JPH01206238A - ディジタル比色定量測定システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素酸化の結果として過酸化水素を発生する
生物学的分子又は有機化合物の濃度の比色定量分析シス
テムに関する。更に、本発明は又、過酸化水素の直接的
比色定量測定システムに関する。

本発明は、測定される溶液中の分析質（被分析物）ａ度
についての従来の精度を向上させ、又過酸化水素のより
高い濃度、並びに反応により従来より多量の過酸化水素
を発生する分析質の測定を可能にする。分析質濃度の決
定のために、色強度に代えて色変化の「オン・オフ」を
利用することにより、広範囲の医学用及び産業用物質の
濃度の直接決定が可能になる。本発明は濃度決定のため
に色変化の強度に依存しないので、比色分析システムの
如き定量分析法に付随する不正確さは本発明においては
認められない。その代りに、測定前希釈の必要なしに高
濃度の分析質の正確な測定を可能にするもので、従来技
術においては未知の方法である。

本特許出願は、同一出願人による同時係属中の発明の名
称を「閾値着色制御システム」とする１９８７年７月２
０日付出願の出願番号第０７５゜８１８号の特許出願、
及び発明の名称を「着色制御システム」とする１９８６
年１２月１６日付出願の出願番号第９４２．４１４号の
特許出願に対する一部継続出願である。

本発明は、過酸化水素濃度、及び基質特異性酸化酵素の
酸化により過酸化水素を発生する生物分子及び有機化合
物についての比色定量分析システムに対する改善された
システム、装置及び方法を提供する。それらのシステム
、装置及び方法は、濃度が測定される有機又は生物分子
基質に対し特異性を示し、基質との反応により過酸化水
素を発生する酸化酵素と、過酸化水素の還元剤であって
、過酸化水素による酸化で着色するクロモゲンと、クロ
モゲンより大きい還元電位を有し、クロモゲンより強く
非可逆的且つ選択的に過酸化水素により酸化されるが、
少なくともクロモゲンが発色する色範囲においては着色
を示さない、空気中で安定な第一の還元剤を使用する。

更に、第一の還元剤又はクロモゲンの過酸化水素による
酸化を促進させるための触媒を用いてもよい。

本発明は又、過酸化水素を発生するための基質特異性酸
化酵素により酸化される、−膜内に生物学的流体試料の
形の有機化合物の濃度測定をも可能にする。本発明の過
程に従えば、過酸化水素の空気中で安定な第一還元剤は
過酸化水素及び過酸化水素により酸化されているすべて
のクロモゲンの両者により酸化されるので、発生した過
酸化水素の１モル当り過酸化水素の当量以下の色の当量
が発生される。それらの反応を促進するために触媒を使
用してもよい。

本発明の一つの特徴によれば、１モル当りの過酸化水素
当りのクロモゲンから１当量以下の着色染料が発生され
る。空気中で安定な第一の過酸化水素還元剤の還元電位
が大きい値を有するために、空気中で安定な第一の過酸
化水素還元剤が使用され終るまでクロモゲンによる着色
変化の検出は遅延される。従って、もし測定されるべき
過酸化水素、生物分子、又は有機物質の濃度が空気安定
な過酸化水素還元剤の濃度に対応する所定レベル以下で
ある場合は、着色変化は発生しない。これにより、着色
強度の変化とは無関係に分析質濃度の直接定量分析が可
能となる。

本発明は、前記第一の空気安定な過酸化水素還元剤の各
種濃度の複数の領域の組合せを使用するシステム、装置
及び方法を提供し、分析質の未知濃度と反応すると、こ
れらのシステム、装置及び方法は、未知物質中に含有さ
れるレベル以下の基質レベルに対応する、空気安定な過
酸化水素還元剤の濃度のそれらの領域において着色を発
生する。

同線に、未知物質中に含有されるよりも大きい分析質レ
ベルに対応する前記第一の空気安定な過酸化水素還元剤
の濃度をもつ領域は色の変化を生じない。未知物質中に
含有される分析質の濃度は、色の変化を生じた前記第一
の空気安定な過酸化水素還元剤の最大濃度に対応するレ
ベルと、色の変化を生じなかった前記第一の空気安定な
過酸化水素還元剤の最小濃度に対応するレベルとの中間
に存在することになる。複数の領域における前記第一の
空気安定な過酸化水素還元剤のレベル間の増分が小さけ
れば小さい程、分析質の未知量の測定精度は益々大きく
なる。

かくて、本発明は基質特異性の酸化酵素と反応して過酸
化水素を発生する、アルコール、コレステロール、ぶど
う糖、乳酸、ビリルビンその他の有機化合物の如き、商
業的に重要な医学用及び産業用の分析質の濃度を希釈す
ることなしに測定することを可能ならしめる。

本発明は又、装置を商業的に大量生産でき、然も分析さ
れるべき液体試料を設定され再現可能な量だけ正確に吸
収する酸素吸収高分子分析装置を提供する。

本発明は決定されるべき物質の量に対応する二種の異な
る方法で着色を発生させる方法で運用できる。即ち、発
色（無色から着色へ）による方法又は可視又は読取り可
能な範囲で大きい色強度から小さい色強度への色の減少
による方法である。

従って、一般に本発明の方法は「色の変化」に関係又は
言及する。

［従来技術とその問題点］ 医学的又は商業的に重要な生物学的分子を、それら分子
と基質特異性の酵素との反応により成牛される化合物の
比色分析法により定性的及び定量的に測定することは科
学的文献及び特許資料の両者において周知のものである
。上述した先願特許は多数のかかるシステムを記述して
いる。

特許出願第９４２，４１４号及びそこに記載されている
多くの従来技術は染料のＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ還元を促進さ
せる酵素に対する総称名であるジアホラーゼと呼ばれる
酵素、又はクロモゲン（プロダイ）を色変化の発生のた
めに使用している。これらの中で広く研究されているの
はピルビン酸デヒドロギナーゼ及びアルファ・ケトグル
タル酸デヒドロギナーゼのりボイル脱水素酵素のサブユ
ニットである（　Ｖ　、　Ｍａｓｓａｙ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅＩＩｌ、ＢＩｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、３７．　３１
４−３２２　　［１９６０］　　）　　、　　Ｍａｓｓ
ａｙはリボイル・デヒドロギナーゼの基質特異性を研究
して、その酵素は広範囲のリポ酸誘導体、即ちフェリシ
アン化カリウムの他に例えばＤＬリポ酸、ＤＬリボイル
壷ダグリシンＤＬリボイル・ベータ命アラニン、ＤＬリ
ボイル・グリシルグリシン、ＤＬカルボエトキシ・リボ
アニリド、ＤＬリボアニリン及びＤＬリボアミド、を還
元することを示した。ジアホラーゼ及びリボイル脱水素
酵素には概説がある（　Ｕ　、　Ｓｃｂｍｌｄｔ、　Ｐ
　、　Ｇｒａｒｒｅｎ、　Ｋ　、　Ａｌｔｌａｎｄ　ａ
ｎｄ　Ｈ，Ｗ、　Ｇｏｅｄｄｅ、　Ａｄｖａｎｃｅｓ　
ｌｎ　Ｅｎｇｙｍｏｌ。

ｇｙ、３２，４２３−４６９　［１９６９］及びＣ１Ｈ
，Ｗｌｌｌｉａｍｓ、　Ｔｈｅ　Ｅｎｇｙｍｅｓ、１３
．　１０６−２１９　［１９７６］　）。

これらの文献の、特に（然しそれのみにではなく）上記
著者等の本発明及びジアホラーゼに適したリポ酸の誘導
体又は化合物に関する発表をここに組入れである。

可視色における変化を発生させるためのジアホラーゼの
使用は広く文献において論じられている。

事実、この酵素の最初の分析の一つは、２，６−シクロ
ロフエノールインドフエノール（ＤＣＰＩＰ）のＮＡＤ
Ｈによる還元に関するものである。

ＤＣＰＩＦは染料であるが、還元されたＤＣＰＩＦは無
色である。Ｂｏｅｔｈｌｉｎｇ及びＷｅａｖｅｒ（Ｒ，
Ｓ。

Ｂｏｅｔｈｌｌｎｇ　ａｎｄ　Ｔ、　　Ｌ、　Ｗｅａｖ
ｅｒ、　Ｃｌ１ｎ　、Ｃｈｅｍ、、２５．２０４０−２
０４２　［１９７９］　）はプロダイ、チアゾリル令ブ
ルー・テトラゾリウム・ブロマイドを利用するジアホラ
ーゼ分析について報告している。還元の後ではこの無色
分子は、５６０ｎｍで最大吸光度を有する着色されたホ
ルマザンに変換される。

テトラゾリウム塩、３−Ｐ−ニトロフェニル−２−ヨー
ドフェニル−５−フェニルテトラゾリウム（ＩＮＴ）、
及びジアホラーゼは原乳酸塩デヒドロギナーゼの自動分
析の作成（Ｎ、　　Ｊ、　Ｈｅ１ｌａａｎｄ　Ｓ　、　
Ｗｅｌｎｈｏｕｓｅ、Ａｎａｌ、ＢＩｏｃｈｅｍ、、　
１３　、　３２２−３２５　［１９６５］　）及び血清
乳酸塩デヒドロギナーゼの単一段階の開発（Ｃ，Ｃ，’
ＡＩＩａｉｎ、　Ｄ。

Ｐ、　　Ｈｅｎ５ｏｎ、　　Ｍ、　　Ｋ、　　Ｎａｄｅ
ｌ、ａｎｄ　　Ａ、　　Ｊ　、　　Ｋｎｏｂｌｅｓｄｒ
ｏｆＬ　　Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、、１９．　２２３−２
２７　　［１９７３］）に使用された。ジアホラーゼの
比色分析法及び臨床化学試薬の調製に対する研究もある
（Ｆ、　　Ｊ、　Ｇｅ１ｌａ、Ｍ、Ｔ、　０１ｌｖｅｌ
ｌａ、　Ｆ、　Ｐｅｇｕｅｒｏｌｅｓ、　ａｎｄ　Ｊ　
、　Ｇｅｎｅｒ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、２７．
　１６８６−１６８９　［１９８１１） ジアホラーゼの比色分析は特許文献においても又論じら
れている。米国特許第４．５５６．６３４号はデヒドロ
ギナーゼ、ジアホラーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）及びテトラゾリ
ウム塩を含む反応を停止させるための蟻酸の低級アルキ
ルエステルの使用について記述している。この特許にお
いては、所定の、注意深く測定された時間内に作り出さ
れたホルマザン染料の量からデヒドロギナーゼの量が推
定されている。

米国特許第４，４２７，７７１号はアミラーゼの作用の
分析法及びそれに使用される麦芽糖デヒドロギナーゼの
製法を論じている。本特許においては、血清、唾液、又
は尿の試料をアルファ・グルコシダーゼ、ヘキソキナー
ゼ及びＡＴＰを用いてぶどう糖及び麦芽糖を取除くため
の予備処理を行う。ぶどう糖高分子を麦芽糖デヒドロギ
ナーゼ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、及びジアホラーゼ、テト
ラゾリウム塩又はフェナジン令メトサルフェート及びテ
トラゾリウム塩と共に試料に加える。アミラーゼはぶど
う糖高分子を分解して麦芽糖を生ずる。

