JPH01215281A - 動物細胞のゲル包括固定化培養方法及び装置 - Google Patents
動物細胞のゲル包括固定化培養方法及び装置Info
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- JPH01215281A JPH01215281A JP63039600A JP3960088A JPH01215281A JP H01215281 A JPH01215281 A JP H01215281A JP 63039600 A JP63039600 A JP 63039600A JP 3960088 A JP3960088 A JP 3960088A JP H01215281 A JPH01215281 A JP H01215281A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は動物細胞のゲル包括固定化培養方法及びそれに
使用する装置に関する。
使用する装置に関する。
最近、動物細胞を液体培地中で培養し、多（の有用物質
を生産しようとする動きが活発である。
を生産しようとする動きが活発である。
すでに動物細胞の培養によりインターフェロン等の医薬
品生産も行われはじめた。
品生産も行われはじめた。
培養方法としては、動物細胞を液体培地中に単純に懸濁
して行う培養法の他に、水和性ゲル中に動物細胞を包括
固定化し、これを液体培地中で培養することにより、ゲ
ル中で増殖させるいわゆるゲル包括固定化培養方法が知
られている（特開昭５５−１５７５０２、特開昭６ｌ−
１０８３７１）。後者は、培養中、機械的に或いは液性
の変化に脆弱な細胞をゲル層により保護できるし、かつ
、培地の交換又は培養後の目的生産物の分離精製に際し
て必要な細胞と液との固液分離が極めて有利になる等、
多くの利点を存し、特に付着性細胞の培養法として好適
であるとされている。ゲルマトリックス中に包括された
細胞は拡散により供給される各種栄養成分及び溶存酸素
を吸収し、目的生成物を拡散により液中に放出しながら
増殖して、ゲル中に細胞の集合体である集落を形成する
。
して行う培養法の他に、水和性ゲル中に動物細胞を包括
固定化し、これを液体培地中で培養することにより、ゲ
ル中で増殖させるいわゆるゲル包括固定化培養方法が知
られている（特開昭５５−１５７５０２、特開昭６ｌ−
１０８３７１）。後者は、培養中、機械的に或いは液性
の変化に脆弱な細胞をゲル層により保護できるし、かつ
、培地の交換又は培養後の目的生産物の分離精製に際し
て必要な細胞と液との固液分離が極めて有利になる等、
多くの利点を存し、特に付着性細胞の培養法として好適
であるとされている。ゲルマトリックス中に包括された
細胞は拡散により供給される各種栄養成分及び溶存酸素
を吸収し、目的生成物を拡散により液中に放出しながら
増殖して、ゲル中に細胞の集合体である集落を形成する
。
ゲル中で増殖した細胞の集落はレンズ状に生長し、ゲル
中に三次元的に分散し、て存在する。集落を構成してい
る細胞は互いに接着された状態となっている。上記の増
殖した細胞を次の培養に際しての種細胞として利用しよ
うとする場合、従来はゲル中から機械的に集落を摘出す
るか、ゲルを機械的に破砕するしかとるべき方法がなか
った。しかし、上記従来方法においては、細胞は極めて
脆弱なため、細胞を破壊し、かつ細胞の失活を伴う。
中に三次元的に分散し、て存在する。集落を構成してい
る細胞は互いに接着された状態となっている。上記の増
殖した細胞を次の培養に際しての種細胞として利用しよ
うとする場合、従来はゲル中から機械的に集落を摘出す
るか、ゲルを機械的に破砕するしかとるべき方法がなか
った。しかし、上記従来方法においては、細胞は極めて
脆弱なため、細胞を破壊し、かつ細胞の失活を伴う。
さらに上記したように細胞相互が接着状態にあるため、
