JPH01215280A - 微生物の改良 - Google Patents
微生物の改良Info
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- JPH01215280A JPH01215280A JP3848288A JP3848288A JPH01215280A JP H01215280 A JPH01215280 A JP H01215280A JP 3848288 A JP3848288 A JP 3848288A JP 3848288 A JP3848288 A JP 3848288A JP H01215280 A JPH01215280 A JP H01215280A
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- Japan
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- gene
- microorganism
- promoter
- bacillus
- tryptophan
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は有用微生物の新規な改良方法及び該改良方法に
より製造された微生物、並びに該微生物を用いる有用物
資の製造方法に関する。本発明の微生物の改良方法は、
既存の遺伝子を含有する染色体に、該遺伝子の発現を制
御することができる発現制御配列を外部から導入するこ
とを特徴とする。
より製造された微生物、並びに該微生物を用いる有用物
資の製造方法に関する。本発明の微生物の改良方法は、
既存の遺伝子を含有する染色体に、該遺伝子の発現を制
御することができる発現制御配列を外部から導入するこ
とを特徴とする。
組換えＤＮＡ技術の発展、進歩によってホルモン、ワク
チン、インターフェロン等の蛋白質や酵素、アミノ酸、
さらにビタミンや抗生物質などの二次代謝産物に至るま
で、微生物中で大壁生産が可能となった。これは、物質
生産に係わる特定の遺伝子を適当な多コピー数のプラス
ミドベクター上にクローン化し、該プラスミドを適当な
微生物中に形質転換法で導入し、物質生産に係わる導入
した遺伝子を発現させることにより達成される。
チン、インターフェロン等の蛋白質や酵素、アミノ酸、
さらにビタミンや抗生物質などの二次代謝産物に至るま
で、微生物中で大壁生産が可能となった。これは、物質
生産に係わる特定の遺伝子を適当な多コピー数のプラス
ミドベクター上にクローン化し、該プラスミドを適当な
微生物中に形質転換法で導入し、物質生産に係わる導入
した遺伝子を発現させることにより達成される。
この際、活性の高いプロモーター遺伝子を有するプラス
ミドベクターを用いて、プロモーター遺伝子と目的遺伝
子を機能的に連結することにより、遺伝子の発現はより
効率的に行われる。しかしながら、プラスミドの脱落が
起こったり、プラスミドに変異や欠失が生じる等の為、
プラスミドベクターを用いた物質生産は一般的に不安定
であり安定的な物質生産には不適当なことがある。
ミドベクターを用いて、プロモーター遺伝子と目的遺伝
子を機能的に連結することにより、遺伝子の発現はより
効率的に行われる。しかしながら、プラスミドの脱落が
起こったり、プラスミドに変異や欠失が生じる等の為、
プラスミドベクターを用いた物質生産は一般的に不安定
であり安定的な物質生産には不適当なことがある。
これに代る方法として、宿主微生物の染色体に目的遺伝
子をインテグレーションせしめる方法があり、この方法
によれば外部から導入された遺伝子を多世代にわたって
安定に維持することができるが、該遺伝子の増幅度を上
げることが困難であり、このため目的とする生成物の生
産性に限界があるという欠点が存在する。
子をインテグレーションせしめる方法があり、この方法
によれば外部から導入された遺伝子を多世代にわたって
安定に維持することができるが、該遺伝子の増幅度を上
げることが困難であり、このため目的とする生成物の生
産性に限界があるという欠点が存在する。
従って、目的の物質に係る遺伝子が染色体中に安定に維
持されており、しかも該遺伝子が強力に発現され、目的
物質を効率よく生産することができる微生物及びその創
成方法が強く求められている。
持されており、しかも該遺伝子が強力に発現され、目的
物質を効率よく生産することができる微生物及びその創
成方法が強く求められている。
本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々検討した
結果、特定の目的物質の生産に係わる遺伝子をすでに含
有する微生物染色体に、該遺伝子の発現を増強すること
ができる強力なプロモーターを導入することにより、目
６勺物質を効率よく生産することができる微生物が得ら
れることを見出し、この発明を完成しな。
結果、特定の目的物質の生産に係わる遺伝子をすでに含
有する微生物染色体に、該遺伝子の発現を増強すること
ができる強力なプロモーターを導入することにより、目
６勺物質を効率よく生産することができる微生物が得ら
れることを見出し、この発明を完成しな。
従って、本発明は、目的物質の生産に係わる遺伝子を含
有する染色体を有する微生物の該染色体に、該遺伝子の
ための発現制御配列が、該遺伝子の発現を制御すること
ができる位置及び方向で導入されている改良された微生
物；該微生物の製造方法；並びに該微生物を培養して該
遺伝子に係わる生成物を生産せしめ、そして該生成物を
採取することを特徴とする有用物質の製造方法を提供し
ようとするものである。
有する染色体を有する微生物の該染色体に、該遺伝子の
ための発現制御配列が、該遺伝子の発現を制御すること
ができる位置及び方向で導入されている改良された微生
物；該微生物の製造方法；並びに該微生物を培養して該
遺伝子に係わる生成物を生産せしめ、そして該生成物を
採取することを特徴とする有用物質の製造方法を提供し
ようとするものである。
本発明は、目的物質の生産に係る遺伝子をすでにその染
色体中に有し該目的物質を生産することができる微生物
、及び目的物質の生産に係る遺伝子をすでにその染色体
中に有するが該目的物質を実質上生産することができず
新たに外部から発現制御遺伝子を導入することにより該
目的物質を生産することができる様になる微生物、のい
ずれにも適用することができる。この様な微生物として
、例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ニジエリシ
ア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒａ
ｔｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｍｓ
）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ）属等に属する微生物を挙げることができる
。バチルス属に属する微生物の例として、例えばバチル
ス・ズブチリス、バチルス・アミロリクエフアシエンス
、バチルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロサー
モフィラス等を挙げることができる。
色体中に有し該目的物質を生産することができる微生物
、及び目的物質の生産に係る遺伝子をすでにその染色体
中に有するが該目的物質を実質上生産することができず
新たに外部から発現制御遺伝子を導入することにより該
目的物質を生産することができる様になる微生物、のい
ずれにも適用することができる。この様な微生物として
、例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ニジエリシ
ア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒａ
ｔｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｍｓ
