JPH01210863A - 精子細胞計数および生存精子細胞の比率、あるいは、これらいずれか一方の高速定量方法ならびにその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業の利用分野〕 本発明は、精子細胞の計数および精液サンプル中の生存
精子細胞の比率、あるいは、これらのいずれか一方の高
速定量方法、ならびにその装置に関する。

〔従来の技術〕

精子細胞に関する研究は、生産量の増大に対する要求、
経済性１人工受精とその畜産への利用という点で、生産
上少なからぬ関心が持たれている。

従って、精子の客観的な品質判定、特に、精子の生物学
的実用性を実際的に予測しうる方法の開発に関して、数
多くの研究が行なわれてきた。

現在、従来の染色法の他に、精子の定貫的、形態学的、
ならびに生理学的特徴における微細な変化を［％するた
めのいくつかの方法を利用することができる。例えば、
電子顕微鏡法［ジエイ　エム　ベツドフォード：アメリ
カン　ジャーナルオブ　アナトミー（Ｊ、Ｍ、　Ｂｅｄ
ｆｏｒｄ　：　Ａｍ、　Ｊ、　Ａｎａｔ、’）１２３号
３２９頁（１９６８年）、および、サーク：ジャーナル
　オブ　アミノ　サイエンス（Ｓａａｃｋｅ　：　Ｊ。

Ａｍ１ｎ、　Ｓｃｉ５）　１１５号１４３頁（１９６４
年）コ、あるいは、酵素分析法［アクタ　ヴエット　ス
キヤント（Ａｃｔａ　Ｖｅｔ、　５ｃａｎｄ５）　１７
号８３頁（１９７６年）コ、あるいは、レーザー技術応
用検査法［マツツアールアラトールヴオソック　ラッピ
ャ（Ｍａｇｙａｒ　Ａｌ−１ａｔｏｒｖｏｓｏｋ　Ｌａ
ｐｊａ）　３８号３８頁（１９８３年）、および、バイ
オフィジックス　ジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｊ５
）３１号１４７頁（１９８３年）］などである。

精液中には、様々な生理学的状態の細胞が存在し、その
部分母集団の比率が、受精に決定的な役割を果たす。

現在のところ、精子細胞の濃度、運動性、従って生存精
子の比率の測定には、依然として、顕微鏡検査法が一般
的方法として最も広く用いられている。これは、適当な
拡大技術を用いて、視野に入ってくる精子を観察するこ
とにより、精子細胞の運動を基準として検査し、精液の
生物学的実用性を主観的に定量する方法である。しかし
、この方法は正確さに欠け、約２５％の誤差を生じる［
テクニカル　コンファレンス　フォー　アーティフィシ
ャル　インセミネーション　リプロダクション　プロセ
ス（Ｔｅｃｈｎ、　Ｃｏｎｆ、　Ａｒｔ、　Ｉｎｓ、　
Ｒｅｐｒｏｄ。

Ｐｒｏｃ５）　　３頁（１９７３年）コ。

前記定量方法は、様々な染色技術で補完することができ
る。すなわち、生きている細胞には染料が吸着されない
ので、いわゆる活性染色法により、生きている部分母集
団と、死んだ部分母集団とを識別することができる。し
かし、この方法では、数百刃側の細胞を含む母集団を、
数百側の細胞の検査結果を基準として定量するため、正
確な結果は得られない。更に、この定量方法には時間が
かかるため、生産技術への応用には向かない。

もう一つの公知の方法は、精液サンプルにヘリウムネオ
ンレーザ−の単色光線を照射し、精子の頭部で散乱する
光に、速度依存性周波数変調成分が含まれているか否か
を観察するものである。精子の速度分布は、ドツプラー
信号の波長スペクトルのフーリエ変換により決定するこ
とができる。

この方法は、精子濃度の測定にも有益である（西ドイツ
　メンシェングラートバッハのベーイーゲー　ビオテッ
ヒニーク　ゲーエムベーハ−（ＢＩＧＢｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｋ　ＧｍｂＨ，）製の運動性検査用ラツユモット（Ｌ
ＡＺＹＭＯＴ）装置参照）。