回収率が低く、かつ液中への分散が極めて困難である。
回収率が低く、かつ液中への分散が極めて困難である。
すなわち、上記従来方法においては、ゲル粒子中で増殖
した細胞集落を失活させずに収率よく回収できないため
、細胞を使い捨てにすることとなり、ゲル包括で培養し
た細胞を再度種細胞として次の培養に使えなくなる。従
って、従来のゲル包括法では、まだ、培養のサイクル化
もしくはスケールアップができず、その都度、他の効率
の低い培養方法で種細胞を調製せざるを得なかった。
した細胞集落を失活させずに収率よく回収できないため
、細胞を使い捨てにすることとなり、ゲル包括で培養し
た細胞を再度種細胞として次の培養に使えなくなる。従
って、従来のゲル包括法では、まだ、培養のサイクル化
もしくはスケールアップができず、その都度、他の効率
の低い培養方法で種細胞を調製せざるを得なかった。
本発明の目的は、上記従来法の問題点を解決し、ゲル中
で増殖して形成される細胞集落中の細胞を失活させずに
収率よく、かつ各細胞を分散した状態で回収し、これを
種細胞として培養に供するゲル包括固定化培養方法及び
それに使用する装置を提供するにある。
で増殖して形成される細胞集落中の細胞を失活させずに
収率よく、かつ各細胞を分散した状態で回収し、これを
種細胞として培養に供するゲル包括固定化培養方法及び
それに使用する装置を提供するにある。
上記目的は主として以下の２点により達成される。
１）動物細胞を水和性ゲルに包括固定化し、これを培養
して得られる細胞集落を含む固定化粒子を、ゲル材の加
水分解酵素で処理して、ゲルマトリックスを溶解する。
して得られる細胞集落を含む固定化粒子を、ゲル材の加
水分解酵素で処理して、ゲルマトリックスを溶解する。
２）次いで、蛋白質加水分解酵素を加えることにより、
ゲル材の加水分解酵素を分解除去し、かつ集落を形成し
ている細胞を分散させる。
ゲル材の加水分解酵素を分解除去し、かつ集落を形成し
ている細胞を分散させる。
本発明に適用できる動物細胞としては、特に限定されず
、懸濁性細胞、付着性細胞の両者に適用できる。前者に
ついては、通常行われてきた細胞懸濁培養等の代案があ
るのに対し、後者については、細胞が増殖する際の足場
が得られる点から本発明が特に適している。適用できる
細胞の例としては、肝癌細胞、Ｈｅ１ａ細胞、線維芽細
胞、血球細胞、Ｎａｖａｌｖａ細胞等、従来公知の各種
細胞及び今後株化される各種の細胞も含まれる。
、懸濁性細胞、付着性細胞の両者に適用できる。前者に
ついては、通常行われてきた細胞懸濁培養等の代案があ
るのに対し、後者については、細胞が増殖する際の足場
が得られる点から本発明が特に適している。適用できる
細胞の例としては、肝癌細胞、Ｈｅ１ａ細胞、線維芽細
胞、血球細胞、Ｎａｖａｌｖａ細胞等、従来公知の各種
細胞及び今後株化される各種の細胞も含まれる。
上記の各種細胞をゲル包括固定化するに際して用いる細
胞を調製するための培養方法としては、特に限定されず
、供試細胞及び目的に適した従来公知の各種の培養方法
が用いられる。例えば、カルチュアフラスコを用いての
静置培養、ローラボトルでの回転培養、培養槽を用いて
の懸濁培養、中空糸膜を用いる培養などである。その際
の液体培地に含まれる栄養成分組成も供試細胞及び目的
に適したものを適宜選択して得られる。栄養成分として
は、血清、アミノ酸類、ビタミン類、ホルモン類、無機
塩類、Ｉ！類等が用いられる。
胞を調製するための培養方法としては、特に限定されず
、供試細胞及び目的に適した従来公知の各種の培養方法
が用いられる。例えば、カルチュアフラスコを用いての
静置培養、ローラボトルでの回転培養、培養槽を用いて
の懸濁培養、中空糸膜を用いる培養などである。その際
の液体培地に含まれる栄養成分組成も供試細胞及び目的
に適したものを適宜選択して得られる。栄養成分として
は、血清、アミノ酸類、ビタミン類、ホルモン類、無機