）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ）属等に属する微生物を挙げることができる
。バチルス属に属する微生物の例として、例えばバチル
ス・ズブチリス、バチルス・アミロリクエフアシエンス
、バチルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロサー
モフィラス等を挙げることができる。
本発明の方法により製造される目的物質は、遺伝子の直
接的な発現生成物である蛋白質又はポリペプチド、例え
ば各種の酵素型、例えばプロテア−ゼ、アミラーゼ、グ
ルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、トリプトファンシ
ンセターゼ；各種のペプチド性ホルモン類、例えばイン
シュリン、成長ホルモン、エンケファリン、ソマトスタ
チン；各種の抗原類、例えば肝炎ワクチン、ポリオワク
チン、ヘルペスワクチン；各種のリンホカイン類、例え
ばインターフェロン、インターロイキン等であることが
できる。
接的な発現生成物である蛋白質又はポリペプチド、例え
ば各種の酵素型、例えばプロテア−ゼ、アミラーゼ、グ
ルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、トリプトファンシ
ンセターゼ；各種のペプチド性ホルモン類、例えばイン
シュリン、成長ホルモン、エンケファリン、ソマトスタ
チン；各種の抗原類、例えば肝炎ワクチン、ポリオワク
チン、ヘルペスワクチン；各種のリンホカイン類、例え
ばインターフェロン、インターロイキン等であることが
できる。
本発明の方法により製造される目的物資はまた、遺伝子
の直接的発現生成物である１又は複数の酵素の触媒作用
により生産される物質であることができる。この様な物
質の例として複数のトリプトファン合成関連酵素により
合成されるＬ−）リプトファン、複数のスレオニン合成
関連酵素により合成されるし一スレオニン、複数のプリ
ンヌクレオチド合成酵素により合成されるイノシンやグ
アニン等を挙げることができる。この様な目的物質の生
産に係わる遺伝子としては、宿主微生物の染色体中に本
来存在する遺伝子であってもよく、又あらかじめ宿主微
生物の染色体中に人為的に挿入しておいた遺伝子であっ
てもよい、前者の遺伝子はその遺伝子に天然に付随する
発現制御配列を有しており、これに加えて本発明の方法
により追加の発現ｆｒＪ１ｍ配列を挿入することにより
、宿主による目的物質の生産を増強することができ、あ
るいはもともと目的物質を実質的に生産しなかった宿主
に目的物質を生産する能力を付与することができる。
ｆ＆者の場合も、多くの場合その構造遺伝子に付随する
発現制御領域を有しており、本発明の方法による強力な
発現制御配列を導入することにより、前記のごとき効果
を得ることができる。あらかじめ挿入された遺伝子がそ
の発現制御配列を伴っていない場合には、そのままでは
宿主微生物は目的物質を生産することができないが、本
発明の方法により発現制御配列を人為的に挿入すること
により該宿主微生物に目的物質を生産する能力を付与す
ることができる。この様な遺伝子を含有する微生物の具
体例として、枯草菌類のトリプトファン合成に係わる遺
伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子を試験管内でラ
イゲーションせしめ、トリプトファン生産菌である枯草
菌類の染色体中に両遺伝子をインテグレーションさせる
ことにより創製された、安定的に両遺伝子産物及びトリ
プトファンを生産する微生物が挙げられる（特開昭６１
−８５１８４、及び特開昭６１−８８８７３）。
の直接的発現生成物である１又は複数の酵素の触媒作用
により生産される物質であることができる。この様な物
質の例として複数のトリプトファン合成関連酵素により
合成されるＬ−）リプトファン、複数のスレオニン合成
関連酵素により合成されるし一スレオニン、複数のプリ
ンヌクレオチド合成酵素により合成されるイノシンやグ
アニン等を挙げることができる。この様な目的物質の生
産に係わる遺伝子としては、宿主微生物の染色体中に本
来存在する遺伝子であってもよく、又あらかじめ宿主微
生物の染色体中に人為的に挿入しておいた遺伝子であっ
てもよい、前者の遺伝子はその遺伝子に天然に付随する
発現制御配列を有しており、これに加えて本発明の方法
により追加の発現ｆｒＪ１ｍ配列を挿入することにより
、宿主による目的物質の生産を増強することができ、あ
るいはもともと目的物質を実質的に生産しなかった宿主
に目的物質を生産する能力を付与することができる。
ｆ＆者の場合も、多くの場合その構造遺伝子に付随する
発現制御領域を有しており、本発明の方法による強力な
発現制御配列を導入することにより、前記のごとき効果
を得ることができる。あらかじめ挿入された遺伝子がそ
の発現制御配列を伴っていない場合には、そのままでは
宿主微生物は目的物質を生産することができないが、本
発明の方法により発現制御配列を人為的に挿入すること
により該宿主微生物に目的物質を生産する能力を付与す
ることができる。この様な遺伝子を含有する微生物の具
体例として、枯草菌類のトリプトファン合成に係わる遺
伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子を試験管内でラ
イゲーションせしめ、トリプトファン生産菌である枯草
菌類の染色体中に両遺伝子をインテグレーションさせる
ことにより創製された、安定的に両遺伝子産物及びトリ
プトファンを生産する微生物が挙げられる（特開昭６１
−８５１８４、及び特開昭６１−８８８７３）。
発現制御配列としては例えばプロモーター、ターミネー
タ−１ＳＤ配列、オペレーターが挙げられ、これらは特
定の発現制御配列に依存して通常は染色体にあらかじめ
存在する、目的物質の生産に係わる構造遺伝子の上流又
は下流に、該構造遺伝子の転写方向に合わせて挿入され
る。前記制御配列の典型的な例はプロモーターであり、
これは一般に前記構造遺伝子の上流に該構造遺伝子の転
写方向に合わせて挿入される。例えば、ある特定の宿主
微生物については、該微生物中に天然に存在するプロモ
ーターをクローン化したもの、又は該微生物のファージ
中に天然に存在するプロモーターをクローン化したもの
、あるいはこれらのプロモーターに由来するバイブリド
プロモーター等を使用することができる。プロモーター
はまた、化学合成されたものであってもよい。
タ−１ＳＤ配列、オペレーターが挙げられ、これらは特
定の発現制御配列に依存して通常は染色体にあらかじめ
存在する、目的物質の生産に係わる構造遺伝子の上流又
は下流に、該構造遺伝子の転写方向に合わせて挿入され
る。前記制御配列の典型的な例はプロモーターであり、
これは一般に前記構造遺伝子の上流に該構造遺伝子の転
写方向に合わせて挿入される。例えば、ある特定の宿主
微生物については、該微生物中に天然に存在するプロモ
ーターをクローン化したもの、又は該微生物のファージ
中に天然に存在するプロモーターをクローン化したもの
、あるいはこれらのプロモーターに由来するバイブリド
プロモーター等を使用することができる。プロモーター
はまた、化学合成されたものであってもよい。
挿入すべき発現制御領域は通常、宿主微生物中で増幅す
ることができるプラスミドにより、あるいは宿主微生物
中で増幅することができない環状又は線状のＤＮＡとし
て導入される。目的とするＤＮＡを宿主微生物に導入す
るための方法として、ＤＮＡを細胞に挿入するために通
常用いられる方法のいずれか、例えばカルシウムセル法
（文献Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．．世、１０）２（１９
）４））、コンピテントセル法（文献Ｇｅｎｅ、１，１
５３（１９〕７））、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏ
１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１６８，１１１（１９７
９） ） 等を用いることができる。
ることができるプラスミドにより、あるいは宿主微生物
中で増幅することができない環状又は線状のＤＮＡとし
て導入される。目的とするＤＮＡを宿主微生物に導入す
るための方法として、ＤＮＡを細胞に挿入するために通
常用いられる方法のいずれか、例えばカルシウムセル法
（文献Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．．世、１０）２（１９
）４））、コンピテントセル法（文献Ｇｅｎｅ、１，１
５３（１９〕７））、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏ
１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１６８，１１１（１９７
９） ） 等を用いることができる。
プロモーター等の発現制御配列を宿主微生物の染色体に
インテグレーションする方法としては一般に、いわゆる
相同的交叉が用いられる。このなめ、挿入されるべき制
御配列はその一端又は両端に、染色体にすでに存在して
いる目的生成物の生産に係わる遺伝子のＤＮＡ配列と相
同なりＮＡ配列を有することが好ましい。
インテグレーションする方法としては一般に、いわゆる
相同的交叉が用いられる。このなめ、挿入されるべき制
御配列はその一端又は両端に、染色体にすでに存在して
いる目的生成物の生産に係わる遺伝子のＤＮＡ配列と相
同なりＮＡ配列を有することが好ましい。
本明ｍ書においては、具体例として、宿主微生物として
バチルス・アミロリクエフアシエンスを用い、目的物質
の生産に係わる遺伝子としてトリプトファンオペロンを
構成する遺伝子を用い、発現制御配列としてバチルス・
アミロリクエフアシエンス由来のプロモーター又はバチ
ルス・ズブチリスに感染する５ＰＯ２フアージ由来のプ
ロモーターを用いる。以下に、この具体例を実−雄側と
して記載する。
バチルス・アミロリクエフアシエンスを用い、目的物質
の生産に係わる遺伝子としてトリプトファンオペロンを
構成する遺伝子を用い、発現制御配列としてバチルス・
アミロリクエフアシエンス由来のプロモーター又はバチ
ルス・ズブチリスに感染する５ＰＯ２フアージ由来のプ
ロモーターを用いる。以下に、この具体例を実−雄側と
して記載する。
なお、実施例において酵素反応条件はおよそ次の通りと
した。
した。
旧ｎｄｌｌｌ消化 反応媒体： １００ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）。
−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）。
５０ｍＭ ＮａＣ１，５ｍＭ ＭｇＣＺ２酵素量
：ＤＮＡ１μｇに対して ５ユニツト 反応条件＝３７℃にて６０分間 １１ｉｎｄｌｌＩ部分消化 反応媒体： １００ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７
，５＞。
：ＤＮＡ１μｇに対して ５ユニツト 反応条件＝３７℃にて６０分間 １１ｉｎｄｌｌＩ部分消化 反応媒体： １００ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７
，５＞。
５０ｍＭ ＮａＣ１，５ｍＭ ＨｇＣｌ２酵素量 ：Ｄ
ＮＡ１μｇに対して ０．１ユニツト〜１ユニツト 反応条件二３７℃にて６０分間 Ｓｅａ Ｉ 消化 反応媒体： １（ＬａＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＩＣ１（ｐＨ８，０）。
ＮＡ１μｇに対して ０．１ユニツト〜１ユニツト 反応条件二３７℃にて６０分間 Ｓｅａ Ｉ 消化 反応媒体： １（ＬａＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＩＣ１（ｐＨ８，０）。
２０ｗ＋Ｍ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ酵素量 ：Ｄ
ＮＡ１μｇに対して １０ユニツト 反応条件二３７℃にて６０分間 Ｘｂａ Ｉ 消化 反応条件： １００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５） 。
ＮＡ１μｇに対して １０ユニツト 反応条件二３７℃にて６０分間 Ｘｂａ Ｉ 消化 反応条件： １００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５） 。
５０ｍＭ ＮａＣｊ！、５ｎ＋Ｍ ｔ４ｇｃ１２酵素量
：ＤＮＡ１μｇに対して ５ユニツト 反応条件＝３７℃にて６０分間 ＥｃｏＲＩ消化 反応媒体： １０（１ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＩＣ１（ｐＨ７，５） 。
：ＤＮＡ１μｇに対して ５ユニツト 反応条件＝３７℃にて６０分間 ＥｃｏＲＩ消化 反応媒体： １０（１ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＩＣ１（ｐＨ７，５） 。
５０ｍＭ ＮａＣ１，５μｌＭ ＨｇＣｌ２酵素量
：ＤＮＡ１μｇに対して ５ユニツト 反応条件＝３７℃にて６０分間 Ｂａｍ１ｌ Ｉ消化 反応媒体： １００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ｔｌｃｉ’（ｐＨ７，５） 。
：ＤＮＡ１μｇに対して ５ユニツト 反応条件＝３７℃にて６０分間 Ｂａｍ１ｌ Ｉ消化 反応媒体： １００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ｔｌｃｉ’（ｐＨ７，５） 。
５０＋＋＋Ｍ ＮａＣ１，５ｍＭ ＨｇＣｌ２酵素量
：ＤＮＡ１μｇに対して １０ユニツト 反応条件＝３７℃にて６０分間 ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメント （ｐｏｌＩ）処理 １１００ｅｉ Ｔｒｉｓ−ＩＩＣｌ
（ｐＨ７，５）、 ５０ｍＭＮａＣ１，５ｎＭ ｔ４ｇ
ｃ１ｚの緩衝液中で消化された１μｓのＤＮＡ （２０ μｍ）に対して、ＤＮＡポリメラ ーゼ■・Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを３ユニツト（１μ
ｌ）、各ｄＸＴＰ ２ｎ ｍｏｌｅ（２ｍＭ溶液を１μＮ）加え、室温で３
０分間インキュベ ーションする。
：ＤＮＡ１μｇに対して １０ユニツト 反応条件＝３７℃にて６０分間 ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメント （ｐｏｌＩ）処理 １１００ｅｉ Ｔｒｉｓ−ＩＩＣｌ
（ｐＨ７，５）、 ５０ｍＭＮａＣ１，５ｎＭ ｔ４ｇ
ｃ１ｚの緩衝液中で消化された１μｓのＤＮＡ （２０ μｍ）に対して、ＤＮＡポリメラ ーゼ■・Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを３ユニツト（１μ
ｌ）、各ｄＸＴＰ ２ｎ ｍｏｌｅ（２ｍＭ溶液を１μＮ）加え、室温で３
０分間インキュベ ーションする。
細菌アルカリ性ホス
ファーターゼ（ＢＡＰ）
処理 制限酵素で消化された１μｇＤＮＡ溶液
に対して０．３ユニツ トのＢＡＰを加え、５５℃、 ３０分間インキュベーションす る。
に対して０．３ユニツ トのＢＡＰを加え、５５℃、 ３０分間インキュベーションす る。
Ｔ４ ＤＮ＾リガーゼ
による連結 １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ’（ｐＨ
７，５＞、５０ｍＭＮａＣ１，５＋ｓＭ ＭｇＣ１ｚ中
で消化された各ＤＮＡ溶液を混合後、１００μＨ になる様にＡＴＰを加え、さら にＴ４ ＤＮ＾リガーゼを３０ユニツ ト添加し、１５℃で１夜インキ ュベーションする。