麦芽糖は麦芽糖デヒドロギナーゼにより酸化されてＮＡ
ＤＨ又はＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを形成するがそれは次いでテ
トラゾリウム塩と反応して着色された染料を生成する。

米国特許第４．３５１，８９９号は、表面をテトラゾリ
ウム塩、ＮＡＤ、一種のデヒドロギナーゼ及び電子担持
体により含浸された結果束ずる乾いた残渣を含有する試
験表面の使用について論じている。この特許では、ジア
ホラーゼは使用されていない。その代りに、ＮＡＤＨか
らテトラゾリウム塩への電子の移送を促進するために電
子担持体メルドラ・ブルーを使用している。メルドラ・
ブルーは又、米国特許第４，２５４，２２２にも電子担
持体として使用されており、そこでは乳酸及びベータ・
ヒドロキシ酪酸塩の乳酸デヒドロゲナーゼ及びベータ・
ヒドロキシ酪酸塩デヒドロゲナーゼによる分析が論じら
れいる。

米国特許第４，２７１．２６５号は、グルタミン酸塩−
オキサル酢酸塩のトランスアミーゼ及びグルタミン酸塩
−ピルピン酸塩トランスアミナーゼの分析におけるジア
ホラーゼ又は電子移送剤、テトラゾリウム塩及びＮＡＤ
Ｐの使用が述べられている。

米国特許第４，２４７．６３３号はクレアチン・フォス
フォキナーゼの分析に対する乾燥した全部込みの試薬の
製造を記述している。この乾燥した試薬は、ＡＤＰ、ク
レアチン燐酸、マグネシウム・イオン、ぶどう糖、ヘキ
ソキナーゼ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ＩＮＴ、ジアホラー
ゼ、バッファ、還元グルタチオン及びＡＭＰを含有して
いる。

米国特許第４，２２３，０９０号はトリグリセライドの
酵素による決定に対する試薬について記述している。こ
れらの試薬は、グリセロールを作るためにトリグリセラ
イドを加水分解するリパーゼ、グリセロールを酸化して
ＮＡＤＨを作るグリセロール・デヒドロゲナーゼ、バッ
ファ及びＮＡＤｌ及び着色されたホルマザン染料及び再
生されたＮＡＤを作るためにＮＡＤＨを使用する、ジア
ホラーゼ及びテトラゾリウム塩から構成されている。こ
の特許で述べられている改善は０．０５から０．１５ｍ
Ａの濃度で存在するマンガンのイオンを含有することで
ある。

米国特許第４，２１５，１９７号はクレアチンの定量の
手段及び方法について記述している。この特許において
は、クレアチニンが酵素により加水分解されてクレアチ
ンになる。クレアチニンは更に酵素的に加水分解されて
サルコシン及び尿素となり、更にサル、コシンは酵素的
に変換されてフォルムアルデヒド及びグリシンとなり同
時にＮＡＤＨを生成する。次いでＮＡＤＨはテトラゾリ
ウム塩ＭＴＴを直接又はジアホラーゼを介して還元して
着色された染料を生ずる。この特許は又上述の成分を含
有する乾燥した試薬錠剤の製造について述べている。

米国特許節４．１４２，９３８号はトリグリセライド及
びグリセロールの分析について記述している。この特許
では、トリグリセライドは中程度の温度で苛性ソーダ処
理により加水分解される。

得られたグリセロールからは妨害物質を沈澱させるマグ
ネシウム・イオンを使用して妨害物質を除去する。試料
は沈澱物を除去するために遠心分離し、上澄み液を、Ａ
ＴＰ、グリセロール拳キナーゼ、グリセロール−１−フ
ォスフェート寺デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ、ジアホラー
ゼ、及びテトラゾリウム塩を含む液体酵素反応により、
グリセロール成分の分析を行う。グリセロールはグリセ
ロールキナーゼにより促進される。グリセロール−１−
フォスフェートは次いで酸化されてＮＡＤＨ及びグリセ
ルアルデヒド−３−フォスフェートとなる。ＮＡＤＨは
次いでジアホラーゼにより促進される反応においてテト
ラゾリウムを還元するのに使用される。

米国特許節４．０２４，０２１は生物学的流体中におけ
るグルタミン酸塩及びグルタミンΦトランスアミナーゼ
の決定法について記述している。

この特許では、トランスアミナーゼのための基質はトラ
ンスアミナーゼを用いて培養するのでグルタミン酸塩が
得られる。生成されたグルタミン酸塩はＮＡＤの存在下
でグルタミン酸塩デヒドロゲナーゼにより酸化されてア
ルファーオクソグルタレート、アンモニア及びＮＡＤＨ
を生成する。ＮＡＤＨは続いてテトラゾリウム塩、ＩＮ
Ｔ、と反応して着色されたホルマザンを生ずる。この最
後の反応はジアホラーゼ又は電子担持体、Ｎ−メチルフ
ェナジン・メトスルフェートを触媒として用いることも
できる。トランスアミナーゼの活性度の測定には単位時
間当りに作られるホルマザンの色の強度を測定する。

米国特許節３，８６７．２５９号及び第３．８６７．２
５８号は乳酸塩デヒドロゲナーゼのための試験材料の製
造について記述している。試験材料は、材料にテトラゾ
リウム塩を含浸させて得られる乾燥残渣を含む吸水性材
料、クロマトグラフィ効果防止剤、酸化防止剤、ジアホ
ラーゼ、ＮＡＤ及びアルカリ乳酸塩混合物より成ってい
る。特許節３．８６７．２５８号は材料の隙間全体に分
散されている親水性で架橋された硫酸塩化されたアルデ
ヒド又はケトン高分子に固定されたジアホラーゼの使用
について開示している。これらの特許では、血清からの
乳酸塩デヒドロキナーゼが乳酸塩をピルビン塩に酸化し
、同時にＮＡＤをＮＡＤＨに変換する。次いで材料中の
ジアホラーゼがＮＡＤＨに依存するテトラゾリウム塩の
還元を促進して着色された染料を形成する。ジアホラー
ゼは分析される乳酸塩デヒドロゲナーゼ以上に過剰に存
在するので、色形成速度（単位時間中に生成される色の
量）は血清試料中の乳酸塩デヒドロゲナーゼ濃度の指示
薬である。　゛ 米国特許節３，７９１，９３１号は又乳酸塩デヒドロキ
ナーゼの分析用の試薬及び方法について論じている。こ
の特許は、１．６〜２．８Ｍの硫酸アンモニアに不溶な
、豚の心臓の蛋白質留分を０．１〜０．３％Ｗ　／　Ｖ
のポリエチレンイミンを用いて弱酸性陽イオン交換機で
７０〜８０℃で熱処理を行い続いて溶離を行って得られ
る、豚の心臓のジアホラーゼを使用している。この特許
は又、バッファ、安定器及び牛の血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を乳酸塩デヒドロキナーゼの水性分析における使用
について論じている。

前述した同時係属中の出願以前の従来技術に存在してい
た欠点は、酸化される生物学的分子毎に１当量の染料分
子が生成されるということである。

分析質の量は色変化の強度によってのみ決定できるであ
ろう。この制限によって、生物学的分子の「高」濃度を
従来の分析方法で行おうとすると、完全又は完全に近い
酸化で発生した色の量は希釈なしでは読取れない位高い
吸光度を有する着色溶液を生ずるので、従来方法による
分析が不可能であった。更に、染料の「高」濃度は染料
・染料間の相互作用がＢｅｅｒの法則で予言される理想
的な関係からの重大な偏差を引起こすことになり、染料
の吸光度対濃度の直線関係を持たない溶液を生ずること
になる。これらの「高」濃度（測定できない程高い濃度
）は、全部でないにしても大部分の医学的に重要な生物
学的代謝物の病気状態を示す正常濃度及び超正常濃度を
含んでいる。そのため、すべての既存の分析に共通な分
析方法で生物学的分子の完全又は完全に近い酸化を使用
する場合には、生物学的分子の濃度を低下させるために
は大規模な希釈が必要であった。

前記の同時係属中の特許出願は上記の問題点を克服する
ものであった。これらの特許においては、分析質分子当
り１分子以下の染料が創造され、分析質が所定の濃度以
上に存在しているのでなければ色変化の発現を防止する
ようになる。分析質の所定濃度を色々と変化させて試験
することにより分析質の濃度を正確に測定できるように
なる。

前記同時係属中の特許出願第９４２，４１４号は、分析
質をその分子に特異なデヒドロゲナーゼ酵素及びＮＡＤ
　（Ｐ）と反応させ、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを発生させるこ
とによりこの問題の解決を達成した。次いでＮＡＤ　（
Ｐ）Ｈはジアホラーゼにより促進される反応においてマ
クロモゲンを還元するのに使用される。ジアホラーゼに
より促進されるＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ還元に対する競合する
基質はクロモゲンが還元され、又競合する基質が消費さ
れるまで色を変えることを防止するのにも使用された。

その発明は、測定すべき基質の所定のレベルに対応する
競合基質の濃度を利用した。もし基質の濃度がこの所定
濃度を越えないならば、色変化は発生しなかった。測定
すべき未知物の濃度を決定するために競合する基質の種
々の濃度が組合わされた。

また、前記同時係属中の特許出願第０７５．８１７は、
ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの還元を促進するためのジアホラーゼ
触媒を必要としない新しい種類のクロモゲン及び競合す
る基質の開示を行った。

本発明はオキシダーゼ酵素を使用する。オキシダーゼは
、過酸化水素の生成に対し特異であるような基質を酸化
するすべての酵素に対する総称基である。これにより、
測定されるべきＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを発生するために以前
の出願に使われた成分ＮＡＤ　（Ｐ）を考慮に入れる必
要をなくする。この発明のオキシダーゼ及びオキシダー
ゼ基質は直接測定のための過酸化水素を発生する。

本発明は全く新しい種類の酵素、測定されるべき基質、
クロモゲン及び競合する基質を開示している。測定され
るべき過酸化水素を直接発生するのに使われるオキシダ
ーゼ酵素は通例、それらのデヒドロゲナーゼの対応物よ
りも、より容易に商業的に入手でき従ってより経済的で
あるから、本発明は従来技術を改善するものである。ビ
リルビン・オキシダーゼ、コレステロール・オキシダー
ゼ及びぶどう糖オキシダーゼは夫々のデヒドロゲナーゼ
よりは容易に入手可能である。このような他の例は、こ
の技術に対する通常の技能を有する者にとっては自明な
ものである。

過酸化水素、特に有機及び生物学的分子の酵素酸化によ
り生成される過酸化水素、の比色分析は科学及び特許の
文献の両者において周知の事である。米国特許節４，６
４２，２８６号は、アルコール・オキシダーゼ、ペロキ
シダーゼを用いる過酸化水素検出システム及びアルコー
ル・オキシダーゼ安定剤を使用するエンタノール検出の
ための分析システムを論じている。ベロキシダーゼ色シ
ステムはオルト・トルイブインをクロモゲンとして使用
している。このシステムでは、過酸化水素の分子毎に染
料の一分子を生成する。

