JPH0120878B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物の変換能力を使用して、発酵法
によりステロール類または、その誘導体からアン
ドロスタン系化合物を製造する方法に関するもの
である。 従来からコレステロール、スチグマステロー
ル、エルゴステロール、カンペステロール、シト
ステロール等のステロール類およびそれらのＡ環
における脱水素化合物（以下ステロール類と略記
する）を原料として発酵法により、アンドロスタ
−１，４−ジエン−３，17−ジオン（以下ADD
と略記する）、アンドロスト−４−エン−３，17
−ジオン（以下4ADと略記する）、17β−ヒドロ
キシアンドロスタ−１，４−ジエン−３−オン
（デヒドロテストステロン）（以下DHTと略記す
る）あるいは、17β−ヒドロキシアンドロスト−
４−エン−３−オン（テストステロン）（以下
TSNと略記する）等のＡ環が脱水素化されたア
ンドロスタン系化合物（以下アンドロスタン系化
合物と略記する）を得ることは既に知られてい
る。ステロール類を分解することのできる微生物
を用い、ステロール類を原料として酸化を行わせ
ると、完全分解に至るまでの代謝中間体としてア
ンドロスタン系化合物が産出される。しかしなが
ら、このような中間代謝物として生成するアンド
ロスタン系化合物は更に酸化を受け易く、培地中
に高濃度に蓄積させることは実質的に不可能であ
る。そこで生成したアンドロスタン系化合物の酸
化を阻害する方法としては、ニツケル、カドミウ
ム、コバルト等の重金属イオンの存在下に変換を
行わせる方法（特公昭46−17951号公報）や、鉄
または銅とキレート化合物を形成し得る化合物の
存在下に培養を行う方法（特公昭42−10862号公
報）などが知られている。又、他の方法として
は、野生株の有するアンドロスタン系化合物の分
解酵素のいずれかを欠失または低活性化させた突
然変異株を用いる方法（特開昭52−105289号公
報）が知られている。 本発明の目的は、ステロイド変換反応に従来ま
つたく利用されなかつたシユードノカルデイア
（Pseudonocardia）属に属する放線菌を新たな変
換菌として提供することにある。 従来、ステロール類よりアンドロスタン系化合
物を生産する能力を有する微生物としては、アル
スロバクター（Arthrobacter）属、バシルス
（Bacillus）属、ブレビバクテリウム
（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム
（Microbacterium）属、ミコバクテリウム
（Mycobacterium）属、ノカルデイア
（Nocardia）属、プロタミノバクター
（Protaminobacter）属、セラチア（Seratia）属
及びストレプトミセス（Streptomyces）属など
の存在が知られているが、シユードノカルデイア
属に属する放線菌についてはその存在は全く知ら
れていない。 本発明者等は、メタノールを主たる炭素源とし
て放線菌を培養する方法について種々の研究を行
つた結果、メタノールを好んで資化するととも
に、メタノールに対する菌体収率も良好であり、
且つ、高い活性でステロール類をアンドロスタン
系化合物に変換する能力を有する放線菌を自然界
より見出し、本発明を完成するに至つた。 メタノール資化性を有するシユードノカルデイ
ア属の放線菌については既にシユードノカルデイ
ア・メタノリグニカ（Pseudonocardia methano
−lignica）及びシユードノカルデイア・ユーコ
テイス（Pseudonocardis yukotes）が知られて
いる（特開昭55−96091号公報）。 これら、メタノールを好んで資化することので
きるシユードノカルデイア属は、形態学的、生理
学的性質において極めて特徴ある性質を有してい
る。本発明は、この様な技術的背景のもとに成さ
れたものである。 本発明者等は、これらシユードノカルデイア属
を広く自然界に客め分離方法の確立を行い数多く
の菌株の分離に成功した。 本発明に用いる放線菌はシユードノカルデイ
ア・メタノリブニカに極めて類似した菌学的性質
を有するシユードノカルデイア・メタノリグニ
カ・バラエテイ・LM−145（Pseudonocardia
methanolignica variety LM−145）（微工研菌
寄第6057号）およびシユードノカルデイア・メタ
ノリグニカ・バラエテイLM−1258
