【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
この発明はバソプレシンの類似体に関する。こ
の類似体は酵素による分解に対して安定であり、
９位のグリシンアミド残基が除去されており、そ
して中枢神径系に対して有意な効果を有する。
脳下垂体後葉ホルモン及びその若干の類似体
が、実験動物の記憶、睡眠、及び学習に影響を与
えることが知られている〔D.デ・ウイード（de
Wied）、Proc.Roy.Soc.B210、183（1980年）〕。し
かしながら、実際に使用するためには、使用する
化合物は天然ホルモンが有する内分泌作用を発揮
せず、且つ酵素による分解から保護されなければ
ならない。
ここに、この発明の類似体により前記の要求が
満たされることが見出された。この類似体は、天
然ホルモンに比べて９位のグリシンアミド残基が
除去されており、８位のＬ−アルギニンがその立
体異性体又はオルニチン残基により置き替えられ
ている。この化合物の１つはチオエーテル結合に
替えてジスルフイド結合を有する。
この発明は、次の式（）、
（式中、R1はＨであり、R2はCH2−Ｓであり、
そしてR3はＤ−Argであり、そして他のすべての
対掌性アミノ酸はＬ−型である）で示されるバソ
プレシン類似体に関する。この明細書において、
Tryはチロシル基、Pheはフエニルアラニル基、
Glnはグルタミニル基、Asnはアスパラギニル基、
Proはプロリル基、Ｄ−ArgはＤ−アルギニン、
そしてＬ−OrnはＬ−オルニチンをそれぞれ表わ
す。
この明細書において、R1がＨ、R2がCH2−Ｓ
そしてR3がＤ−Argである式（）の化合物を
「化合物ａ」とし；R1がNH2、R2がＳ−Ｓそし
てR3がＤ−Argである式（）の化合物を「化合
物ｂ」とし；そしてR1がNH2、R2がＳ−Ｓそ
してR3がＬ−Ornである式（）の化合物を「化
合物ｃ」とする。
ラツトにおいて測定した内分泌生物活性〔国際
単位（I.U.／mg）、「Handbook of Experimental
Pharmacology」Vol.、
Neurohypophysial hormones and similar
polypeptides（B.Berde）、131頁、Speringer−
Verlag、ベルリン（1968年）を参照のこと〕を
第１表に示す。比較のため天然ホルモンであるア
ルギニン−バソプレシンの値も示してある。
This invention relates to analogs of vasopressin. This analog is stable to enzymatic degradation;
The glycinamide residue at position 9 has been removed and has significant effects on the central nervous system. Posterior pituitary hormones and some of their analogues are known to influence memory, sleep, and learning in laboratory animals [D. de Wied].
Wied), Proc.Roy.Soc.B 210 , 183 (1980)]. However, for practical use, the compounds used must not exert the endocrine effects of natural hormones and must be protected from enzymatic degradation. It has now been found that the above requirements are met by the analogs of the invention. This analog has the glycinamide residue at position 9 removed compared to the natural hormone and L-arginine at position 8 replaced by its stereoisomer or ornithine residue. One of these compounds has a disulfide bond instead of a thioether bond. This invention is based on the following formula (), (In the formula, R 1 is H, R 2 is CH 2 -S,
and R 3 is D-Arg and all other chiral amino acids are in the L-form. In this specification,
Try is a tyrosyl group, Phe is a phenylalanyl group,
Gln is a glutaminyl group, Asn is an asparaginyl group,
Pro is prolyl group, D-Arg is D-arginine,
And L-Orn each represents L-ornithine. In this specification, R 1 is H, R 2 is CH 2 -S
The compound of formula () in which R 3 is D-Arg is defined as "compound a"; the compound of formula () in which R 1 is NH 2 , R 2 is S-S, and R 3 is D-Arg is defined as "compound a". and the compound of formula () in which R 1 is NH 2 , R 2 is SS, and R 3 is L-Orn is designated as “compound c”. Endocrine biological activity measured in rats [International Units (IU/mg), “Handbook of Experimental
Pharmacology” Vol.
Neurohypophysial hormones and similar
polypeptides (B.Berde), p. 131, Speringer-
See Verlag, Berlin (1968)] are shown in Table 1. For comparison, the value of the natural hormone arginine-vasopressin is also shown.
