JPH01213232A - 新規な皮膚潰瘍治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は、皮膚潰瘍患者の患部に適用される皮膚潰瘍治
療剤に関するものである。さらに詳しく言えば、本発明
は、コラゲナーゼインしビターを有効成分として軟膏製
剤に含有せしめてなる皮膚潰瘍治療剤に関するものであ
る。

［背景技術］ コラゲナーゼおよびコラゲナーゼインヒビター（ティシ
ュ・インしビター・オブ・メタロプロテアーゼ：　ＴＩ
ＨＰ）はヒトおよびその他の動物の骨、皮膚、歯髄、羊
水、血清、血小板、関節液中および関節軟骨細胞、滑液
細胞、各種組織由来線維芽細胞、線維肉種細胞培養外液
中にそれらの存在が認められている。　　（５ｔｒｉｃ
ｋｌｉｎら、Ｂ１０ＣｈｅｌｌｉＳｔｒＶ、　１７．２
３３１−２３３７．１９７８；　Ｆ４ＬＩｒＤｈＶら、
Ｂｉｏｃｈｅｎ、Ｊ、、　１９５．１６７−１７０．１
９８１　　；　Ｃａｖｔ−ｓｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｉｎ
　、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、　６５７　、　７３
−８３、１９８１　；　ｔｌａｙａｋａｗａら、Ｃｏｎ
ｎｅｃ、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ、。

９　、２４９−２５２　、１９８２；　Ｗｅｌｇｕｓ　
　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｎ、　　、　２５８　、１２２５９−１２２６４
　、１９８３；に１ｓｈｉら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｎ、、
　９６．３９５−４０４　、１９８４　　参照）一方、
皮膚潰瘍、角膜潰瘍、歯周患者、３度熱傷肉芽、先天性
水痘症、慢性関節リウマチなどでコラゲナーゼ活性の上
昇が認められており（Ｋｉｓｈｉ　ら、Ｂｉｏｎｅｄｉ
ｃａｌ　Ｒｅｓ、、　５　、１４９−１５６　。

１９８４参照）、コラゲナーゼの存在がそれらの疾患の
治癒を遅延させていることが知られている。

コラゲナーゼ活性はコラゲナーゼインヒビターの添加に
より阻害される他に、血液由来のα２−マクログロブリ
ン、エチレンジアミン四酢酸および０−フェナントロリ
ンなどの金属イオンキレート剤、あるいはジチオスレイ
トールなどのＳＨ基還元剤の添加によっても阻害される
。

しかし、α２−マクログロブリンはコラゲナーゼ以外の
種々の蛋白質分解酵素とも複合体を形成することにより
、それらの酵素活性を阻害しく　Ｂａｒｒｅｔら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｎ、Ｊ、、　１３３　、７０９−７２４　。

１９７３参照）、また、金属イオンキレート刑およびＳ
Ｈ基還元剤もあらゆる組織成分あるいは体液成分にも影
響を及ぼすため、これらの阻害物質は全てコラゲナーゼ
活性に対して非特異的な阻害物質である。

本発明者らは、コラゲナーゼインしビターの添加によっ
て皮膚潰瘍の主原因と考えられるコラゲナーゼ活性の上
昇を特異的に抑制することにより皮膚潰瘍を治療する手
段につき、種々研究した結果、本発明により皮膚潰瘍治
療剤を提供することに成功した。

［発明の開示］ 本発明は、コラゲナーゼインヒビターを有効成分として
軟膏製剤に含有せしめて成る皮膚潰瘍治療剤を提供する
ものである。

本発明につき、以下に詳細に説明する。

本発明に係る皮膚潰瘍治療剤において使用するコラゲナ
ーゼインヒビターとしては、ＣｏｌＣｏ１１ａ−Ｒｅ１
．Ｒｅｓ、、　７　、３４１−３５０　　（１９８７）
に記載の方法に準じてウシ歯髄の培養外液あるいはヒト
血清からモノクローナル抗体を用いたアフイニテイカラ
ムにより高収量で得られるウシ歯髄コラゲナーゼインヒ
ビターあるいはヒト血清コラゲナーゼインヒビターが好
ましく、使用される。また、コラゲナーゼインヒビター
としては、上記のウシ歯髄培養外液あるいはヒト血清の
池にウシ、ヒトおよびその池の動物の骨、皮膚、羊水、
血清、血漿、血小板、胎盤あるいはウシ、ヒトおよびそ
の他の動物の歯髄、関節軟骨細胞、滑液細胞、各種ａ繊
由来線維芽細胞、線維肉腫細胞培養外液あるいは遺伝子
工学的手法によって得られた細菌または動物細胞および
これらの細菌または動物細胞の培養外液を使用して、上
記と同様にして調製したコラゲナーゼインヒビターを使
用することができる。これらコラゲナーゼインヒビター
の精製方法としては、上記のウシ歯髄コラゲナーゼイン
ヒビターに対するモノクローナル抗体を用いたアフイニ
テイ力ラムクロマトグラフイーを用いる他に、上記の動
物由来の各種コラゲナーゼインヒビターに対するモノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いたアフイ
ニテイクロマトグラフイーによる方法、あるいは通常用
いられる蛋白質の精製法、たとえば硫酸アンモニウムや
！酸ナトリウムなどを用いる塩析分別法、ゲル濾過クロ
マトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーな
どを用いる方法、あるいはコンカナバリンＡ、ヘパリン
またはｌ　ｎ２　＋−イミノニ酢酸などを用いたアフイ
ニテイクロマトグラフイーによる方法を単独でまたは任
意の組み合わせにより使用して適宜行うことができる。