公知の定量方法は、正確で再現可能な結果を得るには不
適当であり、また、精液を利用する産業上に広く応用す
るためには、複雑にすぎ、かつ高価につきすぎる。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、生産上の要件を満たす精度をもって、
簡単、かつ比較的安価に、精液の評価を行ないうる高速
定量方法、およびその装置を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、発光のスペクトル分布や蛍光性量子効率など
、ヨウ化プロピジウム（ＰｒｏρｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄ
ｅ）の有する蛍光特性は、染料と核酸とが相互に干渉し
、結合することにより、変化するという認識に基づくも
のである。染料分子の結合は、自由染料に特有の蛍光レ
ベルで、顕著に増加すると考えられる。

透過性の高い細胞膜を有する死んだ細胞は、生存細胞と
は異なり、ヨウ化プロピジウムを急速に取り込むので、
自由染料と比較して、強度の増加がｒＲ察されるという
事実に基づいて、精液サンプルの定量は行なわれる。こ
れは、極めて短時間で実施できる定量方法であり、全精
子数に比例した。

より高い蛍光強度が得られる。

本発明は、精液サンプル中の精子細胞の計数および生存
精子細胞の比率、あるいはこれらのいずれか一方の高速
定量方法に関し、次の過程を含むものである。

まず、蛍光染料ヨウ化プロピジウムを緩衝液に溶かして
、強度（Ｆｏ）を測定する。次に、前記溶液に精液サン
プルを加えて、強度（Ｆ１）を測定した後、細胞膜透過
性試薬を加えて１強度（Ｆ２）を測定する。次に、前記
緩衝液に緩衝液及び透過性試薬を加えて、強度（Ｆ３）
を測定した後、純粋な緩衝液の強度（Ｆ４）を測定する
。最後に、緩衝液に精液サンプル液を加えて、強度（Ｆ
５）を測定し、次の式により細胞濃度を計算する。

Ｏ 式中、αは希釈前の度数に対応する検量線の勾配から得
られる積である。

また、生存細胞の比率は、次の式により計算される。

細胞膜透過性試薬としては、染色細胞のサンプルに、サ
ポニン、ジギトニン、あるいはナイスクチンを添加して
、各細胞膜を透過性にしたものが適当である。

本発明は、前記定量方法を実施するための装置にも関す
る。

これは、キュベツト（Ｃｕｖｅｔ）保持装置（１）と、
これに接続した光源（５）と、適当なスペクトル領域を
選択した後、サーモスタット制御式のキュベツトホルダ
ー（２）上のサンプルに光源の光を照射する光学フィル
タ（４）および２個のレンズ（３）を含む入光部と、そ
の入光部の光軸に対して直交し、かつ、キュベツト保持
装置（１）に接続した光検出器（８）を介してキュベツ
トホルダー（２）上の試料（１１）の発光を投影する光
学フィルタ（７）および２個のレンズ（６）を含む出光
部と、光検出器（８）のための高電圧供給装置（９）と
、光検出器（８）からの信号を受は取る検出用電子装置
（１０）とを備えてなるものである。

（実施例） 本発明による前記定量装置の概要を第１図に示す。

この定量装置は、次のように作動する。

メインスイッチを入れ、光検出器（８）に電流を供給す
る高電圧供給装置（９）の高電圧値を調節することによ
り、装置は起動する。高電圧値は。

光検出器の信号を受信する検出用電子装置（１０）が選
択した増幅域に関して、十分に測定可能な発光強度を確
実に表示させる。

試料の発光強度を測定するには、キュベツトに入れた試
料をキュベツトホルダー（２）内に置く。

すると、発光強度は、検出用電子装置（１０）により自
動的に表示される。

連続定量を完全に実施するため、すなわち精液サンプル
中の生存細胞の比率を定量するためには、異なる方法で
準備した６個の試料の発光強度をａｌｌＪ定しなければ
ならない。その後、検査するへき精液サンプルの絶対細
胞濃度、ならびに、生存細胞の比率の定量により、精液
の評価を行なう。

電子的なノイズを減少させる濾過、ならびに。

増幅の度合は、いくつかの段階に変化させてもよい。た
だし、検出器として用いる光電子倍率機に加える高電圧
の価を、レコーダに表示させるのがよい。

次に、本発明による高速定量方法を、非制限的実施例を
あげて詳細に説明する。

生存細胞の比率は、次のようにして定量される。

１、　緩衝液に溶解させたヨウ化プロピジウム（ｐｇの
蛍光の強度（Ｆ５）を、ＰＩ濃度２５■／ｎで標準液と
しても用いられる染色液１６００μＱで測定する。

２、前記溶液に、緩衝液４０μＱで予め希釈した検査用
精液サンプルを加え、強度（Ｆｏ）を測定する。

３、前記精液サンプル混合液に、透過性試薬として、ジ
ギトニン５■／Ｑを含むエタノール溶液４０μＱを添加
し、強度（Ｆ２）を測定する。

４、精液サンプルの代わりに、染色液に、まず、ＰＢＳ
　（リン酸塩緩衝液）４０μＱ、次に透過性試薬を加え
て準備した溶液（ＰＩ溶液１６００μＱ＋ｆｌ衝液４０
μＱ＋ジギトニンエタノール溶液４０μＱ）の蛍光の強
度（Ｆ３）を定量する。