【表】【table】
【表】
子宮緊縮作用、催乳作用及び昇圧作用は、天然
ホルモンの対応する作用に比べて少なくとも３オ
ーダー低く、抗利尿作用は少なくとも２オーダー
低い。
調製した類似体を、受動防御反応、すなわちい
わゆる受動回避（パツシブ・アボイダンス）試験
に用いた。この試験において天然バソプレシンが
記憶過程に好ましい影響を与えることが証明され
ている。試験の原理は、ラツトが足に穏和な電気
刺激を受けた空間を回避するという事実に基く。
この回避時間の長さを測定する。化合物の投与に
よりこの反応時間が延長されれば、この実験条件
に関し記憶が強化されたものとして説明される。
化合物は、動物が足に刺激を受けた直後又は回避
反応維持試験の20時間前に5μｇ／Kgの投与量で
皮下投与した。投与の20時間後においても効果が
生ずるという事実によりこの類似体の長期持続効
果が証明され、この点において高く評価される。
例において使用した分析方法は次の通りであ
る。アミノ酸の分析は自動装置（Development
workshops、Czechoslovak Academy of
Sciences、6020型）により行つた。ペプチド試料
は105℃、150Paにて20時間、6M HClを用いて
加水分解した。薄層クロマトグラフイーは、シリ
カゲル板（商標名「Silufol−Kavalier」）を用
い、次の溶媒系により行つた。
系１ ２−ブタノール／98％HCOOH／H2O
（75：13.5：11.5）
系２ ２−ブタノール／25％NH4OH／H2O
（85：7.5：7.5）
系３ １−ブタノール／CH3COOH／H2O（40：
10：10）
系４ １−ブタノール／CH3COOH／ピリジ
ン／H2O（15：３：10：６）
系９ メタノールを20％含むベンゼン
系13 １−ブタノール／CH3COOH／H2O（50：
15：40）
系23 酢酸エチル／ピリジン／CH3COOH／
H2O（５：５：１：３）
電動泳動分析は、湿室中、電圧勾配20V／cmに
て、ワツトマン（Whatman）3MM紙上で行つ
た。化合物はニンヒドリン法又は塩素化法により
検出した。
次に、この発明の類似体の製造方法を例により
示す。
例 １
化合物ａの製造
出発物質（中間体）の製造
ｏ−ニトロベンゼンスルフエニルプロリル−
NG−ｐ−トルエンスルホニル−Ｄ−アルギニ
ンのベンジルエステルの製造
ジメチルホルムアミド（５ml）中ｏ−ニトロベ
ンゼンスルフエニルプローリンの２，４，５−ト
リクロロフエニルエステル（2.5ｇ）及びNG−ｐ
−トルエンスルフオニル−Ｄ−アルギニンのベン
ジルエステルの臭酸塩（2.5ｇ）の溶液を、室温
にて40分間撹拌した。ジメチルホルムアミドを真
空蒸発せしめ、残渣を酢酸エチルに溶解し、そし
て酢酸エチル溶液を、炭酸水素ナトリウムの飽和
溶液、水、PH２のKHSO4／K2SO4溶液及び水で
抽出した。MgSO4上で乾燥した後、酢酸エチル
を蒸発せしめ、そして酢酸エチル及び石油エーテ
ルから結晶化し、３ｇ（90％）の生成物を得た。
融点90〜92℃。〔α〕D＝−40.4゜（ｃ＝0.4、メタノ
ール）。薄層クロマトグラフイーにおけるRf値：
0.88（系１）、0.75（系２）、0.75（系３）、0.83（系
４）、0.60（系９）。
元素分析：式C31H36N6O7S2（分子量668.8）
Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ
計算値(%) 55.67 5.43 12.56 9.59
測定値(%) 55.92 5.38 12.68 9.38
チロシル−フエニルアラニル−グルタミニル−
アスパラギニル−ｓ−（γ−カルボキシプロピ
ル）システイニル−プロリル−NG−ｐ−トル
エンスルホニル−Ｄ−アルギニンのラクタムの
ベンジルエステルの製造
エーテル（１ml）中2.6M塩酸溶液を、ジメチ
ルホルムアミド（１ml）中上記の保護されたベン
ジルエステル（177mg）の溶液に加え、そしてこ
の反応混合物を室温に４分間放置した。こうして
生成した塩酸塩をエーテルで沈澱せしめ、そして
乾燥した（EGly 2.6〕0.96、EHis 5.7＝0.70）。
