JPH0120867B2 - - Google Patents
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- JPH0120867B2 JPH0120867B2 JP12225981A JP12225981A JPH0120867B2 JP H0120867 B2 JPH0120867 B2 JP H0120867B2 JP 12225981 A JP12225981 A JP 12225981A JP 12225981 A JP12225981 A JP 12225981A JP H0120867 B2 JPH0120867 B2 JP H0120867B2
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Description
本発明は哺乳動物細胞用培地の血清濃度はもち
ろんのこと、血清アルブミンの濃度をも顕著に低
下させ、あるいはなくすことができるものであ
る。 哺乳動物細胞用培地は、従来牛胎児血清とか仔
牛血清のような哺乳動物血清を添加する必要があ
るとされてきた。しかしながら、これらの血清は
一般に高価であること、入手が容易でないこと、
ロツト差が大きいことなどから代替技術の開発が
検討され、ヒトおよびウシ血清アルブミンを添加
すれば他の血清成分を添加せずとも、細胞が血清
培地に匹敵する速度で増殖することが最近見出さ
れた。ところが、この血清アルブミンも大量に添
加する必要があるため、依然として高価であるこ
と、特に細胞を培養してインターフエロン、抗体
等の生理活性物質を収得する場合に血清アルブミ
ンとこれらの生理活性物質との分離精製が問題に
なること、血清アルブミンには血清と同様ロツト
差がかなりあり、事前に検定の必要があること、
等の問題点がこの血清アルブミンを含有する培地
にあつた。 本発明者らはこれらの問題点を解決すべく種々
検討の結果、構成脂肪酸が不飽和脂肪酸であるリ
ン脂質と、マンノースまたはガラクトースを培地
に添加することによつて、血清はもちろんのこと
血清アルブミンもほとんど添加しなくても血清培
地に匹敵する速度で細胞を増殖させうることを見
出し、この培地は前記の問題点を解決しうるもの
であることを知つて、これに基づいて本発明を完
成したものである。 すなわち本発明は、構成脂肪酸が不飽和脂肪酸
であるリン脂質と、マンノースまたはガラクトー
スとを含有せしめたことを特徴とする哺乳動物細
胞用培地に関するものである。 本発明の培地はまず不飽和脂肪酸を構成脂肪酸
とするリン脂質を含んでいることが必要である。 リン脂質には、ホスフアチジルコリン、ホスフ
アチジルエタノールアミン、ホスフアチジルイノ
シトール、ホスフアチジルセリン、ホスフアチジ
ル酸、スフインゴミエリン、カルジオリピン等を
含む。不飽和脂肪酸の例としては、オレイン酸、
リノール酸、リノレイン酸、アラキドン酸、エル
シン酸、およびネルボン酸を挙げることができ
る。このような不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とする
リン脂質の例として、ホスフアチジルコリンジリ
ノレオイル、ホスフアチジルエタノールアミンジ
オレオイル、ホスフアチジルコリンジオレオイ
ル、ホスフアチジルコリンモノオレイルモノリノ
レイイル、ホスフアチジルコリンモノリノレオイ
ルモノステアリルなどを挙げることができる。こ
のようなリン脂質は合成で得られたものである
と、天然界から抽出されたものであるとを問わず
適用できることはいうまでもない。また、純粋で
ある必要もなく、例えば大豆レシチン、卵黄レシ
チン、コーンレシチン、綿実油レシチン、ナタネ
レシチン、合成レシチンのようなものであつても
よい。このようなリン脂質の構成脂肪酸は一方が
不飽和脂肪酸であれば、他方は飽和脂肪酸であつ
てもよい。しかしながら、リン脂質全体として構
成脂肪酸の50％以上が不飽和脂肪酸でなければな
らない。本発明の培地における前記リン脂質の含
有量としては0.5〜5μｇ／ml程度が適当である。 本発明の培地は次に少なくともマンノースかガ
ラクトースのうちいずれか一方を含んでいること
が必要である。この２つの糖を両方含んでいても
よいことはいうまでもない。濃度としては0.2〜
２ｇ／程度が適当である。 他の培地成分としては、インシユリンとかヒト
トランスフエリンの如き細胞増殖因子およびヒポ
キサンチン、チミジン、デオキシアデノシン、デ
オキシシチジンの如き核酸前駆体を含み、更に、
β−グリセロリン酸・二ナトリウムの如きPH緩衝
剤、グルコースの如き糖源、アミノ酸、ビタミン
類、無機塩および通常の細胞増殖用の血清培地に
含まれるその他の栄養源を併用することが必要で
ある。 細胞増殖因子の濃度としては１〜100mg／程
度、そして核酸前駆体の濃度は0.01〜50mg／程
度が適当である。細胞増殖因子および核酸前駆体
はいずれも培養する細胞の種類に応じて１種又は
２種以上を適宜組合せて用いる。 糖源としては通常グルコースが用いられ、濃度
としては0.5〜10ｇ／程度がよい。そのほか、
ピルビン酸などを適宜加える。アミノ酸は蛋白質
構成成分アミノ酸であつて、例えば、アラニン、
アルギニン、グルタミン、シスチン、スレオニ
ン、リジン、バリン、フエニルアラニンの如きも
のである。血清培地においては、必須アミノ酸を
中心として添加しているが本発明の培地において
は必須アミノ酸のみでなく非必須アミノ酸も巾広