米国特許節４，４１４，３２６号はコレステロール検出
のための分析システムを記述している。

このシステムでは、コレステロールはコレステロール・
オキシダーゼにより酸化されて過酸化水素の当量を生成
する。過酸化水素はペロキシダーゼにより促進される反
応に使われて４−アミノ−アンチピリンを酸化し、後者
は次いでフェノールと結合して染料を形成する。ここで
も又、このシステムで生成される過酸化水素の各分子毎
に染料の１分子が生成される。この同じ基本的システム
が米国特許節４，３７８，４２９号及び第３，８８４．
７６４号に利用されている。

この過酸化水素／ペロキシダーゼシステムは又、ぶどう
糖の分析及び検出において広く利用されている。例えば
、米国特許第４，０９８，５７４号、第４，２１１，８
４５号、第４，２７３，８６８号、第４，２８１，０６
２号、第４，２９８，５７４号、第４，２１１，８４５
号、第４，２７３゜８６８号、第４，２８１，０６２号
、第４，２９８．６８８号、及び第４，３５３，９８４
号参照。

米国特許第４，１６６．７６３号及び第４，２５１．６
２９号は乳酸及び過酸化水素の分析に対しこの同じ過酸
化水素／ベロキシダーゼシステムを使用している。

米国特許第３．８８６，０４５号及び再発行特許第２９
，４９８号は有機及び生物学的分子の酵素酸化により生
成される過酸化水素を異なる方法で分析する。これらの
特許においては、オキシダーゼはクロモゲンを直接には
酸化しない。その代りに、過酸化水素／ベロキシダーゼ
はフェロシアン化塩をフェリシアン化塩に酸化するのに
使われる。フェリシアン化塩が次にフェノールを非酵素
的反応において着色されたキノンに酸化する。

上述のすべてのオキシダーゼに関する特許は、然し乍ら
、他の従来技術と同様な欠点を有している。即ち、分析
システムで生成されるか又はその中に存在している過酸
化水素の分子当り１個の染料分子を生成する。分析質の
定量的なδｐ１定は色変化の強度の評価によってのみ可
能になる。医学的に有意義な生物学的代謝物の代表的レ
ベルは、代謝物濃度の正確な測定を得るのには余りに高
い還元されたクロモゲンの濃度を生成する。正確な読取
り値を得るためのは大規模な被測定試料の希釈が必要と
なる。

従来技術の、この欠点を軽減しようとする試みは不満足
に終っている。欧州特許第ＷＯ３５１０１７４７号は流
体中の分析質の検出の為に、アナログ入力からディジタ
ル信号を生成する装置を記述している。この発明の一実
施例はぶどう糖に対する種々の感度を持った紙製の円の
一系列である。

異なる領域がぶどう糖の異なる濃度において、白まがい
の色から赤味がかった褐色に変化する。

本発明でも過酸化水素の比色定量分析のための同様のシ
ステムが提供されている。然し、本発明は上記発明とは
異なった方法で機能し、その特許の有する重大な次点の
幾つかを克服するものである。　前記欧州特許において
は、分析質を酸化して過酸化水素を発生する酵素を含有
する乾燥試薬処方を水様試料に適用している。試薬は又
第二の酵素及びその酵素のための基質を含んでいる。こ
の基質が水溶液中で水和すると、それは第二の酵素まで
運ばれそこで反応されてシアン化物を形成する。シアン
化物は第一のオキシダーゼ酵素に対する不活性化物であ
るから反応は発生しない。第一の酵素の反応以前に生成
された過酸化水素は遮断されて、ベロキシダーゼにより
促進される反応で着色するように変換されるか、又はア
スコルビン酸と反応して無色のジヒドロアスコルビン酸
を形成する。

１１ｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒの二つの米国特許、即ち第
４，０５９．４０７号及び第３，９６４，８７１号も又
過酸化水素の直接比色定量分析法を扱っている。

第３．９６４，８７１号はぶどう糖検出装置について述
べている。この特許においては、各種の紙の条片を有す
る装置に試験液を飽和させる。異なる紙条片はすべてぶ
どう糖オキシダーゼ、ペロキシダーゼ及びクロモゲンを
含有している。又それらは異なる濃度の拮抗化合物を含
有している。この特許に開示されている拮抗化合物はす
べてカテコールの誘導体である。

第４，０５９，４０７号も同様に、過酸化水素及びクロ
モゲンの両者を還元する滴定剤の異なる濃度のものと組
合わせたオキシダーゼ酵素及びクロモゲンについて教示
している。

然し、上述の方法については重大な問題が存在する。前
記欧洲特許においては、第二の酵素により生成されるシ
アン化物は第一の酵素を指数関数的に抑止し、それ故基
準曲線は測定が行われる度毎に決定されなければならな
い。更に、基質濃度が第一酵素のｋｍ値よりずっと低い
場合には、酵素反応の速度は基質の濃度のみに比例する
。分析上重要な大部分の酵素のｋｍはぶどう糖オキシダ
ーゼを除けば基質の正常な生理学的濃度以下の値を有し
ている。夫故、この技術を利用する測定する前に、生物
学的試料は希釈する必要がある。

米国特許第３．９６４．８７１号のカテコールは空気に
よる酸化に対し安定でなく従ってこの特許に述べられて
いる方法及び装置の信頼度には限度があるということは
周知である。この特許及び第４，０５９，４０７号の両
者は支持部材として設定され且つ再現可能な量の流体を
吸収すべく製造された濾紙の使用について教示している
。正確な読取りが得られるためには既知量の流体をサン
プルしなければならない。これを達成するために濾紙を
使用するということは商業的に実行可能ではない。然し
、オキシダーゼ酵素が分析質を酸化して過酸化水素を生
成するための酵素の源として空気中の酸素を導入しなけ
ればならないので、吸水性又は高い吸収性を有する材料
が必要とされる。

医学的に重要な代謝物の濃度はしばしば１から５０ミリ
モル（ｍＭ）という濃度範囲にある。空気で飽和された
水の中の酸素の濃度は僅かに０．８ｍＡである。

第４，０５９，４０７号のもう一つの問題点は、滴定剤
が指示薬より大きい還元電位を持つということについて
の要件が存在しないということである。滴定剤より大き
い還元電位を有する指示薬は、過酸化水素の量を減少さ
せ滴定剤が消費される前に色の変化を生ずるのみならず
、それは更に滴定剤の使用量を減少させて色を変化させ
る。このため試験結果は極めて不正確なものになる。

本発明は、クロモゲンより大きい還元電位を持つ、空気
中で安定な過酸化水素還元剤の使用によりこれらの問題
点を克服するものである。大量生産ができる酸素吸収高
分子式の機械的支持部材の使用により濾紙を支持部材と
して使用することによる欠点を克服することができる。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は多数である。本発明の一つの目的は有機
的液体又は流体中に通常存在する選択された有機分子の
定量分析を可能にする正確、圧密、高速で且つ信頼でき
る装置を提供することである。

本発明の他の目的は、求められている未知物の濃度に対
する「オン」−「オフ」を示すディジタル色信号を提供
することである。

本発明の他の目的は、アナログからディジタルの化学的
色信号装置を提供することである。

本発明の他の目的は、決定されるべき有機物分子濃度の
閾値濃度において特有の色を与える使い捨てのキットを
提供することである。

本発明の以下の記載にある技術についての平均的技能を
有する者にとっては自明の幾つかの目的がある。

本発明の他の目的は、本発明の適用分野における多数の
実際的応用を有し且つその分野での技術の進歩に貢献で
きるシステム、方法及び装置を提供することである。

本発明の他の目的は、適当な反応剤の存在下において、
原位置で発生される過酸化水素の濃度の定量的決定のた
めのシステム、方法及び装置を提供することである。

本発明の他の目的は、適当な反応剤の存在の下で最終的
に過酸化水素を発生する有機分子の濃度の定量的決定の
ためのシステム、方法及び装置を提供することである。

［課題を解決するための手段・作用及び効果］本発明は
過酸化水素濃度の比色定量決定に有用である。本発明は
オキシダーゼ酵素により酸化されて過酸化水素を生成し
、更に以下で更に詳しく開示するように、過酸化水素と
所定の関係を有するζ分析質の濃度を比色定量的に決定
するのに有用である。

本発明は化学的構成要素並びに機械的構成要素を有して
いる。機械的要素はアナログ入力からディジタル信号を
生成する。この信号発生のために、異なる領域は一般に
異なる閾値に設定されている。

例えば、コレステロールの測定装置はコレステロールの
増大する濃度、例えば２００，２２０，２３０．２４０
，２５０，２６０，２７０，２８０゜２９０．３００，
３１０，３２０．及び３５０ｍｇ／ｄＮに反応するよう
な、複数の異なる領域を持つようにしてもよい。もし血
液試料が２４５ｍｇ／ｄｌのコレステロール濃度を持っ
ているならば、試験装置の最初の四つの領域では色の変
化が生ずるがその他の領域は初期の状態のままに留まる
。化学的構成要素の詳細は以下に開示する。

装置の機械的構成要素は正確で再現可能な所定体積の試
料を装置の測定領域に供給する。この正確な測定は自動
式ピペット、制御式送出し装置の如き機械を使用するこ
となしに行われる。

化学的構成要素は機械的構成要素の内に置かれている。

本発明の比色定量分析システムは、過酸化水素の電子供
与体又は還元剤で可視光領域において色の変化を生じ得
るプロダイ又はクロモゲンより成っている。代表的なり
ロモゲンはアジノビス（３−エチルーペンチアゾリン会
スルフオン酸）　　（ＡＢＴＳ）である。本発明のシス
テムにおいては、クロモゲンは出発時には無色だが酸化
により発色するか、化合物は出発時には着色されている
が反応が完結すると無色になるか、又はクロモゲンは薄
く着色されているが反応により濃い色又は明らかに異な
る色に変わるものの何れであってもよい。

本発明の装置は又以下に述べるように原位置において生
成される過酸化水素、酸化されたクロモゲン及び／又は
過酸化水素に水素を供与するか或いはそれらを還元する
第一の過酸化水素還元剤、及び電子をクロモゲン又は第
一の還元剤から過酸化水素へ移転させることができる電
子担持体触媒を選択的に有している。

本発明に使用される第一の還元剤は酸化されたクロモゲ
ンの堆積、従って酸化されたクロモゲンに帰せられる発
色を防止し、事実上瞬間的に還元剤を非酸化状態に戻す
か又はその非酸化状態に留まらせる。かくて、本発明に
係わる第一還元剤はクロモゲンを発生させることができ
る。かかる状態は反応剤が全部消費つくされるまで在続
する。

それ以後は、過酸化水素の存在下において、酸化された
過酸化水素の完全な色が事実上瞬間的に発現する。反応
の性質上、実質的に微量のクロモゲン、実用上は約１ｍ
Ｍ、が存在すれば発色が行われる。クロモゲンに対する
第一還元剤の濃度は重要ではなくて、例えば５０，１０
０，２００゜３００ｍＭ又はそれより大きくてもよい。