Ｎ−エチルピペリジンを、ジメチルホルムアミ
ド（１ml）中塩化物の溶液にPHが約10になるよう
に加え、そしてこれに、ジメチルホルムアミド
（1.5ml）中１−デアミノ−１−カルバプレシノン
酸〔ブルトニク（Brtnik）F.、バース（Barth）
T.、ジヨスト（Jost）K.、Collect.Czechoslovak
Chem.Commun.46、278（1981）〕100mg及びＨ−
ヒドロキシベンゾトリアゾール23mgの溶液を注入
した。この反応混合物を−30℃に冷却し、ジメチ
ルホルムアミド（0.5ml）中ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（31mg）を加え、そしてこの混合物
を−５℃にて４時間撹拌し、さらに周囲温度にて
20時間撹拌した。ジシクロヘキシル尿素を去
し、ジメチルホルムアミドを蒸発せしめ、残渣を
塩酸（PH２）と共にすりつぶし、そして過器上
で水、炭酸水素ナトリウム飽和溶液、水、及びエ
ーテルで洗浄した。粗製物を160mg得、ジメチル
ホルムアミド中ゲル過により精製した。純粋な
化合物を含有する溶出液を蒸発せしめ、そして残
渣をジメチルホルムアミド及び水から結晶化し
た。収量100mg（60％）であつた。融点152〜154
℃。〔α〕D＝−34.0゜（ｃ＝0.45、ジメチルホルムア
ミド）。薄層クロマトグラフイーにおけるRf値：
0.50（系１）、0.54（系３）、0.66（系４）。アミノ酸
分析、Pro：0.98、Arg：0.97、Cys
（C3H6CO2H）：0.94、Gin：1.05、Asp：1.04、
Try：0.92、Phe：1.08。
元素分析：式C59H74N12O14S2・H2O（分子量
1257）
Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ
計算値(%) 56.36 6.09 13.37 5.10
測定値(%) 56.52 6.13 13.27 5.09
最終生成物の製造
チロシル−フエニルアラニル−グルタミニル−
アスパラギニル−ｓ−（γ−カルボキシプロピ
ル）システイニル−プロリル−Ｄ−アルギニン
のラクタム
トリフルオロ酢酸（300μ）中上記化合物
（30mg）の溶液を０℃に冷却し、トリフルオロメ
タンスルホン酸（200μ）及びアニソール（20μ
）を加え、そしてこの混合物を上記の温度にて
30分間置いた。エーテルを用いてこの混合物を沈
澱処理し、酢酸塩サイクル中陰イオン交換カラム
を通して過した。溶出液を凍結乾燥し、そして
凍結乾燥物をフリーフロー電気泳動（2500V、
135ｍＡ）により精製した。生成物６mgが得られ
た。〔α〕D＝−47゜（ｃ＝0.1、1M酢酸）。薄層クロ
マトグラフイーのRf値：0.34（系１）、0.57（系
４）、0.74（系23）。EGly 2.4＝0.80。アミノ酸組成、
Arg：1.01、Pro：1.04、Glu：1.01、Asp：1.02、
Phe：0.97、Try：0.94、Cys（C3H6CO2H）：
0.98。
元素分析：式C45H62N12O12S・CH3COOH・
3H2O（分子量1109）
Ｃ Ｈ Ｎ
計算値(%) 50.89 6.54 15.15
測定値(%) 50.68 6.45 14.92
例 ２（参考例）
化合物ｃの製造
出発物質の製造
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−ｓ−（２，４，
６−トリメチルベンジル）システイニル−チロ
シル−フエニルアラニル−グルタミン−アスパ
ラギニル−ｓ−（２，４，６−トリメチルベン
ジル）システイニル−プロリル−N〓−ベンジ
ルオキシカルボナルオルニチンのベンジルエス
テル
ジオキサン（130μ）中3M塩酸溶液を、撹拌
しながら、ジメチルホルムアミド（２ml）中Ｎ−
ベンジルオキシカルボニル−ｓ−（２，４，６−
トリメチルベンジル）システイニル−チロシル−
フエニルアラニル−グルタミニル−アスパラギニ
ル−ｓ−（２，４，６−トリメチルベンジル）シ
ステインのヒドラジド〔ブルトニクF.、バース