く添加するのがよい。全アミノ酸の濃度としては
0.5〜５ｇ／程度がよい。アミノ酸の組成とし
ては、通常の血清用培地を参考にしてこれに新た
なアミノ酸を補充していくのがよい。ビタミン類
にはアスコルビン酸、リボフラビン、チアミン塩
酸塩、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミ
ド、ピリドキサール塩酸塩、ｉ−イノシトール、
葉酸、VB12、ビチオンなど、そして無機塩とし
ては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、亜セレン酸ナトリウ
ムなどを例として挙げることができる。これらビ
タミン類と無機塩は通常の血清用培地を参考にし
てこれに適宜添加していくのがよい。その他、重
酒石酸コリン、グルタチオン、プトレシン二塩酸
塩などの代謝中間体や、重曹、β−グリセロリン
酸二ナトリウム、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸などのバツフ
アーを適宜添加する。 培地組成の決定に参考とすべき基礎培地の例と
しては、ダルベツコ変法イーグル培地
（Dulbeccos′ Modified Eagle Medium）、RPMI
−1640培地、イーグル基礎培地（Eaglgs'
Minimum Essential Medium）、Ham Ｆ−12培
地などを挙げることができる。 従来の培地では大量の哺乳動物血清の添加が必
須であるとされ、そうでない場合には大量の哺乳
動物血清アルブミンの添加が必須であつたが、本
発明の培地においてはこれらの添加量を極めて少
量にすることができる。例えば、哺乳動物血清ア
ルブミンを添加する場合には0.005〜0.05％程度
で充分である。また、これらを全く添加しなくと
も細胞をかなり生育させることができる。 培地の調製方法としては、要はすべての培地成
分を所定の濃度になるように添加溶解すればよ
く、各培地成分の添加順序は問わない。その場
合、リン脂質は水に対する溶解度が低いので、予
めエタノール等に溶解してから添加するのがよ
い。すべての培地成分を溶解した後は、濾過等に
よつて減菌してから培地として用いる。 本発明の培地で培養しうる動物細胞は特に限定
されるものではなく、リンパ球系細胞、繊維芽細
胞、上皮性細胞、これらのトランスフオーム細
胞、ガン細胞等に広く適用できる。このような細
胞の例として、Epstein−Barr Virus（EBV）で
トランスフオームしたヒトリンパ芽球様細胞
UMCL、同C5180Y、ヒトバーキツトリンパ腫由
来のナマルバ細胞、マウスリンパ球由来のハイブ
リドーマであるSPI細胞、ヒト繊維芽細胞HEL、
同IMR−90、ヒトガン由来上皮性細胞HeLa−
S3、同Hep−２、同KB、ヒト初代リンパ球、ラ
ツト吉田肉腫細胞、ハムスター繊維芽細胞BHK
−21、マウス繊維芽細胞3T3、マウスリンパ腫瘍
細胞YAC−１などを挙げることができる。 この培地を用いて動物細胞を培養する方法は一
般に血清培地を用いて培養する従来の方法に準じ
て行なえばよいが、例えば培養タンクに本発明の
培地を入れて細胞を104〜106セル／ml程度加え、
CO2を４〜６容量％含む空気を通気しつつ35〜37
℃で培養すればよい。繊維芽細胞を培養する場合
には５〜10容量％程度の低酸素濃度にするのがよ
い。 本発明の培地は細胞増殖用のみならず細胞を培
養してインターフエロン、リンフオカイン、抗体
などの各種有用物質を産生させる場合にも適用で
きることはいうまでもない。 本発明の培地は、高価で大量に入手することが
難かしくかつロツト差の大きい、牛胎児血清とか
仔牛血清の如き血清とか血清アルブミンの使用量
を大巾に低下させることができる。そして、これ
らのロツト差の影響も少ないところから、本発明
の培地は細胞の大量培養とか細胞培養によるイン
ターフエロンとかリンフオカインなどの有用物質
の大量生産に極めて適するものである。また、高
価な血清とか血清アルブミンの量を節減したこと
によつて細胞とかその培養生産物を安価に製造す
ることができる。 特に、培養生産物が蛋白の場合には、従来の培
地においては血清アルブミンその他の血清中の各
種蛋白質との分離や高価なヒト血清アルブミンを
大量に使用するという大きな問題であつたが、本
発明の培地においてはこのような問題点もない。 また、本発明の培地は、特にインターフエロ
ン、抗体などの糖蛋白を分泌する細胞に対して有
効である。 尚、以下の実施例およびUMCL細胞製造例に
おける細胞数の測定は、UMCL細胞および
RPMI1788細胞についてはトリパンブルー染色法
によつて、Ｋ−562細胞についてはエオジン染色
法によつて、そしてHep−２細胞はセル・細胞自
動カウンター法によつて行なつた。 インターフエロンの活性は、ヒト羊膜由来の
FL細胞とVSV（Vesicular Stomatitis Virus）を
用いる細胞変性抑制法（飯塚雅彦ら、最近医学、
29巻、660頁（1974））で測定した。 また、免疫グロブリンは培養液を濃縮した後、
拡散沈降法で測定した。 UMCL細胞製造例 新生児より切りはなされた臍帯より約20mlの血
液を無菌的にヘパリン採血し、すみやかにフイコ
ール・アイソパツクを用いる比重遠心法でリンパ
球区分を分画した。このリンパ球区分に３倍量の
Eagle MEM（Minimum Essential Medium）培
地（日水製薬(株)製）を加えて遠心分離し、上清液