軟膏製剤としては、公知公用の各種軟膏製剤を使用する
ことができるが、好ましい態様はマクロゴールを用いた
マクロゴール軟膏である。

マクロゴール軟膏は、例えば、液状のマクロゴール４０
０と粉状のマクロゴール４０００をそれぞれ同重量ずつ
混合し、６５℃で加温しながら良く撹拌することにより
マクロゴール４（ｔｏとマクロゴール４０００とを均一
化した後、室温で放置することにより冷却することによ
って調製することができる。

１態様例をあげれば、上記の如く調製したマクロゴール
軟膏１０ｇに対し、上記の如く精製したコラゲナーゼイ
ンヒビター０．９１６■を加えて充分に撹拌することに
より治療用製剤を調製することができる。この際、コラ
ゲナーゼインヒビターがマクロゴール軟膏中に均一に分
布していることを後述のマイクロプレートを用いたサン
ドイッチ定量法により確認することができる。

軟膏基剤のその他の例としては、吸水軟膏、親木軟膏、
単軟膏、白色軟膏あるいは親木ワセリンなどをあげるこ
とができる。

コラゲナーゼインヒビターの添加量は通常軟膏１００ｇ
当たり０．０１■から１００■の範囲が適切である０本
発明の皮膚潰瘍治療剤の適用量は、通常患部１１当たり
１■から１０００■が適切であリ、１日１回から数回塗
布するのが通常である。

軟膏製剤の調製は、常法により行われるが、軟膏の製剤
の調製にあたっては、安定剤、保存剤、着色剤、矯臭剤
、賦形剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、等
張化剤あるいは緩衝剤などの添加前を使用することがで
きる。

また、必要に応じて他の薬剤、たとえば抗生物質、鎮痛
剤あるいは抗ヒスタミン剤などの皮膚潰瘍治療上必要と
される薬剤を適宜、任意に混和することができる。

本発明の皮膚潰瘍治療剤の調製に必要なコラゲナーゼイ
ンヒビターの定量は、コラゲナーゼインヒビターの異な
る抗原決定基に対し、特異的に結合する２種類のモノク
ローナル抗体の組み合わせを用いたサンドイツチ法によ
り、酵素免疫学的に行うことができる。

この定電方法の特徴は固相単体としてマイクロプレート
を用いることであり、従来のサンドイツチ法において抗
原を固相抗体へ結合させた後、標識抗体を加えるという
二段階の反応を用いているのに対し、上記のサンドイツ
チ法では抗原と固相抗体との結合および抗原とＩ識抗体
との結合を同時に行う一段階の反応を用いることにより
、コラゲナーゼインヒビターの定量を１時間で行うこと
ができる。

本発明に係る皮膚潰瘍治療剤の効果確認のテストは、以
下のとおりにして行った。

左右の上腕部つけ根部分に、それぞれ直径はぼ１〜５ｃ
ｍ程度の皮膚潰瘍数個を有する２８才の女性の被験者の
左上腕部つけ根部の皮膚潰瘍患部にコラゲナーゼインヒ
ビターを含む本発明の軟膏を、１日１回約２００．塗布
した。一方、対照として右上腕部つけ根部分の皮膚潰瘍
患部にコラゲナーゼインヒビターを含まない同一基剤の
軟膏を、上記と同様に塗布した。その結果、コラゲナー
ゼインヒビターを含まない軟膏を塗布した皮膚潰瘍患部
の場合に比べて、本発明の軟膏を塗布した皮膚潰瘍患部
の治ゆが項著に認められた。また、本発明の軟膏の塗布
による副作用は認められなかった。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