過酸化水素はまだ残っているが還元剤は使いつくされて
いる場合は、換言すれば、システム中で電子を供与する
第一還元剤よりも多量の過酸化水素の過剰が存在する場
合は発色は瞬時にして起こる。定義の目的としてはこれ
は過酸化水素の「閾」量である。かくして、このシステ
ムは二つの状態、そして二つの状態のみ読出しを与える
。即ちそれらは「オフ」と「オン」の状態で、前者は「
無色」に、後者は「着色」に対応するものである。「オ
ン」及び「オフ」は上述のように単に「着色」から「無
色」及びその逆のみならず「色の変化」をも意味するも
のである。従って、前述した特許出願書の実施例（及び
多数の従来技術による方法及びシステム）とは異なり、
本発明においては過酸化水素の濃度は発現した色の強度
に対応するものでもなく、又過酸化水素、又はもし有機
化合物（基質）が使用された場合は過酸化水素を発生し
た基質、の濃度を知るために何等のプロッティング（発
生した包封基準色の曲線）を行゛う必要とするものでも
ない。

本発明の教示によれば、色が「オン」状態にある場合は
、そうであるかも知れないし又一般にそうなり易いので
あるが、過酸化水素が微量だけ、即ち上述したように約
１ｍＭだけ、第一還元剤が使いつくされた時に発色する
のに必要なりロモゲンよりも、多量に存在する。例とし
て、出発状態において２０ｍＭの第一還元剤、１ｍＭの
クロモゲン及び４０ｍＭの過酸化水素を含有する系では
（第一還元剤が１分子当り２個の電子を１モルの過酸化
水素に供与するような事態においては）、２０ｍＭの使
いつくした第一還元剤、１ｍＭの酸化されたクロモゲン
及び１９ｍＭの過剰の過酸化水素が得られることになる
。この過剰な過酸化水素は本発明の目的のためには何等
の情報を伝えるものではない。

上記のシステムは、この場合では約１ｍＭの微量のクロ
モゲンが１ｍＭの過酸化水素と反応して強く発色した瞬
間に「オン」の読みを与える。

又本発明によれば、例えば上に例示した１ｍＭのような
絶対数に限定されることはない。更に重要なことは、酸
化されたクロモゲン又は染料に帰することができる色形
成ということである。理想的には、酸化されたクロモゲ
ンの吸光係数は十分に大きくて、急激且つ強力なはっき
りした色又は信号を発生させるのには１ｍＭ以下の酸化
されたクロモゲンがあればよい。酸化されたクロモゲン
の吸光係数は既知であり、又未知であるか或いは簡単に
は入手できない場合には、この技術において平均的な技
能を有する者にとってはそれは大がかりな実験をするこ
となしに決定することができる。随って、理想的には、
本発明のシステムにおいて過酸化水素との反応において
、酸化状態において「明瞭」で、鮮明で、紛られしくな
くて明確な色変化を与えるようにクロモゲンを選択すべ
きである。

第一還元剤が使いつくされておらず又過酸化水素が使い
つくされた場合には、クロモゲンはまだ存在するが過剰
な酸化クロモゲンは形成されず従って色変化が発生しな
いのは自明である。

本発明の重要な特徴は以下に述べる議論からより明瞭に
なる。

本発明によれば、ｒオン−オフ」ディジタル信号によっ
て正確且つ効率よく過酸化水素の濃度を測定できること
が発見された。第一還元剤が実質的に使いつくされた時
には、過剰な過酸化水素が存在する場合にのみ可視的な
色を発現する。もしそのような過剰が全熱存在しない場
合には色の発生はない。従って、本発明によれば、特別
に事前選択された第一還元剤の濃度は過酸化水素の閾堆
積値に対応する。もしそれが閾値より大きいなら、第一
還元剤が使いつくされていれば色が発生するが、第一還
元剤が使いつくされておらず且つ過酸化水素が閾値以下
である場合には色の発生はない。

本発明によれば、第一還元剤の数個の濃度が事前に選択
されて、それが流体であるか、又はより望ましくは反応
剤に対する固体支持体を有する装置であるにせよ、色の
発展は決定されるべきシステム中での過酸化水素の濃度
に対応するものとなる。

決定された過酸化水素の濃度は、もし有機化合物が存在
して然もそれが過酸化水素を発生する（適当なオキシダ
ーゼの存在下で）ならば、決定されるべき有機化合物の
濃度にも対応する。

閾値においては、第一の還元剤の濃度は過酸化水素の濃
度の１又は２倍に等しくて、これは第一還元剤が過酸化
水素に２個又は１個の電子を供与できるか否かによって
決まる。第一還元剤が２個の電子を供与できる場合は、
上記関係は１対１であり、第１還元剤が過酸化水素に１
個の電子を供与できる場合にはそれは２対１になる。

本発明のシステム及び種々な装置に加えて、本発明は求
めている濃度を有する有機基質により発生させられる過
酸化水素の濃度の測定法を提供する。その実施例におい
ては、以下に更に詳しく述べるようにその基質に特異な
適当なオキシダーゼも存在している。

本発明の過程はシステムに必要な構成要素を組立てるこ
とに存する。その構成要素又は反応剤は、一般に適当な
物理的支持体内又はその上におかれる実際的な実施例に
対しては、流体（例えば、水様）の媒体のような適当な
媒体中に都合よく置かれている。このような物理的支持
体は文献中において既知であってそれらは前記の特許出
願書中に記載されている。

本発明に使用される物理的支持体には色々の種類のもの
がある。一般に、支持体部材は測定されるべき液体溶液
に露出するためのシステムを支持できる任意の材料であ
ればよいが、好ましくは支持体は反応剤（及び生成物）
に対し十分不活性で反応に悪影響を与えないものがよい
。支持体の特定の例としては、シート、棒、ウェブ、フ
ィルタ、条片及び同様な形状のガラス、セルローズ、木
、金属、又はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアル
キレンアセテート、ポリカーボネート、重合過弗化水素
等、又は織物等である。本発明の一実施例においては、
システムは、水和又は毛細管又は他の類似の手段によっ
て、設定された再現可能な量の液体を取上げることので
きる吸水性材料中に組込んでもよい。このような基準を
満たす材料は広範囲の固体を用いて製造することができ
る。

固体支持体の例は次の通りである：　Ｎｏｒｔｏｎ　Ｃ
ｏｒｐ。

（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、　Ｍ　Ａ　）製の制御孔アルミ
ナＩＳＡ触媒リングに代表されるような金属酸化物、Ｎ
ｕｃ　Ｉ　ｅ。

ｐｏｒｅ社製の制御孔ポリカーボネート膜に代表される
高分子材料、及び埋込みシリカ粒子を有するＡｍｅｒａ
ｃｅ社製のポリビニル塩化物シートに代表されるセラミ
ック／高分子の混成材料。このような混成シートは米国
特許第４，１６９，０１４号に記述されておりそこには
活性酵素とこれらのシートとの結合について述べられて
いる。この特許は上記酵素を含有するこれらのシート中
に既知で校正された量の流体材料を含有させることにつ
いては触れていない。

毛細管の実施例においては、化学的構成要素又は反応剤
材料は理想的にはゼラチン膜のような薄くて膨潤性の膜
の成分として沈積させる。これららの膜は水様試料の存
在下で急速に水和するのに使われて、化学試薬を試料に
提供する一方で同時に形成された染料を固定している。

水様試料が毛細管に導入されると、ゼラチン、アガロー
ズ、寒天、ポリビニル・アルコール、ポリビニル・ピロ
リジン、アルギン酸塩、カラギーナン、デキストラン、
キサンタン・ガム又は上記物質の混合物は、膨張して再
水和して、乾燥しているシステムの成分を活性化する。

このシステムの自明でない利点は複数枚のゼラチン膜を
機械的構成要素内に配置して、異なる層によって本発明
の異なる構成要素を保持させるようにできることである
。異なる層の使用によって、構成要素の安定性のために
特に選択された異なる条件の下で本発明の構成要素を貯
蔵できるようになる。例えば、本発明の酵素の構成要素
は要素の反応のために最適なｐＨやイオン強度とは異な
るそれらの値において安定性を示すであろう。もしそう
ならば、薄膜層は酵素の構成要素を他の層におけるのと
は異なる条件の下で含有することができるであろう。

従って、システム成分の貯蔵に関する不相容性は多層シ
ステムにおいても見られなくなる。

本発明は上述の特別な物理的な実施例に限定されるもの
ではない。文献には多数の適切な物理的配置が記載され
ておるし、更にこの技術について平均的技能を有する者
ならその他の配置をも作製することができよう。

本発明によれば、システムの成分はクロモゲン、電子を
供与する還元剤及び触媒を含む反応混合物として寄せ集
めることができる。その混合物には色の変化が発生する
まで過酸化水素が加えられる。

色の変化が生じたと言うことは第一還元剤が使いつくさ
れて、クロモゲンが十分に目視できる色に酸化されたも
のであることを示している。

上述の方法によれば、第一還元剤の一次的に関係づけら
れている種々の濃度は、分析装置の異なる領域に設ける
ことができる。例えば、−次間数的に関係づけられた第
一還元剤の異なる濃度はこのシステムを含んでいる装置
のｒＸＪ軸に沿って並べることができる。それ故、「Ｘ
」軸に沿って並べられた過酸化水素又は過酸化水素を発
生する物質の一次的に関係づけられた異なる濃度位置に
対して「オン」信号を発生することができる。もし第一
還元剤がこの混合物中に存在する場合には、測定を行う
ためにシステム中に導入する過酸化水素の濃度をｒＸＪ
軸に沿って濃度を増加させるか或いは階段状に上げるか
下げるかすることは、その「オン」信号までの距離、換
言すれば色信号がｒＸＪ軸に沿って伝播すること、によ
り目視により決定することができる。

本発明により有機物質の濃度を測定したい場合には、そ
の方法は、クロモゲン、電子を供与する第一還元剤、触
媒、測定しようとする有機物質に対するオキシダーゼを
寄せ集めることにより達成される。この反応混合物に測
定すべき基質の量を増し乍ら加えて、基質を酸化させ、
基質濃度に比例して過酸化水素を発生させて、上述した
ように色が変化するままで反応を継続する。色変化が生
じた時点で第一還元剤は使いつくされ、基質から発生し
た過酸化水素はクロモゲンと反応して酸化されたクロモ
ゲン及び基質の濃度の指示となる十分に視認可能な色変
化を生ずる。

一般的に、反応は以下に述べる触媒及び酵素の好ましく
は最適なｐＨを有する緩衝環境において、最適な温度に
対して行う。

反応は液体中又は上述したように反応剤が反応できるよ
うな適切な物理的担持体上において行う。

［実施例の説明］ 本発明はいかなる特別な科学的論理又は慣例により限定
されないが、本発明は三つの主要実施例を有するものと
考えられる。

第１の実施例においては、第一還元剤はクロモゲンの触
媒反応により生成された酸化されたクロモゲンと反応し
、それにより着色されたクロモゲンの形成を防止する。

前述したように第一還元剤が使いつくされると、続いて
酸化されたクロモゲンが触媒作用により生成され、その
時発生する色はその濃度を測定しようとしている有機分
子の存在を示すものである。

第２の実施例においては、第一還元剤はシステム中に、
本来存在したか又は有機化合物から形成されれな過酸化
水素に電子を直接与え従って過酸化水素と直接且つ選好
的に作用するように見える。