を棄却する洗浄を３回繰返した後、10v／ｖ％の
ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地（日水製薬
(株)製）に洗浄したリンパ球細胞を有核細胞密度と
して３×106個／mlになるように添加して浮遊さ
せた。このリンパ球浮遊液にＢ−95−８細胞で増
殖させたEBVを５×105TD50／mlになるように加
え、37℃で２時間培養した後遠心分離によつて細
胞を集め、Eagle MEM培地を添加して遠心分離
し上清液を棄却する洗浄を３回繰返した。洗浄し
た細胞を10v／ｖ％のウシ胎児血清を含むRPMI
−1640培地に３×106個／mlになるように植込み、
36〜37℃、5v／ｖ％CO2の条件で培養を行つた。
培養は1.5ケ月間続け、その間５日毎に、10v／ｖ
％ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地を等量ず
つ加えるか、あるいはこの培地と半量の培地交換
を行うのいずれかを行つた。 臍帯血３例について、このような処理を行い、
各細胞のトランスフオーム後についてIFの自発
各産生量を測定した結果を下表に示す。尚、この
産生量は、各々の細胞を10v／ｖ％のウシ胎児血
清を含むRPMI−1640培地に５×105個／mlにな
るように植込み、5v／ｖ％CO237℃の条件下で５
日間培養した後、培養上清液の活性を測定して得
られたものである。 IF活性×103U／ml UMCL−１ 2.5 臍帯血 〃 −２ 6.1 リンパ球 〃 −３ 4.5 実施例 １ 塩化ナトリウム 6400.0mg／ 塩化カリウム 400.0 〃 塩化カルシウム（無水） 200.0 〃 硫酸マグネシウム（無水） 97.7 〃 リン酸二水素ナトリウム（２水和物）
125.0 〃 硝酸第二鉄（９水和物） 0.1 〃 ブドウ糖 1000.0 〃 ピルビン酸ナトリウム 110.0 〃 Ｌ−アルギニン塩酸塩 84.0 〃 Ｌ−シスチン二塩酸塩 62.6 〃 グリシン 30.0 〃 Ｌ−グルタミン 584.0 〃 Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（１水和物） 42.0 〃 Ｌ−イソロイシン 104.8 〃 Ｌ−ロイシン 104.8 〃 Ｌ−リジン塩酸塩 146.2 〃 Ｌ−メチオニン 30.0 〃 Ｌ−フエニルアラニン 66.0 〃 Ｌ−セリン 42.0 〃 Ｌ−スレオニン 95.2 〃 Ｌ−トリプトフアン 16.0 〃 Ｌ−チロシン二ナトリウム 89.5 〃 Ｌ−バリン 93.6 〃 重酒石酸コリン 7.2 〃 葉 酸 4.0 〃 ニコチン酸アミド 4.0mg／ パントテン酸カルシウム 4.0 〃 ピリドキサール塩酸塩 4.0 〃 リボフラビン 0.4 〃 チアミン塩酸塩 4.0 〃 ｉ−イノシトール 7.2 〃 フエノールレツド 5.0 〃 上記の如き組成を有するダルベツコ変法イーグ
ル培地（Dulbeccos´ Modified Eagle Medium）
に下記の如き成分を添加して溶解し、R56−１培
地を得た。 インシユリン 10mg／ ヒトトランスフエリン ５ 〃 ヒポキサンチン ４ 〃 チミジン 0.7 〃 デオキシシチジン 0.03 〃 デオキシアデノシン 1.0 〃 ６，８−ジヒドロキシプリン 0.3 〃 グルコース 1000 〃 マンノース 500 〃 ガラクトース 500 〃 Ｌ−アラニン 20 〃 Ｌ−アスパラギン（１水和物） 56 〃 Ｌ−アスパラギン酸 20 〃 Ｌ−システイン塩酸塩（１水和物） 40 〃 Ｌ−グルタミン酸 20 〃 Ｌ−プロリン 20 〃 アスコルビン酸 10 〃 ビチオン 0.2 〃 ホリニン酸 0.01 〃 VB12 0.1 〃 FeSO4・7H2O 0.8 〃 ZnSO4・7H2O 0.02 〃 Na2SeO3 0.004 〃 CaCl2 100 〃 グルタチオン 1.0 〃 プトレシン二塩酸塩 0.1 〃 β−グリセロリン酸二ナトリウム 1500 〃 重 曹 1300 〃 このR56−１培地に0.01％のヒト血清アルブミ
ンを添加して９つに分割し、それぞれに下記の各
リン脂質成分を所定の50倍濃度に溶解したエタノ
ール溶液を培地の1/50容量添加してメンブレンフ
イルターで濾過滅菌した。添加した各リン脂質成
分と所定濃度を下表に示す。
ろんのこと、血清アルブミンの濃度をも顕著に低
下させ、あるいはなくすことができるものであ
る。 哺乳動物細胞用培地は、従来牛胎児血清とか仔
牛血清のような哺乳動物血清を添加する必要があ
るとされてきた。しかしながら、これらの血清は
一般に高価であること、入手が容易でないこと、
ロツト差が大きいことなどから代替技術の開発が
検討され、ヒトおよびウシ血清アルブミンを添加
すれば他の血清成分を添加せずとも、細胞が血清
培地に匹敵する速度で増殖することが最近見出さ
れた。ところが、この血清アルブミンも大量に添
加する必要があるため、依然として高価であるこ
と、特に細胞を培養してインターフエロン、抗体
等の生理活性物質を収得する場合に血清アルブミ
ンとこれらの生理活性物質との分離精製が問題に
なること、血清アルブミンには血清と同様ロツト
差がかなりあり、事前に検定の必要があること、
等の問題点がこの血清アルブミンを含有する培地
にあつた。 本発明者らはこれらの問題点を解決すべく種々
検討の結果、構成脂肪酸が不飽和脂肪酸であるリ
ン脂質と、マンノースまたはガラクトースを培地