塩類、Ｉ！類等が用いられる。
培養条件、例えば、溶存酸素濃度、ｐＨ、イオン強度、
浸透圧、液の混合等も適宜、選択される。
浸透圧、液の混合等も適宜、選択される。
上記のようにして得られる細胞は、懸濁性細胞の場合に
は、培養液そのまま、もしくは培養液を固液分離処理し
て、細胞を濃縮した培養液とした後、もしくは固液分離
して回収した細胞に付着する培地を洗浄して除いた細胞
の濃縮懸濁液とした後、固定化に供される。
は、培養液そのまま、もしくは培養液を固液分離処理し
て、細胞を濃縮した培養液とした後、もしくは固液分離
して回収した細胞に付着する培地を洗浄して除いた細胞
の濃縮懸濁液とした後、固定化に供される。
固定化方法は、ゲル包括法のうち、動物細胞の生理活性
を著しく損なわない条件下で行うことができ、かつ加水
分解酵素処理でゲルマトリックスを分解できるゲル化剤
を用いるものに限定される。
を著しく損なわない条件下で行うことができ、かつ加水
分解酵素処理でゲルマトリックスを分解できるゲル化剤
を用いるものに限定される。
従って、本発明に用いるゲル化剤は、アルギン酸やカラ
ギーナン、マンナン、ゼラチン等のように実質上天然物
に限定される。
ギーナン、マンナン、ゼラチン等のように実質上天然物
に限定される。
細胞又は細胞含有液は、まず、上記のゲル化剤と混合さ
せる。混合率及びゲル化剤濃度はゲル化剤の種類及び固
定化粒子が培養及びその他の取扱いに際し要求される機
械的強度により適宜選択される０通常、固定化物に対す
る細胞濃度は０．１〜３０％の範囲で行われる。また、
混合する際の温度、ｐＨも細胞の活性を損なわない範囲
、すなわち、１〜４０°Ｃ，ｐＨ２〜８の範囲から適宜
選択される。
せる。混合率及びゲル化剤濃度はゲル化剤の種類及び固
定化粒子が培養及びその他の取扱いに際し要求される機
械的強度により適宜選択される０通常、固定化物に対す
る細胞濃度は０．１〜３０％の範囲で行われる。また、
混合する際の温度、ｐＨも細胞の活性を損なわない範囲
、すなわち、１〜４０°Ｃ，ｐＨ２〜８の範囲から適宜
選択される。
塩形成によりゲル化するゲル化剤、例えばアルギン酸、
カラギーナン、マンナンについてはそれぞれ、ゲル化用
の凝固剤水溶液によりゲル化する。
カラギーナン、マンナンについてはそれぞれ、ゲル化用
の凝固剤水溶液によりゲル化する。
すなわち、細胞及び細胞懸濁液と混合したゲル化剤水溶
液は凝固剤水溶液と接触させゲル化させることによりゲ
ル包括物とする。凝固剤水溶液としては、各ゲル化剤に
対応する凝固剤を用いる。例えば、アルギン酸、マンナ
ンはカルシウム塩、カラギーナンはカリウム塩が適して
いる。凝固剤の濃度やｐＨ１温度もｉ胞の生理活性を基
準に選択される。例えば、アルギン酸を用いる際には０
．５〜２％の塩化カルシウム水溶液、カラギーナンの際
には０．５〜５％の塩化カリウムが用いられる。
液は凝固剤水溶液と接触させゲル化させることによりゲ
ル包括物とする。凝固剤水溶液としては、各ゲル化剤に
対応する凝固剤を用いる。例えば、アルギン酸、マンナ
ンはカルシウム塩、カラギーナンはカリウム塩が適して
いる。凝固剤の濃度やｐＨ１温度もｉ胞の生理活性を基
準に選択される。例えば、アルギン酸を用いる際には０
．５〜２％の塩化カルシウム水溶液、カラギーナンの際
には０．５〜５％の塩化カリウムが用いられる。
温度、ｐＨについては混合に準じて用いられる。
ゲル化の際の成形方法も適宜選択される。例えば不定形
、球、円柱の粒子状、板状、膜状等に成形される。細胞
のゲル包括固定化物は、次の培養工程で用いる場合の混
合の容易性等の点から球状粒子が特に好ましい。球状粒
子に成形するには、通常細胞のゲル化剤水溶液への懸濁
液を凝固剤浴中に滴下させる。円柱状粒子に成形するに
は凝固剤浴中に懸濁液を押し出し、適当な長さに切断す
ればよい。
、球、円柱の粒子状、板状、膜状等に成形される。細胞