（Pseudonocardia methanolignica variety LM
−1258）（微工研菌寄第6058号）によつて代表さ
れるシユードノカルデイア属である。 次に、本発明者等が分離、採集して本発明方法
に於いて用いるシユードノカルデイア・メタノリ
グニカ・バラエテイ・LM−145（以下単にLM−
145と略して記載する場合がある）、シユードノカ
ルデイア・メタノリグニカ・バラエテイ・LM−
1258（以下単にLM−1258と略して記載する場合
がある）の２菌株の菌学的性質を述べる。尚、菌
学的性質のうち特に菌種別に記載しないものは各
菌種共通の性質及び生育状態である。 Ａ 形態学的特徴 栄養菌糸は合成培地および天然培地において
ともによく発達し、グルコース・アスパラギン
寒天平板培地で、白色の気菌糸を豊富に着生す
る。顕微鏡で観察すると、気菌糸は10個以上の
長い胞子鎖が不規則に分岐し、時にジグザグ状
に伸長し、その先端は直線状である。走査型電
子顕微鏡による観察の結果、胞子は0.4〜0.6×
1.0〜1.8ミクロンの円柱状ないし長楕円形であ
る。また、いわゆるブラストスポアを形成する
過程で、求頂的成長が認められる。胞子の表面
は平滑である。菌核、胞子のうおよび遊走子は
見出されない。 Ｂ 各種培地上に於ける性状 各種培地上に於ける性状は特に記載しない限
り37℃で14日培養後の観察である。 (1) シユークロース・硝酸塩寒天培地： 生育良好、白色気菌糸を着生する。裏面は
淡黄色を示し可溶性色素は生成しない。LM
−145菌株は若干生育が劣る。 (2) アスパラギン・グルコース寒天培地： 生育豊富、厚いカバー周辺に微弱な白色気
菌糸を着生する。裏面はうすい淡黄色を示
し、可溶性色素は生成しない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地： 生育豊富、厚いカバー状となる。LM−
1258菌株は盛り上つてシワを生ずる。周辺部
に微弱な白色気菌糸を着生し、裏面は濃い淡
黄色を示し、可溶性色素は生成しない。 (4) 澱粉・無機塩寒天培地： 生育中程度、一面に粉状の白色気菌糸を着
生、裏面は象牙色を示し、可溶性色素は生成
しない。 (5) チロシン寒天培地： 生育豊富、カバー状となり盛り上つてシワ
を生じ割れ目ができる。一面に白色気菌糸を
着生し、裏面は淡黄色を示す。LM−1258菌
株は、褐色がかつた淡黄色を示している。可
溶性色素は共に生成しない。 (6) 栄養寒天培地： 生育豊富、微弱な白色気菌糸を形成。裏面
は黄色で可溶性色素は生成しない。 (7) イースト・麦芽寒天培地： 生育豊富、コロニー表面に割れ目を生じ、
一面に白色の気菌糸を着生する。裏面は淡黄
色で可溶性色素を生成しない。 (8) オートミール寒天培地： 生育中程度、白色気菌糸を豊富に着生す
る。裏面は象牙色から黄色を示し、可溶性色
素は生成しない。 (9) グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（28
℃）： 生育豊富、盛り上つてシワを生ずる。気菌
糸は着生しない。可溶性色素は生成しない。 (10) プリドハム・ゴドリーブ寒天培地： 生育中程度、一面に白色気菌糸を着生す
る。裏面は象牙色から、うすい淡黄色を示
す。可溶性色素は生成しない。 (11) ペプトン・イースト・鉄寒天培地： 生育豊富、盛り上つた生育を示し、シワ状
となり割れ目を生ずる。気菌糸の着生はな
く、裏面は淡黄色となり、可溶性色素は生成
しない。 Ｃ 生理的性質 (1) 生育温度範囲： 25〜47℃（LM−145菌株） 25〜45℃（LM−1258菌株） (2) 最適生育温度： 37〜44℃（LM−145菌株） 35〜43℃（LM−1258菌株） 両菌株共に43℃にても37℃と同程度または
それ以上に良好な生育を示す。 (3) ゼラチンの液化：陽性 (4) 澱粉の加水分解：陰性 (5) 脱脂乳の凝固：陰性 (6) 脱脂乳のペプトン化：陽性 (7) メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地：陰性 ペプトン・イースト・鉄寒天培地：陰性 (8) 硝酸塩の還元能：陽性 (9) 炭素源の資化性：（プリドハム・ゴドリー
ブ寒天培地） (a) 資化するもの：Ｌ−アラビノース、Ｄ−
キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラク
