JPH01214761A - 光音響分光法による免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫分析方法に係り、特に光音響分光法によ
り試料中の成分を分析するに好適な免疫分析方法に関す
る。

〔従来の技術〕

抗原、抗体、ハブテンなどの試料中の測定対象物質をこ
れらと特異的に反応する受容体（抗体あるいは抗〃■）
と反応させて、生成する免疫複合体によるｉｓパターン
や濁度あるいは光散乱の強度を測定して、測定対象物質
の濃度を求める方法は従来より知られている。しかしな
がら、これらの方法は、試料中の夾雑成分の影響をうけ
やすい」二に、測定感度の面からみても問題があり、測
定対象成分の濃度が低い場合（１０−８Ｍ以下）には：
ＩＩ！１定できない。　　　゛ このような低濃度の物質を測定するために従来用いられ
ている方法は、ラジオアイソトープを標識として用いる
ＲＩＡ法である。しかしラジオアイソトープの扱いが部
列であることから、アイソトープの代わりに螢光物質や
酵素を標識とする方法が開発された。これらの方法には
一長一短がある。定トま性に優れた測定方法のうち、操
作性のよい均一反応系の方法では測定感度が不十分であ
るし、不均一反応系を用いる測定方法は、感度は比較的
高いが結果を得られるまで長時間を要するため１通常の
臨床検査の場においては不便なものであった。不均一反
応系のうち、標識抗原と抗体の結合物（ＢＯＵＮＤまた
はＢと略す）と、遊離の状ｍ　（ＦＲＥＥまたはＦ）で
残った過剰の標識抗原とを分離するいわゆるＢ／Ｆ分離
方法のなかでは液相中では沈降してしまう大粒径の同相
担体やあるいは反応管壁を同相として反応を進行させ、
その後洗浄して遊離標識抗原を除去してＢの活性を測定
する方法が広く使われている。同相担体の扱いが容易で
あるために、近年普及してきているが、これらの同相法
は反応の効率が極めて悪いために測定結果を得るまでに
数時間を要する。また測定感度においても、従来の検知
手段である吸光度あるいは螢光強度の検出限界とのかね
あいから１０−１２Ｍ程度の測定感度を達成するのが限
界であった。すなわち、この測定検出感度よりもさらに
低濃度に存在する試料成分は、その濃度はもとより存在
の有無さえも確認できなかった。

さらにＢ／Ｆ分離の工程は、測定結果のバックグラウン
ド値に直接影響するために、ｄ１ｑ定値の再現性の低下
をまねく大きな要因となっている。さらに、一般に装置
構成−ヒからみると、機構と最も精度が要求されるため
、装置の性能の良否がＨ１ｌｌ定僅の信頼性にも大きく
影響しているという実状にありＢ／Ｆ分離の不要な、高
感度および高精度な分析方法が望まれている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術による固相法において、Ｂ／Ｆ分離が必要
なために操作が面倒であり測定結果を得るまでに長時間
を要し、さらに吸光度あるいは螢光強度の検出限界によ
る測定感度が低いといった問題あった。

本発明の目的は、操作時間が短縮できて、しかも測定感
度を高めた免疫分析方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

］−記目的を達成するために、本発明の免疫分析゛方法
においては、測定対象物質を含む試料と、抗原または抗
体を所定の物質で標識した標識抗原または抗体と、抗原
または抗体を固相化した担体とを抗原抗体反応させた反
応液に断続光を照射して発生する音響波を測定する光音
響分光法によって。

前記担体に結合した前記標識抗原または抗体と、結合し
ない前記標識抗原または抗体とを分離測定し、測定対象
物質量を求める。

〔作用〕

上記本発明による免疫分析方法によれば、測定対象物質
を含む試料と、抗原または抗体を所定の物質で標識した
標識抗原または抗体と、抗原または抗体を固相化した担
体とを抗原抗体反応させて、前記担体に結合した前記標
識抗原または抗体と結合しないものとに分離した反応液
に、断続光を照射して発生する音響波を測定することに
よって、測定対象物質量を定量する。