実施例１ ｆａ）ウシコラゲナーゼインヒビターの分離精製Ｃｏｌ
Ｃｏ１１ａ　Ｒｅ１．Ｒｅｓ、、７　、３４１−３５０
　　（１９８７）に記載の方法に従いウシ末萌出知歯の
根部歯髄をイーグルＭＥＭ培地（日永製薬製）で培養し
た培養外液からコラゲナーゼインヒビターに対するモノ
クローナル抗体を用いたアフイニテイ力ラムクロマトグ
ラフイーによりコラゲナーゼインヒビターを分離精製し
た。

（ｂ）マクロゴール軟膏の調製 液状のマクロゴール４００（日本油脂製）５ｇと粉状の
マクロゴール４０００　（牛丼化学製＞５ｇを混合し、
６５℃で加温しながらよく撹拌して両者を均一にした。

この混合物を室温に戻して徐々に温度を下げマクロゴー
ル軟膏を調製した。

次に上記（ａ）で得られたコラゲナーゼインヒビター０
．９１６■を上記のマクロゴール軟膏１０ｇに加え、よ
く撹拌した。コラゲナーゼインヒビターがマクロゴール
軟膏中に均一に分布していることは後記のコラゲナーゼ
インヒビターのサンドイッチ定量法により確かめられた
。

実施例２ （ａ）ヒト血清コラゲナーゼインしビターの精製ヒト血
清の３０〜６０％飽和硫安画分を、実施例１、（ａ）に
おけると同様にしてアフイニテイ力ラムクロマトグラフ
イーに供し、得られたコラゲナーゼインヒビターを含む
両分をもう１度同じクロマトグラフィーに付した。得ら
れたコラゲナーゼインヒビターを含む画分をＡＣＡＳ４
ゲル濾過クロマトグラフィーに供することによりコラゲ
ナーゼインヒビターを分離精製した。

（ｂ）マクロゴール軟膏の調製 実施例１、（ｂ）におけると同様にして、上記（ａ）で
得られたコラゲナーゼインしビターをマクロゴール軟膏
に加えて製剤化した。

実施例３ 実施例１、（ｂ）において得られたコラゲナーゼインヒ
ビターを含む軟膏を治療試験用とし、また、コラゲナー
ゼインヒビターを含まない同一基剤の軟膏を対照試験用
とした。

被験者として、左右の上腕部つけ根部にそれぞれ直径１
〜５ｃｓの皮膚潰瘍を数コずつ有する２８才の女性を選
び、治療試験と対照試験を、それぞれ同一人物の左上腕
部つけ根部分の患部と右上腕部つけ根部分の患部におい
て行った。

治療試験用マクロゴール軟膏と対照試験用マクロゴール
軟膏の患者患部への塗布は、いずれも１日１回約２００
■の量で３週間行った。この３週間の後、対照試験用マ
クロゴール軟膏を塗布した右上腕部つけ根部の患部潰瘍
は依然として残っているのに対し、治療試験用マクロゴ
ール軟膏を塗布した左上腕部つけ根部の患部の潰瘍はほ
ぼ完治していることが認められた。なお、この試験にお
いて、副作用は全く認められなかった。

また、実施例２、（ｂ）で得られたヒトコラゲナーゼイ
ンヒビターを有効成分としたマクロゴール軟膏を治療試
験用とした場合についても上記と同様の結果が得られた
。

目　サンドイッチ測定法によるコラゲナーゼインヒビタ
ーの定量法 （ａ）マイクロプレートへのモノクローナル抗体のコー
ティング Ｃｏ１１ａｏｅｎ　Ｒｅ１．Ｒｅｓ、、７　、３４１−
３４５　　（１９８７）に記載された方法に従って調製
したモノクローナル抗体（クローン７−２３Ｇ９）を０
．１％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍ！Ｊン［！衝ｉ　
（ＤＨ７，５）に溶解し、それを１００μｇ／ｒｔｊ　
　（Ａ２ｓ。＝　０．１５　）の濃度に調整した後、そ
のモノクローナル抗体溶液をマイクロプレートの各ウェ
ルに０．Ｉ　ｎ＋Ｊ！　　　・ずつ加え、４℃に２４時
間静置した。次に、モノクローナル抗体溶液を除去した
後、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｎＨリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）をマイクロプレートの各ウェルに０．３
　ｌＪ！ずつ加え、吸引除去した。この操作をさらに２
度繰り返すことにより各ウェル内を洗浄した後、１％Ｂ
ＳＡ　、０．１　Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％アジ
化ナトリウム含有０．１Ｍリンｉ［衝液（ｐＨ７，０）
を各ウェルに０．３　ｎＪずつ加え、４℃に４８時間静
置した０次に、各ウェル内の溶液を除去した後、脱イオ
ン水を用いて上記洗浄方法と同様に３度洗浄した。上記
の如くして得られたマイクロプレートを真空下、１０℃
で３時間放置することにより乾燥し、４℃で保存した。

