JPS61268183A - Ｄｎａ，組換体ｄｎａおよびそれらを含む微生物 - Google Patents
Ｄｎａ，組換体ｄｎａおよびそれらを含む微生物Info
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- JPS61268183A JPS61268183A JP60110565A JP11056585A JPS61268183A JP S61268183 A JPS61268183 A JP S61268183A JP 60110565 A JP60110565 A JP 60110565A JP 11056585 A JP11056585 A JP 11056585A JP S61268183 A JPS61268183 A JP S61268183A
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- recombinant dna
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（発明の目的）
本発明は好熱菌バシルス・ステアロサーモフィルス由来
のプロモーター領域を含むＤＮＡ。
のプロモーター領域を含むＤＮＡ。
そのＤＮＡを組込んだ組換体ＤＮＡおよびそれらを含む
微生物に関するものである。近年遺伝子操作技術の発達
ζ二より、外来遺伝子由来の蛋白質を微生物を用いて大
量生産することが可能になってきている。
微生物に関するものである。近年遺伝子操作技術の発達
ζ二より、外来遺伝子由来の蛋白質を微生物を用いて大
量生産することが可能になってきている。
微生物によるこれら蛋白質生産（二関する遺伝子の発現
のためＣ二は強いプロモーターを用いることが重要な要
素の一つである。
のためＣ二は強いプロモーターを用いることが重要な要
素の一つである。
従来、大腸菌を宿主とする系では強いプロモーターを含
む発現ベクターの開発が進み、 ｔｒｐプロモーター
、 ｌａｃプロモーター、 １ｐｐプロモーター、
ｐｈｏプロモーター等が利用されている。
む発現ベクターの開発が進み、 ｔｒｐプロモーター
、 ｌａｃプロモーター、 １ｐｐプロモーター、
ｐｈｏプロモーター等が利用されている。
一方、枯草菌に代表されるパシルス属細菌は安全性、蛋
白質の菌体外分泌能等の点で、大腸菌に比べて優れた宿
主であるが２発現ベクターの開発はかなり遅れている。
白質の菌体外分泌能等の点で、大腸菌に比べて優れた宿
主であるが２発現ベクターの開発はかなり遅れている。
従来、バシルス属細菌Ｃ；おける発現ベクターの作成と
その利用Ｃ二関しては枯草菌のファージｓｐｏ ２のプ
ロモーターを利用したプラスミドｐＰＬ６０８ （ｉ；
’ −ｙ （Ｇｅｎｅ）第１６巻、１９９頁、 １９
８１年、〕。
その利用Ｃ二関しては枯草菌のファージｓｐｏ ２のプ
ロモーターを利用したプラスミドｐＰＬ６０８ （ｉ；
’ −ｙ （Ｇｅｎｅ）第１６巻、１９９頁、 １９
８１年、〕。
枯草菌の染色体ＤＮＡ上の未同定のプロモーターを利用
したｐＧＲ７１シリーズのプラスミド〔モレキュラー・
クローニング・アンド・ジーン・レギュレーション・イ
ン・バシリイ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａ
ｎｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃ
ｉｌｌｉ）、第３１１頁。
したｐＧＲ７１シリーズのプラスミド〔モレキュラー・
クローニング・アンド・ジーン・レギュレーション・イ
ン・バシリイ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａ
ｎｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃ
ｉｌｌｉ）、第３１１頁。
アカデミツク・プＶ ス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ ）、 １９８２年、〕。
ｓ ）、 １９８２年、〕。
パシルス・ライヘニホルミスのペニンリナーゼ遺伝子（
ｐｅｎ Ｐ）のプロモーターを利用したプラスミド（モ
レキュラー・クローニング・アンド・ジーン・レギュレ
ーション・イン・パシリイ。
ｐｅｎ Ｐ）のプロモーターを利用したプラスミド（モ
レキュラー・クローニング・アンド・ジーン・レギュレ
ーション・イン・パシリイ。
第１５９頁、アカデミツク・プレス、 １９８２年）
等があげられるが、いずれもプロモーターの下流（：組
込んだ外来遺伝子の発現量がまだ充分とはいえない。
等があげられるが、いずれもプロモーターの下流（：組
込んだ外来遺伝子の発現量がまだ充分とはいえない。
本発明者等は、先Ｃ：遺伝子組換え技術を利用してバシ
ルス・ステアロサーモフィルスの耐熱性β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（ｂｇａ Ｂ ）をベクターを介して枯草
菌に導入することに成功し、この枯草菌が細胞蛋白質当
り６〜１０％ｌニーも及ぶ耐熱性β−ガラクトシダーゼ
を生産することを見出した。
ルス・ステアロサーモフィルスの耐熱性β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（ｂｇａ Ｂ ）をベクターを介して枯草
菌に導入することに成功し、この枯草菌が細胞蛋白質当
り６〜１０％ｌニーも及ぶ耐熱性β−ガラクトシダーゼ
を生産することを見出した。