トース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、
Ｄ−マンニトール、メタノール、エタノー
ル、ｎ−パラフイン (b) 資化しないもの：シユークロース、ラフ
イノース (10) 細胞壁の化学組成〔リツチバリアらの方法
（International Journal of Systematic
Bacteriology Vol 20、435−443（1970）に
よつた。〕 (a) 細胞壁の主要成分：ジアミノピメリン酸
はメソ型でグリシンを有せず、アラビノー
ス、ガラクトースを有する。 (b) 細胞壁のタイプ： 細胞壁組成（Cell wall type）：型 糖組成（Whole cell suger patern）：
Ａ型 Ｄ 分離源：土壌 以上、上記２菌株は細胞壁組成と糖組成が型
及びＡ型であることから、ミコバクテリウム
（Mycobacrium）属、ノカルデイア（Nocardia）
属、ミクロポリスポーラ（Micropolyspora）属、
シユードノカルデイア（Pseudonocardia）属、
サーモモノスポラ（Thermomonospora）属のい
ずれかに属するものと考えられる。しかしなが
ら、その形態において10個以上の長い胞子鎖が不
規則に分岐し、胞子は円柱状ないしは長楕円形で
あり、その先端は直線状である。その胞子はブラ
ストスポアを形成することを特徴とすることか
ら、シユードノカルデイア（Pseudonocardia）
属とするのが妥当である（Arch.Fur
Microbiology Vol、26、373〜414（1957）参照）。
シユードノカルデイア属の既知菌種としてはシユ
ードノカルデイア・サーモフイラATCC−19285
（Pseudonocardia thermophila ATCC−19285）、
シユードノカルデイア・スピノサATCC−25924
（Pseudonocardia Spinosa ATCC−25924）、シ
ユードノカルデイア・フアスチジオサATCC−
31181（Pseudonocardia Fastidiosa ATCC−
31181）、シユードノカルデイア・メタノリグニカ
ATCC−31596（Pseudonocardia methanolignica
ATCC−31596）、シユードノカルデイア・ユウコ
テイスATCC−31597（Pseudonocardia yukotes
ATCC−31597）、シユードノカルデイア・エスピ
ーAM−3696（Pseudonocardia SP.AM−3696）
（特開昭55−115894）が知られている。本発明に
使用している菌株は生育温度範囲が25〜47℃であ
ること、メタノール及びｎ−パラフインを単一炭
素源として生育することが出来ること、ゼラチン
の液化及び脱脂乳のペプトン化が共に陽性である
ことなどから、シユードノカルデイア・メタノリ
グニカ（特開昭55−96091参照）と極めて類似し
た菌学的性質を有している。しかしながら、コレ
ステロール分解活性及びADD、4AD生成におい
て大きな差が認められることなどから、シユード
ノカルデイア・メタノリグニカの変種と認め、シ
ユードノカルデイア・メタノリグニカ・バラエテ
イLM−145（Pseudonocardia methanolignica
variety LM−145）、シユードノカルデイア・メ
タノリグニカ・バラエテイLM−1258
（Pseudonocardia methanolignica variety LM
−1258）と命名した。なお本菌株は工業技術院微
生物工業技術研究所に微生物受託番号微工研菌寄
第6057号（LM−145）第6058号（LM−1258）と
して寄託されている。 本発明において使用する菌株としては、上記２
菌株を好適な例として挙げることができるが、シ
ユードノカルデイア属でアンドロスタン系化合物
を蓄積する菌であればすべて用いることができ
る。 使用培地組成としては、実施例に示す如き炭素
源、窒素源、無機塩その他、使用菌の必要とする
栄養源を含む培地ならば使用可能である。 炭素源としては、ｎ−パラフイン、α−オレフ
イン、キシレン等の炭化水素、メタノール、エタ
ノール、グリセリン、高級アルコール等のアルコ
ール類、コハク酸、酢酸、高級脂肪酸等の有機酸
およびその塩、澱粉、麦芽糖、シヨ糖、ブドウ
糖、ラムノース等の糖類があげられる。炭素源、
窒素源およびその他の栄養物質を含む天然栄養源
としては、各種糖蜜、コーンステイープリカー、
