JPH01207135A - 自己抗体産生ｂ細胞用吸着剤および自己抗体産生ｂ細胞の吸着除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、体液より自己抗体産生Ｂ細胞を吸着除去する
吸着剤および該吸着剤を用いて自己抗体産生Ｂ細胞を吸
着除去する方法に関する。

［従来の技術・発明が解決しようとする課８］生体は外
部から侵入してくる異物を防御するための免疫を備えて
いる。

免疫には自然免疫と獲得免疫とがあり、獲得免疫を担っ
ているのがリンパ球である。

リンパ球中のＴ細胞は直接抗原に取りついたり、他の細
胞を活性化することにより、またリンパ球中のＢ細胞は
抗体と呼ばれるタンパク質を血液中や体液中に分泌する
ことにより、生体の防御を行なっている。

しかし、外部からの異物でなく、自己の細胞や組織のも
つ抗原に対して免疫の応答がおこり、自己に対する抗体
（以下、自己抗体という）が生成したり、抗原抗体反応
によって作られる複合体（以下、免疫複合体という）な
どが大量に生じる自己免疫疾患と呼ばれる免疫異常がお
こることがある。

自己免疫疾患およびその疾患における自己抗体の代表例
としては、それぞれ全身性エリテマトーデス（以下、Ｓ
ＬＥという）における抗二本鎖ＤＮＡ抗体、抗−本鎖Ｄ
ＮＡ抗体、抗Ｓｓ抗体；慢性関節リウマチ（以下、ＲＡ
という）におけるリウマチ因子、抗−本鎖ＤＮＡ抗体；
シエーグレン症候群（以下、ＳｊＳという）における抗
８９−Ａ抗体、抗５Ｓ−Ｂ抗体、抗ミトコンドリア抗体
：全身性強皮症（以下、ＰＳＳという）における抗５ｃ
１７０抗体、抗−本鎖ＤＮＡ抗体；混合型結合繊病（以
下、ＭＣＴＤという）における抗ＲＮＰ抗体などがあげ
られる。

これら自己免疫疾患の治療法について古くから研究され
ており、病因物質と考えられる自己抗体および自己抗体
から生成する免疫複合体を除去する方法が研究されてき
ている。すなわち、血漿交換法、自己抗体の吸着除去法
などの方法である。

しかし、リンパ球中の自己抗体産生Ｂ細胞が産生じた自
己抗体を除去することを目的としたこれら従来の治療方
法では、自己抗体の産生が抑制されたり終結するわけで
はなく、治療後も病因物質である自己抗体は産生される
ので充分有効な治療方法とはいえない。

前記方法の問題点を解決する治療法として、リンパ球や
リンパ球中のＢ細胞を分離する方法についても検討され
ているが、これらの方法ではリンパ球やリンパ球中のＢ
細胞全体が分離されてしまうという問題がある。

［課題を解決するための手段］ かかる現状に鑑み、本発明者らは病因物質の産生を抑制
する方法として、患者体液より病因物質の産生に関与す
る自己抗体産生Ｂ細胞を選択的に吸着除去する方法を開
発すべく鋭意検討を重ねた結果、アニオン性官能基を有
する固体物質を患者体液と接触させると、リンパ球中の
Ｂ細胞の中の自己抗体産生Ｂ細胞をとくに強く吸着する
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、アニオン性官能基を有する固体物質
からなる自己抗体産生Ｂ細胞用吸着剤および該吸着剤を
リンパ球を含む体液と接触させることを特徴とする自己
抗体産生Ｂ細胞の吸着除去方法に関する。

［実施例］ 本明細書における体液とは、生体由来の液性成分のこと
であり、その具体例としては、たとえば血液、血漿、血
清、腹水、リンパ液、関節内液およびこれらからえられ
た分画成分などがあげられる。

また本明細書における自己抗体産生Ｂ細胞とは、Ｂ細胞
表面免疫グロブリンのイデオタイブが自己抗体のそれと
同じであるＢ細胞、その前駆細胞および自己抗体を産生
ずる形質細胞を意味する。

本発明における固体物質とは、常温常圧で固体であり水
不溶性であることを意味し、該固体物質の表面には、た
とえば非特異吸着を抑制する血球損傷をふせぐなどの作
用をするタン白質、多糖、水溶性高分子などの水溶性物
質が存在していてもよい。