T.、クレジー（Krejci）I.、ジヨストK.、
Collection Czechoslovak Chemical
Communications、（印刷中）〕（238mg）の溶液に
加えた。この溶液を−20℃に冷却し、そしてこれ
にジメチルホルムアミド（0.5ml）中亜硝酸ブチ
ル（21mg）を加えた。この反応混合物を20分間撹
拌し、−40℃に冷却し、Ｎ−エチルピペリジンで
中和（湿潤PH試験紙上PH７）し、そして次のよう
にして調製した溶液を加えた。
ｏ−ニトロベンゼンスルフエニルプロリル−
N〓−ベンジルオキシカルボニルオルニチンのベ
ンジルエステル〔ブルトニクF.、バースT.、ク
レジーI.、ジヨストK.、Collection
Czechoslovak Chemical Communications、（印
刷中）〕（182mg）をジメチルホルムアミド（１ml）
に溶解し、そしてこの溶液にエーテル（0.5ml）
中3M HClを加えた。５分後、反応混合物をエー
テルで希釈し、そして分離した沈澱をデカント
し、そしてエーテルで洗浄した。こうして得られ
る塩酸塩をジメチルホルムアミド（２ml）に溶解
し、この溶液をＮ−エチルピペリジンでPH10に調
整し、そしてこの溶液を上記の方法で調製したア
ジドに加えた。０℃にて60時間置いた後、反応混
合物を蒸発せしめ、そして残渣を、0.5M HCl、
水、NaHCO3の飽和溶液、そして再び水と共に
次々とすりつぶした。生成物を、ジメチルホルム
アミド−水混合物液から結晶化し、そしてジメチ
ルホルムアミド中ゲル過を行うことにより精製
した。300mg（93％）の生成物が得られた。融点
238〜240℃、〔α〕D＝−27.6゜（ｃ＝0.15、ジメチル
ホルムアミド）。薄層クロマトグラフイーのRf
値：0.86（系１）、0.97（系２）、0.82（系３）、0.91
（系４）。
元素分析：式C86H106N11O16S2・2H2O（分子量
1617）
Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ
計算値(%) 63.88 6.67 9.53 3.97
測定値(%) 64.00 6.38 9.57 3.95
最終生成物の製造
〔８−オルニチン、９−グリシンアミド除去〕
バソプレシン
上記の保護されたオクタペプチド（100mg）を
トリフルオロ酢酸（1.25ml）に溶解し、チオアニ
ソール（100μ）を加え、そしてこの溶液を０
℃に冷却した。同じ温度に冷却したトリフルオロ
メタンスルホン酸（１ml）を上記の反応混合物に
加えた。０℃にて30分間置いた後、混合物をエー
テルで希釈し、分離した沈澱を取し、そして水
（300ml）に溶解した。この溶液のPHを0.1N
NaOHにより6.8に調整し、そしてこの反応混合
物を空気中酸素により１時間酸化した。次に酢酸
を用いてPHを3.9に調整し、そしてこの溶液を、
酢酸塩サイクル中弱塩基性イオン交換カラムを通
して過した。溶出液を凍結乾燥し（89mg）、凍
結乾燥物を50％酢酸水溶液に溶解し、そして生成
物をゲル過により精製した。15.3mg（24％）の
生成物を得た。〔α〕D＝−15.1゜（ｃ＝0.2、1M酢
酸）。EGly 2.4＝0.89、EHis 5.7＝0.34。薄層クロマトグ
ラ
フエーにおけるRf値：0.37（系４）、0.43（系13）、
0.89（系23）。アミノ酸分析、Phe：1.01、Try：
0.92、Gln：1.00、Asp：1.00、Pro：1.03、Orn：
0.99。試料の一部を過蟻酸により酸化した後シス
テイン酸として求めたシスチンの量、1.92。
元素分析：式C43H59N11O12S2・2CH3CO2H・
2H2O（分子量1142）
Ｃ Ｈ Ｎ
計算値(%) 49.42 6.26 13.48
測定値(%) 49.18 5.95 13.30
例 ３（参考例）
化合物ｂの製造
出発物質の製造
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−ｓ−（２，４，
６−トリメチルベンジル）システイニル−チロ
シル−フエニルアラニル−グルタミニル−アス
パラギニル−ｓ−（２，４，６−トリメチルベ