本発明は、この耐熱性β−ガラクトシダーゼの枯草菌に
おける高発現機構を利用したパシルス属細菌を宿主とす
る発現ベクターの開発を目的とする研究過程（＝於いて
好熱菌パシルス・ステアロサーモフィルス由来のプロモ
ーターが強いプロモーター活性を有することを見出し、
そのＤＮＡ構造を解明したことに基くものであり。
おける高発現機構を利用したパシルス属細菌を宿主とす
る発現ベクターの開発を目的とする研究過程（＝於いて
好熱菌パシルス・ステアロサーモフィルス由来のプロモ
ーターが強いプロモーター活性を有することを見出し、
そのＤＮＡ構造を解明したことに基くものであり。
本発明により目的ポリペプチドの発現に好適なパシルス
属細菌に於ける発現ベクターの作製を可能（ニジたもの
である。
属細菌に於ける発現ベクターの作製を可能（ニジたもの
である。
（発明の構成）
本発明は好熱菌パシルス・ステアロサーモフィルス由来
のプロモーターを含む式〔Ｉ〕で示されるＤＮＡ、その
ＤＮＡを組込んだ組換体ＤＮＡおよびそれらを含む微生
物（＝関するものである。
のプロモーターを含む式〔Ｉ〕で示されるＤＮＡ、その
ＤＮＡを組込んだ組換体ＤＮＡおよびそれらを含む微生
物（＝関するものである。
５’ ＧＧＣＣＴＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴ
ＴＴＡＡ３’ ＣＣＧＧＡＴＡＴＡＴＡＡＡＣＣＡＡ
ＣＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴ
ＡＴＴＴＡＧＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡ
ＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡＡＴＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＣＡ
ＡＡＴＡＣＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＴ
ＴＴＡＴＧＡＴＴＡ、ＴＴＴＴＡＡＣＴＴＡＡＴ’ｌ’
ＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＡＡ
ＡＴＡＴＴＡＡＴＴＴＧバシルス・ステアロサーモフィ
ルスから単離したｂｇａ Ｂ遺伝子は大腸菌プラスミド
ｐＨ０１，−Ｇ２（特願昭５８−１７１０７７号）ある
いは枯草菌プラスミド田Ｇ５（特願昭５９−２０２９６
５号）にクローン化されている。
ＴＴＡＡ３’ ＣＣＧＧＡＴＡＴＡＴＡＡＡＣＣＡＡ
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ＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＡＡ
ＡＴＡＴＴＡＡＴＴＴＧバシルス・ステアロサーモフィ
ルスから単離したｂｇａ Ｂ遺伝子は大腸菌プラスミド
ｐＨ０１，−Ｇ２（特願昭５８−１７１０７７号）ある
いは枯草菌プラスミド田Ｇ５（特願昭５９−２０２９６
５号）にクローン化されている。
このｂｇａ ｆ３遺伝子からのｂｇａ Ｂプロモーター
領域を含むＤＮＡの単離はプラスミドｐＨ０１，ｐＨ０
２あるいはｐＨ０５を制限酵素で切断することＣ二より
行うことが出来る。
領域を含むＤＮＡの単離はプラスミドｐＨ０１，ｐＨ０
２あるいはｐＨ０５を制限酵素で切断することＣ二より
行うことが出来る。
そのＤＮＡを組込んだ組換体ＤＮＡの調製は。
単離したＤＮＡと制限酵素で切断したベクターＤＮＡと
をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結することにより行うことが
出来る。
をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結することにより行うことが
出来る。
ここで用いるベクターＤＮＡとしてはｐＵＢ １１０゜
１）Ｅ１９４． ｐＣ１９４，ｐＢＤ９． ｐＴＰ４．
ｐＰＬ６０３． 等のパシルス属細菌で複製可能な
プラスミドが好適である。
１）Ｅ１９４． ｐＣ１９４，ｐＢＤ９． ｐＴＰ４．
ｐＰＬ６０３． 等のパシルス属細菌で複製可能な
プラスミドが好適である。
上記方法で得られた組換体ＤＮＡのパシルス属細菌への
導入はプロトプラスト形質転換法〔モレキュラー・アン
ド・ゼネラル・ゼネテイックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第１６
８巻。
導入はプロトプラスト形質転換法〔モレキュラー・アン
ド・ゼネラル・ゼネテイックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第１６
８巻。
１１１頁、 １９７９年、）Ｃ二より行うことが出来る
。
。
組換体ＤＮＡ（即ち、ｂｇａＢ遺伝子のプロモーターを
含むＤＮＡを組込んだベクターＤＮＡ）を有する菌株の
選択方法は、当該組換体ＤＮＡの調製Ｃ：使用した制限
酵素やベクターＤＮＡの種類によっても異なるが２例え
ば制限酵素としてＥｃｏ ＲＩとＰｓｔ ｌを用いベク
ターとしてｐＰＬ６０３を用いた場合には、このｂｇａ
ＢプロモーターＣ：より下流のｃａｔ−８６遺伝子が
発現するのでクロラムフェニコールとカナマイシンを含
むＤＭ３寒天培地Ｃ：生育可能なコロニーとして選択出
来る。
含むＤＮＡを組込んだベクターＤＮＡ）を有する菌株の
選択方法は、当該組換体ＤＮＡの調製Ｃ：使用した制限
酵素やベクターＤＮＡの種類によっても異なるが２例え