前記固体物質は、アニオン性官能基を有する固体物質で
あるかぎり、その形状、粒径、表面状態、材料などには
とくに限定はなく、使用方法などに応じて適宜形状、粒
径などを選択して使用すればよい。

前記固体物質の形状としては、たとえば粒状、板状、膜
状、繊維状などが具体例としてあげられる。

また前記固体物質の粒径にはとくに限定はないが、固体
物質をカラムに充填して使用するばあいには、体液に含
まれる細胞が充分に通過しうる間隙が形成されるもので
あるのが好ましい。

たとえば固体物質が粒状であるばあい、微粉末のような
ものは好ましくなく　、２００　刷程度以上の平均粒径
であることが好ましく、さらには粒子の大きさが小さす
ぎるものと大きすぎるものとを除去したものの使用が好
ましく、平均粒径２００〜１０００−で、かつ粒径分布
が狭いものが好ましい。固体物質が繊維状で、かつ中空
のもののばあい、内径が５泊以上のものが好ましく、中
がつまった繊維状のばあいには径が１加以上であるのが
好ましい。

さらに前記固体物質の表面状態にもとくに限定はないが
、表面が粗であると非特異吸着が増加し、選択性が低下
しや□すくなる傾向が生ずるなどするため滑らかなほう
が好ましい。

さらに前記固体物質の材料としては、たとえば架橋ポリ
ビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリア
クリルアミドなどの合成高分子や結晶性セルロース、架
橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなど
の多糖類からなる有機担体さらにはこれらの組合わせに
よってえられる有機−有機複合担体、ガラス、シリカゲ
ルなどの無機担体などのものがあげられるが、これらの
ものに限定されるものではない。

本発明におけるアニオン性官能基とは、ｐＨが中性付近
で負に帯電するような官能基を含んでいる基のことであ
り、このような性質を有する基であるかぎりいかなるも
のでもよい。

このような官能基の代表例としては、たとえばカルボキ
シル基、スルホン酸基、硫酸エステル基、シラノール基
、リン酸エステル基、フェノール性水酸基などがあげら
れるが、これらに限定されるものではない。

本発明におけるアニオン性官能基は、−官能基あたり１
つのアニオン性基を有するモノアニオン性官能基であっ
てもよく、また複数のアニオン性基を有するポリアニオ
ン性官能基であってもよい。ポリアニオン性官能基は自
己抗体産生Ｂ細胞に対する親和性が大きく、また単位量
の固体物質に多くのアニオン性基を導入しやすいなどの
点から好ましい。なかでも分子量が１０００以上のポリ
アニオン性官能基は自己抗体産生Ｂ細胞に対する親和性
、多くのアニオン性基を導入できるなどの点からより好
ましい。ポリアニオン性官能基が有するアニオン性基は
１種であってもよく、２種以上であってもよい。

また、本発明におけるアニオン性官能基は上記モノアニ
オン性官能基やポリアニオン性官能基の１種のみからな
っていてもよく、２種以上からなっていてもよい。

前記アニオン性官能基は固体物質の表面積１−当りｌＸ
１０２〜ｌＸｌ０ＩＯμｌ１ｏｌ含有されていることが
好ましく、とりわけ固体物質の表面積ニー当りＩ　ＸＩ
Ｏ’　〜Ｉ　ＸＩＧ’　、ｃｚｓｏｌ含有されているこ
とが好ましい。前記含有量が少なすぎるとアニオン性官
能基の効果が充分でなくなり、多すぎると非特異吸着や
細胞障害が起りやすくなる傾向が生ずる。

本発明の吸着剤は前記アニオン性官能基を有する前記固
体物質からなる。

固体物質がアニオン性官能基を有するとは、固体物質自
体がアニオン性官能基を有する材料から構成されたもの
であってもよく、アニオン性官能基を有さない材料から
構成された固体物質にアニオン性官能基を有する化合物
を導入してアニオン性官能基を導入したものであっても
よい。