に添加することによつて、血清はもちろんのこと
血清アルブミンもほとんど添加しなくても血清培
地に匹敵する速度で細胞を増殖させうることを見
出し、この培地は前記の問題点を解決しうるもの
であることを知つて、これに基づいて本発明を完
成したものである。 すなわち本発明は、構成脂肪酸が不飽和脂肪酸
であるリン脂質と、マンノースまたはガラクトー
スとを含有せしめたことを特徴とする哺乳動物細
胞用培地に関するものである。 本発明の培地はまず不飽和脂肪酸を構成脂肪酸
とするリン脂質を含んでいることが必要である。 リン脂質には、ホスフアチジルコリン、ホスフ
アチジルエタノールアミン、ホスフアチジルイノ
シトール、ホスフアチジルセリン、ホスフアチジ
ル酸、スフインゴミエリン、カルジオリピン等を
含む。不飽和脂肪酸の例としては、オレイン酸、
リノール酸、リノレイン酸、アラキドン酸、エル
シン酸、およびネルボン酸を挙げることができ
る。このような不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とする
リン脂質の例として、ホスフアチジルコリンジリ
ノレオイル、ホスフアチジルエタノールアミンジ
オレオイル、ホスフアチジルコリンジオレオイ
ル、ホスフアチジルコリンモノオレイルモノリノ
レイイル、ホスフアチジルコリンモノリノレオイ
ルモノステアリルなどを挙げることができる。こ
のようなリン脂質は合成で得られたものである
と、天然界から抽出されたものであるとを問わず
適用できることはいうまでもない。また、純粋で
ある必要もなく、例えば大豆レシチン、卵黄レシ
チン、コーンレシチン、綿実油レシチン、ナタネ
レシチン、合成レシチンのようなものであつても
よい。このようなリン脂質の構成脂肪酸は一方が
不飽和脂肪酸であれば、他方は飽和脂肪酸であつ
てもよい。しかしながら、リン脂質全体として構
成脂肪酸の50％以上が不飽和脂肪酸でなければな
らない。本発明の培地における前記リン脂質の含
有量としては0.5〜5μｇ／ml程度が適当である。 本発明の培地は次に少なくともマンノースかガ
ラクトースのうちいずれか一方を含んでいること
が必要である。この２つの糖を両方含んでいても
よいことはいうまでもない。濃度としては0.2〜
２ｇ／程度が適当である。 他の培地成分としては、インシユリンとかヒト
トランスフエリンの如き細胞増殖因子およびヒポ
キサンチン、チミジン、デオキシアデノシン、デ
オキシシチジンの如き核酸前駆体を含み、更に、
β−グリセロリン酸・二ナトリウムの如きPH緩衝
剤、グルコースの如き糖源、アミノ酸、ビタミン
類、無機塩および通常の細胞増殖用の血清培地に
含まれるその他の栄養源を併用することが必要で
ある。 細胞増殖因子の濃度としては１〜100mg／程
度、そして核酸前駆体の濃度は0.01〜50mg／程
度が適当である。細胞増殖因子および核酸前駆体
はいずれも培養する細胞の種類に応じて１種又は
２種以上を適宜組合せて用いる。 糖源としては通常グルコースが用いられ、濃度
としては0.5〜10ｇ／程度がよい。そのほか、
ピルビン酸などを適宜加える。アミノ酸は蛋白質
構成成分アミノ酸であつて、例えば、アラニン、
アルギニン、グルタミン、シスチン、スレオニ
ン、リジン、バリン、フエニルアラニンの如きも
のである。血清培地においては、必須アミノ酸を
中心として添加しているが本発明の培地において
は必須アミノ酸のみでなく非必須アミノ酸も巾広
く添加するのがよい。全アミノ酸の濃度としては
0.5〜５ｇ／程度がよい。アミノ酸の組成とし
ては、通常の血清用培地を参考にしてこれに新た
なアミノ酸を補充していくのがよい。ビタミン類
にはアスコルビン酸、リボフラビン、チアミン塩
酸塩、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミ
ド、ピリドキサール塩酸塩、ｉ−イノシトール、
葉酸、VB12、ビチオンなど、そして無機塩とし
ては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、亜セレン酸ナトリウ
ムなどを例として挙げることができる。これらビ
タミン類と無機塩は通常の血清用培地を参考にし
てこれに適宜添加していくのがよい。その他、重
酒石酸コリン、グルタチオン、プトレシン二塩酸
塩などの代謝中間体や、重曹、β−グリセロリン
酸二ナトリウム、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸などのバツフ
アーを適宜添加する。 培地組成の決定に参考とすべき基礎培地の例と
しては、ダルベツコ変法イーグル培地
（Dulbeccos′ Modified Eagle Medium）、RPMI
−1640培地、イーグル基礎培地（Eaglgs'
Minimum Essential Medium）、Ham Ｆ−12培
地などを挙げることができる。 従来の培地では大量の哺乳動物血清の添加が必
須であるとされ、そうでない場合には大量の哺乳
動物血清アルブミンの添加が必須であつたが、本
発明の培地においてはこれらの添加量を極めて少
量にすることができる。例えば、哺乳動物血清ア
ルブミンを添加する場合には0.005〜0.05％程度
で充分である。また、これらを全く添加しなくと
も細胞をかなり生育させることができる。 培地の調製方法としては、要はすべての培地成
分を所定の濃度になるように添加溶解すればよ
く、各培地成分の添加順序は問わない。その場