ば制限酵素としてＥｃｏ ＲＩとＰｓｔ ｌを用いベク
ターとしてｐＰＬ６０３を用いた場合には、このｂｇａ
ＢプロモーターＣ：より下流のｃａｔ−８６遺伝子が
発現するのでクロラムフェニコールとカナマイシンを含
むＤＭ３寒天培地Ｃ：生育可能なコロニーとして選択出
来る。
なおりＭ３寒天培地は次の８溶液を別、滅菌後混合して
調製する。
調製する。
１） ４チ寒天 ２００−２）
ＩＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ７，３） ５０
０１１ｔ１３）５チカザミノ酸 １００
−４）１０％酵母エキス ５０−３．５
係リン酸２カリウム＋ 、。。ｄ５）１．５チリン
酸ｌカリウム ６）２０チグルコース ２５１Ｌ１７）
ＩＭＭｇｃＺ、
２０ｙ８）２チ牛血清アルブミン ５ｄ次い
で、上記方法で得られた組換体ＤＮＡ菌株より組換体Ｄ
ＮＡをアルカリ抽出法〔ニークレイツク・アシッド・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
）第７巻、 １５１３頁、 １９７９年、〕（二よっ
て単離し、該ＤＮＡが組込まれていることをジデオキシ
法〔チイｘ ｙ ス（５ｃｉｅｎｃｅ ） 第２１４巻
、 １２０５頁。
ＩＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ７，３） ５０
０１１ｔ１３）５チカザミノ酸 １００
−４）１０％酵母エキス ５０−３．５
係リン酸２カリウム＋ 、。。ｄ５）１．５チリン
酸ｌカリウム ６）２０チグルコース ２５１Ｌ１７）
ＩＭＭｇｃＺ、
２０ｙ８）２チ牛血清アルブミン ５ｄ次い
で、上記方法で得られた組換体ＤＮＡ菌株より組換体Ｄ
ＮＡをアルカリ抽出法〔ニークレイツク・アシッド・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
）第７巻、 １５１３頁、 １９７９年、〕（二よっ
て単離し、該ＤＮＡが組込まれていることをジデオキシ
法〔チイｘ ｙ ス（５ｃｉｅｎｃｅ ） 第２１４巻
、 １２０５頁。
１９８１年、〕 で塩基配列を決定し確認する。
次に９本発明の詳細な説明するため実施例を示す。
なお、以下）二示す実施例は、ＤＮＡ供与体としてｂｇ
ａ Ｂ遺伝子をクローン化したプラスミドｐＨ０２を保
持する大腸菌エシェリヒア・コ！Ｊ ２９４−４３（ｐ
Ｈ０２）（微工研菌寄第７２３３号）を、ベクターＤＮ
ＡとしてｐＰＬ６０３ （ジャーナル・オブ・バタテリ
オロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）第１４６巻、 １１６２頁、 １９８１年
、〕を、宿主微生物としてパシルス・ズブチリスＲＭ１
２５（モレキュラー・アンド・ゼネラル・ゼネティック
ス第１５２巻。
ａ Ｂ遺伝子をクローン化したプラスミドｐＨ０２を保
持する大腸菌エシェリヒア・コ！Ｊ ２９４−４３（ｐ
Ｈ０２）（微工研菌寄第７２３３号）を、ベクターＤＮ
ＡとしてｐＰＬ６０３ （ジャーナル・オブ・バタテリ
オロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）第１４６巻、 １１６２頁、 １９８１年
、〕を、宿主微生物としてパシルス・ズブチリスＲＭ１
２５（モレキュラー・アンド・ゼネラル・ゼネティック
ス第１５２巻。
６５頁、 １９７７年、）〔本微生物はオハイオ州立
大学。
大学。
パシルス・ゼネティック拳ストック・セン９−（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ
ｒ） （：パシルス・ズブチリスＩ Ａ ２５３として
保存されており、誰でも入手可能である。〕 をそれぞれ利用して行った例である。
ｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ
ｒ） （：パシルス・ズブチリスＩ Ａ ２５３として
保存されており、誰でも入手可能である。〕 をそれぞれ利用して行った例である。
実施例１．（ｂｇａ Ｂ遺伝子のプロモーターを含むＤ
ＮＡの単離） エシェリヒア・コリ２９４−４３ （ｐＨ０２）をＭ９
培地（Ｎａ、 ＨＰＯ４５，８ｊｉ／ｌ、 ＫＨ２ＰＯ
２３ｌ／ｌ 。
ＮＡの単離） エシェリヒア・コリ２９４−４３ （ｐＨ０２）をＭ９
培地（Ｎａ、 ＨＰＯ４５，８ｊｉ／ｌ、 ＫＨ２ＰＯ
２３ｌ／ｌ 。
ＮａＣＬ ５９／ｌ、 ＮＨ４ｃｚ １ ｉ／Ｌ、 Ｃ
ａＣ／４１１ｍ＋５；’／’４Ｍｇ５Ｏａ ９５′Ｉｔ
９／４ Ｆｅｃｔ３１，６ｉｙ／４ カザミノ酸５１
１／ｌ、 グルコース４．ｙ／ｚ） １５０１１１１
中、３７℃で培養液の６００ ｎｍの吸光度が０．６−
１．０になるまで培養後、２００μＩ／！Ｋｌのクロラ
ムフェニコールヲ添加して一夜培養を続けた。菌体を集
洗菌後、２１ｖ／ｄのりゾテームを含む２５ ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ −ＨＣＬ （ｐＨ８，０）、 ５０ｍＭグ／
Ｉ／ニア−、Ｃ，１０ｍＭＥＤＴＡ、１５ｍ（：懸濁し
、０℃で３０分間放置後、 ０．２ＮＮａＯＨ。
ａＣ／４１１ｍ＋５；’／’４Ｍｇ５Ｏａ ９５′Ｉｔ
９／４ Ｆｅｃｔ３１，６ｉｙ／４ カザミノ酸５１
１／ｌ、 グルコース４．ｙ／ｚ） １５０１１１１
中、３７℃で培養液の６００ ｎｍの吸光度が０．６−
１．０になるまで培養後、２００μＩ／！Ｋｌのクロラ
ムフェニコールヲ添加して一夜培養を続けた。菌体を集