前記アニオン性官能基、好ましくはポリアニオン性官能
基を固体物質に導入するための化合物の代表例としては
、たとえばポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリビニ
ルスルホン酸、ポリビニルリン酸、ポリスチレンスルホ
ン酸、ポリスチレンリン酸、ポリグルタミン酸、ポリア
スパラギン酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、スチレ
ン−マレイン酸共重合体などの合成ポリアニオン化合物
、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン、コン
ドロイチン硫酸、ホスホマンナンなどのアニオン性基を
有する多糖類などがあげられるが、これらに限定される
わけではない。

つぎに本発明の吸着剤の製法について説明する。

本発明の吸着剤の製法の１つとして、前記のようにアニ
オン性官能基を有さない固体物質にアニオン性官能基を
導入する方法がある。アニオン性官能基を固体物質に導
入する方法には種々の方法があり、いかなる方法で導入
してもよいが、代表的な導入方法としては、下記の方法
があげられる。

（１）アニオン性官能基あるいは容易にアニオン性官能
基に変換しつる官能基を有する化合物を七ツマ−あるい
は架橋剤として用いる重合によって吸着剤を形成する方
法、 （′２Ｊアニオン性官能基を有する化合物を固体物質に
固定させる方法、 （３）アニオン性官能基を有する化合物と固体物質を直
接反応させることによって、固体物質にアニオン性官能
基を有する化合物を固定させる方法 などがあげられる。

（１）の方法において用いるアニオン性官能基あるいは
容易にアニオン性官能基に変換しうるモノマーあるいは
架橋剤の代表例としては、アクリル酸およびそのエステ
ル、メタクリル酸およびそのエステル、スチレンスルホ
ン酸などがあげられるが、これらに限定されるわけでは
ない。

（２）の方法、すなわちアニオン性官能基を有する化合
物を固体物質に固定させる方法としては、物理的吸着に
よる方法、イオン結合による方法、共存結合により固定
化する方法などがあり、いかなる方法を用いてもよいが
、吸着剤の保存性ならびに安定性のためにはアニオン性
官能基を有する化合物が脱離しないことが重要であるの
で、強固な固定が可能な共有結合法が望ましい。

共有結合によりアニオン性官能基を有する化合物を固定
化するばあい、アニオン性官能基を有する化合物がアニ
オン性官能基以外に固定化に利用できる官能基を有する
多官能性化合物であることが好ましい。

固定化に利用できる官能基の代表例としては、アミノ基
、アミド基、カルボキシル基、酸無水物基、スクシニル
イミド基、水酸基、チオール基、アルデヒド基、ハロゲ
ン基、エポキシ基、シラノール基などがあげられるが、
これらに限定されるわけではない。

たとえば、硫酸エステル基を有する化合物を固体物質に
共有結合で固定化するばあい、硫酸エステル基を有する
化合物の代表例としてアルコール、糖類、グリコールな
どの水酸基を有する化合物の硫酸エステル化物があげら
れるが、これらのなかでも多価アルコールの部分硫酸エ
ステル化物、とりわけ多糖類の硫酸エステル化物が硫酸
エステル基、固定化に必要な官能基の双方を含んでいる
うえに容易に固体物質に固定化できるため、とくに好ま
しい。

つぎに（３）の方法、すなわちアニオン性官能基を有す
る化合物と固体物質とを反応させることによって固体物
質にアニオン性官能基を有する化合物を固定化してアニ
オン性官能基を導入する方法の代表例として、水酸基を
有する固体物質に硫酸エステル基を導入する方法があげ
られる。このばあい、水酸基を有する固体物質とクロル
スルホン酸、濃硫酸などとを反応させることによって直
接硫酸エステル基を導入することができる。

本発明の吸着剤を用いて体液から自己抗体産生Ｂ細胞を
吸着除去する方法には種々の方法がある。代表的な例と
しては、体液を取り出してバッグなどに貯留し、これに
吸着剤を混合して自己抗体産生Ｂ細胞を吸着除去したの
ち、吸着剤を濾別して自己抗体産生Ｂ細胞の除去された
体液をうる方法、体液の入口と出口とを有し、出口に体
液は通過するが吸着剤は通過しないフィルターを装着し
た容器に吸着剤を充填し、これに体液を流す方法などが
ある。いずれの方法を用いてもよいが、後者の方法は操
作も簡単であり、また体外循環回路に組み込むことによ
り患者の体液、とくに血液から効率よくオンラインで自
己抗体産生Ｂ細胞を除去することが可能である。本発明
の吸着剤はこの方法に適している。