７，５＞、５０ｍＭＮａＣ１，５＋ｓＭ ＭｇＣ１ｚ中
で消化された各ＤＮＡ溶液を混合後、１００μＨ になる様にＡＴＰを加え、さら にＴ４ ＤＮ＾リガーゼを３０ユニツ ト添加し、１５℃で１夜インキ ュベーションする。
まず、プロモーター検索ベクターｐＧＲ７１（Ｎａｔｕ
ｒｅ。
ｒｅ。
２９３．３０９（１９８１） Ｇｏｌｄｆａｒｂ、Ｄ、
Ｓ、ｅｔ ａｌ、） （このベクターは当業界において
広く使用されており、容易に入手することができる。）
を制限酵素旧ｎｃｌｎ［で消化し、これと同じく制限酵
素旧ｎｄｌｌｌで消化したバチルス・アミロリクエフア
シエンス■＾Ｍ １５２１の染色体ＤＮＡとを試験管内
で混合し、Ｔ４ ＤＮ＾リガーゼを用いて連結反応を行
った後、バチルス・ズブチリスυＯＴ ０５３１ （東
京大学応用微生物研究所）にプロトプラスト形質転換法
（Ｓ、Ｃｈａｎｇ ＆ Ｓ、Ｎ。
Ｓ、ｅｔ ａｌ、） （このベクターは当業界において
広く使用されており、容易に入手することができる。）
を制限酵素旧ｎｃｌｎ［で消化し、これと同じく制限酵
素旧ｎｄｌｌｌで消化したバチルス・アミロリクエフア
シエンス■＾Ｍ １５２１の染色体ＤＮＡとを試験管内
で混合し、Ｔ４ ＤＮ＾リガーゼを用いて連結反応を行
った後、バチルス・ズブチリスυＯＴ ０５３１ （東
京大学応用微生物研究所）にプロトプラスト形質転換法
（Ｓ、Ｃｈａｎｇ ＆ Ｓ、Ｎ。
Ｃｏｈｅｎ、Ｍｏ１ｅｃ、ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１６８
，１１１（１９７９） ） で導入し、２５ｐｐｍの
クロラムフェニコールを含むし寒天プレートに生える形
質転換体を多数取得した。
，１１１（１９７９） ） で導入し、２５ｐｐｍの
クロラムフェニコールを含むし寒天プレートに生える形
質転換体を多数取得した。
次にこの形質転換体のクロラムフェニコール耐性塵およ
びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの
活性を測定し、活性が一番高い形質転換体バチルス・ズ
ブチリスＴＦＫフ５６を高活性プロモーターがクローン
化されている株として選んだ。
びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの
活性を測定し、活性が一番高い形質転換体バチルス・ズ
ブチリスＴＦＫフ５６を高活性プロモーターがクローン
化されている株として選んだ。
ＴＦＫ７５６からプラスミドを分離・精製し、クローン
化されていた０、３ＨＤの大きさの旧ｎｄＩＩＩ断片Ｄ
ＮＡをプロモーター活性を有する配列Ｐ７５６と命名、
Ｐ２Ｓ５がクローン化されたｐＧＲ７１をｐＳＤＫ ７
５６と命名した。
化されていた０、３ＨＤの大きさの旧ｎｄＩＩＩ断片Ｄ
ＮＡをプロモーター活性を有する配列Ｐ７５６と命名、
Ｐ２Ｓ５がクローン化されたｐＧＲ７１をｐＳＤＫ ７
５６と命名した。
次にｐＳＤＫ ７５６のＰ７５６プロモーターの上流に
マーカーとしてのテトラサイクリン耐性遺伝子を組込む
為に枯草菌プラスミドｐＴＰ５を制限酵素口ｎｄＩ［Ｉ
で消化し、これと同じく制限酵素口ｎｄＩ［Ｉで部分消
化したｐＳＤＫ ７５６とを混合し、Ｔ４ ＤＮ＾リガ
ーゼを用いて結合反応を行った後、大腸菌Ｃ６００に形
質転換を行い、テトラサイクリン耐性で、かつクロラム
フェニコール耐性となる形質転換体を得た。これにより
ｐＳＤＫ ７５６のＰ７５６上流に１．５ＨＤのテトラ
サイクリン耐性遺伝子を組込んだプラスミツドｐｓＤＫ
２７３６４を作製した。
マーカーとしてのテトラサイクリン耐性遺伝子を組込む
為に枯草菌プラスミドｐＴＰ５を制限酵素口ｎｄＩ［Ｉ
で消化し、これと同じく制限酵素口ｎｄＩ［Ｉで部分消
化したｐＳＤＫ ７５６とを混合し、Ｔ４ ＤＮ＾リガ
ーゼを用いて結合反応を行った後、大腸菌Ｃ６００に形
質転換を行い、テトラサイクリン耐性で、かつクロラム
フェニコール耐性となる形質転換体を得た。これにより
ｐＳＤＫ ７５６のＰ７５６上流に１．５ＨＤのテトラ
サイクリン耐性遺伝子を組込んだプラスミツドｐｓＤＫ
２７３６４を作製した。
さらに図１に示したようにまずｐＳＤＫ ２７３６４を
制限酵素ｌｌ１ｎｄｌＩ［で部分消化し、Ｋｌｅｎｏｗ
Ｆｒａｇ＋５ｅｎｔと４種のＸＴＰを用いて、平滑末
端を作った０次に、Ｓｎ＋ａ Ｉ で消化しＢＡＰで
脱リン酸化したｐｕｃ ｔｓと混合し、Ｔ４ ＤＮ＾リ
ガーゼを用いて結合反応を行い、大腸菌ＪＭ １０９に
形質転換を行い、プラスミドｐＳＤＫ２７３６５を含む
、アンピシリン、テトラサイクリン耐性を示す形質転換
体をスクリーニングした。これにより、テトラサイクリ
ン耐性のマーカーが付与されたＰ）５６を有するＤＮＡ
断片の調製ができるプラスミドが取得された。
制限酵素ｌｌ１ｎｄｌＩ［で部分消化し、Ｋｌｅｎｏｗ
Ｆｒａｇ＋５ｅｎｔと４種のＸＴＰを用いて、平滑末
端を作った０次に、Ｓｎ＋ａ Ｉ で消化しＢＡＰで
脱リン酸化したｐｕｃ ｔｓと混合し、Ｔ４ ＤＮ＾リ
ガーゼを用いて結合反応を行い、大腸菌ＪＭ １０９に
形質転換を行い、プラスミドｐＳＤＫ２７３６５を含む
、アンピシリン、テトラサイクリン耐性を示す形質転換
体をスクリーニングした。これにより、テトラサイクリ
ン耐性のマーカーが付与されたＰ）５６を有するＤＮＡ
断片の調製ができるプラスミドが取得された。
前記プラスミドｐＳＤＫ ２フ３６５をＥｃｏＲＩ及び
Ｘｂａ １で消化、アガロース電気泳動により分離し、
フェノール抽出及びエタノール沈澱により精製すること
により、テトラサイクリン耐性遺伝子及びプロモーター
Ｐ７５６を含有する１、８ＨＤのＥｃｏＲＩ −Ｘｂａ
Ｉ、 断片を調製した。
Ｘｂａ １で消化、アガロース電気泳動により分離し、
フェノール抽出及びエタノール沈澱により精製すること
により、テトラサイクリン耐性遺伝子及びプロモーター
Ｐ７５６を含有する１、８ＨＤのＥｃｏＲＩ −Ｘｂａ
Ｉ、 断片を調製した。
一方、バチルス・アミロリクエフアシエンスのトリプト
ファン合成系遺伝子が大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２に
クローニングされているプラスミドｐｓＤＴ１１１１を
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ Ｉ で消化し、アガ
ロースゲル電気泳動により分離し、そしてフェノール抽
出及びエタノール沈澱により精製することにより、トリ
プトファン合成系遺伝子の上流部分を含有する２、５Ｈ
Ｄの大きさのＥｃｏＲＩ −Ｘｂａ １フラグメントを
得た。なお、前記プラスミドｐｓＤＴ１１１１を含有す
る大腸菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第７８６１号（ＦＥＲＭＰ−７８６１）として寄託
されている。
ファン合成系遺伝子が大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２に
クローニングされているプラスミドｐｓＤＴ１１１１を
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ Ｉ で消化し、アガ
ロースゲル電気泳動により分離し、そしてフェノール抽
出及びエタノール沈澱により精製することにより、トリ
プトファン合成系遺伝子の上流部分を含有する２、５Ｈ
Ｄの大きさのＥｃｏＲＩ −Ｘｂａ １フラグメントを
得た。なお、前記プラスミドｐｓＤＴ１１１１を含有す
る大腸菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第７８６１号（ＦＥＲＭＰ−７８６１）として寄託
されている。
次に、両フラグメント約１μｇずつを混合し、Ｔ４ Ｄ
Ｎ＾リガーゼを用いて連結反応を行い、これを用いてバ
チルス・アミロリクエフアシエンスのトリプトファン生
産株バチルス５Ｄ３０のコンビテン１〜セルを次の様に
して形質転換した。
Ｎ＾リガーゼを用いて連結反応を行い、これを用いてバ