洗菌後、２１ｖ／ｄのりゾテームを含む２５ ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ −ＨＣＬ （ｐＨ８，０）、 ５０ｍＭグ／
Ｉ／ニア−、Ｃ，１０ｍＭＥＤＴＡ、１５ｍ（：懸濁し
、０℃で３０分間放置後、 ０．２ＮＮａＯＨ。
ＩＬｓＳＤＳ（ラウリル硫酸ｆ−） ！Ｊ クム）３０
ｍヲ加え溶菌させ、０℃で５分間放置した。次いで３Ｍ
酢酸ナトリウム（關４．８ ） ２２．５友ｌを加え、
０℃で１時間放置後、遠心分離（８，００Ｏｒｐｍ、
２０分）して上溝を得た。上清Ｃ二２．５倍量のエタノ
ールを加え、ＤＮＡを沈殿させた後、５友ｌのｌＱｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＣＬ （ｐＨ７，５） 、 １ ｍＭ
ＥＤＴＡ（以下ＴＥ緩衝液と称す）に溶かした。この
ＤＮＡ溶液を工ｔジクムブロマイドー塩化セシクム平衡
密度勾配遠心にかけ、ｐＨ０２プラスミド５００μｓを
得た。
ｍヲ加え溶菌させ、０℃で５分間放置した。次いで３Ｍ
酢酸ナトリウム（關４．８ ） ２２．５友ｌを加え、
０℃で１時間放置後、遠心分離（８，００Ｏｒｐｍ、
２０分）して上溝を得た。上清Ｃ二２．５倍量のエタノ
ールを加え、ＤＮＡを沈殿させた後、５友ｌのｌＱｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＣＬ （ｐＨ７，５） 、 １ ｍＭ
ＥＤＴＡ（以下ＴＥ緩衝液と称す）に溶かした。この
ＤＮＡ溶液を工ｔジクムブロマイドー塩化セシクム平衡
密度勾配遠心にかけ、ｐＨ０２プラスミド５００μｓを
得た。
ｂｇａ Ｂ遺伝子のプＯモーターを含むＤＮＡ （１０
７ｂｐ （Ｄ Ｈａｅ ［１−Ａｌｕ （断片）を単離
するため、１００μＩのｐＨＧ２に対し２００Ｕの、Ｈ
ｉｎｄｌ［と１２００（７）Ｃ１ａＩを加え、 １０
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｔ （ｐＨ１８，０）、 １
０ ｍＭＭｇＣｔ、、５０ｍＭＮａＣｔ、１ｍＭジ？、
ｔスレイ）−ル（７）反応液３２０μを中で、３７℃で
４時間処理した後。
７ｂｐ （Ｄ Ｈａｅ ［１−Ａｌｕ （断片）を単離
するため、１００μＩのｐＨＧ２に対し２００Ｕの、Ｈ
ｉｎｄｌ［と１２００（７）Ｃ１ａＩを加え、 １０
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｔ （ｐＨ１８，０）、 １
０ ｍＭＭｇＣｔ、、５０ｍＭＮａＣｔ、１ｍＭジ？、
ｔスレイ）−ル（７）反応液３２０μを中で、３７℃で
４時間処理した後。
４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（二より分画し、
９７５ｂｌ）のｌ（ｉｎｄ １ｌ−−１断片ヲ回収
り、り。
９７５ｂｌ）のｌ（ｉｎｄ １ｌ−−１断片ヲ回収
り、り。
（１３μＩ几
９７５ｂｐの）（ｉｎｄ Ｉｌｌ −Ｃ１ａ ｌ断片１
３μ、９＋二対し、３６ＵのＨａｅ［ｌを加え、 １
０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｔ （ｐＨ７，５） 。
３μ、９＋二対し、３６ＵのＨａｅ［ｌを加え、 １
０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｔ （ｐＨ７，５） 。
１０ｍＭＭｇｃｔ２，５０ｍＭＮａｃｔ、１ｍＭジテオ
スレイトールの反応液５０ｇ中で３７℃で３時間処理し
た後、７０’Ｃで１０分間加熱してＨａｅ［ｌを失活さ
せた。
スレイトールの反応液５０ｇ中で３７℃で３時間処理し
た後、７０’Ｃで１０分間加熱してＨａｅ［ｌを失活さ
せた。
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで５′末端をリン酸化し
たＥＣ０ＲＩリンカ−ｐＧＧＡＡ’Ｉ’Ｔｃｃ （宝酒
造製） ２５０ｐｍｏ（を加え、 ６６ ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ −Ｈｃｔ（ｐＨ７，５） 、 １０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｔｚ、 １０ｍＭ ９ ｆ オスＬ／ イ） ／
Ｉ／、１ｍＭＡＴＰの反応液１００μを中で１２５Ｕの
Ｔ４ＤＮＡ！ＪガーゼＣ二より１５℃で１６時間反応さ
せた。
たＥＣ０ＲＩリンカ−ｐＧＧＡＡ’Ｉ’Ｔｃｃ （宝酒
造製） ２５０ｐｍｏ（を加え、 ６６ ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ −Ｈｃｔ（ｐＨ７，５） 、 １０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｔｚ、 １０ｍＭ ９ ｆ オスＬ／ イ） ／
Ｉ／、１ｍＭＡＴＰの反応液１００μを中で１２５Ｕの
Ｔ４ＤＮＡ！ＪガーゼＣ二より１５℃で１６時間反応さ
せた。
６５℃で２０分間加熱してＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを失活
させた後、４μｔのＩＭＮａＣｚを加えた反応液１０４
μを中、６０ＵのＥｃｏ Ｒｉと４８ Ｕ （Ｄ Ａｌ
ｕ ■テ３７℃、４時間処理した。
させた後、４μｔのＩＭＮａＣｚを加えた反応液１０４
μを中、６０ＵのＥｃｏ Ｒｉと４８ Ｕ （Ｄ Ａｌ
ｕ ■テ３７℃、４時間処理した。
７０℃、 １０分間加熱し、 ＥｃｏＲｌとＡｌｕ Ｉ