本発明は自己免疫疾患患者の体液より自己抗体産生Ｂ細
胞を吸着除去するための吸着剤およびその吸着剤を用い
た吸着除去方法に関するものであるが、自己抗体産生Ｂ
細胞の中でもとくにＳＬＨの病因物質である抗ＤＮＡ抗
体産生Ｂ細胞に対する効果が著しい。

以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本
発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ 吸着剤の作製 ガラスピーズ（粒径２１０〜２９７加、■東芝マロティ
ー二製）約７００ｇに約０．１Ｎ硝酸水溶液５００　ｍ
ｌを加え、水浴中、７０〜８０℃で３時間加熱したのち
水約２ｇで洗浄し、ン炉液が中性であることを確認した
。ついでメタノール約３００ｍ１で洗浄し、乾燥させた
。えられた洗浄済ガラスピーズ２００ｇにトルエン８０
ｇ１アミノ化シランカツプリング剤（鱒日本ユニカー製
のＡ−１１００）　４０ｇを加え、９０℃で３．５時間
反応させたのちトルエン約１５０ｍ１．ついでメタノー
ル２００　ｍｌで洗浄し、風乾させた。

一方、デキストラン硫酸３．０ｇを水２０　ｍｌに溶解
させ、水酸化ナトリウム０．４８　ｇおよび水素化ホウ
素ナトリウム９０ｍｇを加えた溶液を調製した。この溶
液に先に作製したアミノ化ガラスピーズ２５ｇを加え、
室温で２時間反応させたのち、水およびメタノールで洗
浄し、乾燥させて吸着剤を作製した。

リンパ球浮遊液の調製 フィコールバックの上層にヘパリン化ＳＬＥ患者抹梢血
を重層し、比重遠心法によりリンパ球を分離し１．ハン
クス緩衝液で充分に洗浄したリンパ球分画をＩ　Ｘ　１
０７〜５　Ｘ　１０’　／　ｍｌの濃度になるように０
．１％牛血清アルブミンを含むｐＨ７，２０１１ＥＰＥ
Ｓ−ＨＢＳＳ緩衝液で調整した。

吸着操作 吸着剤１．００　ｇをポリ塩化ビニールチューブ（φ３
ｔＤ　Ｘ８５ｍｍ）に生理食塩液（日本薬局方、大塚製
薬■製）を用いて充填し、両端をメツシュ（血小板粘着
能測定管、医学書院器械■）で押さえた吸着体を作製し
た。この吸着体に細胞浮遊液を通液する前に、細胞浮遊
液と同じ緩衝液を用いてリンスを行なった。そののち、
細胞浮遊液の通液を流速０．４ｍｌ／ｓｉｎ　ｓ　２５
℃で行なった。

分析方法 リンパ球の吸着率はカラムに通液していない細胞浮遊液
および流出液の一部をサンプリングし、コールタ−カウ
ンターで濃度を測定して求めた。

Ｂ細胞の吸着率は、カラムに通液していない細胞浮遊液
および流出液の一部をＰＩＴＣ標識抗標識抗ヒト１休ｓ
抗応させてＢ細胞を蛍光発色させ、顕微鏡下にカウント
し、リンパ球に対するＢ細胞の比およびリンパ球の濃度
から求めた。

抗ＤＮＡ抗体産生Ｂ細胞の除去効果をみるための分析方
法について次の３つの方法、すなわち（１）表面免疫グ
ロブリンの遊離物の検出（２）精製Ｂ細胞を培養し、培
養上清中の免疫グロブリンの検出 （３）リンパ球（ＢＳＴ細胞）を培養し、培養上清中の
免疫グロブリンの検出 を行なう方法により行なった。

（１）についてさらに詳しく述べると、細胞表面グロブ
リンの検査法（臨床検査、Ｖｏｌ、２Ｂ（Ｎｏ、４）ｐ
４３０（１９８４））を参考にしてカラムに通液してい
ない細胞浮遊液およびカラムからの流出液を遠心分離（
１０００ｒｐｍで５分間）し、緩衝液をＰＢＳに置換し
、ＰＢＳおよびＷ−ＭＥＮ（Ｅａｇｌｅｓ　ＨＥＭ　（
日永製薬■製）にウシ胎児血清を添加し２％としたもの
）で洗浄して讐−ＨＥＭで３　Ｘ　１０’　／　ｍｌに
調整し、４℃で４８時間保存した。遠心後リンパ球を除
去し、遊離表面免疫グロブリンを濃縮し、免疫グロブリ
ン溶液をえた。これらの免疫グロブリン溶液（原液およ
び流出液よりえたもの）の抗ＤＮＡ抗体の定量を行ない
、その比率から求めた。