５、緩衝液１６００μＱの強度（Ｆ４）を測定する。

６、ｆｅｔ衝液に、予め希釈した精液サンプル４０μＱ
を加えた後１強度（Ｆ５）を測定する。

生存細胞の比率は、測定強度から１次の式を用いて計算
される。

細胞計数は、次のようにして決定される。

試料中に含ま九る細胞数は、生存細胞の比率を定量する
ための一連の測定範囲内で、前記のＩ’ｌ定強度から同
時に決定することができる。すなわち、測定強度（Ｆ２
）（Ｆ３）の差、すなわち値（Ｆ２　　Ｆ３）は、透過
細胞の総数から引出された値であるから、試料の細胞計
数に比例する。Ｉ　Ｘ　１０ｓセル／ｍＱ乃至１．５　
Ｘ　１０’セル／　ｍ　４２の範囲内では、値（Ｆ２　
　Ｆ３）は、細胞濃度と１次関数的な相関関係にある。

従って、前記範囲内では、検査の過程で測定した値（Ｆ
２−Ｆ３）を基に、検量線から試料の細胞計数を知るこ
とができる。この場合、精子から生じる非特異的な強度
の強調（ＦＳ−Ｆ４）を考慮しなければならない。

計算は、次の式により行なわれる。

Ｏ 式中、αは、前記の要領で検量線から求めた値である。

検量線は、流量細胞針及びＰＩで標識付けした細胞サン
プルを用いて１次のようにして作成することができる。

検査用の細胞！＠濁液は、ＰＢＳ緩衝液で、０．５ＸＩ
Ｏ’セル／　ｍ　２乃至２Ｘ１０’セル／ＩＩＩＱまで
希釈する。氷で冷却しつつ、希釈懸濁液１ｍＱを、１％
ＮＰ−４０溶液１ｍＭで処理する（西ドイツ国　ダイゼ
ンホーヘンのシグマ（Ｓ　ＩＧＭＡ）社製造によるノニ
デット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ　−４０）　、前記処理
により、全ての細胞は死に、ＰＩは細胞膜を透過するよ
うになる。

前記処理の後、ＰＩを溶解させたＰＢＳ緩衝液で、染料
の最終濃度が３０μＱ／ｍＱになるまで試料を染色する
。

染色標本は、例えば、流速１５００セル／秒で、デッキ
ンソン（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＦＡＣ３ｍ型装置などの
流量細胞針で分析する。

励起は、波長４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザ−で達
成され、かつ、６２０ｎｍ以上の波長で表面透過性の抑
制フィルタを挿入することにより１発光が登録される。

分析の過程で、装置を通過する細胞は、ＰＩの蛍光の強
度の登録に基づき、装置で計数される。

処理により、ＰＩは試料中の精子に均一に吸着されるの
で、前記計数は、絶対細胞計数と等しくなる。

測定に要した試料の容量を正確に逆測定し、かつ、希釈
係数を考慮することにより、同一試料を分光蛍光計で測
定した蛍光強度の商 （Ｆ２−Ｆ３）−（１，−Ｆ４） Ｆ。

に等しい、試料の最初の細胞濃度が得られる。

試料を一連の希釈度で希釈し、かつ、細胞計ならびに分
光蛍光計を併用した一連の測定により、分光蛍光計で測
定した強度の商に属する絶対細胞計数を、様々な濃度領
域で決定することができる。

また、同じ測定ポイントで数回検査を繰り返すことによ
り、高い精度を得ることができる。

蛍光強度の商の値は、細胞計数と１次関数的な相関関係
にあるので、いかなる精液系についても、測定値の回帰
線をプロットすることができ、これに基づき特定の強度
の商に属する細胞計数を決定することができる。