を失活させた後これ（ニーＴ４ボリヌクレオデドキナー
ゼで５′末端をリン酸化したＰｓｔｉ９ンカー ｐＧＣ
ＴＧＣＡＧＣ（宝酒造製） ２００ｐｍｏｌを加え、６
６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐｋｌ ７．５ ） 、
１０ ｍＭ ＭｇＣｔ、、 １０ ｍＭジテオスレイト
ール、 １ ｍＭ Ａ Ｔ Ｐの反応液２００μを中
で、 １５０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（二より１５℃
で１６時間反応させた。
を失活させた後これ（ニーＴ４ボリヌクレオデドキナー
ゼで５′末端をリン酸化したＰｓｔｉ９ンカー ｐＧＣ
ＴＧＣＡＧＣ（宝酒造製） ２００ｐｍｏｌを加え、６
６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐｋｌ ７．５ ） 、
１０ ｍＭ ＭｇＣｔ、、 １０ ｍＭジテオスレイト
ール、 １ ｍＭ Ａ Ｔ Ｐの反応液２００μを中
で、 １５０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（二より１５℃
で１６時間反応させた。
６５℃、２０分間加熱してＴ４ＤＮＡリガーゼを失活さ
せた後２０μｔのＩＭＮａｃｔを加えた反応液２１０μ
を中、６０ＵのＰｓｔ ｌで３７℃、３時間処理した。
せた後２０μｔのＩＭＮａｃｔを加えた反応液２１０μ
を中、６０ＵのＰｓｔ ｌで３７℃、３時間処理した。
このＤＮＡ溶液を５チポリアクリルアミドゲル電気泳動
Ｃ二より分画し、 １１９ｂｐのＥｃｏＲｌ −Ｐｓ
ｔ ｌ断片を回収した。（１，５μｇ）。
Ｃ二より分画し、 １１９ｂｐのＥｃｏＲｌ −Ｐｓ
ｔ ｌ断片を回収した。（１，５μｇ）。
実施例２．（ベクターＤＮＡの調製と切断）カナマイシ
ン耐性を有するｐ ＰＬ６０３のＤＮＡを下記のよう（
ニジて調製した。
ン耐性を有するｐ ＰＬ６０３のＤＮＡを下記のよう（
ニジて調製した。
ｐ ＰＬ ６０３をプラスミドとして持つ公知の枯草菌
、パシルス・ズブチリスＩＥ３１ ［オへイオ州立大学
、バシルス・ゼネティック・スｌ−ツク・セｙ ９−（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ０ｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅ
ｎｔｅｒ ）より入手〕をＬ培地（トリプトン１チ、酵
母エキス０．５ｔ４ 、 Ｎａ Ｃ１０，５％ ＋
グル：７−ス０．２％、 ｐＨ７，０） ５０佃ノ中
、３７℃で培養液の５ＱＱ ｎｍの吸光度が２〜３（＝
なるまで振とう培養し、菌体を集洗菌後、２〜／Ｒ１ノ
リゾテームを含む２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｔ（ｐ
Ｈ８，０）。
、パシルス・ズブチリスＩＥ３１ ［オへイオ州立大学
、バシルス・ゼネティック・スｌ−ツク・セｙ ９−（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ０ｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅ
ｎｔｅｒ ）より入手〕をＬ培地（トリプトン１チ、酵
母エキス０．５ｔ４ 、 Ｎａ Ｃ１０，５％ ＋
グル：７−ス０．２％、 ｐＨ７，０） ５０佃ノ中
、３７℃で培養液の５ＱＱ ｎｍの吸光度が２〜３（＝
なるまで振とう培養し、菌体を集洗菌後、２〜／Ｒ１ノ
リゾテームを含む２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｔ（ｐ
Ｈ８，０）。
５０ｍＭグ／ｌ／：７−ス、 １０ｍＭＥＤＴＡ５０
ＷｔＪ！ｉ：ｌ−懸濁し。
ＷｔＪ！ｉ：ｌ−懸濁し。
３７℃で３０分間放置する。０．２ＭＮａＯＨ，１ｌ
Ｓ Ｄ ８１００ｍ／を加え溶菌させ、０℃で５分間放
置した。
Ｓ Ｄ ８１００ｍ／を加え溶菌させ、０℃で５分間放
置した。
次いで３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８） ７５ｍ／を
加え。
加え。
０℃で１時間放置後、遠心分離（８，００Ｏｒｐｍ、
２０分）して上清を得た。上清（二２．５倍量のエタノ
ールを加え、ＤＮＡを沈殿させた後、５ｄのＴＥ緩衝液
に溶かした。このＤＮＡ溶液を工ｔジウムプロマイド・
塩化セシウム平衡密度勾配遠心にかけ、 ｐＰＬ ６
０３プラスミドＤ Ｎ Ａ ５０μｇを得た。
２０分）して上清を得た。上清（二２．５倍量のエタノ
ールを加え、ＤＮＡを沈殿させた後、５ｄのＴＥ緩衝液
に溶かした。このＤＮＡ溶液を工ｔジウムプロマイド・
塩化セシウム平衡密度勾配遠心にかけ、 ｐＰＬ ６
０３プラスミドＤ Ｎ Ａ ５０μｇを得た。
ベクターＤＮＡを切断するため、 ｐＰＬ ６０３２
．２μｇ（二対してＩＯＵのＥｃｏＲｌと５ＵのＰｓｔ
ｌを加え。
．２μｇ（二対してＩＯＵのＥｃｏＲｌと５ＵのＰｓｔ
ｌを加え。
５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｈ（１（ｐＨ７，５） 、
１０ ｍＭ ＭｇＣ４、１００ｍＭＮａ ＣＬ、 ｌ
ｍＭジチオスレイトールの反応液２５μを中で３７℃、
２時間反応を行った。７０℃、１０分間加熱してＥｃｏ
ＲＩとＰｓｔ ｌを失活させた。
１０ ｍＭ ＭｇＣ４、１００ｍＭＮａ ＣＬ、 ｌ
ｍＭジチオスレイトールの反応液２５μを中で３７℃、
２時間反応を行った。７０℃、１０分間加熱してＥｃｏ