味液、魚粉、肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテ
トエキス、麦芽エキスなどがあげられる。無機物
としては、リン酸ニカリ、リン酸−ナトリウム、
硫酸マグネシウムなどが使用できる。その他、必
要に応じてビタミン類を添加することもできる。 培地の組成は用いる菌株の種類に応じて選ばれ
るが、炭素源、窒素源、カリウム、リンおよびマ
グネシウムは培地成分として不可欠である。 消泡剤が必要な場合には周知のものを添加すれ
ばよい。 界面活性剤はステロール類の乳化剤として有効
であり、培地中に添加されることが望ましい。界
面活性剤としては、具体的にはたとえばポリオキ
シエチレンソルビタンモノステアレート、ソルビ
タンモノパルミテート、ポリエチレングリコール
モノステアレートなどを挙げることができる。 培養温度は通常25〜50℃であるが、培養温度は
37〜43℃付近が最適である。 培地のPHは通常５〜９に調整されるが6.5〜7.5
が好ましい。 本発明で原料として用いられるステロール類と
はコレステロール、スチグマステロール、カンペ
ステロール、シトステロール、エルゴステロー
ル、ブラツシカステロール、フコステロール、ラ
ノステロール、アグノステロール、ジヒドロラノ
ステロール、ジヒドロアグノステロール等が挙げ
られる。好ましいステロールはコレステロール、
カンペステロールおよびシトステロールである。
また魚油やイカ油からのアルカリ洗浄ダーク油、
さらに植物油の脱臭スカム、脱臭スラツジ、トー
ル油などのステロール含有天然物および加工物も
同様に本発明方法の原料として使用される。 さらに各種ステロールの酸化中間体も本発明の
原料として使用される。このような酸化中間体と
しては各種ステロールの４−エン−３−オン又は
１，４−ジエン−３−オン誘導体等が挙げられる
が、具体的には、たとえばコレスト−４−エン−
３−オン、コレスタ−１，４−ジエン−３−オ
ン、コレスタ−４，22−ジエン−３−オン、22，
23−ビスノルコラ−５−コレニツクアシツド−
3β−オール、22，23−ビスノルコラ−１，４−
ジエン−３−オン−22−オイツクアシツド、プレ
グネノロン、プロゲステロン等である。 本発明でアンドロスタン系化合物を培地中に高
濃度に蓄積させる為に、アンドロスタン系化合物
の酸化阻害剤を添加することが好ましい。このよ
うな酸化阻害剤としては、例えばニツケル、コバ
ルト、カドミウム等の塩類又はキレート化剤が用
いられる。キレート化剤としては、例えば２，
2′−ジピリジル、１，10−フエナントロリン、８
−ヒドロキシキノリン、クベロン、イソニコチン
酸ヒドラジトン、オルソフエニレンジアミン、
Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム
等を挙げることができる。これ等のキレート化剤
は２種以上を併用して用いることも可能である。 原料としてのステロール類または、その４−エ
ン−３−オンもしくは１，４−ジエン−３−オン
誘導体の添加は菌体生育後に行う。その添加濃度
は通常培地量に対し、0.5〜５ｇ／であり１〜
３ｇ／の範囲が好ましい。 酸化阻害剤の添加は基質の添加と同時或いは基
質添加後、数時間で行う。酸化阻害剤の添加濃度
はその種類及び培地組成によつて選択されるが、
通常培地量に対して１×10^-1〜１×10^-3モルが適
当である。培養は好気的条件下で行い16〜120時
間継続する。 変換反応終了後、培養液から目的物であるアン
ドロスタン系化合物の採取は一般の既知の方法が
用いられる。例えば、反応終了後の液を酢酸エチ
ル、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等の有機溶媒で
抽出し、抽出液から溶媒を除去したのち、シリカ
ゲル、アルミナ等の吸着剤を充填したカラムに吸
着させ、石油エーテル、ベンゼン、クロロホル
ム、酢酸エチル、エーテル、メタノール、エタノ
ール等の溶媒を用いて溶出分取する。この様にし
て溶出されたアンドロスタン系化合物は溶出液を
濃縮し、溶媒を留去したのち酢酸エチル、ベンゼ
ン等の有機溶媒から結晶化させて得られる。また
抽出物を適当に濃縮し、ｎ−ヘキサン等で不純物
の一部を沈澱させ除去したのち、再結晶を繰返す
ことによつても得られる。 以下の実施例で、本発明をさらに詳細に説明す
るが、本発明は、その要旨を超えないかぎり、以
下の実施例に限定されない。 なお以下の実施例において、ステロール類およ