（ｂ）サンドイッチ測定法 精製したコラゲナーゼインしビター浴液、あるいはコラ
ゲナーゼインヒビターを含む試料溶液を１％ＢＳ＾、０
．１％ツイーン含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）で希釈した溶液２０μｍとＣｏ１１ａａｅｎ　Ｒｅ１
．Ｒｅｓ、、７　、３４１−３５０　（１９８７）に記
載した方法に従って得られたＦａｂ’　（クローン７−
２５Ｇ　９　）−ＰＯ口複合体を１０．７μｇ／ＩＩｊ
となるように上記緩衝液で希釈した溶液２８０μ」を混
合した後、合計３００μ」の混合液のうちの１００μｍ
を上記（ａ）で得られたマイクロプレートのウェルに加
え、室温で３０分間静置した。その後、ウェル内の混合
液を除去した後、各ウェルを０．１Ｍ塩化ナトリウムお
よび０．１％ツイーン含有０．１Ｍリン酸Ｍ衝液０．３
　ｎｊで３回洗浄した０次に、各ウェルに０．５■／Ｉ
ｊｏ−フェニレンジアミンおよび０．０２％過酸化水素
含有０．２Ｍクエン酸−リン酸ｌ！衝液（ＤＨ４，９）
　　０．ｌｌ１ｊを加え、室温で２０分間静置した後、
２Ｎ硫酸０．１ｎｊを添加することにより反応を停止さ
せた。その反応混液のＡ、９２値をマイクロプレートリ
ーダーで測定し、標準直線より試料中のコラゲナーゼイ
ンヒビター量を求めた。

（Ｃ）標準直線の作成 上記（Ｃ）に示した方法により、コラゲナーゼインヒビ
ターの添加量を変えてサンドイッチ定量を行うことによ
って標準直線を作成した。得られた結果を第１図に示す
、なお、第１図は実施例１、（ａ）で得られたウシ歯髄
コラゲナーゼインヒビターを用いて得られた結果（０）
および実施例２、（ａ）で得られたヒト血清コラゲナー
ゼインヒビターを用いて得られた結果（・）の２つを示
している。第１図にみられるように、添加したウシ歯髄
コラゲナーゼインヒビター量とＡ４９２値の間に直線関
係が成立しているので、ウシ（１ｍコラゲナーゼインヒ
ビターを定量することができる。また、ヒト血清コラゲ
ナーゼ−インヒビターを用いた場合も上記ウシ歯髄コラ
ゲナーゼインヒビターを用いた場合と同様である。

ただし、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの定量感度
はウェル当たり１ｐｏ（３２ａ　ｎｏｊ）であるのに対
し、ヒト血清コラゲナーゼインヒビターの定量感度はウ
ェル当たり１．５１）！Ｉｆ（４８ａ　ｍｏｔ）であり
、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの定量感度に比べ
て１．５倍低いことがわかった。

重用、岩田らは、先にウシコラゲナーゼインヒビターに
対するモノクローナル抗体を用い、ポリスチレン製ボー
ルを固相単体としたサンドイツチ法に基づく酵素免疫学
的測定法（ＥＩＡ）を行うことにより微量の試料で精度
良く、簡便かつ迅速にコラゲナーゼインヒビターを特異
的に定量する方法を開発しな（特願昭６２−４２７８１
号）が、本発明者らはマイクロプレートを固相単体とし
たＥＩＡを行うことにより上記ＥＩＡでコラゲナーゼイ
ンヒビターの定量に要する時間（３時間）に比べて短時
間（１時間）でコラゲナーゼインヒビターの定量ができ
ることを見い出した。このマイクロプレートを固相単体
としてＥＩＡを行う方法は、固相抗体と抗原の結合反応
および抗原と標識抗体の結合反応を同時に行うことが特
徴であり、その結果、ポリスチレン　　　゛製ボールを
固相単体としたＥＩＡでは上記の２つの結合反応を別々
に行っている場合に比べて著しく短時間で結合反応がす
むようになった。

従って、マイクロプレートを固相単体としたＥＩＡはポ
リスチレン製ボールを固相単体としたＥＩＡに比べて精
度を損うことなく短時間でコラゲナーゼインヒビターを
定量できるより優れた方法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は固相７−２３０９抗体−複合体Ｆａｂ’＜　７
−６ｃｌ　）−ＰＯＤ測定系でノコラゲナーゼインしビ
ターの標準直線を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コラゲナーゼインヒビターを有効成分として軟膏製剤に
   含有せしめて成る皮膚潰瘍治療剤。