ンジル）システイニル−プロリル−NG−ｐ−
トルエンスルホニル−Ｄ−アルギニンのベンジ
ルエステル
例１に記載したのと同様の方法で、保護された
アジドの溶液を調製した。
ｏ−ニトロベンゼンスルホニルプロリル−NG
−ｐ−トルエンスルホニル−Ｄ−アルギニンのベ
ンジルエステルをチエコスロバキア国特許（出願
第2099−81号）に従つて調製した。エーテル
（0.5ml）中塩酸（2M溶液）を、ジメチルホルム
アミド（１ml）中上記化合物（200mg）の溶液に
加えた。この反応混合物を５分間周囲温度に置
き、そしてエーテルで希釈した。沈澱する塩酸塩
を吸引分離し、エーテルで洗浄し、ジメチルホル
ムアミド（２ml）に溶解し、そしてこの溶液のPH
をＮ−エチルピペリジンで10に調整した。この溶
液をアジドの溶液に加え、そして反応混合物を０
℃にて60時間静置した。ジメチルホルムアミドを
蒸発せしめ、そして残渣を採取し、例１に記載し
た方法により精製した。生成物310mg（93％）を
得た。融点230〜232℃。〔α〕D＝−28.6゜（ｃ＝0.5、
ジメチルホルムアミド）。薄層クロマトグラフイ
ーのRf値：0.94（系１）、0.75（系２）、0.90（系３）
、
0.96（系４）。
元素分析：式C86H105N13O16S3・H2O（分子量
1691）
Ｃ Ｈ Ｎ Ｓ
計算値(%) 61.08 6.26 10.77 5.69
測定値(%) 60.89 6.23 10.75 5.42
最終生成物の製造
〔８−Ｄ−アルギニン、９−グリシンアミド除
去〕バソプレシン
上記のオクタペプチド（100mg）から保護基を
脱離し、例１に記載した方法と同様にして酸化を
行つた。同様にして脱塩及びゲル過も行つた。
14mg（23％）の生成物を得た。〔α〕D＝−17.7゜（ｃ
＝0.27、1M酢酸）。EGly 2.4＝0.56、EHis 5.7＝0.32。薄
層
クロマトグラフイーにおけるRf値：0.34（系４）、
0.42（系13）、0.91（系23）。アミノ酸分析、Phe：
1.02、Try：0.91、Asp：1.02、Gln：1.04、Pro：
1.02、Arg：1.00、Cys（O3H）：1.92（試料の一部
を過蟻酸で酸化した後にシステイン酸として求め
た値）。
元素分析：式C44H61N13O12S2・2CH3COOH（分
子量1124）
Ｃ Ｈ Ｎ
計算値(%) 49.14 6.19 16.20
測定値(%) 49.02 5.98 15.94Table: The tonic, lactogenic and pressor effects are at least 3 orders of magnitude lower than the corresponding effects of the natural hormone, and the antidiuretic effect is at least 2 orders of magnitude lower. The prepared analogs were used in a passive defense response, the so-called passive avoidance test. In this study it has been proven that natural vasopressin has a positive influence on memory processes. The principle of the test is based on the fact that rats avoid spaces in which they receive mild electrical stimulation to their feet.
Measure the length of this avoidance time. If administration of the compound prolongs this reaction time, this is explained as enhanced memory for this experimental condition.