チルス・アミロリクエフアシエンスのトリプトファン生
産株バチルス５Ｄ３０のコンビテン１〜セルを次の様に
して形質転換した。
まず、ＴＢＡ［ｌ寒天培地ＣＤ１ｆｃｏ社、Ｂａｃｔｏ
Ｔｒｙｐｔｏｓｅｌｏｇ、 Ｂａｃｔｏ Ｂｅｅｆ
Ｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ％ＮａＣ１５ｇ１Ｂａｃｔ。
Ｔｒｙｐｔｏｓｅｌｏｇ、 Ｂａｃｔｏ Ｂｅｅｆ
Ｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ％ＮａＣ１５ｇ１Ｂａｃｔ。
＾ｇａｒ １５ｇ ； １１２０１１’）で画線培養し
たバチルス５Ｄ３０をＣＩ培地（に２１１Ｐ０４１４ｇ
、 ＫＨ２ＰＯ４６ｇ、（ＮＨ４）２Ｓ０゜２ｇ、クエ
ン酸ナトリウム・２Ｈ２０１ｇ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
０５−、グルコース５ｇ、カザミノ酸０．２ｇ、Ｌ−）
リプトファン５０ｐｐａ＋、 Ｈ２Ｏ１１）に００６６
０が０．０５になる様に接種、３７℃で振とう培養し、
００６６０が約０．５になった時点で遠心分離（４００
０ｒｐｍ、 １０分間）し、沈澱をｃｎ培地（Ｋ２ＨＰ
Ｏ４１４ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４６ｇ、（ＮＨ４）２Ｓ０４
２ｇ、クエン酸ナトリウム・２Ｈ２０１ｇ、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２０５ｇＭ、グルコース５ｇ、カザミノ酸０．１
ｇ、Ｌ−トリプトファン５ｐｐｍ）で、２倍に希釈され
るように懸濁した。さらに３７℃で振どう培養を続け、
３０分後に、連結反応を行なったＤＮＡ溶液を加え、３
７℃で振とうを１時間行ない、テトラサイクリンを５
ｐｐｍ含むＴＢＡＢ寒天培地に塗布した。
たバチルス５Ｄ３０をＣＩ培地（に２１１Ｐ０４１４ｇ
、 ＫＨ２ＰＯ４６ｇ、（ＮＨ４）２Ｓ０゜２ｇ、クエ
ン酸ナトリウム・２Ｈ２０１ｇ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
０５−、グルコース５ｇ、カザミノ酸０．２ｇ、Ｌ−）
リプトファン５０ｐｐａ＋、 Ｈ２Ｏ１１）に００６６
０が０．０５になる様に接種、３７℃で振とう培養し、
００６６０が約０．５になった時点で遠心分離（４００
０ｒｐｍ、 １０分間）し、沈澱をｃｎ培地（Ｋ２ＨＰ
Ｏ４１４ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４６ｇ、（ＮＨ４）２Ｓ０４
２ｇ、クエン酸ナトリウム・２Ｈ２０１ｇ、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２０５ｇＭ、グルコース５ｇ、カザミノ酸０．１
ｇ、Ｌ−トリプトファン５ｐｐｍ）で、２倍に希釈され
るように懸濁した。さらに３７℃で振どう培養を続け、
３０分後に、連結反応を行なったＤＮＡ溶液を加え、３
７℃で振とうを１時間行ない、テトラサイクリンを５
ｐｐｍ含むＴＢＡＢ寒天培地に塗布した。
３７℃で１夜培養後に、テトラサイクリン耐性の形質転
換体が取得された。
換体が取得された。
この様にして、相同的交叉によりプロモーターＰ７５６
が染色体上のトリプトファン合成系遺伝子のすぐ上流に
インテグレーションされ、目的とするトリプトファン生
産株が得られた。この相同的交叉の結果を第２図に模式
的に示す。
が染色体上のトリプトファン合成系遺伝子のすぐ上流に
インテグレーションされ、目的とするトリプトファン生
産株が得られた。この相同的交叉の結果を第２図に模式
的に示す。
入（第３図）
第３図に示す出発プラスミドｐｓＤ［ｌ １３６は、枯
草菌ファージ５ＰＯ２由来のプロモーター（Ｐ２Ｏ３）
を含有する０、ｌ７ＨＤのＥｃｏＲＩフラグメントを含
有し、その下流に制限酵素切断点Ｂａｍ１ｌ ｌ 、
Ｓａｌ Ｉ 及びＰｓｔ Ｉを含み、さらにその下流
にバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉ！
ｕｓユ）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子の構造
遺伝子を含有する５ＨＤの大きさのプラスミドである。
草菌ファージ５ＰＯ２由来のプロモーター（Ｐ２Ｏ３）
を含有する０、ｌ７ＨＤのＥｃｏＲＩフラグメントを含
有し、その下流に制限酵素切断点Ｂａｍ１ｌ ｌ 、
Ｓａｌ Ｉ 及びＰｓｔ Ｉを含み、さらにその下流
にバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉ！
ｕｓユ）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子の構造
遺伝子を含有する５ＨＤの大きさのプラスミドである。
該プラスミドはｐＰＬ７０８（（：ｅｎｅ 。
１６．１９９（１９８１）＞（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ。
ｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ。
オハイオ・ステート・ユニバージティーから商業的に入
手することができる。）をＥｃｏＲｌとＢｇｌ Ｉ［で
消化し、ＥｃｏＲＩとＢａｍ１ｌｌで消化したｐＢＲ３
２２と混合、Ｔ４ ＤＮ＾リガーゼで結合反応後、大腸
菌ｃ６００に形質転換を行ない、得られたクロラムフェ
ニコール耐性の形質転換体から調製される。
手することができる。）をＥｃｏＲｌとＢｇｌ Ｉ［で
消化し、ＥｃｏＲＩとＢａｍ１ｌｌで消化したｐＢＲ３
２２と混合、Ｔ４ ＤＮ＾リガーゼで結合反応後、大腸
菌ｃ６００に形質転換を行ない、得られたクロラムフェ
ニコール耐性の形質転換体から調製される。
プラスミドｐＳＤＢ １３６を制限酵素ＢａｍＨＩで消
化し、次に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフ
ラグメントで処理した。他方、プラスミドｐＳＤＴ １
１１を制限酵素ＥｃｏＲ（で消化し、次に大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理した
。両ＤＮＡ断片を混合した後、Ｔ４ ＤＮ＾リガーゼに
より連結し、この生成物を用いてトリプトファン要求性
大腸菌Ｊ＾２２１を形質転換した。得られたトリプトフ
ァン非要求性、アンピシリン耐性でかつクロラムフェニ
コール耐性の形質転換体よりプラスミドを抽出、分析し
て５ＰＯ２フアージ由来プロモーターとトリプトファン
合成系遺伝子を含むフラグメントが機能的に連結してい
る大きさｌ０ＨＤの組替えプラスミド、５ＥＹ１２１３
が得られた。
化し、次に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフ
ラグメントで処理した。他方、プラスミドｐＳＤＴ １
１１を制限酵素ＥｃｏＲ（で消化し、次に大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理した
。両ＤＮＡ断片を混合した後、Ｔ４ ＤＮ＾リガーゼに
より連結し、この生成物を用いてトリプトファン要求性
大腸菌Ｊ＾２２１を形質転換した。得られたトリプトフ
ァン非要求性、アンピシリン耐性でかつクロラムフェニ
コール耐性の形質転換体よりプラスミドを抽出、分析し
て５ＰＯ２フアージ由来プロモーターとトリプトファン
合成系遺伝子を含むフラグメントが機能的に連結してい
る大きさｌ０ＨＤの組替えプラスミド、５ＥＹ１２１３
が得られた。
このプラスミドｐｓＥＹ１２１３を用い、実施例１に記
載したのと同様にしてバチルス・アミロリクエフアシエ
ンスのトリプトファン生産株バチルス５Ｄ−３０のコン
ピテントセルを形質転換した。こうして、相同的交叉に
よりプロモーターＰ２Ｏ１が染色体上のトリプトファン
合成系遺伝子のすぐ上流にインテグレーションされ、目