合、リン脂質は水に対する溶解度が低いので、予
めエタノール等に溶解してから添加するのがよ
い。すべての培地成分を溶解した後は、濾過等に
よつて減菌してから培地として用いる。 本発明の培地で培養しうる動物細胞は特に限定
されるものではなく、リンパ球系細胞、繊維芽細
胞、上皮性細胞、これらのトランスフオーム細
胞、ガン細胞等に広く適用できる。このような細
胞の例として、Epstein−Barr Virus（EBV）で
トランスフオームしたヒトリンパ芽球様細胞
UMCL、同C5180Y、ヒトバーキツトリンパ腫由
来のナマルバ細胞、マウスリンパ球由来のハイブ
リドーマであるSPI細胞、ヒト繊維芽細胞HEL、
同IMR−90、ヒトガン由来上皮性細胞HeLa−
S3、同Hep−２、同KB、ヒト初代リンパ球、ラ
ツト吉田肉腫細胞、ハムスター繊維芽細胞BHK
−21、マウス繊維芽細胞3T3、マウスリンパ腫瘍
細胞YAC−１などを挙げることができる。 この培地を用いて動物細胞を培養する方法は一
般に血清培地を用いて培養する従来の方法に準じ
て行なえばよいが、例えば培養タンクに本発明の
培地を入れて細胞を104〜106セル／ml程度加え、
CO2を４〜６容量％含む空気を通気しつつ35〜37
℃で培養すればよい。繊維芽細胞を培養する場合
には５〜10容量％程度の低酸素濃度にするのがよ
い。 本発明の培地は細胞増殖用のみならず細胞を培
養してインターフエロン、リンフオカイン、抗体
などの各種有用物質を産生させる場合にも適用で
きることはいうまでもない。 本発明の培地は、高価で大量に入手することが
難かしくかつロツト差の大きい、牛胎児血清とか
仔牛血清の如き血清とか血清アルブミンの使用量
を大巾に低下させることができる。そして、これ
らのロツト差の影響も少ないところから、本発明
の培地は細胞の大量培養とか細胞培養によるイン
ターフエロンとかリンフオカインなどの有用物質
の大量生産に極めて適するものである。また、高
価な血清とか血清アルブミンの量を節減したこと
によつて細胞とかその培養生産物を安価に製造す
ることができる。 特に、培養生産物が蛋白の場合には、従来の培
地においては血清アルブミンその他の血清中の各
種蛋白質との分離や高価なヒト血清アルブミンを
大量に使用するという大きな問題であつたが、本
発明の培地においてはこのような問題点もない。 また、本発明の培地は、特にインターフエロ
ン、抗体などの糖蛋白を分泌する細胞に対して有
効である。 尚、以下の実施例およびUMCL細胞製造例に
おける細胞数の測定は、UMCL細胞および
RPMI1788細胞についてはトリパンブルー染色法
によつて、Ｋ−562細胞についてはエオジン染色
法によつて、そしてHep−２細胞はセル・細胞自
動カウンター法によつて行なつた。 インターフエロンの活性は、ヒト羊膜由来の
FL細胞とVSV（Vesicular Stomatitis Virus）を
用いる細胞変性抑制法（飯塚雅彦ら、最近医学、
29巻、660頁（1974））で測定した。 また、免疫グロブリンは培養液を濃縮した後、
拡散沈降法で測定した。 UMCL細胞製造例 新生児より切りはなされた臍帯より約20mlの血
液を無菌的にヘパリン採血し、すみやかにフイコ
ール・アイソパツクを用いる比重遠心法でリンパ
球区分を分画した。このリンパ球区分に３倍量の
Eagle MEM（Minimum Essential Medium）培
地（日水製薬(株)製）を加えて遠心分離し、上清液
を棄却する洗浄を３回繰返した後、10v／ｖ％の
ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地（日水製薬
(株)製）に洗浄したリンパ球細胞を有核細胞密度と
して３×106個／mlになるように添加して浮遊さ
せた。このリンパ球浮遊液にＢ−95−８細胞で増
殖させたEBVを５×105TD50／mlになるように加
え、37℃で２時間培養した後遠心分離によつて細
胞を集め、Eagle MEM培地を添加して遠心分離
し上清液を棄却する洗浄を３回繰返した。洗浄し
た細胞を10v／ｖ％のウシ胎児血清を含むRPMI
−1640培地に３×106個／mlになるように植込み、
36〜37℃、5v／ｖ％CO2の条件で培養を行つた。
培養は1.5ケ月間続け、その間５日毎に、10v／ｖ
％ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地を等量ず
つ加えるか、あるいはこの培地と半量の培地交換
を行うのいずれかを行つた。 臍帯血３例について、このような処理を行い、
各細胞のトランスフオーム後についてIFの自発
各産生量を測定した結果を下表に示す。尚、この
産生量は、各々の細胞を10v／ｖ％のウシ胎児血
清を含むRPMI−1640培地に５×105個／mlにな
るように植込み、5v／ｖ％CO237℃の条件下で５
日間培養した後、培養上清液の活性を測定して得
られたものである。 IF活性×103U／ml UMCL−１ 2.5 臍帯血 〃 −２ 6.1 リンパ球 〃 −３ 4.5 実施例 １ 塩化ナトリウム 6400.0mg／ 塩化カリウム 400.0 〃 塩化カルシウム（無水） 200.0 〃 硫酸マグネシウム（無水） 97.7 〃 リン酸二水素ナトリウム（２水和物）