Compounds were administered subcutaneously at a dose of 5 μg/Kg immediately after the animals received the paw stimulus or 20 hours before the avoidance response maintenance test. The fact that the effect occurs even 20 hours after administration demonstrates the long-lasting effect of this analog and is highly appreciated in this respect. The analytical method used in the example is as follows. Amino acid analysis is performed using automatic equipment (Development
workshops, Czechoslovak Academy of
Sciences, Model 6020). Peptide samples were hydrolyzed using 6M HCl at 105°C and 150Pa for 20 hours. Thin layer chromatography was performed using a silica gel plate (trade name "Silufol-Kavalier") with the following solvent system. System 1 2-butanol/98% HCOOH/H 2 O
(75:13.5:11.5) System 2 2-butanol/25% NH4OH / H2O
(85:7.5:7.5) System 3 1-Butanol/ CH3COOH / H2O (40:
System 4 1-Butanol/CH 3 COOH/Pyridine/H 2 O (15:3:10:6) System 9 Benzene system containing 20% methanol 13 1-Butanol/CH 3 COOH/H 2 O ( 50:
15:40) System 23 Ethyl acetate/Pyridine/ CH3COOH /
H 2 O (5:5:1:3) Electrophoretic analysis was performed on Whatman 3MM paper at a voltage gradient of 20 V/cm in a humid chamber. Compounds were detected by the ninhydrin method or the chlorination method. Next, the method for producing the analogs of the invention will be illustrated by way of example. Example 1 Production of compound a Production of starting material (intermediate) o-Nitrobenzenesulfenylprolyl-
Preparation of benzyl ester of N G -p-toluenesulfonyl-D-arginine 2,4,5-trichlorophenyl ester of o-nitrobenzenesulfenylproline (2.5 g) and N G -p in dimethylformamide (5 ml)
A solution of the benzyl ester of -toluenesulfonyl-D-arginine bromate salt (2.5 g) was stirred at room temperature for 40 minutes. The dimethylformamide was evaporated in vacuo, the residue was dissolved in ethyl acetate, and the ethyl acetate solution was extracted with a saturated solution of sodium bicarbonate, water, a KHSO 4 /K 2 SO 4 solution at PH2 and water. After drying over MgSO 4 , ethyl acetate was evaporated and crystallized from ethyl acetate and petroleum ether to give 3 g (90%) of product.
Melting point 90-92℃. [α] D = -40.4° (c = 0.4, methanol). R f value in thin layer chromatography:
0.88 (system 1), 0.75 (system 2), 0.75 (system 3), 0.83 (system 4), 0.60 (system 9). Elemental analysis: Formula C 31 H 36 N 6 O 7 S 2 (molecular weight 668.8) C H N S Calculated value (%) 55.67 5.43 12.56 9.59 Measured value (%) 55.92 5.38 12.68 9.38 Tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-
Preparation of the benzyl ester of the lactam of asparaginyl-s-(γ-carboxypropyl)cysteinyl-prolyl-N G -p-toluenesulfonyl-D-arginine A 2.6M hydrochloric acid solution in ether (1 ml) was dissolved as above in dimethylformamide (1 ml). of the protected benzyl ester (177 mg) and the reaction mixture was left at room temperature for 4 minutes. The hydrochloride salt thus formed was precipitated with ether and dried (E Gly 2.6 〕0.96, E His 5.7 = 0.70). N-Ethylpiperidine is added to a solution of chloride in dimethylformamide (1 ml) to a pH of approximately 10, and to this is added 1-deamino-1-carbaprecinonic acid [Brutnik] in dimethylformamide (1.5 ml). (Brtnik) F., Barth
T., Jost K., Collect.Czechoslovak
Chem.Commun. 46 , 278 (1981)] 100 mg and H-
A solution of 23 mg of hydroxybenzotriazole was injected. The reaction mixture was cooled to -30°C, dicyclohexylcarbodiimide (31mg) in dimethylformamide (0.5ml) was added and the mixture was stirred at -5°C for 4 hours and then allowed to stand at ambient temperature.
Stirred for 20 hours. The dicyclohexylurea was removed, the dimethylformamide was evaporated, the residue was triturated with hydrochloric acid (PH2) and washed on the sieve with water, saturated sodium bicarbonate solution, water and ether. 160 mg of the crude product was obtained and purified by gel filtration in dimethylformamide. The eluate containing pure compound was evaporated and the residue was crystallized from dimethylformamide and water. The yield was 100 mg (60%). Melting point 152-154
℃. [α] D = -34.0° (c = 0.45, dimethylformamide). R f value in thin layer chromatography:
0.50 (system 1), 0.54 (system 3), 0.66 (system 4). Amino acid analysis, Pro: 0.98, Arg: 0.97, Cys
( C3H6CO2H ) : 0.94, Gin: 1.05, Asp: 1.04,
Try: 0.92, Phe: 1.08. Elemental analysis: Formula C 59 H 74 N 12 O 14 S 2・H 2 O (molecular weight
1257) C H N S Calculated value (%) 56.36 6.09 13.37 5.10 Measured value (%) 56.52 6.13 13.27 5.09 Production of final product Tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-
Lactam of asparaginyl-s-(γ-carboxypropyl)cysteinyl-prolyl-D-arginine A solution of the above compound (30 mg) in trifluoroacetic acid (300 μ) was cooled to 0° C., and trifluoromethanesulfonic acid (200 μ) and anisole ( 20μ
) and this mixture at the above temperature.
