溶性相上のアビエチンと第
一の受容体部分のビオチンとが反応したとき、得られる
複合体は不溶化され、そして得られる不溶化された複合
体を試験装置中の未反応物質から分離することができ
る。受容体の１つまたは不溶性相を適当に標識し、不溶
化された複合体を検出することができる。

好ましい態様では、水性液中のhCGの測定方法は、 （Ａ）１以上の試験区画を有し、かつ、その試験区画の
少なくとも１つに固定された、少なくとも50重量％のア
クリルアミドを有する１以上の乾燥された水溶性アクリ
ルアミドホモポリマーまたはコポリマーと混合されそし
て乾燥状態で存在するhCGに対するビオチン化抗体を有
する水不溶性支持体を含んでなる試験装置と液体試料を
接触せしめて、第一のエピトープ部位において前記ビオ
チン化抗体とhCGとの反応生成物を形成する工程、 （Ｂ）工程（Ａ）の接触の前後または同時に、標識され
そして第二のエピトープ部位においてhCGと反応する、h
CGに対する第二の抗体と前記液体試料とを接触せしめて
第一および第二の抗体とhCGとの複合体を形成する工
程、 （Ｃ）アビエチンを結合した不溶性相を含んでなる不溶
化試薬と前記三重複合体とを接触せしめ、ビオチンとア
ビエチンとの反応を介して不溶化された複合体を形成す
る工程、 （Ｄ）得られる標識化され、不溶化された複合体を未反
応物質から分離する工程、ならびに （Ｅ）標識化され不溶化された複合体の有無を測定する
工程、を含んでなる。

本発明の方法は、尿試料をアッセイすることにより、妊
娠の初期決定用として医院または家庭で実施することが
できる。

次の例は、本発明の代表的な実施例を示すものである
が、本発明の範囲を限定することを意図するものでな
い。

材料 抗体−ビオチンの複合体は、ホフマンらによって公表さ
れている方法〔Hofman et al,J.A.C.S.100,3585（197
8）、参照〕により、イムノーサーチ，インコ（Immuno
−Search,Inc.,Toms River,N.J.）から入手した抗hCGモ
ノクローナル抗体およびカルビオケム−ベーリング，コ
ープ（Calbiochem−Behring Corp.）から入手したビオ
チンＮ−ヒドロキシスクシンイミドを使用して調整し
た。

ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）は、カルビオケム
（Calbiochem）から入手した。

抗体−ペルオキシダーゼの複合体は、ヨシタケらによっ
て公表されている方法〔Yoshitake etal,Eur.J.Bioche
m.101,395（1979）〕によって、ケンブリッジ・メディ
カル・ダイアゴノティックス（Cambridge Medical Diag
nostics,Bellerica,Mass.）から入手した抗hCGモノクロ
ーナル抗体およびマイルス・ラボラトリーズ（Miles La
boratries）から入手したワサビのペルオキシダーゼを
使用して調製した。

ロイコ染料溶液は、２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメ
トキシフェニル）−4,5−ビス（４−メトキシフェニ
ル）イミダゾールを使用して次のように調製した。

固体ロイコ染料（0.1％の溶液を調製する目的で）を、
リン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中の20％ポ
リ（ビニルピロリドン）溶液に溶解した。次に、この溶
液を、リン酸ナトリウム緩衝液中に過酸化水素（10ミリ
モル）、電子移動剤４′−ヒドロキシアセトアニリド
（５ミリモル）およびキレート剤ジエチレントリアミン
五酢酸（10μモル）を含む溶液に添加し、１％のポリ
（ビニルピロリドン）および0.005％のロイコ染料の最
終濃度とした。

スクシニル化カゼインは、25℃でカゼインを等重量の無
水琥珀酸と４時間反応せしめた後、透析によってその生
成物を精製した。

MOPS緩衝液は、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホ
ン酸（pH7.5）である。

例１ hCGを含む尿のアッセイ 不溶化試薬の調製 以下に既述する３種類の溶液を、80℃において脱気した
水を含有する1365mlの容器に、それぞれに示す速度で連
続的に添加した。

溶液1:スチレン（739g）、ｍ−およびｐ−（２−クロロ
エチルスルホニルメチル）スチレン（82g）ならびに１
−ドデカンチオール（8.2g）（2.5g/分にて、380分
間）。