ＲＩとＰｓｔ ｌを失活させた。
実施例３．（ｂｇａ Ｂプロモーターを含むＤＮＡ断片
とベクターＤＮＡの連結） 実施例１で得たＤＮＡ断片０．５μ９と実施例２で得た
ベクターＤ Ｎ Ａ ０．５１ｔ／ｉを５５ ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ −Ｈｃｔ（ｐＨ７，５）、 １０ｍＭＭｇＣｚ
、、 １０ｍＭ シｆ 、ｔ ／Ｃｖ イ）−，１１／
、 １ ｍＭ Ａ Ｔ Ｐ （７）反応液３５ｐＬ中
で５０ＵのＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼにより１５℃、１６時
間反応させた。
とベクターＤＮＡの連結） 実施例１で得たＤＮＡ断片０．５μ９と実施例２で得た
ベクターＤ Ｎ Ａ ０．５１ｔ／ｉを５５ ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ −Ｈｃｔ（ｐＨ７，５）、 １０ｍＭＭｇＣｚ
、、 １０ｍＭ シｆ 、ｔ ／Ｃｖ イ）−，１１／
、 １ ｍＭ Ａ Ｔ Ｐ （７）反応液３５ｐＬ中
で５０ＵのＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼにより１５℃、１６時
間反応させた。
ここまでの工程の概略は第１図Ｃ：示した。
実施例４．（組換体ＤＮＡによる枯草菌の形質転換）
バンルス・ズブテリ、ｃＲＭ１２５をＰｅｎａｓｓａｙ
ｂｒｏｔｈ（肉エキス０．１５％、酵母エキス０．１
５％、ペプト１０．５％、グ／Ｉ／ コース０．１ ％
、 ＮａｃｔＯ，３％ 、 リン酸２カリウム０
．３７％、 リン酸１カリクム０．１３Ｌ。
ｂｒｏｔｈ（肉エキス０．１５％、酵母エキス０．１
５％、ペプト１０．５％、グ／Ｉ／ コース０．１ ％
、 ＮａｃｔＯ，３％ 、 リン酸２カリウム０
．３７％、 リン酸１カリクム０．１３Ｌ。
ｐｉ（７，０） ２０ゴ中３７℃で、５７０面の吸光度
が０．８−１．ＯＣ二なるまで振とう培養し、集菌する
。２ ｗ／ｌｄのリゾチームを含むＳＭＭＰ溶液（２倍
濃度の８ＭＭ溶液と４倍濃度のＰｅｎａｓｓａｙ ｂｒ
ｏｔｈを等量２合した溶液） ２．５ｍＡ！≦二懸濁し
、３７℃で２時間、おだやか（：振とうしながらプロト
プラストを調製する。
が０．８−１．ＯＣ二なるまで振とう培養し、集菌する
。２ ｗ／ｌｄのリゾチームを含むＳＭＭＰ溶液（２倍
濃度の８ＭＭ溶液と４倍濃度のＰｅｎａｓｓａｙ ｂｒ
ｏｔｈを等量２合した溶液） ２．５ｍＡ！≦二懸濁し
、３７℃で２時間、おだやか（：振とうしながらプロト
プラストを調製する。
プロトプラストを遠心分離（４，００Ｏｒｐｍ、 １５
分）で集め８ＭＭＰ溶液で洗浄後、再度遠心分離し。
分）で集め８ＭＭＰ溶液で洗浄後、再度遠心分離し。
２′Ｒ１のＳＭＮＰ溶液（二懸濁する。
なお、８ＭＭ溶液は０．５Ｍ ｉ／ ！糖、２０ｍＭマ
レイン酸（ｐＨ６，５） 、 ２０ｍＭ ＭｇＣＺ、
ヨＧＪ ７’Ｚ ６１１合液である。
レイン酸（ｐＨ６，５） 、 ２０ｍＭ ＭｇＣＺ、
ヨＧＪ ７’Ｚ ６１１合液である。
実施例３で得たＤＮＡ溶液３５μｔと２倍濃度の８ＭＭ
溶液３５μｔの混合液に対し、このプロトプラスト懸濁
液０．５１＋７．および１．５ｄの４０チボリエテレン
グリコール溶液（１００１７中（：ポリエチレングリコ
ール６０００を４０．！ｉ’、 ２倍濃度の８ＭＭ溶
液５０コを含む）を加え、２分間放置後、 ５＋ｊの
ＳＭＭＰ溶液を加え、プロトプラストを遠心分離で回収
した。このプロトプラストを１−のＳＭＭＰ溶液（二懸
濁し、３０℃で１．５時間振とう培養後、カナマイシン
（１ｘｔｇ／ｄ ）およびクロラムフェニコール（１０
μｇ／ｄ）ＤＭ３再生用寒天培地に塗布した。３７℃で
２日間培養すると組換体ＤＮＡを保持する枯草菌はカナ
マイシン、クロラムフェニコールの両抗生物質（二耐性
なコロニーとして取得出来る。
溶液３５μｔの混合液に対し、このプロトプラスト懸濁
液０．５１＋７．および１．５ｄの４０チボリエテレン
グリコール溶液（１００１７中（：ポリエチレングリコ
ール６０００を４０．！ｉ’、 ２倍濃度の８ＭＭ溶
液５０コを含む）を加え、２分間放置後、 ５＋ｊの
ＳＭＭＰ溶液を加え、プロトプラストを遠心分離で回収
した。このプロトプラストを１−のＳＭＭＰ溶液（二懸
濁し、３０℃で１．５時間振とう培養後、カナマイシン
（１ｘｔｇ／ｄ ）およびクロラムフェニコール（１０
μｇ／ｄ）ＤＭ３再生用寒天培地に塗布した。３７℃で
２日間培養すると組換体ＤＮＡを保持する枯草菌はカナ
マイシン、クロラムフェニコールの両抗生物質（二耐性
なコロニーとして取得出来る。
このようにして得た新規な枯草菌はパシルス・ズブチリ
スＲＭ１２５ （ｐＴＦ ６ ）と命名した。
スＲＭ１２５ （ｐＴＦ ６ ）と命名した。
なお、このバシルス・ズブチリスＲＭ１２５（ｐＴＦ６
）の菌学的性質はカナマイシン耐性、クロラムフェニコ
ール耐性を示す以外は普通の枯草菌の性質と同一である
。
）の菌学的性質はカナマイシン耐性、クロラムフェニコ
ール耐性を示す以外は普通の枯草菌の性質と同一である
。
実施例５．（組換体プラスミドの構造解析）バシルス・
ズブチリスＲＭ １２５ （ｐＴＦ ６ ）からの組換
体プラスミドの調製は実施例２に記載の方法で行った。
ズブチリスＲＭ １２５ （ｐＴＦ ６ ）からの組換
体プラスミドの調製は実施例２に記載の方法で行った。
１）ＴＦ６２μｇ≦二ＥｃｏＲ１５Ｕとｐｓｔ（５Ｕを
加え。
加え。