Leave it for 30 minutes. The mixture was precipitated with ether and passed through an anion exchange column during an acetate cycle. The eluate was lyophilized and the lyophilizate was subjected to free flow electrophoresis (2500V,
135 mA). 6 mg of product was obtained. [α] D = -47° (c = 0.1, 1M acetic acid). R f values for thin layer chromatography: 0.34 (system 1), 0.57 (system 4), 0.74 (system 23). E Gly 2.4 = 0.80. Amino acid composition,
Arg: 1.01, Pro: 1.04, Glu: 1.01, Asp: 1.02,
Phe: 0.97, Try: 0.94, Cys ( C3H6CO2H ) :
0.98. Elemental analysis: Formula C 45 H 62 N 12 O 12 S・CH 3 COOH・
3H 2 O (molecular weight 1109) C H N Calculated value (%) 50.89 6.54 15.15 Measured value (%) 50.68 6.45 14.92 Example 2 (Reference example) Production of starting material for production of compound c N-benzyloxycarbonyl-s-(2 ,4,
Benzyl ester of 6-trimethylbenzyl)cysteinyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutamine-asparaginyl-s-(2,4,6-trimethylbenzyl)cysteinyl-prolyl-N-benzyloxycarbonalornithine 3M hydrochloric acid solution in dioxane (130μ) was dissolved in N- in dimethylformamide (2 ml) with stirring.
benzyloxycarbonyl-s-(2,4,6-
trimethylbenzyl)cysteinyl-tyrosyl-
Phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-s-(2,4,6-trimethylbenzyl)cysteine hydrazide [Brutnik F., Barth
T., Krejci I., Giost K.,
Collection Czechoslovak Chemical
Communications, (in press)] (238 mg). The solution was cooled to -20°C and to it was added butyl nitrite (21mg) in dimethylformamide (0.5ml). The reaction mixture was stirred for 20 minutes, cooled to -40°C, neutralized with N-ethylpiperidine (PH 7 on wet PH paper), and a solution prepared as follows was added. o-Nitrobenzenesulfenylprolyl-
Benzyl ester of N-benzyloxycarbonylornithine [Brutnik F., Barth T., Krezi I., Gijost K., Collection
Czechoslovak Chemical Communications, (in press)] (182 mg) in dimethylformamide (1 ml)
and add ether (0.5ml) to this solution
Medium 3M HCl was added. After 5 minutes, the reaction mixture was diluted with ether and the precipitate that separated was decanted and washed with ether. The hydrochloride thus obtained was dissolved in dimethylformamide (2 ml), the solution was adjusted to pH 10 with N-ethylpiperidine, and the solution was added to the azide prepared as described above. After 60 hours at 0°C, the reaction mixture was evaporated and the residue was dissolved in 0.5M HCl,
Triturated successively with water, a saturated solution of NaHCO 3 and again with water. The product was crystallized from a dimethylformamide-water mixture and purified by gel filtration in dimethylformamide. 300 mg (93%) of product was obtained. melting point
238-240°C, [α] D = -27.6° (c = 0.15, dimethylformamide). R f of thin layer chromatography
Values: 0.86 (system 1), 0.97 (system 2), 0.82 (system 3), 0.91
(Corollary 4). Elemental analysis: Formula C 86 H 106 N 11 O 16 S 2・2H 2 O (molecular weight
1617) C H N S Calculated value (%) 63.88 6.67 9.53 3.97 Measured value (%) 64.00 6.38 9.57 3.95 Production of final product [8-ornithine, 9-glycinamide removal]
Vasopressin The above protected octapeptide (100mg) was dissolved in trifluoroacetic acid (1.25ml), thioanisole (100μ) was added, and the solution was
Cooled to ℃. Trifluoromethanesulfonic acid (1 ml) cooled to the same temperature was added to the above reaction mixture. After standing for 30 minutes at 0°C, the mixture was diluted with ether, the precipitate that separated was collected and dissolved in water (300ml). The pH of this solution is 0.1N