のゲル包括固定化物は、次の培養工程で用いる場合の混
合の容易性等の点から球状粒子が特に好ましい。球状粒
子に成形するには、通常細胞のゲル化剤水溶液への懸濁
液を凝固剤浴中に滴下させる。円柱状粒子に成形するに
は凝固剤浴中に懸濁液を押し出し、適当な長さに切断す
ればよい。
このようにして調製した細胞のゲル包括固定化物は、目
的とする培養に供される。培養は、液体培地とゲル包括
固定化物とを溶存酸素存在下で接触させて行われる。培
養方法及び条件は前記の細胞調製の場合と同様、細胞の
種類、目的により適宜選択される。固定化物として粒子
を用いる場合には粒子を懸濁し流動化させる方法が便利
である。
的とする培養に供される。培養は、液体培地とゲル包括
固定化物とを溶存酸素存在下で接触させて行われる。培
養方法及び条件は前記の細胞調製の場合と同様、細胞の
種類、目的により適宜選択される。固定化物として粒子
を用いる場合には粒子を懸濁し流動化させる方法が便利
である。
一定期間培養するとゲル中に包括された細胞はゲルマト
リックスを透過してくる栄養成分を摂取し、老廃成分を
固定化物外に排出しつつ増殖する。増殖した細胞はゲル
マトリックス中にレンズ状の集落を形成する。培養は目
的生産物の生成に都合がよい期間、実施される。或いは
、目的生産物の生物を目的とせず、細胞を増殖させるた
めの前培養として培養が行われることもある。上記いず
れの場合にしても増殖した細胞は、以下本発明の中心で
ある固定化物からの抽出分離工程に供される。
リックスを透過してくる栄養成分を摂取し、老廃成分を
固定化物外に排出しつつ増殖する。増殖した細胞はゲル
マトリックス中にレンズ状の集落を形成する。培養は目
的生産物の生成に都合がよい期間、実施される。或いは
、目的生産物の生物を目的とせず、細胞を増殖させるた
めの前培養として培養が行われることもある。上記いず
れの場合にしても増殖した細胞は、以下本発明の中心で
ある固定化物からの抽出分離工程に供される。
培養液は、まず固定化物と液とに固液分離される。固液
分離法は特に限定されず、公知の方法、例えば、沈降分
離、濾過等が用いられる。固液分離した固定化物はその
まま、あるいは洗浄、あるいは部分的に機械破砕後、ゲ
ルの酵素分解工程に移される。
分離法は特に限定されず、公知の方法、例えば、沈降分
離、濾過等が用いられる。固液分離した固定化物はその
まま、あるいは洗浄、あるいは部分的に機械破砕後、ゲ
ルの酵素分解工程に移される。
まず、固液分離により回収した固定化物をゲルマトリッ
クスを加水分解する酵素と接触させることにより、ゲル
を溶解してゲル中に含まれる細胞・集落を少なくとも部
分的に遊蒲させる。酵素としてはゲルに対応した酵素が
用いられる。当然、反応条件もゲルを分解し、かつ細胞
の生理活性を損なわない条件を選択して用いられる。ア
ルギン酸にはアルギナーゼ（ポリ−ベーター１，４−マ
ンニュロニドグリカノヒドラーゼ）が適している。本酵
素はシュードモナス属、アルギノビブリオ属、アルギノ
バクター属等の微生物や軟体動物に属するアワビから得
られる。
クスを加水分解する酵素と接触させることにより、ゲル
を溶解してゲル中に含まれる細胞・集落を少なくとも部
分的に遊蒲させる。酵素としてはゲルに対応した酵素が
用いられる。当然、反応条件もゲルを分解し、かつ細胞
の生理活性を損なわない条件を選択して用いられる。ア
ルギン酸にはアルギナーゼ（ポリ−ベーター１，４−マ
ンニュロニドグリカノヒドラーゼ）が適している。本酵
素はシュードモナス属、アルギノビブリオ属、アルギノ
バクター属等の微生物や軟体動物に属するアワビから得
られる。
カラギーナンについてはカラギーゼ、マンナンについて
はマンナン加水分解酵素が用いられる。
はマンナン加水分解酵素が用いられる。
次いで、上記反応液を蛋白加水分解酵素と接触させる。
上記工程は次の目的のために行われる。すなわち、１）