（２、（３）はＢ細胞活性因子測定法（臨床検査、Ｖｏ
ｌ、２８．（Ｎｏ、７）ｐ８１ｇ）を参考にして行ナツ
タ。（２のばあいにはＢ細胞の分離、精製を行ない、（
３）のばあいにはリンパ球をそのまま、カラムに通液し
ていない細胞浮遊液およびカラムからの流出液を、７％
ＰＣ８加ＲＰＭＩ　１８４０メデイウム中、９６ウエル
マイクロカルチヤープレートを用いて炭酸ガス培養器内
で培養し、４日後および（または）７０後上清をサンプ
リングし、抗ＤＮＡ抗体の定量を行った。

分析結果 リンパ球の吸着率　　　　　　　２１％Ｂ細胞の吸着率
　　　　　　　　３２％抗ＤＮＡ抗体産生Ｂ細胞の吸着
率　７５％実施例２ 吸着剤の作製 実施例１と同様にして合成した。

リンパ球浮遊液の調製 フィコールバックの上層にヘパリン化ＳＬＥ患者抹梢血
を重層し、比重遠心法によりリンパ球を分離し、ハンク
ス緩衝液で充分に洗浄したリンパ級分画をｌＸ１０７〜
５　Ｘ　１０’　／　ｍｌの濃度になるように１．０％
牛血清アルブミンを含むｐＨ７，２０ＨＥＰＥＳ−１１
８ＳＳ緩衝液で調整した。

吸着操作 実施例１と同様に行なった。

分析方法 実施例１と同様に行なった。

分析結果 リンパ球の吸着率　　　　　　　１８％Ｂ細胞の吸着率
　　　　　　　　２８％抗ＤＮＡ抗体産生Ｂ細胞の吸着
率　６５％実施例３ 吸着剤の作製 実施例１と同様に合成した。

リンパ球浮遊液の調製 フィコールバックの上層にヘパリン化Ｓｔ、Ｅ患者抹梢
血を重層し、比重遠心法によりリンパ球を分離し、ハン
クス緩衝液で充分に洗浄したリンパ球分画をｌＸ１０７
〜５　Ｘ　１０’　／　ｍｌの濃度になるように牛血清
アルブミンを含まないｐＨ７，２０ＩＩ　Ｅ　Ｐ　Ｅ　
Ｓ　−ＨＢ　Ｓ　Ｓ緩衝液で調整した。

吸着操作 実施例１と同様に行った。

分析方法 実施例１と同様に行った。

分析結果 リンパ球の吸着率　　　　　　　２９％Ｂ細胞の吸着率
　　　　　　　　４５％抗ＤＮＡ抗体産生Ｂ細胞の吸着
率　８５％［発明の効果］ 本発明によると、患者体液より病因物質の産生に関与す
る自己抗体産生Ｂ細胞を選択的に吸着除去することがで
きる。

特許出願人　　鐘淵化学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　アニオン性官能基を有する固体物質からなる自己抗
   体産生Ｂ細胞用吸着剤。 ２　アニオン性官能基が、硫酸エステル基、スルホン酸
   基、カルボキシル基およびリン酸エステル基よりなる群
   から選ばれた少なくとも１種である請求項１記載の吸着
   剤。 ３　アニオン性官能基が、該官能基内に複数のアニオン
   性基を有するポリアニオン性官能基である請求項１記載
   の吸着剤。 ４　アニオン性官能基が、固体物質の表面積１ｍｍ＾２
   当り１×１０＾４〜１×１０＾７μｍｏｌ存在する請求
   項１記載の吸着剤。 ５　アニオン性官能基を有する固体物質からなる自己抗
   体産生Ｂ細胞用吸着剤を、リンパ球を含む体液と接触さ
   せることを特徴とする自己抗体産生Ｂ細胞の吸着除去方
   法。