的とするトリプトファン生産株が得られた。この相同的
交叉の結果を第３図に模式的に示す。
載したのと同様にしてバチルス・アミロリクエフアシエ
ンスのトリプトファン生産株バチルス５Ｄ−３０のコン
ピテントセルを形質転換した。こうして、相同的交叉に
よりプロモーターＰ２Ｏ１が染色体上のトリプトファン
合成系遺伝子のすぐ上流にインテグレーションされ、目
的とするトリプトファン生産株が得られた。この相同的
交叉の結果を第３図に模式的に示す。
夾１例（トリプトファン人 系」ＵＩケ免現２ＩｌｌＩ
菌染色体上のトリプトファン遺伝子近傍に、プロモータ
ー配列を挿入した菌株バチルス５Ｄ１０３４、及びバチ
ルス５Ｄ１０３５の生産する酵素トリプトファンシンセ
ターゼおよびアントラニールシンセターゼ活量を両酵素
の活性測定により測った。
菌染色体上のトリプトファン遺伝子近傍に、プロモータ
ー配列を挿入した菌株バチルス５Ｄ１０３４、及びバチ
ルス５Ｄ１０３５の生産する酵素トリプトファンシンセ
ターゼおよびアントラニールシンセターゼ活量を両酵素
の活性測定により測った。
プロモーターの導入されていない親株バチルス５Ｄ３０
、並びにプロモーターが導入されている株バチルス５Ｄ
１０３４、及びバチルス５Ｄ１０３５をＴＢＡＢ寒天培
地（Ｄｉｆｃｏ社）で前培養し、５ｐｉｚｉｚｅｎ最少
培地１００社にＯＤ ＜６６０ｎｓ）が約０．０３にな
るように接種し、３７℃で○Ｄ （６６０ｎｍ）が約０
．５になるまで振とう培養した。 ５０００ｒｐｍ 、
１５分間冷却遠心を行い、沈澱をバッファー１ （０
，０２５８ＫＨ２ＰＯ４，０，０７５ＭＫ２ＨＰＯ，、
ｐＨ７，３，０，０１８Ｌ−グルタミン、１０％グリセ
リン）で洗浄遠心後、２社のバッファー■ −（０
，０２５Ｍ ＫＨ３ＰＯ，，０，０７５Ｍ Ｋ２）ＩＰ
Ｏ，、ｐＨ７，３−０，０１ＭＬ−グルタミン、４ｍＭ
ＭｇＣｌ２２．４０％グリセリン）に懸濁した。リゾ
チーム０．５ｍｇ、 ＤＮａｓｅ ５μｇ添加し、３７
°Ｃで３０分間インキュベーションした。
、並びにプロモーターが導入されている株バチルス５Ｄ
１０３４、及びバチルス５Ｄ１０３５をＴＢＡＢ寒天培
地（Ｄｉｆｃｏ社）で前培養し、５ｐｉｚｉｚｅｎ最少
培地１００社にＯＤ ＜６６０ｎｓ）が約０．０３にな
るように接種し、３７℃で○Ｄ （６６０ｎｍ）が約０
．５になるまで振とう培養した。 ５０００ｒｐｍ 、
１５分間冷却遠心を行い、沈澱をバッファー１ （０
，０２５８ＫＨ２ＰＯ４，０，０７５ＭＫ２ＨＰＯ，、
ｐＨ７，３，０，０１８Ｌ−グルタミン、１０％グリセ
リン）で洗浄遠心後、２社のバッファー■ −（０
，０２５Ｍ ＫＨ３ＰＯ，，０，０７５Ｍ Ｋ２）ＩＰ
Ｏ，、ｐＨ７，３−０，０１ＭＬ−グルタミン、４ｍＭ
ＭｇＣｌ２２．４０％グリセリン）に懸濁した。リゾ
チーム０．５ｍｇ、 ＤＮａｓｅ ５μｇ添加し、３７
°Ｃで３０分間インキュベーションした。
３０、ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心し上清を粗酵素液と
した。
した。
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｇｙｍｏｌｏｇｙ、５，７９
４（１９６２）に従って行っなトリプトファンシンセタ
ーゼ活性測定の結果、およびＧｅｎｅｔｉｃｓ、５２．
１３０３（１９６５）に従って行っなアントラニール酸
シンセターゼ活性測定の結果を示す。
４（１９６２）に従って行っなトリプトファンシンセタ
ーゼ活性測定の結果、およびＧｅｎｅｔｉｃｓ、５２．
１３０３（１９６５）に従って行っなアントラニール酸
シンセターゼ活性測定の結果を示す。
菌株 トリプトファン アントラニールシンセター
ゼ活性 酸シンセターゼ ５Ｄ３０ １００ １００ＳＤ
１０３４ ２５０ ３００ＳＤ１０
３５ ３００ ３２０バチルス５Ｄ
１０３４においては、Ｐ７５６プロモーター及びアント
ラニール酸シンセターゼ遺伝子を含有するトリプトファ
ン合成系遺伝子の上流部分が宿主細菌の染色体上のトリ
１）・ファン合成系遺伝子の近傍に導入されており、こ
の結果として染色体上に元から存在したトリプトファン
合成系の遺伝子の発現が強化されていると共に、追加の
アントラニール酸シンセターゼ遺伝子が導入されている
。
ゼ活性 酸シンセターゼ ５Ｄ３０ １００ １００ＳＤ
１０３４ ２５０ ３００ＳＤ１０
３５ ３００ ３２０バチルス５Ｄ
１０３４においては、Ｐ７５６プロモーター及びアント
ラニール酸シンセターゼ遺伝子を含有するトリプトファ
ン合成系遺伝子の上流部分が宿主細菌の染色体上のトリ
１）・ファン合成系遺伝子の近傍に導入されており、こ
の結果として染色体上に元から存在したトリプトファン
合成系の遺伝子の発現が強化されていると共に、追加の
アントラニール酸シンセターゼ遺伝子が導入されている
。
このため、トリプトファンシンセターゼ活性が約２．５
倍に増強され、アントラニール酸シンセターゼ活性は約
３．０倍に増強された。他方、バチルス５Ｄ１０３５に
おいては、トリプトファン合成系遺伝子の２倍体が形成
されており、さらにその片方の１〜リブトファン合成系
遺伝子近傍にＰ２Ｏ１プロモ一ター配列ＤＮＡが導入さ
れていることにより、アントラニル酸シンセターゼ活性
、及びトリプトファンシンセターゼ 実施例５． Ｌ−トリプト−２アンの聚庵グルコース
５％、硫安０．２％、Ｋ２１１ＰＯ． １．４％、Ｋ１
２Ｐ０４０．ｆ３％、クエン酸ナトリウム・２Ｈ２０１
ｇ、阿ｇｓＱ． ・ ７Ｈ２０ ０．０２％、 Ｆ
ｅＳ０４ ・ ７Ｈ２０ １ ｐｐｍ， ＭｌＩＳ
Ｏ４１ ｐｐｍを含む培地（ｐＨ ７．０） ２ Ｌに
アントラニル酸８００ｐｐｍを添加し、これにプロモー
ターの導入されていない親株バチルスＳＤ３０、並びに
プロモーターが導入された株バチルスＳＤ１０３４、及
びバチルスＳＤ１０３５を植菌し、３５℃で５Ｌのジャ
ーファメンターで通気撹はん培養しな．培養中、アント
ラニル酸濃度が５０ｐｐ＋ｓ以下まで減少した時点でア
ントラニル酸濃度４度が約ｔｏｏｏｐｐ−になるように
適宜追加添加し、また培養途中グルコースを１００ｇ追
加し、更にアンモニア水の添加により培地のｐＨを７．
０±０、４に保ちながら１５時間培養した。培養液中に
蓄積されたＬ−トリプトファンの量を高速液体クロマＩ
・グラフィーにより測定した結果を下に示す。
倍に増強され、アントラニール酸シンセターゼ活性は約
３．０倍に増強された。他方、バチルス５Ｄ１０３５に
おいては、トリプトファン合成系遺伝子の２倍体が形成
されており、さらにその片方の１〜リブトファン合成系
遺伝子近傍にＰ２Ｏ１プロモ一ター配列ＤＮＡが導入さ
れていることにより、アントラニル酸シンセターゼ活性
、及びトリプトファンシンセターゼ 実施例５． Ｌ−トリプト−２アンの聚庵グルコース
５％、硫安０．２％、Ｋ２１１ＰＯ． １．４％、Ｋ１
２Ｐ０４０．ｆ３％、クエン酸ナトリウム・２Ｈ２０１
ｇ、阿ｇｓＱ． ・ ７Ｈ２０ ０．０２％、 Ｆ
ｅＳ０４ ・ ７Ｈ２０ １ ｐｐｍ， ＭｌＩＳ
Ｏ４１ ｐｐｍを含む培地（ｐＨ ７．０） ２ Ｌに
アントラニル酸８００ｐｐｍを添加し、これにプロモー
ターの導入されていない親株バチルスＳＤ３０、並びに
プロモーターが導入された株バチルスＳＤ１０３４、及
びバチルスＳＤ１０３５を植菌し、３５℃で５Ｌのジャ
ーファメンターで通気撹はん培養しな．培養中、アント
ラニル酸濃度が５０ｐｐ＋ｓ以下まで減少した時点でア
ントラニル酸濃度４度が約ｔｏｏｏｐｐ−になるように
適宜追加添加し、また培養途中グルコースを１００ｇ追
加し、更にアンモニア水の添加により培地のｐＨを７．
０±０、４に保ちながら１５時間培養した。培養液中に
蓄積されたＬ−トリプトファンの量を高速液体クロマＩ
・グラフィーにより測定した結果を下に示す。
Ｓ０３０ ４。７
ＳＤ１０３４ ８．９ＳＤ１０３５
１５．１上の表から明らかな様に、本
発明のプロモーターの導入によって染色体上のトリプト
ファン合成系遺伝子の発現が増強されたバチルスＳＤ１
０３４は親株ＳＤ３０に比べて約２倍のトリプトファン