ゲル加水分解酵素を分解失活させ、後続のゲル包括固定
化を阻害させない。２）細胞集落を形成している細胞を
解合させ単細胞に分散させる。
ゲル加水分解酵素を分解失活させ、後続のゲル包括固定
化を阻害させない。２）細胞集落を形成している細胞を
解合させ単細胞に分散させる。
用いうる酵素としては公知の各種の蛋白質加水分解酵素
を用いうるが、経済性、適用ｐＨが中性である点でトリ
プシンが好適である。反応条件は上記のゲル加水分解酵
素と同じく、目的とする両効果の発揮と細胞活性を損な
わない範囲で適宜選択される。
を用いうるが、経済性、適用ｐＨが中性である点でトリ
プシンが好適である。反応条件は上記のゲル加水分解酵
素と同じく、目的とする両効果の発揮と細胞活性を損な
わない範囲で適宜選択される。
尚、上記の両酵素反応中に細胞活性が影響する際には、
反応混合物に栄養成分及び酸素を供給しながら行うとさ
らに効果的である。
反応混合物に栄養成分及び酸素を供給しながら行うとさ
らに効果的である。
−以上の工程で得られた細胞懸濁液は、必要あれば濃縮
、洗浄後、再度固定化に供される。
、洗浄後、再度固定化に供される。
以上の工程を繰り返し行うことにより、培養をサイクル
化し、スケールアップすることが可能になる。
化し、スケールアップすることが可能になる。
一方、本発明の培養装置は、本発明の培養方法の各工程
に対応した要素により構成、すなわち、細胞ゲル包括粒
子貯槽、培養槽、ゲル加水分解反応槽、蛋白加水分解反
応槽、ゲル包括粒子調製槽、ゲル包括粒子分離槽を具備
することを特徴とする。
に対応した要素により構成、すなわち、細胞ゲル包括粒
子貯槽、培養槽、ゲル加水分解反応槽、蛋白加水分解反
応槽、ゲル包括粒子調製槽、ゲル包括粒子分離槽を具備
することを特徴とする。
なお、上記ラインの中間に、すなわち、培養槽とゲル加
水分解処理槽との間に、固液分離槽を挿入してもよい。
水分解処理槽との間に、固液分離槽を挿入してもよい。
本発明の培養装置の装置フローを第１図を例に説明する
。液体培地貯槽１から液体培地２と、細胞ゲル包括粒子
貯槽８から細胞ゲル包括粒子７が培養槽ｌＯに供給され
、無菌空気が空気圧縮機４から液面に供給され、液面か
ら液中に酸素が溶解し、細胞ゲル包括粒子７中の細胞に
接散される。増殖して内部に細胞集落を形成した細胞ゲ
ル包括粒子１５は固液分離装置１３で分離される。次い
で粒子はゲル加水分解反応槽１７に送られ、ゲル加水分
解酵素貯槽３０から供給されるゲル加水分解酵素水溶液
３１により、ゲル部分が溶解する。反応液は蛋白加水分
解反応槽２０に送られゲル分解酵素の残存活性を分解し
かつ細胞集落を細胞単位に分散させる。
。液体培地貯槽１から液体培地２と、細胞ゲル包括粒子
貯槽８から細胞ゲル包括粒子７が培養槽ｌＯに供給され
、無菌空気が空気圧縮機４から液面に供給され、液面か
ら液中に酸素が溶解し、細胞ゲル包括粒子７中の細胞に
接散される。増殖して内部に細胞集落を形成した細胞ゲ
ル包括粒子１５は固液分離装置１３で分離される。次い
で粒子はゲル加水分解反応槽１７に送られ、ゲル加水分
解酵素貯槽３０から供給されるゲル加水分解酵素水溶液
３１により、ゲル部分が溶解する。反応液は蛋白加水分
解反応槽２０に送られゲル分解酵素の残存活性を分解し
かつ細胞集落を細胞単位に分散させる。
本反応液２１は混合槽３６に導入され、ゲル化剤４０と
混合する。ゲル化剤細胞混合液３７は、ゲル包括粒子調
製槽２３に送られ固定化される。ゲル包括粒子・凝固剤
混合液２５は、固液分離装置２７で粒子２９が回収され
、粒子貯槽８に返送され、培養の全工程がｌサイクル進
行する。
混合する。ゲル化剤細胞混合液３７は、ゲル包括粒子調
製槽２３に送られ固定化される。ゲル包括粒子・凝固剤
混合液２５は、固液分離装置２７で粒子２９が回収され
、粒子貯槽８に返送され、培養の全工程がｌサイクル進
行する。
〔作 用］