検査した精液サンプルの希釈度に対応する回帰線の勾配
から得られる積から係数αを知ることができ、この係数
を測定した蛍光強度の商に乗じると、試料の最初の細胞
濃度が得られる。

検量線は、血球計による計数によっても作成できる。

演算は、コンピュータを用いて行なうのが適当である。

〔発明の効果〕

本発明による高速定量方法及びその装置の効果を要約す
ると、次のとおりである。

ａ）従来のいかなる技術と比較して、より簡単に、しか
も安い費用で実施することができる。

ｂ）正確で再現可能な結果が高速に得られるので、その
結果を、精液の実用工学に組み入れることができる。

Ｃ）死細胞に対する生細胞の正確な比率の決定に便利で
ある。

ｄ）任意射出の抵抗を客観的に設定することができ、か
つ、ローディングテスト用精液サンプルの連続検査によ
り、検査した精液の生物学的価値を確実に予測すること
ができる。

ｅ）精子の絶対濃度の測定が可能となる。

ｆ）従来の技術に比較して、感度が高い。

ｇ）ヨウ化プロピジウム染料の結合により、蛍光強度が
著しく増加するので、より高い精度が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による細胞計数装置の概要図、第２図
は、雌豚の精液の検量線を示す図、第３図は、雄牛の精
液の検量線を示す図である。 （１）キュベツト保持装置　（２）キュベツトホルダー
（３）レンズ　　　　　　　（４）光学フィルタ（５）
光源　　　　　　　　（６）レンズ（７）光学フィルタ
　　　　（８）光検出器（９）高圧供給装置　　　　（
１０）検出用電子装置、Ａ　Ｇ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）精液サンプル中の精子細胞の計数および生存精子
   細胞の比率、あるいはこれらいずれか一方の高速定量方
   法であって、 蛍光染料ヨウ化プロピジウム（ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏ
   ｄｉｄｅ）を溶解した緩衝液の強度（Ｆ＿０）を測定し
   、 前記溶液に精液サンプルを加えて強度（Ｆ＿１）を測定
   し、 前記サンプル混合液に細胞膜透過性試薬を加えて強度（
   Ｆ＿２）を測定し、 次に、前記緩衝液に別の緩衝液および透過性試薬を加え
   て強度（Ｆ＿３）を測定し、 次に、純緩衝液の強度（Ｆ＿４）を測定し、最後に、緩
   衝液に精液サンプルを加えて強度（Ｆ＿５）を測定し、 細胞濃度を、次式 細胞濃度＝α・［（Ｆ＿２−Ｆ＿３）−（Ｆ＿５−Ｆ＿
   ４）］／Ｆ＿０（１００万／ｍｍ＾３）を用いて計算し
   （式中、αは希釈前の度数に対応する検量線の勾配から
   得られる積）、 かつ、生存精子細胞の比率を、次式 生存細胞％＝１００−［（Ｆ＿１−Ｆ＿０）−（Ｆ＿５
   −Ｆ＿４）］／［（Ｆ＿２−Ｆ＿３）−（Ｆ＿５−Ｆ＿
   ４）］・１００を用いて計算することを特徴とする高速
   定量方法。（２）濃度１２．５ｍｇ／ｌ乃至２５ｍｇ／
   ｌのヨウ化プロピジウムを使用することを特徴とする請
   求項（１）記載の精子細胞計数および生存精子細胞の比
   率、あるいは、これらいずれか一方の高速定量方法。 （３）細胞膜透過性試薬として、サポニン、ジギトニン
   、あるいはナイスタチンを使用することを特徴とする請
   求項（１）記載の精子細胞計数および生存精子細胞の比
   率、あるいは、これらいずれか一方の高速定量方法。 （４）キュベット保持装置（１）と、これに接続させた
   光源（５）と、適当なスペクトル領域を選択した後、サ
   ーモスタット制御式のキュベットホルダー（２）上に定
   置した試料に、光源からの光を照射する光学フィルタ（
   ４）および２個のレンズ（３）を含む入光部と、その入
   光部の軸と直交し、かつキュベット保持装置に結合させ
   た光検出器（８）を介して、キュベットホルダー（２）
   上に定置した試料（１１）の発光を投影する光学フィル
   タ（７）および２個のレンズ（６）を含む出光部と、光
   検出器のための高圧供給装置（９）と、光検出器からの
   信号を受信する検出用電子装置（１０）とを備えること
   を特徴とする請求項（１）記載の高速定量方法を実施す
   るための装置。