第一還元剤が使いつくされると過酸化水素はクロモゲン
と図応して前述のように酸化されたクロモゲンを形成す
る。

第３の実施例においては、第一還元剤は、過酸化水素、
及び過酸化水素との反応によって形成された酸化された
クロモゲンがもし幾らかでも存在するなら、それらの両
者と同時に反応し還元を行い、それによって第二の還元
剤が使い尽くされるまで観ｎ１できる色変化の発生を防
止する。

本発明の実施に際しては上記三つの実施例に区別を設け
ることは本質ではない。その理由は、これらのすべての
場合において酸化されたクロモゲンにより発生された色
は可視光領域に形成されて読取ることができる（希釈な
しに）からである。

本発明の説明から明らかになったと考えられるが、閾が
設けられ−そして「オン」信号が読出され−た時には、
過酸化水素の任意の濃度において、過酸化水素の当量当
り１当量より少い染料（酸化されたクロモゲン）が生成
される。これは従来技術とは異なるもう一つの点である
。

この二重還元剤システムの開発に関連した研究の結果、
本発明の主実施例のための理想的な第−又はそれと競合
する過酸化水素還元剤の定義要件が見出だされた。この
結果によれば、第一還元剤は以下の４種の試験にかなう
化合物である。

第一の還元剤に対する第１の要件は、本発明によれば、
それは無触媒或はペロキシダーゼを触媒とする反応で過
酸化水素を還元できることである。

この要件なしには、分析質の閾レベルが存在する場合を
除けば、クロモゲンによる検出可能な色変化の防止を行
うことはできない。この性質は以下のようにして決定す
ることができる。

約１０ｍＭの測定された過酸化水素の溶液は１０ｍＭ、
ｐＨ７・４の燐酸塩緩衝液となし、濃縮された第一還元
剤溶液のある測定量をこの溶液に加えて最終的な第一還
元剤の溶液を５及び１０ｍＭの間とした。ｌ０ＩＵ／ｍ
ｆＩのペロキシダーゼを二重反応系に加え両方を室温で
１時間培養した。

第一還元剤は、もし培養の終りで第一還元剤が実質的に
使い尽くされていて、１ｍＭ以下しか残部がなくて、過
酸化水素に対応する濃度減少があれば、上記試験をパス
する。この試験は二つの異なる点に関して付加的な情報
を与える。即ち、それは第一還元剤がペロキシダーゼ酵
素に対する基質であるか及び／又は過酸化水素と直接相
互作用して還元を行うか否かについての情報を与える。

培養において消費された第−還元剤及び過酸化水素の量
の測定は、第一還元剤の電子供与能についての情報を与
える。過酸化水素の水への還元は電子２個を必要とする
ことは周知である。還元剤は一般に１個或いは２個の電
子を供与できる。従って、もし過酸化水素と等量が第一
還元剤の各当量に対して消費されているならば、第一還
元剤は２電子還元剤である。一方、もし半当量の過酸化
水素が消費されているならば、第一還元剤は１電子供与
者である。

本発明に従う適切な第一還元剤に対する第２の要件は、
空気による酸化に対し安定であることである。空気によ
る劣化からの前記第一還元剤の濃度減少は本発明におけ
る色変化を生じさせる分析質の濃度効果を低下させて、
読みに誤差が生ずることになる。この性質は以下のよう
にして決定できる。

正確に知られている被検化合物的５０ｍＭを含む５０ｒ
ｒｌの化合物を１００ｒｒｌの目盛付きシリンダに入れ
る。プラスチックの管をシリンダ内に入れて、液を通っ
て定常的に空気を３０分間流して泡立たせる。空気の流
れを止めて、未反応の第一還元剤を化学的に決定する。

もし第一還元剤の約９９．５％以上が未反応状態にある
ならば第一還元剤はこの試験に合格したとする。

本発明において第一還元剤として使用できる化合物であ
るが、この空気安定性試験に不合格になった物には、１
，２−ジオールを含む有機還元剤、アスコルビン酸及び
その塩類が含まれる。アコルピン酸塩は空気中の酸素に
よる酸化に対して安定でないという事は周知である。空
気酸化に対する感度の同様な欠点は、米国特許節３，９
６４，８７１号にＨｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒにより電子
供与分子として開示されたカテコール中に発見された、
１．２−ジヒドロキシベンゼンの一部分を含んでいる芳
香族分子にも見られる。３−メトキシ−４−ヒドロキシ
マンデル酸、３．４−ジヒドロキシフェニル酢酸、ＤＯ
ＰＡ、　　ドパミン及びアドレナリンは極めて大きい空
気不安定を受けることは周知である。

この空気安定性試験を実際パスした化合物が発見された
。即ち、それらはフェロシアン酸塩、亜硝酸塩及び例え
ば、くえん酸第１鉄、第１鉄ＥＤＴＡキレート及びエチ
レンジアミンを有する第１鉄錯体のような第１鉄の安定
な錯体である。ＥＯ′として測定される電気陰性度の発
表値の検査の結果はこれらの観察の証明を与えている。

この試験をパスした還元剤は過酸化水素／酸素の組（第
１表参照）に対するよりも更に大きい正の酸化電圧を有
している。従って、これらの分子の分子状酸素の２電子
還元による酸化はエネルギー的には上り坂の反応である
。観測された空気安定性に対する別な説明も可能で、例
えば還元剤と分子状酸素との間の反応に対するカイネテ
ィック・バリア等も考えられる。空気安定な還元剤とし
て付加的な分子は上述の第１試験を用いて発見すること
かでき、それによりそれらに対する更に付加的な理由を
生ずるであろう。提出される科学的な説明又は仮説は本
発明に対しては重大ではない。

上述の試験は空気安定性に対する適切な試験で、この技
術において平均点な技能を有する者なら誰でも採用でき
る。

（以下余白） 第１表 （ＡＣｅＬａｔｅ＋Ｈｒｌ）Ｏｒｌ　（ＩｉＯＸＩｄｅ
／ｐｙｒｕＶａｔｅ）　　　　−０，７０Ｍａｈｅｒ　
ａｎｄ　Ｃｏｒｄｅｓ、Ｂｌｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　。

（Ｈａｒｐｅｒ　＆　Ｒｏｖ、Ｎｅｗ　ｙｏｒｋ、　１
９６６　）及びＨａａｐｅｌ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉ
ａ　　ｏｆ　　ＥＩｅｃｔｒｏｃｈｃｖｌｓｔｒｙ、　
　（Ｒｅ１ｎｈ。

Ｉｄ　Ｐｕｂｌｌｓｈｌｎｇ　Ｃｏｒｐ、、Ｎｅｗ　ｙ
ｏｒｋ、　　１９６４　）に発表されている上記の表の
ような、酸化−還元表を参考のためここに組入れた。

空気安定性試験をバスした第一還元剤はそれらの過酸化
水素還元能を調べた。驚くべき事には、亜硝酸ナトリウ
ム又はカリウムは無触媒又は有触媒試験の何れにおいて
も過酸化水素を還元しなかった。これは、亜硝酸ナトリ
ウムはＨｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ、米国特許箱４，０５
９，４０７号に還元剤であると開示されているので二重
の驚きである。

ヘキサシアノ（ｎ）鉄酸塩は上述の試験により理想的な
還元剤候補である事が示された。ヘキサシアノ鉄（ＩＩ
）酸塩はペロキシダーゼの触媒で過酸化水素を効率よく
水に還元する。

適切な還元剤のための第３の要件は、酸化された第−還
元剤及び／又は第一還元剤は過酸化水素と相互作用をし
て、第１銖イオンの水様錯体との場合におけるように、
活性化された水酸基を発生し同時に酵素活動の変性をも
たらすような事があってはならないと言う事である。

鉄イオンは過酸化水素と作用して極めて活発なｒ　Ｆｅ
ｎｔｏｎＪの試薬として知られる還元種を生ずることは
周知である。この試薬は水酸化物基の源であることは公
知である。このようにして生成された水酸化物基は溶液
の多くの源から電子を抽出する事ができる。例えば、ア
ミンを含有する緩衝液や溶液中に存在する任意の酵素か
ら電子を取去って酵素の変性をもたらす。

他方で、フェロシアン酸塩は理想的な第一還元剤である
。反応生成物のフェロシアン酸塩は過酸化水素と作用し
ない安定なイオンで、水酸化物基を生成しない。

適切な第一還元剤に対する第４の要件は、第一還元剤は
クロモゲンより大きい還元電位を有するという事である
。その還元電位は又Ｍａｌｈｅｒ　ａｎｄ　Ｃ気陰性度
表から求められる。

上に述べたように、第一還元剤がクロモゲンよりも大き
い還元電位を持っているのでなければ、クロモゲンが過
酸化水素を還元して第一還元剤が使いつくされる前に色
の変化を生ずるのみならず、クロモゲンも又第一還元剤
を還元して色を変えてしまう。

さもなければ、電子を供与する還元剤の選択は上記に開
示した物又は成る種の他の重要な制限の中で幅広く行え
る。即ち、第一還元剤はオキシダーゼ酵素又は触媒に対
して不活性でなければならない。更に、第一還元剤は過
酸化水素が存在しない所でオキシダーゼ酵素及び触媒の
両方に対して無色でなければならない。

第一還元剤としては、高い原子価で、元素の水溶性の塩
を形成するように元素を酸化する、水溶性の塩で、好ま
しくは上述の特性を有するものを使用するのが有利であ
る。第１鉄の安定した錯体はその例である。他の、元素
の水溶性の塩であって、酸化して高い原子価の元素にな
るような水溶性の塩で、本発明の分析システムとしての
使用に適したものはこの分野の技術についての技能を持
つ者にとっては周知である。

本発明によれば、第一還元剤は上述のすべての要件を満
たすものであることが大いに望ましい。

然し、極めて正確な結果を得るために今述べた事が本質
的ではないようなもっと緩やかな事態では、第一還元剤
は上記の条件をすべて満す事は必要ではなくなる。上記
試験中の一つ又はそれ以上が完全には満されていなくて
も許容できるであろう。

本発明においては、この技術における技能を有する者は
精神も形式も共に発明に従い、第一還元剤はここに記し
たシステム内において使用されるものと考える。

選択される第一還元剤はへキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩で
、そのナトリウム、カリウム及びその他の当価の水溶性
鉄塩又は他の当価のものである。重硫酸塩及びＮＡＤ　
（Ｐ）Ｈも又望ましい第一還元剤でそれらは優れた空気
安定性を有している。ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ又はフェロシア
ン酸塩を第一還元剤として使用することは従来の文献に
は開示されていない。ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ又はヘキサシア
ノ鉄（ＩＩ）酸塩を第一還元剤として使用することはそ
れらの空気に対する安定性の他にも利点がある。この二
つの第一還元剤は他の分子とキレートを形成しないので
、システムの他の成分として極めて広範囲から選択でき
る。然し、過酸化水素と作用して活性化されたハイドロ
キシル基を作らず、又システム中のクロモゲンより大き
い還元電位を有する任意の空気安定な過酸化水素の還元
剤を使用してもよい。この分野の技能を有する者は、第
一還元剤として適当なその他の物質を正しく探し出すこ
とができる。その理由は、そのような還元剤に対するパ
ラメータ又は試験がここに開示されているからである。