本発明においては、動物細胞を水相性ゲルに包括固定化
し、これを培養して得られる細胞集落を含む固定化粒子
を、ゲル材の加水分解酵素で処理して、ゲルマトリック
スを溶解することにより、集落中の細胞を失活させずに
かつ収率よく細胞単位で液中に懸濁化することが可能と
なる。
し、これを培養して得られる細胞集落を含む固定化粒子
を、ゲル材の加水分解酵素で処理して、ゲルマトリック
スを溶解することにより、集落中の細胞を失活させずに
かつ収率よく細胞単位で液中に懸濁化することが可能と
なる。
実施例１
ラット肝臓癌細胞（ＪＴＣ−１株）を以下の組成の培地
ｔｏｏ ｄの入った５００ ｒ１１１ガラス製回転培養
ビン２０本に４．５ Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／−に接種し
、３７°Ｃ２回転速度１５ｒｐｍで３．５日間培養した
。気相ガスとしては５％炭酸ガス富化空気を用いた。
ｔｏｏ ｄの入った５００ ｒ１１１ガラス製回転培養
ビン２０本に４．５ Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／−に接種し
、３７°Ｃ２回転速度１５ｒｐｍで３．５日間培養した
。気相ガスとしては５％炭酸ガス富化空気を用いた。
培地組成
グルコース ２０００ ｍｇ／ １アルギ
ニン・塩酸塩 １２６〃 シスチン ２４〃 グルタミン ２９２〃 ヒスチジン塩酸塩 ４２〃 ロイシン ５２〃 イソロイシン ５２〃 リジン塩酸塩 ７３〃 メチオニン １５〃 フェニルアラニン ３２〃 スレオニン ４８〃 トリプトファン １０〃 チロシン ３６ ｍｇ／ｌバリン
４６〃 チアミン １．Ｏ〃 リボフラビン ０．ｌ〃 ピリドキサール １．０〃 パントテン酸 １．０ 〃 ニコチン酸 １．０〃 ビオチン ０．０２ 〃コリン塩酸塩
１．８〃 葉 酸 １．Ｏ〃イノシトール
２．０〃 塩化ナトリウム ８０００〃 塩化カリウム ２００〃 牛胎児血清 ｌＸｌ０’／／ ｐ Ｈ７，０計ｉｎ 上記の培養した培養びんの表面に付着した細胞を剥離し
、細胞濃度１．５Ｘ１０’細胞／ｒｎｌの培養液２１を
得た。
ニン・塩酸塩 １２６〃 シスチン ２４〃 グルタミン ２９２〃 ヒスチジン塩酸塩 ４２〃 ロイシン ５２〃 イソロイシン ５２〃 リジン塩酸塩 ７３〃 メチオニン １５〃 フェニルアラニン ３２〃 スレオニン ４８〃 トリプトファン １０〃 チロシン ３６ ｍｇ／ｌバリン
４６〃 チアミン １．Ｏ〃 リボフラビン ０．ｌ〃 ピリドキサール １．０〃 パントテン酸 １．０ 〃 ニコチン酸 １．０〃 ビオチン ０．０２ 〃コリン塩酸塩
１．８〃 葉 酸 １．Ｏ〃イノシトール
２．０〃 塩化ナトリウム ８０００〃 塩化カリウム ２００〃 牛胎児血清 ｌＸｌ０’／／ ｐ Ｈ７，０計ｉｎ 上記の培養した培養びんの表面に付着した細胞を剥離し
、細胞濃度１．５Ｘ１０’細胞／ｒｎｌの培養液２１を
得た。
これを無菌的に遠心分離して３Ｘ１０’細胞／−の細胞
Ｉ４縮液１０−を得た。
Ｉ４縮液１０−を得た。
本液を２％カラギーナン水溶液４０−と室温で混合し、
内径０．２ ｆｆ１ｍの単孔ノズルから２％塩化カリウ
ム溶液を入れた２２の槽の液面に滴下した０滴下してゲ
ル化した細胞を包括したカラギーナンにゲル粒子を濾過
により分離し、水洗して、６０ｇの粒子を得た（細胞濃
度１．４Ｘ１０’細胞／＠１）。
内径０．２ ｆｆ１ｍの単孔ノズルから２％塩化カリウ
ム溶液を入れた２２の槽の液面に滴下した０滴下してゲ
ル化した細胞を包括したカラギーナンにゲル粒子を濾過
により分離し、水洗して、６０ｇの粒子を得た（細胞濃
度１．４Ｘ１０’細胞／＠１）。
次に、直径１０４ ｔｒａ、高さ１６４ ｍｍ、容量７
０５−１子牛血清９０ｍｆ （合計９００ ｉｆ）を入
れて３７°Ｃに保温した。培養槽には気相部に空気導入
用配管及び排気用配管の他、液中に撹拌翼とｐＨ電極を