溶液2:過硫酸アンモニウム（19.7g）および脱気し蒸溜
水（1152g）（2.140/分にて、380分間）。

溶液3:ピロ亜硫酸ナトリウム（9.9g）および蒸溜水（11
52g）（2.27g/分にて、380分間）。

380分後に反応を停止し、33.4％（固体）のラテックス
を約1218gを得た。このラテックスを３日間透析し、37.
3％（固体）およびpH5を有するラテックスを得た。この
ラテックスを13.5％（固体）に希釈した。NMR分析でス
チレン対第二のモノマーのモル比が96:4であることが確
認された。透過型電子顕微鏡で測定したところ、得られ
たラテックス粒子は、直径約0.67μｍを有していた。

前述したラテックス試料（0.75ml）を硼酸緩衝液（50ミ
リモル濃度、pH8.5）で20mlに希釈し、次いでアビジン
（5mg）を添加した。得られた懸濁液を転倒型ミキサー
で37℃で18時間撹拌し、次いで遠心した。上澄を廃棄し
た後、遠心により緩衝液を用いて粒子を洗浄し、次いで
硼酸緩衝液10ml中に再懸濁した。ビオチンのバインディ
ング分析（すなわち、トリチウム標識したビオチンによ
る滴定）は、アビジンが前記粒子に共有結合（0.3％の
ビーズ懸濁液当たり７×10^-6モルのバインディグ部位）
していることを示した。かくして本発明の試薬を調製さ
れた。

アッセイ 次のように前述の試験装置を使用してhCGを測定した。
この試験装置は、バックグランドを示しそして対照とし
て使用する負対照ウェル、試薬および手順が正確に使用
されていることを示す正対照ウェル、ならびにアッセイ
用の試験ウェルを含んでなる。各々の試験ウェルは、ス
クシニル化されたカゼインで被覆（1.07g/m²）された微
孔質ナイロン濾過膜（Pall Corp.から入手した）からな
る濾過膜を所持している。

試験装置Ａは、本発明に従って調製した。負対照試験ウ
ェルには、MOPS緩衝剤（2mg）およびポリ（アクリルア
ミド）結合剤（60μｇ）を含ませた。アッセイ用の試験
ウェルには、ポリ（アクリルアミド）結合剤（60μｇ）
により固定化されているビオチン化抗hCG抗体（３μ
ｇ）の乾燥した被膜およびその試験ウェルの別の位置に
乾燥したMOPS緩衝剤（2mg）を含ませた。正対照ウェル
には、ポリ（アクリアミド）結合剤（60μｇ）により固
定されているビオチン化抗hCG抗体（３μｇ）およびそ
の試験ウェルのMOPS緩衝剤（2mg）から離れた位置に乾
燥したhCG（400mI.U.）を含ませた。

ポリ（アクリルアミド）結合剤中に前記抗体が固定化さ
れていないこと以外は、試験装置Ａと同様な材料を含む
試験装置Ｂを調製し、対照装置として試験した。

両試験装置を、25℃および相対湿度50％に３分間保持し
た。

保持時間の経過後、前記両方の試験装置を使用してhCG
を含む尿試料をアッセイした。これらの試料は予備濾過
されて不純物が除去され、hCG約50mI.U./mlを含むこと
が既知である、この試料を、各試験装置のすべてのウェ
ルに添加し、続いてそれぞれのウェルにペルオキシダー
ゼ標識したモノクローナル抗hCG抗体（10^-9モル濃度溶
液40μｌ）を添加した。２分間インキュベーションした
後、前述した不溶性免疫反応試薬（0.42％の分散液40μ
ｌ）を添加し、その流体をそれぞれのウェル中の膜を通
して徐々に排出せしめた。

リン酸ナトリウム（0.1モル濃度）を含んでなる洗浄を
それぞれのウェルに添加し、次いで前述したロイコ染料
溶液（40ml）を添加した。２分後、標準的な装置を使用
して反射率を測定し、ウィリアム−クラッパー（Willia
ms−Clapper）変換を使用して透過率濃度（D_T）に換算
して評価した。

得られたデータを、それぞれの実験装置の試験試料ウェ
ル濃度と負対照ウェル濃度との間の差（ΔD_T）として以
下の第１表に示した。標準偏差は、カッカ内に示した。
このデータは、ビオチン化抗体を固定化するための試験
装置中のポリ（アクリルアミド）の存在により、試験装
置ＡがhCG測定に対して保持する感度をあきらかに改善
することを示している。