５０ ｍＭ ’ｌ”ｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，５） 、
１０ ｍＭ Ｍｇｃｔ＊、 １００ ｍＭＮａＣｔ
、 １ｍＭジテオスレイトールの反応液５０μを中で３
７℃、２時間処理して生じた２種のＤＮＡ断片の大きさ
を５チポリアクリルアミドゲル電気泳動および１％アガ
ロースゲル電気泳動で測定すると４６００ ｂｐと１１
９ｂｐであった。
１０ ｍＭ Ｍｇｃｔ＊、 １００ ｍＭＮａＣｔ
、 １ｍＭジテオスレイトールの反応液５０μを中で３
７℃、２時間処理して生じた２種のＤＮＡ断片の大きさ
を５チポリアクリルアミドゲル電気泳動および１％アガ
ロースゲル電気泳動で測定すると４６００ ｂｐと１１
９ｂｐであった。
次（二、この１１９ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列をジデ
オキシ法で決定した結果、 ｂｇａＢプロモーターを
含む１０７ｂｉ）のＨａｅ １ｌｌ−Ａｌｕ ｌ断片の
末端にＥｃｏ ＲＩリンカ−、Ｐｓｔｌリンカ−の連結
した構造であることが確認できた。
オキシ法で決定した結果、 ｂｇａＢプロモーターを
含む１０７ｂｉ）のＨａｅ １ｌｌ−Ａｌｕ ｌ断片の
末端にＥｃｏ ＲＩリンカ−、Ｐｓｔｌリンカ−の連結
した構造であることが確認できた。
（発明の効果）
本発明のｂｇａ Ｂプロモーターを含むＤＮＡがパシル
ス属細菌Ｃ二おいて高い発現効率を有することを試験例
Ｃ二より説明する。
ス属細菌Ｃ二おいて高い発現効率を有することを試験例
Ｃ二より説明する。
試験例 ［ｂｇａ Ｂプロモーターにより発現したｃａ
ｔ−→６遺伝子産物（クロラムフェニコールア セチルトランスフェラーゼ）生産量の 比較〕 パシルス・ズブチリスＲＭ １２５ （ｐＴＦ ６ ）
を５μｇ／コクロラムフェニコール及び１％グルコース
を含むＰｅｎａｓｓａｙ ｂｒｏｔｈ ５Ｑｍ中で３７
℃、２０時間娠とう培養し、集菌後０．１ Ｍ Ｔｒｉ
ｓ −ＨＣｌ （ｐＨ７，８） ５ ＲＩＣ：懸濁する
。超音波処理後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、 １５
分）して得た上清を細胞抽出液とした。
ｔ−→６遺伝子産物（クロラムフェニコールア セチルトランスフェラーゼ）生産量の 比較〕 パシルス・ズブチリスＲＭ １２５ （ｐＴＦ ６ ）
を５μｇ／コクロラムフェニコール及び１％グルコース
を含むＰｅｎａｓｓａｙ ｂｒｏｔｈ ５Ｑｍ中で３７
℃、２０時間娠とう培養し、集菌後０．１ Ｍ Ｔｒｉ
ｓ −ＨＣｌ （ｐＨ７，８） ５ ＲＩＣ：懸濁する
。超音波処理後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、 １５
分）して得た上清を細胞抽出液とした。
この細胞抽出液のクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（以下ＣＡＴという）活性をシャツ（Ｗ、
Ｖ、 Ｓｈａｗ ）の方法〔メソッド・イｙ ａ ｘ
ｙテモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｇｙｍｏ
ｌｏｇｙ）第４３巻７３７頁、 １９７５年、〕で測定
すると１７Ｕ／■蛋白であった。
スフェラーゼ（以下ＣＡＴという）活性をシャツ（Ｗ、
Ｖ、 Ｓｈａｗ ）の方法〔メソッド・イｙ ａ ｘ
ｙテモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｇｙｍｏ
ｌｏｇｙ）第４３巻７３７頁、 １９７５年、〕で測定
すると１７Ｕ／■蛋白であった。
ｐＰＬ ６０３を保持するパシルス・ズーＩｆ−９スＲ
Ｍ１２５を同様な方法で培養して得た細胞抽出液（７）
ＣＡＴ活性）１０．０５２ Ｕ／１に９蛋白であったの
で。
Ｍ１２５を同様な方法で培養して得た細胞抽出液（７）
ＣＡＴ活性）１０．０５２ Ｕ／１に９蛋白であったの
で。
ｂｇａ Ｂプロモーターを導入することによりＣＡＴ生
産量は約３００倍上昇したこと（二なる。
産量は約３００倍上昇したこと（二なる。
第１図は本発明の組換体ＤＮＡｐＴＦ６の製造法のフロ
ーチャートを示す。図中Ｅ Ｉｄ、 ＢｃｏＲｌ 。 ＣはＣ１ａｌ、ＨはＨｉｎｄｌｌｌ、 ＰはＰｓｔｌ、
ＢはＢａｍＨｌ。 ＢｇはＢｇｌ Ｉｔの制限部位をそれぞれ示す。 Ｔｃはテトラチイクリン耐性遺伝子、 Ｋｍはカナマイ
ンン耐性遺伝子、 ｃａｔ−８６はクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子を示す。
ーチャートを示す。図中Ｅ Ｉｄ、 ＢｃｏＲｌ 。 ＣはＣ１ａｌ、ＨはＨｉｎｄｌｌｌ、 ＰはＰｓｔｌ、
ＢはＢａｍＨｌ。 ＢｇはＢｇｌ Ｉｔの制限部位をそれぞれ示す。 Ｔｃはテトラチイクリン耐性遺伝子、 Ｋｍはカナマイ
ンン耐性遺伝子、 ｃａｔ−８６はクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子を示す。
Claims (3)
- （１）好熱菌バシルス、ステアロサーモフィルス由来の
プロモーター領域を含む式〔 I 〕で示されるＤＮＡ。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔 I 〕 - （２）式〔 I 〕で示されるＤＮＡを組込んだ組換体Ｄ
ＮＡ。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔 I 〕 - （３）式〔 I 〕で示されるＤＮＡを組込んだ組換体Ｄ