配置した。気相部に滅菌処理した５％炭炭酸ガス化化空
気−０，３ｃｍ／ｓｅｃで通気し、ｐＨ７，０にコント
ロールし、撹拌速度４０ｒｐｍで５日間培養した。培養
後、デカンテーションで培養液を除き、細胞固定化粒子
を回収した。
０５−１子牛血清９０ｍｆ （合計９００ ｉｆ）を入
れて３７°Ｃに保温した。培養槽には気相部に空気導入
用配管及び排気用配管の他、液中に撹拌翼とｐＨ電極を
配置した。気相部に滅菌処理した５％炭炭酸ガス化化空
気−０，３ｃｍ／ｓｅｃで通気し、ｐＨ７，０にコント
ロールし、撹拌速度４０ｒｐｍで５日間培養した。培養
後、デカンテーションで培養液を除き、細胞固定化粒子
を回収した。
次に、本ゲル粒子にカラギーナ″ン分解酵素を、１００
０単位添加し、混合して３７℃で３０分間保温して、ゲ
ルを溶解した０次いで、ズブチリシンをｌＯ単位添加し
、３７℃で２分間保持した。顕微鏡下で細胞集落が個々
の細胞に分散していることを確認し、細胞濃度３．２Ｘ
１０’細胞／ｄの液８０ｗ１を得た。本液中の細胞の９
３％が生細胞であった。
０単位添加し、混合して３７℃で３０分間保温して、ゲ
ルを溶解した０次いで、ズブチリシンをｌＯ単位添加し
、３７℃で２分間保持した。顕微鏡下で細胞集落が個々
の細胞に分散していることを確認し、細胞濃度３．２Ｘ
１０’細胞／ｄの液８０ｗ１を得た。本液中の細胞の９
３％が生細胞であった。
本実施例に示すように、高い生残率で、かつ高い収率で
ゲル中の細胞を分散状態として回収し、再度培養用の種
細胞として用いることが可能となる。
ゲル中の細胞を分散状態として回収し、再度培養用の種
細胞として用いることが可能となる。
実施例２
実施例１と同じ条件でラット肝臓癌細胞を培養し、細胞
濃度１．４Ｘ１０’細胞／ｍＩの培養液を２２得た。こ
れを遠心分離して２．９Ｘ１０’細胞／−の細胞培養液
ｌ〇−を得た。
濃度１．４Ｘ１０’細胞／ｍＩの培養液を２２得た。こ
れを遠心分離して２．９Ｘ１０’細胞／−の細胞培養液
ｌ〇−を得た。
本漬を実施例１と同じ方法で同じ条件下で固定化して、
凝固剤水溶液から固液分離した。本粒子（６０ｇ、細胞
濃度１．３Ｘ１０’細胞／−）０次に実施例１と同じ方
法及び同じ条件下で培養した。次いで実施例１で行う培
養後の固液分離をせず、そのままカラギーナン分解酵素
２０００単位を添加し、３７℃で通気しながら２０分間
保持した。次にズブチリシンを５０単位添加し、３７℃
で通気しながら５分間保持した。顕微鏡下で細胞集落が
個々の細胞に分散していることを確認し、細胞濃度２．
８Ｘ１０’の液９２０ｄを得た０本液中細胞の生残率は
実施例１よりも高い９６％であった。
凝固剤水溶液から固液分離した。本粒子（６０ｇ、細胞
濃度１．３Ｘ１０’細胞／−）０次に実施例１と同じ方
法及び同じ条件下で培養した。次いで実施例１で行う培
養後の固液分離をせず、そのままカラギーナン分解酵素
２０００単位を添加し、３７℃で通気しながら２０分間
保持した。次にズブチリシンを５０単位添加し、３７℃
で通気しながら５分間保持した。顕微鏡下で細胞集落が
個々の細胞に分散していることを確認し、細胞濃度２．
８Ｘ１０’の液９２０ｄを得た０本液中細胞の生残率は
実施例１よりも高い９６％であった。
実施例３
１１ｅｌａの細胞（大子宮ガン細胞）を以下の組成の培
地１００−の入った５００ｍガラス製回転培養ビン２０
本に５ Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／ｄに接種し、３７°Ｃ１
回転速度１０ｒｐｍで３日間培養した。気相ガスは空気
とした。
地１００−の入った５００ｍガラス製回転培養ビン２０
本に５ Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／ｄに接種し、３７°Ｃ１
回転速度１０ｒｐｍで３日間培養した。気相ガスは空気
とした。
培地組成