電子を供与するクロモゲンを選択する事は本発明にとり
本質的ではない。科学及び特許の文献に開示されている
広い範囲から選んだものを本発明において同様に利用す
ることができる。ＡＢＴＳ。

オルトジアンシジン、４−アミノアンチピリン及び４−
アミノアンチピリン　プラス　フェノールは満足な結果
で用いられ且つ望ましい物とされている。一般に、触媒
により促進される反応において過酸化水素に電子を与え
て、その結果可視部で色の変化を生ずるような任意の分
子は、クロモゲンの電子供与能が第一還元剤のそれより
も小さい限りこのシステムにおいて使用できる。第−還
元剤及び過酸化水素に対するクロモゲンの電子供与能は
以下の如くにして決定できる。

候補となるクロモゲンの当量を触媒量のペロキシダーゼ
を入れたフラスコにある当量の過酸化水素に加える。候
補のクロモゲンは、もしそれが過酸化水素存在下で変色
するならばその初期試験をパスした事になる。得られる
染料は試験管内にアリコートして、上述の特性を有する
筈の候補の第一還元剤を試験管に１当量だけ余分になる
ように加える。クロモゲンと第一還元剤の組合せはもし
染料の色がなくなるならば、即ち酸化されたクロモゲン
がクロモゲンに戻されるならば、この試験をパスする。

この事はクロモゲンと第一還元剤の両者は過酸化水素の
還元剤であって、第一還元剤はクロモゲンよりも高い還
元電位を有する事を示している。

広範囲の種類の分子が、システムの他のいかなる構成要
素との反応又は相互作用により過酸化水素の存在しない
所で、はっきり視認できる色を発生するものでない限り
、触媒として選択することができる。本発明の一実施例
ではペロキシダーゼ酵素を触媒として使用している。ペ
ロキシダーゼは上に開示したように、それが電子を電子
供与体から過酸化水素に移送する能力を有するので特許
及び科学の文献において広く利用されている。過酸化水
素の他に成る種の金属イオンをこの触媒として使用する
ことができる。この移送反応の触媒としてペロキシダー
ゼの代りに鉄イオンを使えることは以前に開示されてい
る。例えば、フェロセンの水溶性誘導体は電子を両方の
電子供与体から過酸化水素へ効率的に促進することがで
きる。本発明の出願者等は第１鉄イオンがこの同じ移送
を効率的に実行できることをも示した。

本発明によれば、システム中に加えられた物質の存在下
で触媒及び第一還元剤の作用範囲が大きく向上される。

触媒による電子移送は一つの塩、好ましくは無機塩、の
存在下で行うのが有利である。特に興味があるのはフェ
ロセン（ジシクロペンタジェニル鉄）のような有機の金
属配位子である。触媒量の白金又はパラジウムのような
貴金属は触媒の触媒能力を増進させる。塩化パラジウム
のようなパラジウムの水溶性の塩が適当である。

最初に、ＮＡＤＨを第一還元剤としペロキシダーゼを触
媒として試みた所、色の減少は見られなは西洋わさびペ
ロキシダーゼは亜マンガン酸イオンの存在下で、ＮＡＤ
　（Ｐ）Ｈ，ＮＡＤＨ，グルタチオン及びインドルー３
−酢酸を酸化することを示した。約２ｍＭの亜マンガン
酸イオンを上述のシステムに加えると、ＮＡＤＨ，ＮＡ
Ｄ　（Ｐ）Ｈ１グルタチオン及びインドール−３−酢酸
はペロキシダーゼを触媒として満足な或いは優れた第−
還元剤となった。Ｂｒｏｏｋｓ他の論文は、ペロキシダ
ーゼを触媒とする反応で発生した色の量を減少のための
これらの基質の使用については開示していない。上で述
べた特許は許容できる第一還元剤の範囲を増大するため
の亜マンガン酸イオンの添加を開示していない。

本発明によれば、本発明のシステム（及び方法）は過酸
化水素を直接分析するのに使用できる。本発明の別な実
施例においては、本発明は、任意の化学的（及び酵素を
用いる）又は電気化学的方法により生じた過酸化水素の
分析及び決定に有用である。

過酸化水素の源は、本発明にとって重要又は限定的な面
ではない。本発明の適用範囲は、実験方法の節で議論及
び例示の目的のために用いられた特定の実施例よりもは
るかに遠くまで拡がっている。過酸化水素に関連してい
るオキシダーゼ・システムに対する基質である、実質的
にすべての有機化合物の濃度は本発明により決定するこ
とができる。興味のある有機物には次のものがある。即
ちアシル−ＣｏＡ、ぶどう糖、乳糖及びガラクトースの
ような糖類；グリセロール及びソルビトールのようなポ
リアルコール；トリグリセルド、コレステロール、及び
エタノール及びメタノールのようなアルコール；カフェ
イン、キサンチン、ビリルビン、ピルバートφオキザレ
ート、アスコルビン酸、コリン、燐酸グリセロール、サ
ルコシン、チトクローム、ＮＡＤＨ及びゲルトチオン；
モノ−及びジー置換アミン、Ｌ−及びＤ−アミノ酸及び
他の蛋白質のようなアミン化合物；ケトン及び乳酸及び
尿酸のような有機酸；フォルムアルデヒド及びアセトア
ルデヒドのようなアルデヒド；ベーターヒドロキシブチ
ラート及び抗原（肝臓炎Ｂ表面抗体、獲得免疫性欠失症
候群、免疫性欠失ウィルスその他の抗原）；ヌクレオチ
ド系列、グリセロール−３−燐酸塩、乳酸グリシン及び
その他の種々の酵素により促進される酸化に対し反応す
る有機基質及び文献に開示されているその他の物質。

本発明の商業的応用には脂肪族及び芳香族の炭化水素及
び塩素と結合した脂肪族及び芳香族の炭化水素のような
環境汚染物質の測定；テアフラビン、テオブロミン会シ
クロスポリンのような治療薬剤及び各種抗生物質の体液
レベルの測定；及びコカイン等のような非合法薬剤、各
種鎮静剤及び各種のテトラヒドロカンナビノル（ＴＨＣ
）の体液レベルの測定などが含まれる。他の有機分子の
分析及び商業的応用の開発の中で、この技術についての
通常の技能を有する者にとって自明なものが特に本発明
において考えられている。

人間及び例えば他の種の哺乳類の血清、血液、尿、精液
、唾液、脳を髄液又はその他の液のような生物学的流体
中には共通して基質が存在している。

これらの流体は人間から得られた物に限定されなくて一
般に他の哺乳類、例えば牛、豚、馬、猫、犬から得られ
たをも含んでいる。

濃度決定のための基質が存在する場合は、系は又特定の
基質に対する特定のオキシダーゼをも有している。オキ
シダーゼは勿論公知である。代表的なオキシダーゼは以
下に示す商業的に入手できるオキシダーゼであるか、入
手できるオキシダーゼか又は各特定の例において使用さ
れるオキシダーゼの代替品である。

アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、アルコール・オキシダー
ゼ、アスコルビン酸塩オキシダーゼ、ビリルビン・オキ
シダーゼ、コレステロールΦオキシダーゼ、コリン・オ
キシダーゼ、ぶどう糖オキシダーゼ、グリセロ燐酸塩オ
キシダーゼ、乳酸塩オキシダーゼ、ピルビン酸塩オキシ
ダーゼ及びサルコシン・オキシダーゼはＦｉｎｎｓｕｇ
ａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、（Ｅｌｋ　
Ｇｒｏｖｅ　Ｖｌｌｌａｇｅ、ｌｌ１ｉｎｏ１ｓ）から
大量に入手できる。更に、ガラクトース・オキシダーゼ
、グリコラート・オキシダーゼ、蓚酸塩オキシダーゼ、
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
、モノアミン・オキシダーゼ、ジアミン・オキシダーゼ
、チトクローム・オキシダーゼ、ＮＡＤＨベロキシダー
ゼ、ラクトベロキシダーゼ及びグルタチオン・ペロキシ
ダーゼはＳＩｇｍａ　Ｃｏｒａｐａｎｙ　（Ｓｔ、　Ｌ
ｏｕｊｓ、ＭＯ）から入手できる。

本発明によれば、この分野の技術に優れた者にとっては
これらのオキシダーゼは他の蛋白質触媒と共用すれば広
範囲の生物分子の分析が行えることを注意する必要があ
る。濃度を決定すべき化合物はそれ自体でオキシダーゼ
に対する基質である必要はない。それはオキシダーゼに
対する基質を生成する能力を有すれば十分である。例え
ば、エステル化したコレステロールは、フリーなコレス
テロールを生成するコレステロール・エステラーゼ及び
コレステロールを酸化して過酸化水素を用いて適切に検
出及び分析を行うことができる。この技術に優れている
者にとっては明かであるこのようなすべての組合せでの
分析システムを利用するということは本発明の特にねら
っている点である。

一般に、基質を酸化して過酸化水素を生ずることができ
る任意の酵素、例えば本発明に参考として組入れである
Ｂａｒｍａｎ、　Ｅｎｚｇｍｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　（
Ｓｐｒｌｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ　ｙｏｒｋ、
　１９６９　、５ｕｐｐｌｅａ＋ｅｎｔｌ　９７４）に
リストされているもの、を使用することができる。

本発明の装置は、閾値を持つ色が出た（又は出ない）場
合にはしばしば使い捨てになるものであるが、第一還元
剤の単一又は複数の濃度を有する支持部材から成ってい
る。以下で幾つかの選好された実施例が述べられるのだ
が、支持部材は特定の構築材料が必要であるという意味
で重要なものではない。一般に、反応剤及びシステムの
他の構成要素を支持し得て、若し必要なら試験すべき溶
液に露出される物なら何であってもよい。支持部材の特
定の例は、ウェブ、杖、条片、スプリンタ、シート、棒
及び似たような形のガラス、金属、木材、紙、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリアルキレン・アセテート、
ポリカーボネート、弗化水素高分子などの高分子及び同
様の材料、織物等である。好ましい材料は、その上に特
別な反応剤を含んだゼラチン膜を何層も積重ねることが
できるような微孔性テトラフルオロポリエチレン又は微
孔性テフロン等の吸水性材料である。その他の吸水性材
料は濾紙及び吸取紙である。本発明の物理的方式は既に
前述した。

本発明の分析システムの反応構成要素は支持部材の上に
置くようにゲル状に調製するのが望ましい。−旦支持部
材上に置かれたら、溶液中の反応組成物は組成物が支持
部材に付着するように乾燥される。一般に、反応組成物
の支持部材への接着は支持部材が吸水性であれば都合よ
く達成される。

従来使用されている不活性フィルタ、バインダ、表面活
性剤等を必要に応じて試薬組成物中に組込んでもよい。

ある種のバインダ例えば樹脂ゴムは反応組成物中に有利
に組込んで、それらが非孔性の支持部材例えば金属、ガ
ラス又は非孔性高分子材料に接着されるのを支援する。

製品の美観及び正確さのために、本発明の装置の各指示
薬ゾーンにおける色変化は明瞭、鮮明、間違いなく且つ
十分はっきりしたものでなければならない。

本装置は、米国特許節４，０５９，４０７号に開示され
ている如くに、例えば毛細管等の中に試験すべき生物学
的溶液に潰しておくのがよい。本装置を温度計式に機能
させたい場合は、装置の数個の場所又は領域を持たせる
とよい。又、本装置は前記の第４，０５９，４０７号に
開示されたように構築する。更に本発明の適切な物理的
実施例を示している同特許の図面をも参照されたい。