125.0 〃 硝酸第二鉄（９水和物） 0.1 〃 ブドウ糖 1000.0 〃 ピルビン酸ナトリウム 110.0 〃 Ｌ−アルギニン塩酸塩 84.0 〃 Ｌ−シスチン二塩酸塩 62.6 〃 グリシン 30.0 〃 Ｌ−グルタミン 584.0 〃 Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（１水和物） 42.0 〃 Ｌ−イソロイシン 104.8 〃 Ｌ−ロイシン 104.8 〃 Ｌ−リジン塩酸塩 146.2 〃 Ｌ−メチオニン 30.0 〃 Ｌ−フエニルアラニン 66.0 〃 Ｌ−セリン 42.0 〃 Ｌ−スレオニン 95.2 〃 Ｌ−トリプトフアン 16.0 〃 Ｌ−チロシン二ナトリウム 89.5 〃 Ｌ−バリン 93.6 〃 重酒石酸コリン 7.2 〃 葉 酸 4.0 〃 ニコチン酸アミド 4.0mg／ パントテン酸カルシウム 4.0 〃 ピリドキサール塩酸塩 4.0 〃 リボフラビン 0.4 〃 チアミン塩酸塩 4.0 〃 ｉ−イノシトール 7.2 〃 フエノールレツド 5.0 〃 上記の如き組成を有するダルベツコ変法イーグ
ル培地（Dulbeccos´ Modified Eagle Medium）
に下記の如き成分を添加して溶解し、R56−１培
地を得た。 インシユリン 10mg／ ヒトトランスフエリン ５ 〃 ヒポキサンチン ４ 〃 チミジン 0.7 〃 デオキシシチジン 0.03 〃 デオキシアデノシン 1.0 〃 ６，８−ジヒドロキシプリン 0.3 〃 グルコース 1000 〃 マンノース 500 〃 ガラクトース 500 〃 Ｌ−アラニン 20 〃 Ｌ−アスパラギン（１水和物） 56 〃 Ｌ−アスパラギン酸 20 〃 Ｌ−システイン塩酸塩（１水和物） 40 〃 Ｌ−グルタミン酸 20 〃 Ｌ−プロリン 20 〃 アスコルビン酸 10 〃 ビチオン 0.2 〃 ホリニン酸 0.01 〃 VB12 0.1 〃 FeSO4・7H2O 0.8 〃 ZnSO4・7H2O 0.02 〃 Na2SeO3 0.004 〃 CaCl2 100 〃 グルタチオン 1.0 〃 プトレシン二塩酸塩 0.1 〃 β−グリセロリン酸二ナトリウム 1500 〃 重 曹 1300 〃 このR56−１培地に0.01％のヒト血清アルブミ
ンを添加して９つに分割し、それぞれに下記の各
リン脂質成分を所定の50倍濃度に溶解したエタノ
ール溶液を培地の1/50容量添加してメンブレンフ
イルターで濾過滅菌した。添加した各リン脂質成
分と所定濃度を下表に示す。
【表】
ルエタノールアミンジオレ
オイル
このようにして調製した各培地にいずれも
UMCL−３細胞を５×105セル／mlになるように
添加してCO2を５容量％含む空気を通気しつつ37
℃で５日間培養した。 培養液の細胞濃度およびインターフエロンの産
生量を測定した結果を第１図に示す。図中、斜線
の棒グラフは細胞濃度を、そして白棒グラフはイ
ンターフエロンの産生量を表わしている。 対照例として、RPMI−1640培地に牛胎児血清
（FBS）を10容量％加えた場合について同様に培
養して得られた第１図右端に示す。 実施例 ２ 実施例１と同様にして調製したR56−１培地
に、ヒト血清アルブミンのかわりに牛血清アルブ
ミンを0.05％の濃度になるように添加して３つに
分割し、リン脂質としてホスフアチジルコリンジ
リノレオイル（PCL）３mg／およびホスフア
チジルエタノールアミンジオレオイル（PEO）
１mg／を添加した培地、ホスフアチジルコリン
ジステアロイル（PCS）３mg／およびホスフア
チジルエタノールアミンジステアロイル（PES）
１mg／を添加した培地およびリン脂質を添加し
なかつた培地（None）にいずれもＫ−562細胞を
２×105セル／mlになるように添加してCO2を５
容量％含む空気を通気しつつ37℃で５日間培養し
た。 培養液の細胞濃度を測定した結果を第２図に示
す。 対照例として、RPMI−1640培地に牛胎児血清
を10容量％加えた場合について同様に培養して得
られた結果を第２図右端に示す。 実施例 ３ MEM培地（Minimum Essential Medium、日
水製薬(株)製） 9400mg／ Ｌ−アスパラギン酸 13.3 〃 Ｌ−グルタミン 292 〃 グリシン 7.5 〃 Ｌ−グルタミン酸 0.15 〃 Ｌ−プロリン 3.5 〃 Ｌ−セリン 10.5 〃 ホリニン酸 0.00005 〃 ３，3′，５−トリヨード−Ｌ−チロニン
0.0002 〃 マウス−EGF 0.01 〃 ヒトトランスフエリン 10 〃 インシユリン １ 〃 VB12 0.02 〃 ビオチン 0.02 〃 プトレシン二塩酸塩 0.02 〃 ピルビン酸ナトリウム 110 〃 塩化コリン 16 〃 チミジン 0.07 〃 ヒポキサンチン 0.24 〃 CuSO4・5H2O 0.0000025 〃 FeSO4・7H2O 0.8 〃 MnSO4・7H2O 0.0000024 〃 （NH4）6Mo7O24・H2O 0.0012 〃 NiCl2・6H2O 0.000012 〃 NH4VO3 0.000058 〃 H2SeO3 0.00039 〃 Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−
エタンスルホン酸 3300 〃 NaOH 300 〃 NaHCO3 1400 〃 上記のような組成を有するRITC80−７培地に
0.05％のヒト血清アルブミンおよびヒト血漿から
分離された10mg／のフアイブロネクチンを添加
した培地を用いて実施例２と同様にリン脂質を添
加し、ヒト咽頭ガン由来細胞Hep−２を培養して
得られた各培養液について細胞数を測定した結果