〔実施例〕

本発明による一実施例を図面を参照して説明する。

まず、本発明で用いる光音響分光法の詳細について説明
する。光音響分光法では、まず光を吸収することが不可
欠である。物質が光を吸収するということは、物質が光
エネルギーを取りこみ、物質を構成している原子あるい
は分子がエネルギーが富んだ状態に上がることを意味す
る。この原子あるいは分子がとりこんだ光エネルギーが
、熱を放出して元の状態に戻る過程を測定する分光法が
光音響分光法である。放出された熱により音響波が発生
するので、この光音響信号を検出する。

光音響分光計における主要な構成要素は、第１図に示す
ように、光源１．光チョッパ２．レンズ３、光音響セル
４．音響センサー５．増幅器６゜データ処理部７である
。光源１から出た光は、分光器を通ったのちに光チョッ
パ２により断続光にされ、光音響セル４に入射する。光
音響セル４内では試料が断続光を吸収する結果、光音響
信号が発生する。これをマイクロフォンなどの音響セン
サー５を用いて検出する。試料用の光音響セル４として
は、試料自体を圧力媒体として、試料中に発生した熱を
圧力変化に変えて、圧電素子を用いて検出する方式のセ
ルがよい。試料を、気体を封入した気密容器に入れ、試
料中に発生した熱を気体の圧力変化に変えて高感度マイ
クロフォンで検出するタイプのセルもある。しかし臨床
検査で多く用いる試料は水溶液であり高感度マイクロフ
ォンは水蒸気を嫌うので取扱いにくい。

試料としては、試料中の測定対象成分濃度に比例した量
の微小担体粒子を含む最終反応液を、光音響セル４に入
れて光音響信号強度を測定する。

つまり、前記最終反応液を光音響セル４に導き。

入射光を照射する。試料内に発生する圧力変化（光音響
信号）は、圧電セラミックスにより電気信号（電圧の発
生）に変換される。あらかじめ濃度既知の抗原を用いて
、抗原濃度と光音響信号との間で検量線を作成しておく
ことにより、抗原抗体反応を光音響分光法を用いて定量
的に測定し、これにより目的の抗原又は抗体を定量する
ことができる。

本発明の望ましい実施例によれば、従来実用的には、Ｒ
ＩＡによって初めて測定可能であったような微量成分を
、それよりもはるかに高感度で迅速に定量的に測定でき
る。

本発明に使用する微小担体粒子は、平均粒径が０．０１
　μｍから１００μｍのものが目的にかない、特に好ま
しくは、平均粒径０．１　　μｍから１０μｍの不活性
担体粒子を固相として用いるのがよい。このような担体
を測定試料と反応させると反応効率が非常によくなるた
め測定が迅速に進行する。

試料中の測定対象物質を、本発明による方法によって、
高感度、迅速に定量するためには、例えばラックス粒子
のような不活性担体に担持させた反応物質となるべく高
濃度でこれと反応する測定試料とを接触させることが望
ましいことはいうまでもない。

種々の粒子径を有する不溶性担体を用いて、ヒトＩｇＧ
定量のために抗原抗体反応をさせたところ、担体の平均
粒径１００μｍ以下のものを用いると反応時間が１時間
以内に抗原であるヒトＩｇＧを定量的に検出できること
がわかった。また、特に１０μｍ以下の不溶性担体粒子
を用いると反応時間１５分以内に定量が可能であること
がわかった。測定試料の分析にあたり、処理スピードの
点から許容される反応時間は、１時間、好ましくは１５
分以内であることから平均粒径１０μｍ以下の不活性担
体粒子を使用することが好ましいといえる。また測定感
度とＳ／Ｎ比に着目して比較すると、平均粒径０．０１
μｍ以上、好ましくは、０．１μｍ以上の粒子径が必要
であることが判明した。以上の結果から、不活性担体粒
子は、平均粒子径が０．１μｍから１０μｍの担体が好
適であることが判明した。