以下の実施例は単に本発明の説明のために発明者等が現
時点で最善のモードと考えているものに過ぎない。実施
例は本発明を限定するものと考えるべきではない。この
技術に熟練している者は格別の実験を行うことなく種々
の代用及び変形を行い均等な手段によって実質的に同様
な方法で実験を行い、本発明の教示及び精神から逸脱す
ることなしに実質的に同様の結果を得ることができる。

以下においては特に明記しない限り数字はすべて重量部
についてのものである。

実施例１ 血液の完全型及び直接型ビリルビンを ｎ１定する使い捨て装置 毛細管装置の底部を形成することになるプラスチックシ
ート上に多層ゼラチンフィルムをセットする。このゼラ
チン膜の一つの層は、 ビリルビンオキシダーゼ　１００ＩＵ／ｍｆＩ。

ペルオキシダーゼ　　　　２０１Ｕ／ｍ、ｌ）。

硫酸マンガン（ＩＩ）　　　　２ｍＭ。

トリス−クロリド緩衝液　（ｐＨ８，２）１００ｍＭ。

ＡＢＴＳ　　　　　　　　　　１ｍＭ を含有している。

また、このシステムのもう一つの層はフェロシアニドを
含有し、その水平直線勾配は一端がｌＸｌ０−７モルで
、他端が２×１０°６モルである。この装置のさらに別
な層は液状験体の毛細管への拡散を補助するポリマー分
子及びデタージエントを含有している。また、さらに別
な層を適宜膨潤層として加え、ゲルを膨潤化して、水和
後毛細管全体を充填することができる。デタージェント
の種類及びその位置を変えると、完全型ビリルビンから
直接型どりルピンを区別することができる。このシステ
ムのさらに別な成分は有機アニオンであればよく、これ
はビリルビンをそのアルブミン結合位置から変位させる
ものである。次に、この底部層を上部層に音波溶接して
、１０μｇの溶液を含むことになる完全に平坦な毛細管
を形成する。

また、この上部層は赤血球が毛細管測定域に流れ込むの
を防止する膜によって覆った吸収性材料からなり、かつ
血清験体によって変位された時に、空気を毛細管から逃
がす空気の逃げ孔を備えた験体受けを有している。

上部層の最上部は、下部層のフェロシアニドの直線勾配
に正確に一致する直線状目盛りを備えている。説明した
この装置は、０．３〜５　ｍ　ｇ　／　ｄｇのビリルビ
ンを着色カラムとして測定するものである。カラムの長
さが長くなる程、ビリルビンの濃度が高くなる。

この装置において、ビリルビンオキシダーゼの代わりに
、使用量を調節して−５業者には自明なはずであるー、
グルコースオキシダーゼ、アスコルベートオキシダーゼ
又はピルベートオキシダーゼを使用すると、それぞれグ
ルコース、アスコルベート及びピルベートの濃度を測定
することができる。

実施例２ 血液コレステロールの測定用使い捨て装置ビリルビンオ
キシダーゼの代わりにコレステロールオキシダーゼを使
用する以外は、上記のビリルビン装置と同様にして、血
液コレステロール測定装置を構成する。全コレステロー
ルを測定する場合には、このシステムにコレステロール
エステラーゼを追加する。フェロシアニドの直線勾配は
下端でｌＸｌ０−５モルに、そして上端で４×１０°４
モルに変更する。説明したこの装置は１〜２０ｍＭのコ
レステロールを測定するものである。

このコレステロール濃度は溶存酸素の濃度よりも高く、
従って、装置の底部に直接流延する代わりに、微孔質ナ
イロン膜などの酸素透過膜に多層ゲルフィルムを流延す
る。装置のプラスチック底部は測定域において多数の孔
を有しているので、空気中の酸素が自由に微孔質膜を通
過できる。

この装置において、コレステロールオキシダーゼの代わ
りに、使用量を調節して−５業者には自明なはずである
一、アシルーＣｏＡオキシダーゼ、ガラクトースオキシ
ダーゼ又はコリンオキシダーゼ使用すると、各基質の濃
度を測定することができる。

実施例３ 唾液中のアルコール測定用使い捨て装置シリカ粒子を含
むポリ塩化ビニルシートを正確な、再現できる厚さに形
成する。このシートを次に２２ｍＭの重亜硫酸塩、２０
０ｍＭのトリス（ｐＨ９，５）　、２ｍＭのＡＢＴＳ、
０．０２ｍＭ（７）塩化第一鉄、２００ＩＵ／ｍ＃のア
ルコールオキシダーゼ、及び酵素安定化用成分を含む溶
液に浸漬してから、減圧で高温空気の流れ中で乾燥する
。このシートを小さな部分−ただし、寸法には制限はな
い−に切断し、プラスチック支持体に締め付ける。この
シートが唾液溶液に触れると、毛細管作用によ°って験
体がポリ塩化ビニル材料に運び込まれる。０．１％以上
のアルコールを含有する験体に触れると、このシートは
青緑色に変色するが、濃度が０．１％未満の溶液に触れ
た場合には、淡茶色／灰色のままである。このように、
この装置は、アルコールの法定基準を測定するさいに非
常に有用なアナログ／デジタル変換式比色計である。

この装置において、アルコールオキシダーゼの代わりに
、使用量を調節して一当業者には自明なはずであるー、
オキサレートオキシダーゼ、ラクトペリオキシダーゼ又
はグルタチオンペルオキシダーゼを使用すると、各基質
の濃度を測定することができる。

実施例４ 血清ラクテートの測定用使い捨て装置 微孔質膜に多層ゼラチンフィルムを流延するが、このフ
ィルムのひとつの層は１００ＩＵ／ｍｊ７のラクテート
オキシダーゼ、０．５ｍＭのフェロセン、１ｍＭのオル
ト−ジアンシジン及び１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ
８，０）を含有している。

フィルムの別な層は０．１インチ幅の部分を含み、各部
分のアスコルビン酸濃度は５Ｘ１０”モルからｌＸｌ０
−３モルに漸増している。このフィルムを長さ１インチ
、幅２ｍｍの部分に切断する。フィルム部分を（前記の
ように）プラスチック毛細管に組み込み、毛細管の最終
容積を５０μｇにする。血清を毛細管に導入すると、５
Ｘ１０”モルを含む部分における１ｍＭの乳酸とｌＸｌ
０−３モルを含む部分における２０ｍＭの乳酸との間に
変色が生じる。

この装置において、ラフチートルオキシダーゼの代わり
に、使用量を調節して一当業者には自明なはずであるー
、グリセロールホスフェートオキシダーゼ、グリコラー
トオキシダーゼ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈペルオキシダーゼを
使用すると、各基質の濃度を測定することができる。

実施例５ 比色定量測定装置の大量生産方法 一般に微孔質テフロンとして知られている微孔質テトラ
フルオロエチルン（ＴＦＰＥ）の、幅が１．５インチの
ロールをＤｕＰｏｎｔ　　ＣｈｅｍｉｃａｌｓやＧｏｒ
ｅ、Ｉｎｃなどの会社から購入する。このロールをコー
ターにセットする。微孔質材料をまづコロナ放電ステー
ション（ステーションＡ）に送る。このステーションで
は、電気コロナ放電装置、例えば（イリノイ州、シャラ
ムバーブのＴａｍｐｏ　　Ｐｒ１ｎｔが販売している）
ＴａｕｔｅＣコロナ発生器で、通常は疎水性である微孔
質材料の表面を一時的に変成して、これを親水性にする
。コーティングステーション（ステーションＢ）では、
ゲル層を連続的にウェブに被覆する。第１層は酵素、例
示のみを目的として挙げるのだが、１〜１００ＩＵ／ｍ
ｆＩのコレステロールオキシダーゼ、０．１〜１００１
Ｕ／ｍ＃のコレステロールエステラーゼ及び１０〜１，
００ＱＩＵ／ｆｎｊ！のペルオキシダーゼだけでなく、
所要の緩衝塩及びデタージェントを含有している。

緩衝塩は、理想的には、第一級アミンを含有するように
選択すべきである。第２層は非緩衝ゲル層で、これは酵
素を他の層から分離する作用を示す。

第３層はフェロシアニドを含む。理想的には、この層は
微孔質材料の異なる領域において所定の、あるいは既知
の、又は異なる濃度のフェロシアニドを含有しているべ
きである。例えば、ウェブの幅間で直線状に又は非直線
状にフェロシアニド濃度を高くすべきである。第４層は
別な薄い分離層であり、そして第５層は吸上層であり、
表面全体に材料を急速に拡散させる層である。一般に、
この層は微結晶性セルロースなどのセルロースとデター
ジェントとの混合物からなる。適宜、例えばゲルなどの
バインダーをこの吸上層に配合する。

この吸上層は、事実上、水性験体の拡散を補助するため
に下層のゲル層に予め流延した非常に薄い紙片である。

ステーションＢのコーターは、低温の乾燥空気を導入す
ることによって４０℃に冷却したエアチャンバに封入す
るのが有利である。この冷却により、ゲル層が形成した
ままの状態でゲル化するので、異なる層の各成分の混合
を防ぐことができる。

被覆された微孔質材料を次に乾燥ステーション（ステー
ションＣ）に送り、ここで４０℃に加熱された乾燥空気
スチームに暴すことによってゲルを乾燥する。乾燥した
被覆材料を次に巻取ロールに巻取り、次の処理に備える
。

装置の組立ては次の通りである。

被覆微孔質材料を巻取りロールからスライシングステー
ションに送り、ここで幅が１／８インチのストリップに
切断する。縁部を薄い（０，１ｍｇ）の接着層で被覆し
であるポリスチレンボックスの縁部にこれらストリップ
を締め付ける。微孔質材料の被覆側を外側に向けた状態
で、被覆材料がボックスの一つの開放端部を覆っている
、中空のポリスチレンボックスを次にトップピースで覆
う。このトップピースを次に音波溶接機を使用すること
によってポリスチレンボックスに溶接し、装置を完成さ
せ、次に包装する。

親出願の明細書に記載したように、本発明はまた任意の
酵素混合物と共に使用して、この混合物又は一連の酵素
の生成物の一つになる生物学的分子を測定することがで
きる。

上述したように、通常、本発明のシステムは、公知の通
り、酵素に対して相溶性を示す各種の緩衝液、（生成す
る染料についての酵素用）安定化剤及び所望ならば、湿
潤剤を含むものである。例示すれば、ＢＡＳ、ポリアル
コール類、軽度な還元剤、非イオン湿潤剤がある。一般
に、ｐＨ範囲は約４〜約１１である（使用する各種酵素
に応じて最適化する）。各種のオキシダーゼについて適
切なｐＨ範囲が知られている。従って、当業者ならば、
（ろ紙ストリップ、試験管、又は他の液体か固体媒体の
場合）最適ｐＨで、あるいは最適なｐＨ範囲内で、また
は最適なｐＨ値に近い値で酵素が活性である環境を調節
できるはずである。なお、前記の多層装置の場合、すべ
ての層を同じｐＨで保存する（または存在させる）必要
がなく、これは各成分の保存可使時間からみて非常に有
利である。