を第３図に示す。 対照例として、MEM培地に仔牛血清を10容量
％加えた場合について同様に培養して得られた結
果を第３図左端に示す。 実施例 ４ R56−１培地のうちガラクトースとマンノース
の分を下表の如く変え、更にいずれもホスフアチ
ジルコリンジリノレオイル３mg／およびホスフ
アチジルエタノールアミンジオレオイル１mg／
を加えて各種の培地を調製した。 糖 濃 度 − ０mg／ グルコース 1000 〃 フコース 1000 〃 ガラクトース 1000 〃 マンノース 1000 〃 ガラクトース＋マンノース 各500 〃 これらの各培地にいずれもUMCL−３細胞を
実施例１と同様に添加して培養した結果を第４図
に示す。 対照例として、RPMI−1640培地に牛胎児血清
を10容量％加えた場合について同様に培養して得
られた結果を第４図右端に示す。 実施例 ５ 実施例４と同様にして培地を調製し、この各培
地にいずれもRPMI−1788細胞を実施例１と同様
に添加して培養した結果を第５図に示す。
オイル
このようにして調製した各培地にいずれも
UMCL−３細胞を５×105セル／mlになるように
添加してCO2を５容量％含む空気を通気しつつ37
℃で５日間培養した。 培養液の細胞濃度およびインターフエロンの産
生量を測定した結果を第１図に示す。図中、斜線
の棒グラフは細胞濃度を、そして白棒グラフはイ
ンターフエロンの産生量を表わしている。 対照例として、RPMI−1640培地に牛胎児血清
（FBS）を10容量％加えた場合について同様に培
養して得られた第１図右端に示す。 実施例 ２ 実施例１と同様にして調製したR56−１培地
に、ヒト血清アルブミンのかわりに牛血清アルブ
ミンを0.05％の濃度になるように添加して３つに
分割し、リン脂質としてホスフアチジルコリンジ
リノレオイル（PCL）３mg／およびホスフア
チジルエタノールアミンジオレオイル（PEO）
１mg／を添加した培地、ホスフアチジルコリン
ジステアロイル（PCS）３mg／およびホスフア
チジルエタノールアミンジステアロイル（PES）
１mg／を添加した培地およびリン脂質を添加し
なかつた培地（None）にいずれもＫ−562細胞を
２×105セル／mlになるように添加してCO2を５
容量％含む空気を通気しつつ37℃で５日間培養し
た。 培養液の細胞濃度を測定した結果を第２図に示
す。 対照例として、RPMI−1640培地に牛胎児血清
を10容量％加えた場合について同様に培養して得
られた結果を第２図右端に示す。 実施例 ３ MEM培地（Minimum Essential Medium、日
水製薬(株)製） 9400mg／ Ｌ−アスパラギン酸 13.3 〃 Ｌ−グルタミン 292 〃 グリシン 7.5 〃 Ｌ−グルタミン酸 0.15 〃 Ｌ−プロリン 3.5 〃 Ｌ−セリン 10.5 〃 ホリニン酸 0.00005 〃 ３，3′，５−トリヨード−Ｌ−チロニン
0.0002 〃 マウス−EGF 0.01 〃 ヒトトランスフエリン 10 〃 インシユリン １ 〃 VB12 0.02 〃 ビオチン 0.02 〃 プトレシン二塩酸塩 0.02 〃 ピルビン酸ナトリウム 110 〃 塩化コリン 16 〃 チミジン 0.07 〃 ヒポキサンチン 0.24 〃 CuSO4・5H2O 0.0000025 〃 FeSO4・7H2O 0.8 〃 MnSO4・7H2O 0.0000024 〃 （NH4）6Mo7O24・H2O 0.0012 〃 NiCl2・6H2O 0.000012 〃 NH4VO3 0.000058 〃 H2SeO3 0.00039 〃 Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−
エタンスルホン酸 3300 〃 NaOH 300 〃 NaHCO3 1400 〃 上記のような組成を有するRITC80−７培地に
0.05％のヒト血清アルブミンおよびヒト血漿から
分離された10mg／のフアイブロネクチンを添加
した培地を用いて実施例２と同様にリン脂質を添
加し、ヒト咽頭ガン由来細胞Hep−２を培養して
得られた各培養液について細胞数を測定した結果
を第３図に示す。 対照例として、MEM培地に仔牛血清を10容量
％加えた場合について同様に培養して得られた結
果を第３図左端に示す。 実施例 ４ R56−１培地のうちガラクトースとマンノース
の分を下表の如く変え、更にいずれもホスフアチ
ジルコリンジリノレオイル３mg／およびホスフ
アチジルエタノールアミンジオレオイル１mg／
を加えて各種の培地を調製した。 糖 濃 度 − ０mg／ グルコース 1000 〃 フコース 1000 〃 ガラクトース 1000 〃 マンノース 1000 〃 ガラクトース＋マンノース 各500 〃 これらの各培地にいずれもUMCL−３細胞を
実施例１と同様に添加して培養した結果を第４図
に示す。 対照例として、RPMI−1640培地に牛胎児血清
を10容量％加えた場合について同様に培養して得
られた結果を第４図右端に示す。 実施例 ５ 実施例４と同様にして培地を調製し、この各培
地にいずれもRPMI−1788細胞を実施例１と同様
に添加して培養した結果を第５図に示す。
第１図は各種リン脂質を添加した培地に
UMCL細胞を培養して、細胞数とインターフエ
ロン産生量を測定した結果を示すものである。第
２図はＫ−562細胞をそして第３図はHep−２細
胞を、いずれも各種リン脂質を添加した培地に培