びその誘導体、アンドロスタン系化合物の定性と
定量は薄層、クロマトグラフイ、赤外吸収、核磁
気共鳴、質量分析、ガスクロマトグラフイーおよ
び高速液体クロマトグラフイーにより分析確認さ
れた。 実施例 １ グルコース10ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキ
ス３ｇ、麦芽エキス３ｇ 水１よりなる種培地
（PH7.0）100mlを500ml肩付きフラスコに分注し、
121℃、15分殺菌後、シユードノカルデイア・メ
タノリグニカバラエテイLM−145を１白金耳接
種した。40℃で約16時間通気下に振盪し、種培養
を行つた。 グルコース10ｇ、塩化アンモニウム４ｇ、リン
酸ニカリ７ｇ、リン酸−ナトリウム・２水塩３
ｇ、硫酸マグネシウム0.5ｇ、塩化第二鉄・６水
塩１mg、硫酸銅・５水塩0.1mg、硫酸亜鉛・７水
塩0.1mg、硫酸マンガン・７水塩0.1mg、塩化コバ
ルト・６水塩１mg、酵母エキス0.03ｇ、ポリペプ
トン１ｇ、水１を有し、121℃で15分間殺菌さ
れた本培養培地100ml（PH7.0）を含む500mlの肩
付きフラスコに上記のようにして得られた種培養
液２mlを接種する。本培養は40℃で行い、培養開
始後18時間目に、水２mlに懸濁したステロール類
100mgを添加し、更に培養開始から24時間後に0.1
mlのメタノールに溶解させた２，2′−ジピリジル
15.62mgを添加した。２，2′−ジピリジル添加か
ら42時間後に培養を停止し、培養液を酢酸エチル
で抽出し、ガスクロマトグラフイー及び高速液体
クロマトグラフイーによりADDと4ADの生成量
を測定した。ステロール類として、コレステロー
ル、スチグマステロール、β−シトステロールと
カンペステロールの２：１混合物、コレスト−４
−エン−３−オンおよびコレスタ−１，４−ジエ
ン−３−オンを用いたときの結果を第１表に示
す。

【表】 実施例 ２ 実施例１と同じようにして種培養したシユード
ノカルデイア・メタノリグニカバラエテイLM−
145の培養液２mlを実施例１に示した本培養培地
のグルコースをメタノール１％に置き換えた培地
100mlに接種する。40℃で培養が行われ、培養開
始後48時間目にコレステロール200mgを、培養開
始後54時間目に２，2′−ジピリジル15.62mgを添
加した。２，2′−ジピリジル添加から16時間後に
培養を停止した。その後実施例１と同じようにし
てADDと4ADの生成量を測定したところ、ADD
が18mg、4ADが9.5mg生成していた。 実施例 ３ シユードノカルデイア・メタノリグニカ・バラ
エテイLM−1258を実施例１に示した方法によ
り、種培養及び本培養を行ない、培養開始後18時
間目にコレステロール100mgを添加し、さらに24
時間目に２，2′−ジピリジル15.62mgを添加した。
２，2′−ジピリジル添加から72時間後に培養を停
止し、酢酸エチル抽出物のアンドロスタン系化合
物の測定を行つたところ、ADDが15.8mg、4AD
が16.4mg、DHTが4.4mg及びTSNが3.9mg生成し
ていた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ステロール類又はそのＡ環における脱水素化
   誘導体をアンドロスタン系化合物に変換する能力
   を有するシユードノカルデイア属の微生物を培養
   し、該微生物によりステロール類又はそのＡ環に
   おける脱水素化誘導体をアンドロスタン系化合物
   に変換し、採取することを特徴とする微生物によ
   るアンドロスタン系化合物の製造方法。 ２ 微生物がシユードノカルデイア・メタノリグ
   ニカ・バラエテイ・LM−145またはシユードノ
   カルデイア・メタノリグニカ・バラエテイ・LM
   −1258であることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３ アンドロスタン系化合物が、アンドロスタ−
   １，４−ジエン−３，17−ジオン、アンドロスト
   −４−エン−３，17−ジオン、17，β−ヒドロキ
   シアンドロスタ−１，４−ジエン−３−オン、
   17，β−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３
   −オンであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項または第２項記載の方法。