Adjusted to 6.8 with NaOH and the reaction mixture was oxygenated with atmospheric oxygen for 1 hour. The pH was then adjusted to 3.9 using acetic acid, and the solution was
Passed through a weakly basic ion exchange column during the acetate cycle. The eluate was lyophilized (89 mg), the lyophilizate was dissolved in 50% aqueous acetic acid, and the product was purified by gel filtration. 15.3 mg (24%) of product was obtained. [α] D = -15.1° (c = 0.2, 1M acetic acid). E Gly 2.4 = 0.89, E His 5.7 = 0.34. R f value in thin layer chromatography: 0.37 (system 4), 0.43 (system 13),
0.89 (column 23). Amino acid analysis, Phe: 1.01, Try:
0.92, Gln: 1.00, Asp: 1.00, Pro: 1.03, Orn:
0.99. Amount of cystine, determined as cysteic acid after oxidizing a portion of the sample with performic acid, 1.92. Elemental analysis: Formula C 43 H 59 N 11 O 12 S 2・2CH 3 CO 2 H・
2H 2 O (molecular weight 1142) C H N Calculated value (%) 49.42 6.26 13.48 Measured value (%) 49.18 5.95 13.30 Example 3 (Reference example) Production of starting material for production of compound b N-benzyloxycarbonyl-s-(2 ,4,
6-trimethylbenzyl)cysteinyl-tyrosyl-phenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-s-(2,4,6-trimethylbenzyl)cysteinyl-prolyl-N G -p-
Benzyl Ester of Toluenesulfonyl-D-Arginine A solution of the protected azide was prepared in a manner similar to that described in Example 1. o-nitrobenzenesulfonylprolyl-N G
The benzyl ester of -p-toluenesulfonyl-D-arginine was prepared according to the Czechoslovak national patent (Application No. 2099-81). Hydrochloric acid (2M solution) in ether (0.5ml) was added to a solution of the above compound (200mg) in dimethylformamide (1ml). The reaction mixture was left at ambient temperature for 5 minutes and diluted with ether. The precipitated hydrochloride salt was suctioned off, washed with ether, dissolved in dimethylformamide (2 ml) and the pH of this solution
was adjusted to 10 with N-ethylpiperidine. Add this solution to the solution of azide and reduce the reaction mixture to 0.
It was left standing at ℃ for 60 hours. The dimethylformamide was evaporated and the residue was collected and purified by the method described in Example 1. 310 mg (93%) of product was obtained. Melting point 230-232℃. [α] D = -28.6° (c = 0.5,
dimethylformamide). R f value of thin layer chromatography: 0.94 (system 1), 0.75 (system 2), 0.90 (system 3)
,
0.96 (column 4). Elemental analysis: Formula C 86 H 105 N 13 O 16 S 3・H 2 O (molecular weight
1691) C H N S Calculated value (%) 61.08 6.26 10.77 5.69 Measured value (%) 60.89 6.23 10.75 5.42 Production of final product [8-D-arginine, 9-glycinamide removed] Vasopressin Above octapeptide (100 mg) The protecting group was removed from and the oxidation was carried out analogously to the method described in Example 1. Desalting and gel filtration were also carried out in the same manner.
14 mg (23%) of product was obtained. [α] D = −17.7° (c
= 0.27, 1M acetic acid). E Gly 2.4 = 0.56, E His 5.7 = 0.32. R f value in thin layer chromatography: 0.34 (system 4),
0.42 (system 13), 0.91 (system 23). Amino acid analysis, Phe:
1.02, Try: 0.91, Asp: 1.02, Gln: 1.04, Pro:
1.02, Arg: 1.00, Cys (O 3 H): 1.92 (value determined as cysteic acid after oxidizing a part of the sample with performic acid). Elemental analysis: Formula C 44 H 61 N 13 O 12 S 2・2CH 3 COOH (molecular weight 1124) C H N Calculated value (%) 49.14 6.19 16.20 Measured value (%) 49.02 5.98 15.94