特定のオキシゲナーゼをその特定の基質に作用させるこ
とによって過酸化水素を発生する場合、酸化された特定
基質と反応し、これを捕捉、固定化などする緩衝分子に
配合するのが有利である。

これら化合物は一般に、ｐＨ制御に使用することもでき
るトリスやグリシンなどのアミン含有化合物である。こ
の捕捉機能に特に有用な化合物はα−効果アミンとして
知られているクラスの化合物である。α−効果アミンは
、不対電子がアミン官能基に隣接している原子をもつア
ミン含有化合物である。本発明システムに有利に配合で
きるα−効果アミンを例示すれば、ヒドラジン、Ｎ−置
換ヒドラジン類、ヒドロキシアミンや〇−置換ヒドロキ
シアミン類があり、特に沸点が高く、また蒸気圧が低い
ため乾燥安定性である〇−置換ヒドロキシアミン類が挙
げられる。このクラスの特に好適な化合物はカルボキシ
メトキシアミンである。

本発明を実施するさいには、乾燥状態における基本的成
分の保存、水溶液の存在下における再水和や発色の制御
を許すゲル又はフィルムを形成する化学物質も有用であ
る。このような物質については、米国特許第４．５５６
．６３４号公報の第４欄を参照されたい。なお、この公
報の記載は参考として一部本明細書に利用しである。

本発明の目的から、“閾値”とは、過酸化水素の濃度を
示す変色状態を意味する。すなわち、過酸化水素の濃度
が閾値未満の場合には、色は存在しない。また、過酸化
水素の濃度が閾値以上の場合には、クリアかつシャープ
で、見間違うことのない程好ましい強い色が発色する。

還元された色素原が無色の場合には、逆になる。

先行例には、本発明の実施にそのままの形で、あるいは
変形して使用することのできる、使い捨て形式のものが
多い、装置が記載されている。しかし、本発明のシステ
ムにおける試薬及び反応（反応順序）は新規であり、自
明なものではない。

このような装置は米国特許第４，０５９，４０７号公報
、この公報に記載されている米国特許公報、同第３，９
６４，８７１号公報及び同第３．９９２．１５８号公報
で言及さている。また、本発明に関係する最近の特許公
報には、本発明に特に有用な装置が記載されている。こ
れら特許公報には、分析された分子の存在下で変色する
多層分析要素が記載されている。これら特許公報に開示
されている技術によれば、アナログ式で濃度を入力する
と、アナログ式の色信号が発生する。本発明の知識を参
考にし、かつこれを使用して、上記の装置及び分析要素
を改変すると、デジタル式の色信号を発生させることが
できる。また、米国特許節３゜４８５．５８７号及び同
第３，１６４．５３４号公報には、本発明の技術を使用
して改変した場合に、デジタル式の“オン・オフ”信号
を記録できるように改良できる装置が記載されている。

さらに、（親出願の明細書に列記した特許公報に加えて
）この明細書を作成するさいに参照した別な特許文献は
ＰＣＴＷＯ８５１０１７４７（発明の名称二流体の迅速
定量分析装置、Ｉｎｏｍｅｄｌｘ社のＨｏｆ等に発行）
である。

なお、本発明により過酸化水素によって継続消費される
（相互に不活性な）２種以上の反応体を使用することも
本発明の範囲内である。同様に、２種以上の色素原も使
用することができる。また同様に、反応性レヴエルが相
互に異なっていてもよい２種以上の有機化合物を測定す
るために（その各酵素系と共に）本発明システムを使用
できる。

また、反応体を反応が生じる多数の反応域に送り、変色
させる装置に本発明の方法を連続使用することも本発明
の範囲内にある。

このような装置は、有機化合物の有無や混入をモニター
するなどの工業的用途において特に重要になる可能性が
ある。

また、過酸化水素を発生する結果になる任意の酵素又は
酵素の組み合わせを決定するさいに本発明を使用するこ
とも本発明の範囲内にある。オキシダーゼ酵素の量は、
酵素基質、所要緩衝塩、本発明の成分及び未知量のオキ
シダーゼ酵素を含むシステムにおいて変色が生じる速度
によって決定できる。発生する過酸化水素１分子につき
染料が１分子づつ発生する従来混合物によって発色する
場合とは逆に、混合物における発色量が減少することは
、色が直線状の可視範囲にある場合、時間的に非常に有
利な結果になる。

以上いくつかの特定な実施態様について本発明の詳細な
説明してきたが、勿論、特許請求の範囲に記載した本発
明の精神及び範囲内で変更、改変その他が可能である。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）過酸化水素濃度が閾値以上の時に色信号を発生し
   、そして過酸化水素濃度が閾値未満の時に色信号を発生
   しないことによって過酸化水素濃度を測定する比色測定
   システムにおいて、 過酸化水素を還元でき、そして可視範囲内で変色して、
   異なる色の酸化された色素原を発生できる色素原、及び
   該色素原よりも還元能力が大きい、空気安定性を有する
   過酸化水素の第１還元剤からなり、過酸化水素が存在す
   る時には発色する閾値で、一方過酸化水素が存在しない
   時には発色しない閾値で、前記第１還元剤の量が実質的
   になくなるまで、第１還元剤が酸化された色素原の蓄積
   及びそれによる可視変色を防止する上記測定システム。
2. （２）第１還元剤が過酸化水素及び／又は色素原を還元
   できる請求項第１項に記載の測定システム。
3. （３）第１還元剤が酸化された色素原を還元し、これに
   よって該色素原を再生できる請求項第２項に記載の測定
   システム。
4. （４）第１還元剤か又は酸化された色素原のいずれかに
   よる過酸化水素の還元を触媒及び選択的に該触媒の活動
   を強める金属塩によって促進する請求項第１項に記載の
   測定システム。
5. （５）過酸化水素又は酸化された色素原の還元を促進す
   る触媒が、システムの他の成分と反応又は相互作用せず
   、従って過酸化水素がない場合に、目に見える程度の可
   視色を発色する請求項第４項に記載の測定システム。
6. （６）過酸化水素又は酸化された色素原の還元を促進す
   る触媒をペルオキシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキ
   シダーゼからなる群から選択する請求項第５項に記載の
   測定システム。
7. （７）過酸化水素又は酸化された色素原の還元を促進す
   る触媒が第１鉄イオンの水溶性誘導体である請求項第５
   項に記載の測定システム。
8. （８）第１還元剤が重硫酸塩若しくはフェロシアニドの
   水溶性アルカリ金属塩であって、それらがナトリウム塩
   又はカリウム塩である請求項第１項に記載の測定システ
   ム。
9. （９）前記第１還元剤がＮＡＤ（Ｐ）Ｈで、前記触媒が
   ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから電子を受容できるものであって、該
   触媒はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はジアホラーゼから選択され、
   それは有機多環式化合物である請求項第５項に記載の測
   定システム。
10. （１０）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから電子を受容する該有機多環
    式化合物触媒を、メルドラブルー、フェナジンメトスル
    フェート、Ｎ−メチル−フェナジンメトスルフェート、
    メチレンブルー、あるいはメチル、クロロ、ブロモ、ア
    ミノ、ヒドロキシ、ニトロ、メトキシ又は硫酸からなる
    群から選択した基で置換したアントラキノン類からなる
    群から選択する請求項第９項に記載の測定システム。
11. （１１）該触媒の触媒活性を強める該金属塩が硫酸マン
    ガン若しくは、白金又はパラジウムの水溶性塩からなる
    群から選択する請求項第５項に記載の測定システム。
12. （１２）該色素原をアジノビス（３−エチルベンズ−チ
    アゾリンスルホン酸）（ＡＢＴＳ）、オルト−ジアンシ
    ジン、４−アミノアンチピリン又は４−アミノアンチピ
    リン＋フェノールからなる群から選択する請求項第１項
    に記載の測定システム。
13. （１３）可視発色が生じて、該還元剤がなくなり、かつ
    過酸化水素の閾濃度を示す時に、過酸化水素１当量につ
    き１当量未満の酸化された色素原を発生する請求項第１
    項に記載の測定システム。
14. （１４）濃度を測定すべき特定な有機基質に相当するオ
    キシダーゼ及び又は該オキシダーゼに相当する、濃度を
    測定すべき有機基質からなる請求項第１項に記載の測定
    システム。
15. （１５）該有機基質と、この有機基質に相当するオキシ
    ダーゼとの反応によって過酸化水素が発生する請求項第
    １４項に記載の測定システム。
16. （１６）該有機基質をコレステロール、グルコース、乳
    酸、ビリルビン又は反応して、その場で該基質及び該有
    機基質に相当するオキシダーゼを発生する化合物からな
    る群から選択する請求項第２１５項に記載の測定システ
    ム。
17. （１７）第１還元剤を予め選択する異なる濃度で存在さ
    せる共に、各濃度を測定すべき過酸化の濃度に対応させ
    、そしてこれら異なる第１還元剤濃度うち、一部をなく
    し、一部を残すようにして、発色を示すと共に、過酸化
    水素の閾濃度を示すようにした請求項第１項に記載の測
    定システム。
18. （１８）第１還元剤がフェロシアニドの水溶性アルカリ
    金属塩で、該色素原がＡＢＴＳである請求項第１７項に
    記載の測定システム。
19. （１９）過酸化水素濃度が閾値以上の時に色信号を発生
    し、そして過酸化水素濃度が閾値未満の時に色信号を発
    生しないことによって過酸化水素濃度を測定する診断用
    比色装置において、 過酸化水素を還元でき、かつ可視範囲内にある変色を起
    こして、異なる色の酸化された色素原を発生できる色素
    原、該色素原よりも還元能力が大きい、空気安定性を示
    す、過酸化水素の第１還元剤、及び第１還元剤から電子
    を過酸化水素又は上記の酸化された色素原に移動できる
    電子キャリヤー触媒を支持する物理的支持手段からなる
    上記装置。
20. （２０）過酸化水素濃度が閾値以上の時に色信号を発生
    し、そして過酸化水素濃度が閾値未満の時に色信号を発
    生しないことによって濃度を測定すべき有機基質が発生
    する過酸化水素の濃度を測定する分析用比色デジタル方
    法において、 過酸化水素を還元でき、そして可使範囲内で変色して、
    異なる色の酸化された色素原を発生できる色素原、該色
    素原よりも還元能力が大きい、空気安定性を示す、過酸
    化水素の第１還元剤であって、過酸化水素が存在する時
    には発色する閾値で、そして過酸化水素が存在しない時
    には発色しない閾値で第１還元剤の量が実質的になくな
    るまで、第１還元剤が酸化された色素原の蓄積、従って
    可視変色を防止する第１還元剤、第１還元剤から電子を
    該過酸化水素又は上記の色素原に移動できる電子キャリ
    ヤー触媒及び濃度を測定すべき基質に対する特定なオキ
    シダーゼからなる混合物に濃度を測定すべき基質を配合
    し、該基質と対応するオキシダーゼとを反応させ、これ
    によって過酸化水素を発生すると共に、可視色が発色す
    る点で第１還元剤がなくなり、基質の濃度を示すまで、
    反応を進行させることからなる上記方法。