養して細胞数を測定した結果をそれぞれ示すもの
である。第４図および第５図は糖の影響を調べた
結果を示すものであり、第４図はUMCL細胞を、
そして第５図はRPMI−1788細胞を、いずれも各
種の糖を添加した培地に培養して得られた培養液
の細胞数を表わしている。尚、図中斜線の棒グラ
フは細胞数を、そして白い棒グラフはインターフ
エロン又は免疫グロブリンの産生量をそれぞれ表
わしている。
UMCL細胞を培養して、細胞数とインターフエ
ロン産生量を測定した結果を示すものである。第
２図はＫ−562細胞をそして第３図はHep−２細
胞を、いずれも各種リン脂質を添加した培地に培
養して細胞数を測定した結果をそれぞれ示すもの
である。第４図および第５図は糖の影響を調べた
結果を示すものであり、第４図はUMCL細胞を、
そして第５図はRPMI−1788細胞を、いずれも各
種の糖を添加した培地に培養して得られた培養液
の細胞数を表わしている。尚、図中斜線の棒グラ
フは細胞数を、そして白い棒グラフはインターフ
エロン又は免疫グロブリンの産生量をそれぞれ表
わしている。
Claims (1)
- １ 構成脂肪酸が不飽和脂肪酸であるリン脂質
と、マンノースまたはガラクトースとを含有せし
めたことを特徴とする哺乳動物細胞用培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12225981A JPS5823784A (ja) | 1981-08-04 | 1981-08-04 | 哺乳動物細胞用培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12225981A JPS5823784A (ja) | 1981-08-04 | 1981-08-04 | 哺乳動物細胞用培地 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5823784A JPS5823784A (ja) | 1983-02-12 |
| JPH0120867B2 true JPH0120867B2 (ja) | 1989-04-18 |
Family
ID=14831518
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12225981A Granted JPS5823784A (ja) | 1981-08-04 | 1981-08-04 | 哺乳動物細胞用培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5823784A (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5198349A (en) * | 1986-01-03 | 1993-03-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C and analogs |
| US5250421A (en) * | 1986-01-03 | 1993-10-05 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C-type proteins |
| DE3785102T2 (de) * | 1986-01-03 | 1993-07-22 | Genetics Inst | Verfahren zur herstellung von faktor-viii:c-typ-proteinen. |
| JPS62269694A (ja) * | 1986-05-20 | 1987-11-24 | Teijin Ltd | 増殖性動物細胞を培養して有用な高分子物質を生産する方法 |
| CA1331157C (en) * | 1987-04-06 | 1994-08-02 | Randal J. Kaufman | Method for producing factor viii:c-type proteins |
| JPH0793880B2 (ja) * | 1988-02-29 | 1995-10-11 | 森永製菓株式会社 | モノクローナル抗体生産増強法 |
| ATE135397T1 (de) * | 1988-09-23 | 1996-03-15 | Cetus Oncology Corp | Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte |
| JP2018023356A (ja) * | 2016-08-04 | 2018-02-15 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
| EP3858980A4 (en) * | 2018-09-28 | 2021-12-08 | Ajinomoto Co., Inc. | CULTURE ADDITIVE, CULTURE MEDIA AND CULTURE PROCESS FOR ANIMAL CELLS |
-
1981
- 1981-08-04 JP JP12225981A patent/JPS5823784A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5823784A (ja) | 1983-02-12 |
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