を蓄積した。他方、プロモーターのほかに追加のトリプ
トファン合成系遺伝子が導入されたバチルスＳＤ１０３
５は親株ＳＤ３０に比べて約３倍のトリプトファンを蓄
積した。
１５．１上の表から明らかな様に、本
発明のプロモーターの導入によって染色体上のトリプト
ファン合成系遺伝子の発現が増強されたバチルスＳＤ１
０３４は親株ＳＤ３０に比べて約２倍のトリプトファン
を蓄積した。他方、プロモーターのほかに追加のトリプ
トファン合成系遺伝子が導入されたバチルスＳＤ１０３
５は親株ＳＤ３０に比べて約３倍のトリプトファンを蓄
積した。
実９施−例６１
バチルスＳＤ１０３４、及びバチルスＳＤ１０３５に於
いてプロモーター配列ＤＮＡがトリプトファン遺伝子の
近傍に導入されていることは次の様なサザンハイプリダ
イゼイション法により確認しな。
いてプロモーター配列ＤＮＡがトリプトファン遺伝子の
近傍に導入されていることは次の様なサザンハイプリダ
イゼイション法により確認しな。
バチルスＳＤ１０３４、及びバチルスＳＤ１０３５をＬ
培地３００ｍｌ’で３５℃、１夜振とう培養して、通常
のＤＮＡ抽出法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．＾
ｅｔａ ７２，６１９。
培地３００ｍｌ’で３５℃、１夜振とう培養して、通常
のＤＮＡ抽出法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．＾
ｅｔａ ７２，６１９。
（１９６３））により染色体ＤＮＡを抽出・精製し約１
ｍｇを得た。各ＤＮＡＩμｇずつを制限酵素Ｂａｗｌ
Ｅ、ＥｃｏＲ Ｉ 、Ｘｂａ Ｉ で夫々完全に消化
し、アガロース電気泳動を行った。常法に従ってアルカ
リ変性、中和後、ニトロセルロースフィルターにＤＮＡ
をトランスファーした。フィルターを洗浄後，。８０℃
で２時間熱処理した。
ｍｇを得た。各ＤＮＡＩμｇずつを制限酵素Ｂａｗｌ
Ｅ、ＥｃｏＲ Ｉ 、Ｘｂａ Ｉ で夫々完全に消化
し、アガロース電気泳動を行った。常法に従ってアルカ
リ変性、中和後、ニトロセルロースフィルターにＤＮＡ
をトランスファーした。フィルターを洗浄後，。８０℃
で２時間熱処理した。
プローブＤＮＡとして別に精製したトリプトファン遺伝
子を含む５ＨＤのＥｃｏＲ ＩフラグメントとＰ７５６
プロモーターを含む０．３ＨＤの旧ｎｄｌ［フラグメン
トとＰ２０１プロモーターを含む０．１８ＭＤのＥｃｏ
Ｒ Ｔフラグメントをニックトランスレーション法によ
り〔γ−３２Ｐ） ｄＣＴＰでラベルして比活性４０μ
Ｃｉ／１００ｎＨのプローブＤＮＡを作製した。
子を含む５ＨＤのＥｃｏＲ ＩフラグメントとＰ７５６
プロモーターを含む０．３ＨＤの旧ｎｄｌ［フラグメン
トとＰ２０１プロモーターを含む０．１８ＭＤのＥｃｏ
Ｒ Ｔフラグメントをニックトランスレーション法によ
り〔γ−３２Ｐ） ｄＣＴＰでラベルして比活性４０μ
Ｃｉ／１００ｎＨのプローブＤＮＡを作製した。
前述のフィルターをプレハイブリダイゼーション溶液（
６ＸＳＳＣ、５×デンハルｔ・溶液中で４２℃２時間イ
ンキュベーションの後４０μＣｉのプローブＤＮＡと５
０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液（
６ＸＳＳＣ、２×デンハルト溶液中で４２℃１夜インキ
ユベーシヨンした．次にフィルターを２回、３７℃で１
５分間緩衝液（２ＸＳＳＣ）中でインキュベーションし
低塩濃度の緩衝液（０．ＩＸＳＳＣ）に移し、２回、３
７℃で５分間洗浄した．フィルターの水分を拭きとリコ
ダックＸＡＲ５フィルムを用いて一８０℃で３時間オー
トラジオグラフィーを行った。
６ＸＳＳＣ、５×デンハルｔ・溶液中で４２℃２時間イ
ンキュベーションの後４０μＣｉのプローブＤＮＡと５
０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液（
６ＸＳＳＣ、２×デンハルト溶液中で４２℃１夜インキ
ユベーシヨンした．次にフィルターを２回、３７℃で１
５分間緩衝液（２ＸＳＳＣ）中でインキュベーションし
低塩濃度の緩衝液（０．ＩＸＳＳＣ）に移し、２回、３
７℃で５分間洗浄した．フィルターの水分を拭きとリコ
ダックＸＡＲ５フィルムを用いて一８０℃で３時間オー
トラジオグラフィーを行った。
その結果、バチルス５Ｄ１０３４の場合、Ｂａｍ１ｌ
Ｉで消化した７ＨＤの大きさ付近にトリプトファン遺伝
子を含むフラグメントプローブでも、Ｐ２Ｓ５を含むフ
ラグメントプローブでもシグナルが生じた。又、Ｅｃｏ
ＲＩで消化した４、３ＨＤの大きさ付−近にトリプトフ
ァン遺伝子を含むフラグメントプローブでもＰ２Ｓ５を
含むフラグメントプローブでもシグナルが生じ、更にＸ
ｂａ Ｔ で消化した４ 、 ３ＨＤの大きさ付近に
もトリプトファン遺伝子を含むフラグメントプローブで
もＰ２Ｓ５を含むフラグメントプローブでもシグナルが
生じた。従ってバチルス５Ｄ１０３４のトリプトファン
遺伝子付近の構造は第２図のようであり、プロモーター
配列がトリプトファン遺伝子の近傍に導入されているこ
とが確認された。
Ｉで消化した７ＨＤの大きさ付近にトリプトファン遺伝
子を含むフラグメントプローブでも、Ｐ２Ｓ５を含むフ
ラグメントプローブでもシグナルが生じた。又、Ｅｃｏ
ＲＩで消化した４、３ＨＤの大きさ付−近にトリプトフ
ァン遺伝子を含むフラグメントプローブでもＰ２Ｓ５を
含むフラグメントプローブでもシグナルが生じ、更にＸ
ｂａ Ｔ で消化した４ 、 ３ＨＤの大きさ付近に
もトリプトファン遺伝子を含むフラグメントプローブで
もＰ２Ｓ５を含むフラグメントプローブでもシグナルが
生じた。従ってバチルス５Ｄ１０３４のトリプトファン
遺伝子付近の構造は第２図のようであり、プロモーター
配列がトリプトファン遺伝子の近傍に導入されているこ
とが確認された。
バチルス５Ｄ１０３５の場合、Ｘｂａ Ｉ で消化し
た１０ＭＤの大きさ付近にトリプトファン遺伝子を含む
フラグメン１−プローブでもＰ２Ｏ１を含むフラグメン
トプローブでもシグナルが生じ、相同的交叉の結果、第
３図に示すように、プロモーター配列がトリプトファン
遺伝子の近傍に導入されていることが確認された。
た１０ＭＤの大きさ付近にトリプトファン遺伝子を含む
フラグメン１−プローブでもＰ２Ｏ１を含むフラグメン
トプローブでもシグナルが生じ、相同的交叉の結果、第
３図に示すように、プロモーター配列がトリプトファン
遺伝子の近傍に導入されていることが確認された。
本発明に従えば、プラスミドを用いた遺伝子増幅と異な
り、安定的に微生物の生産する特定の物質を多量に工業
的に生産することが可能となる。
り、安定的に微生物の生産する特定の物質を多量に工業
的に生産することが可能となる。
さらに遺伝子増幅に於いては、目的の遺伝子が完全無傷
でないとその目的を達成することができないが、本発明
では目的遺伝子の上流部分と任意のプロモーターＤＮＡ
さえあれば、簡単にその目的が達成される。
でないとその目的を達成することができないが、本発明
では目的遺伝子の上流部分と任意のプロモーターＤＮＡ
さえあれば、簡単にその目的が達成される。
第１図は、プロモーター配列ＤＮＡのクローニング方法
を示す。 第２図は、プロモーター配列ＤＮＡとトリプトファン遺
伝子上流部分の細菌への導入方法を示す。 第３図は、プロモーター配列下流ヘトリブトファン遺伝
子が組み込まれたＤＮＡの調製法、及び細菌への導入方
法を示す。
を示す。 第２図は、プロモーター配列ＤＮＡとトリプトファン遺
伝子上流部分の細菌への導入方法を示す。 第３図は、プロモーター配列下流ヘトリブトファン遺伝
子が組み込まれたＤＮＡの調製法、及び細菌への導入方
法を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、目的物質の生産に係わる遺伝子を含有する染色体を
有する微生物の該染色体に、該遺伝子のための発現制御
配列が、該遺伝子の発現を制御することができる位置及