不活性の担体粒子としては、生体液の測定を行なうとき
に用いられる液体媒体に実質的に不溶で前記平均粒径を
有する有機高分子のラテックス。

細胞、あるいは例えばシリカ、シリカアルミナ。

アルミナのような無機酸化物、その他鉱物粉末。

金属等が用いられる。

光音響分光法では１粒子径の異なる物質についてそれぞ
れの信号強度を区別して取り出すことができる。このた
めには１粒子径に対応した波長を選択して照射すればよ
い。本発明による分析方法においては、標識抗体が結合
した一定粒径の担体粒子を標的粒径とすればよく、残余
の標識物質の信号を取り出す必要はない。

次に５本発明による具体的な一実施例について説明する
。

まず、抗α−フェトプロティン抗体感作ラテックス試薬
（抗ヒトＡＦＰラテックス試薬）を以下のようにして調
製する。

抗ヒトＡＦＰ抗体のグリシン緩衝液（０，１Ｍ。

ｐ　Ｉ（６、５）　１０　ｍ　Ｑに、平均粒径がＱ、２
２　μｍのポリスチレンラテックス（固形分濃度、１０
重量％）１ｍＱを加えて室温において３時間撹拌したの
ち、２〜４℃の冷却下で４０分間、１２．００Ｏｒｐｍ
にて遠心した。得られた沈澱を、０．５　％牛血清アル
ブミン、０．１Ｍ　ＮａＣＱ、２ｍＭＭｇＣＱｚを含む
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）に懸濁させて、該
感作ラテックス粒子濃度が１重量％の抗ＡＦＰラテック
ス試薬を調製した。

次に、試料溶液１００μＱと、抗ＡＦＰラテックス試薬
５０μＱと、標識抗体溶液５０１ｔΩと、反応用緩衝液
１００μＱとを混合して、３７℃。

２０分間抗抗原体反応させた。これによって固相抗体と
、抗原と、標識抗体からなる免疫反応複合体と、抗原量
に応じて残存する標識抗体とができる。

次に、反応液をフロー型の光音響セルに導き、光音響信
号を測定した。光源にはアルボイオンレーザを用いた。

測定装置の構成概略は第１図に示すとおりである。

又、ヒトへＦＰ測定のために作成した検量線を第２図に
示す。第２図からあきらかなように従来の方法では測定
することのできなかったＩＱｍｇ／ｍＱ以下の低濃度領
域を定量的に測定できていることがわかる。

このように、光音響分光法により測定すると、免疫反応
複合体と、残余の標識抗体との粒子としての大きさが著
しく異なるために測定上の識別が容易である。さらに、
反応溶液のＢ／Ｆ分離が不要であるため、操作性が向上
する。

〔発明の効果〕

本発明によれば、上述の通りの方法によるので以下に記
載する効果を奏する。

抗原抗体反応をＢ／Ｆ分離を必要とせずに、光音響分光
法を用いて定量的に測定し、これにより目的の抗原又は
抗体を定量することができ、測定感度を高め、低濃度の
領域を測定することができるといった効果がある。さら
に、固相化した担体としては、ラテックスに限らず１分
子量の均一な人工細胞など任意のものを用いることがで
き、該担体の粒子径を０．０１〜１００μｍの範囲とす
ることで、抗原抗体反応の反応時間が短く、操作時間を
短縮できて、微量成分を、高感度で迅速に定量的に測定
できるといった優れた効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明による免疫分析方法の一実施例で使用
した光音響分光器の概略構成図、第２図はＡＦＰ測定の
ための検量線を示す図である。 ■・・・光源、２・・・光チョッパ、３・・・レンズ、
４・・・光音響セル、５・・・音響センサー、６・・・
増幅器、７・・・データ処理部。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、測定対象物質を含む試料と、抗原または抗体を所定
   の物質で標識した標識抗原または抗体と、抗原または抗
   体を固相化した担体とを抗原抗体反応させた反応液に断
   続光を照射して発生する音響波を測定する光音響分光法
   によつて、前記担体に結合した前記標識抗原または抗体
   と、結合しない前記標識抗原または抗体とを分離測定し
   、測定対象物質量を求めることを特徴とする光音響分光
   法による免疫分析方法。 ２、前記担体の粒子径が、０．０１〜１００μｍの範囲
   内であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   光音響分光法による免疫分析方法。