ＮＡを含む微生物。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔 I 〕
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60110565A JPS61268183A (ja) | 1985-05-24 | 1985-05-24 | Ｄｎａ，組換体ｄｎａおよびそれらを含む微生物 |
| US06/780,842 US4861718A (en) | 1984-09-29 | 1985-09-27 | Gene coding for thermostable beta-galactosidase, bacillus subtilis having the gene, enzyme coded by the gene and a process for the production thereof |
| EP85112245A EP0176971A3 (en) | 1984-09-29 | 1985-09-27 | Gene coding for thermostable beta-galactosidase, bacillus subtilis having the gene, enzyme coded by the gene and a process for the production thereof |
| DE198585112245T DE176971T1 (de) | 1984-09-29 | 1985-09-27 | Fuer ein thermostabiles beta-galaktosidase, kodierendes gen, dieses gen enthaltender bacillus-subtilis, das durch dieses gen kodiertes enzym und verfahren zu dessen herstellung. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60110565A JPS61268183A (ja) | 1985-05-24 | 1985-05-24 | Ｄｎａ，組換体ｄｎａおよびそれらを含む微生物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61268183A true JPS61268183A (ja) | 1986-11-27 |
Family
ID=14539052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60110565A Pending JPS61268183A (ja) | 1984-09-29 | 1985-05-24 | Ｄｎａ，組換体ｄｎａおよびそれらを含む微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61268183A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01215280A (ja) * | 1988-02-23 | 1989-08-29 | Showa Denko Kk | 微生物の改良 |
| EP0955368A2 (en) | 1998-03-18 | 1999-11-10 | Ajinomoto Co., Ltd. | L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing l-glutamic acid |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5519092A (en) * | 1978-06-08 | 1980-02-09 | Harvard College | Selected protein producing method |
| JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
-
1985
- 1985-05-24 JP JP60110565A patent/JPS61268183A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5519092A (en) * | 1978-06-08 | 1980-02-09 | Harvard College | Selected protein producing method |
| JPS57132895A (en) * | 1980-12-31 | 1982-08-17 | Parubua Irutsuka | Production of rearranged dna molecule and protein |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01215280A (ja) * | 1988-02-23 | 1989-08-29 | Showa Denko Kk | 微生物の改良 |
| EP0955368A2 (en) | 1998-03-18 | 1999-11-10 | Ajinomoto Co., Ltd. | L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing l-glutamic acid |
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