び方向で導入されている改良された微生物。 ２、前記微生物がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生
物である請求項１に記載の微生物。 ３、前記微生物がバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバチルス・アミロリクエフ
アシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）である請求項２に記載の微生物。 ４、前記発現制御配列がプロモーターであり、該プロモ
ーターが前記遺伝子の上流に挿入されている、請求項１
〜３のいずれか１項に記載の微生物。 ５、該プロモーターがバチルス属微生物のプロモーター
又は、バチルス属微生物のファージのプロモーターであ
り、該プロモーターが前記遺伝子の上流に挿入されてい
る、請求項４に記載の微生物。 ６、前記遺伝子がトリプトファンの合成に係る遺伝子で
ある請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。 ７、目的物質の生産に係わる遺伝子を含有する染色体を
有する微生物の該染色体に、該遺伝子のための発現制御
領域を、該遺伝子の発現を増強することができる位置及
び方向で導入することを特徴とする改良された微生物の
製造方法。 ８、特許請求の範囲第１項に記載の微生物を培養して該
遺伝子に係わる生成物を生産せしめ、そして該生成物を
採取することを特徴とする有用物質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63038482A JP2708168B2 (ja) | 1988-02-23 | 1988-02-23 | 微生物の改良 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63038482A JP2708168B2 (ja) | 1988-02-23 | 1988-02-23 | 微生物の改良 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01215280A true JPH01215280A (ja) | 1989-08-29 |
| JP2708168B2 JP2708168B2 (ja) | 1998-02-04 |
Family
ID=12526473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63038482A Expired - Lifetime JP2708168B2 (ja) | 1988-02-23 | 1988-02-23 | 微生物の改良 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2708168B2 (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10229879A (ja) * | 1997-02-17 | 1998-09-02 | Kao Corp | 相同組換え体による蛋白質生産方法 |
| WO2007088970A1 (ja) | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Ajinomoto Co., Inc. | メタノール資化性細菌を用いたｌ－リジンの製造法 |
| WO2007114465A1 (ja) | 2006-03-30 | 2007-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法 |
| WO2007136133A1 (en) | 2006-05-23 | 2007-11-29 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family |
| WO2008044614A1 (en) | 2006-09-28 | 2008-04-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing 4-hydroxy-l-isoleucine |
| WO2008093829A1 (ja) | 2007-02-01 | 2008-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2011016301A1 (ja) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | 味の素株式会社 | ビブリオ属細菌を用いたｌ－リジンの製造法 |
| WO2012011596A1 (en) | 2010-07-21 | 2012-01-26 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l- amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with enhanced expression of the bssr gene |
| WO2012121291A1 (ja) | 2011-03-09 | 2012-09-13 | 三井化学株式会社 | ペンタメチレンジイソシアネート、ペンタメチレンジイソシアネートの製造方法、ポリイソシアネート組成物、ポリウレタン樹脂およびポリウレア樹脂 |
| WO2012147989A1 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid belonging to the glutamate family, using a coryneform bacterium |
| EP0811682B2 (en) † | 1996-06-05 | 2017-04-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing L-lysine |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SK7702000A3 (en) | 1998-09-25 | 2000-10-09 | Ajinomoto Kk | Process for preparing coryneform bacteria having an improved amino acid- or nucleic acid-productivity |
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| JPS61268183A (ja) * | 1985-05-24 | 1986-11-27 | Wakamoto Pharmaceut Co Ltd | Ｄｎａ，組換体ｄｎａおよびそれらを含む微生物 |
| WO1987003006A1 (en) * | 1985-11-08 | 1987-05-21 | Genetics Institute, Inc. | Yeast strains |
-
1988
- 1988-02-23 JP JP63038482A patent/JP2708168B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
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| WO2012147989A1 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid belonging to the glutamate family, using a coryneform bacterium |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2708168B2 (ja) | 1998-02-04 |
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