第１表 保存試験後のΔD_T 試験装置Ａ（本発明） 0.042（0.006） 試験装置Ｂ（対 照） 0.000（0.001） 例２〜３ 種々の結合剤の比較 種々の結合剤を使用してそれらの中に前記抗体を固定化
している種々の試験装置により、例１に記載したアッセ
イを繰り返した。結合剤にビオチン化抗体を取り込ませ
た後、試験装置を25℃および相対湿度50％に５分間保持
した。

保存試験前（「新鮮」）および保持試験後の両方につい
て算出されたD_Tとしてのデータを以下の第２表に示し
た。各装置の試験ウェルおよび負対照試験ウェルに対す
るD_Tを測定した。

抗原の明確な測定結果を得るためには、新鮮なものおよ
び保持試験後の両方の試験ウェルと負対照試験ウェルと
の間には、少なくとも0.008単位のD_T値の差が必要であ
ると解される。その差が0.0008単位未満であるときは、
バックグランドが高すぎるか、または試験装置の感度が
欠失しているかである。

試験の結果は、例１〔ポリ（アクリルアミド）60μ
ｇ〕、例２〔ポリ（アクリルアミド）30μｇ〕および例
３〔コポリ（アクリルアミド/1−ビニル−２−ピロリド
ン）〕で使用された結合剤が有用であり、その中でも例
１のものが最も好ましいことを示している。ポリ（１−
ビニル−２−ピロリドン）60μｇを使用した対照Ａのア
ッセイは、新鮮なものでさえも許容できず、ウシ血清ア
ルブミン60μｇを使用した対照Ｂは、バックグランドが
高すぎそして５箇月保存した後には感度が欠失してい
た。

〔発明の効果〕 本発明の装置、キットおよび方法は、流体試料中のリガ
ンドの有無の定性または定量定測用の迅速かつ精確な手
段を提供する。本発明のキットは、必要なそして任意の
構成部品を有するが、溶液および混合工程の数は微少で
ある。

より重要なことは、長期にわたって安定な１以上のビオ
チン化受容体を本発明の装置が有することである。これ
らの長所は、１以上のアクリルアミドホモポリマーまた
はコポリマーにより乾燥状態で装置中に前記受容体を固
定化することにより達成された。かかる結合剤は、製造
工程中、輸送中および保存中の受容体の保持性を効果的
に高める。このことによって、流体試料中の目的とする
リガンドとビオチン化受容体との反応を可能にしてい
る。しかしながら、例２および３に示したごとく、水溶
性結合剤のすべてが望ましい保持安定性を提供するとは
限らない。本明細書で定義されるアクリルアミドポリマ
ー類が、本発明により予期せぬ保持安定性を提供するに
すぎない。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】水不溶性支持体を含んでなり、かつその支
   持体の一ヶ所又はそれ以上の位置に、少なくとも50重量
   ％のアクリルアミドを有する一種又はそれ以上の乾燥し
   た水溶性アクリルアミドのホモポリマーもしくはコポリ
   マーとの混合又は該ホモポリマーもしくはコポリマーに
   よる被覆によって、乾燥状態で固定化されているリガン
   ドに対するビチオン化受容体を有する水性液中のリガン
   ドの測定に有用な装置。
2. 【請求項２】水不溶性支持体を含んでなり、かつその支
   持体の一ヶ所又はそれ以上の位置に、少なくとも50重量
   ％のアクリルアミドを有する一種又はそれ以上の乾燥し
   た水溶性アクリルアミドのホモポリマーもしくはコポリ
   マーとの混合又は該ホモポリマーもしくはコポリマーに
   よる被覆によって、乾燥状態で固定化されているリガン
   ドに対するビチオン化受容体を有する装置、ならびに前
   記リガンドとビオチン化受容体との反応複合体の形成を
   検出するための検出組成物を含んでなる水溶液中のリガ
   ンドの測定用キット。
3. 【請求項３】A.液体試料を、水不溶性支持体を含んでな
   り、かつその支持体の一ヶ所又はそれ以上の位置に、少
   なくとも50重量％のアクリルアミドを有する一種又はそ
   れ以上の乾燥した水溶性アクリルアミドのホモポリマー
   もしくはコポリマーとの混合又は該ホモポリマーもしく
   はコポリマーによる被覆によって乾燥状態で固定化され
   ているリガンドに対するビオチン化受容体を有する装置
   と接触せしめ、前記リガンドと受容体との反応生成物を
   形成する工程、ならびに B.前記反応生成物の有無を検出する工程、を含んでなる
   水性液中のリガンドの測定方法。