グルコース ２０００ Ｂ／ １２アルギ
ニン・塩酸塩 １２６〃 シスチン ２４〃 グルタミン ２９２〃 ヒスチジン塩酸塩 ４２〃 ロイシン ５２〃 イソロイシン ５２〃 リジン塩酸塩 ７３ ｔａｇ／Ｉｔメチオニ
ン １５〃 フェニルアラニン ３２〃 スレオニン ４８〃 トリプトファン １０〃 チロシン ３６〃 バリン ４６〃 チアミン １．０〃 リボフラビン ０．１〃 ピリドキサール １．０〃 パントテン酸 １．０〃 ニコチ、ン酸 １．０〃ビオチン
０．０２〃 コリン塩酸塩 １．８〃 葉 酸 １．０〃イノシトール
２．０〃 塩化ナトリウム ８０００〃 塩化カリウム ２００〃 牛胎児血清 ｌＸ１０’＃ ｐＨ７，０計ｌ！ 上記の培養した培養びんの表面に付着した細胞は剥離し
、細胞濃度１．ｌＸ１０’細胞／−の培養液２２を得た
。これを無菌的に遠心分離を行い２．２×１０−細胞／
−の濃縮細胞液１０ｍを得た。
ニン・塩酸塩 １２６〃 シスチン ２４〃 グルタミン ２９２〃 ヒスチジン塩酸塩 ４２〃 ロイシン ５２〃 イソロイシン ５２〃 リジン塩酸塩 ７３ ｔａｇ／Ｉｔメチオニ
ン １５〃 フェニルアラニン ３２〃 スレオニン ４８〃 トリプトファン １０〃 チロシン ３６〃 バリン ４６〃 チアミン １．０〃 リボフラビン ０．１〃 ピリドキサール １．０〃 パントテン酸 １．０〃 ニコチ、ン酸 １．０〃ビオチン
０．０２〃 コリン塩酸塩 １．８〃 葉 酸 １．０〃イノシトール
２．０〃 塩化ナトリウム ８０００〃 塩化カリウム ２００〃 牛胎児血清 ｌＸ１０’＃ ｐＨ７，０計ｌ！ 上記の培養した培養びんの表面に付着した細胞は剥離し
、細胞濃度１．ｌＸ１０’細胞／−の培養液２２を得た
。これを無菌的に遠心分離を行い２．２×１０−細胞／
−の濃縮細胞液１０ｍを得た。
本漬を２％アルギン酸溶液４０ｍ１と室温で混合し、内
径０．２園の単孔ノズルから１％ＣａＣ１，溶液を入れ
た２１の槽の液面に滴下した０滴下して生成する直径２
〜３Ｍの細胞のアルギン酸−Ｃａゲル包括粒子をデカン
テーションにより分離し、水洗して、５８ｇの粒子を得
た（細胞濃度４．４Ｘ１０’細胞／−）。
径０．２園の単孔ノズルから１％ＣａＣ１，溶液を入れ
た２１の槽の液面に滴下した０滴下して生成する直径２
〜３Ｍの細胞のアルギン酸−Ｃａゲル包括粒子をデカン
テーションにより分離し、水洗して、５８ｇの粒子を得
た（細胞濃度４．４Ｘ１０’細胞／−）。
次に、直径ＩＱ４ ＩＩＩＩｌ、高さ１６４ ｅｒａ、
容量１５００ａｉｆの円筒形のガラス製培養槽に液体培
地７０５−１子牛血清９０−（合計９００ ｍｌ＞を入
れて３７°Ｃに保温した。
容量１５００ａｉｆの円筒形のガラス製培養槽に液体培
地７０５−１子牛血清９０−（合計９００ ｍｌ＞を入
れて３７°Ｃに保温した。
培養槽には気相部に空気導入用配管及び排気用配管の他
、液中に撹拌翼とｐＨ電極を配置した。気相部に滅菌処
理空気を０．３ｃｍ／ｓｅｅで通気し、ｐＨ７，０にコ
ントロールし、撹拌速度４Ｑｒｐｍで５日間培養した。
、液中に撹拌翼とｐＨ電極を配置した。気相部に滅菌処
理空気を０．３ｃｍ／ｓｅｅで通気し、ｐＨ７，０にコ
ントロールし、撹拌速度４Ｑｒｐｍで５日間培養した。
培養後、デカンテーションで培養液を除き、細胞固定化
粒子を回収した。ゲル粒子の一部を破砕しＤＮＡ量から
細胞濃度を測定した結果、ゲル粒子体積基準で７．ＯＸ
１０ｈケ／−であった（総数４．０６Ｘ１０”）。
粒子を回収した。ゲル粒子の一部を破砕しＤＮＡ量から
細胞濃度を測定した結果、ゲル粒子体積基準で７．ＯＸ
１０ｈケ／−であった（総数４．０６Ｘ１０”）。
次に、本ゲル粒子にアルギュナーゼ（アルギン酸分解酵
素） １０００単位を添加し、混合して３７°Ｃで２０
分間保温して、ゲルを溶解した。次いで、トリプシンを
２０単位添加し、３７°Ｃで１分間保持した。
素） １０００単位を添加し、混合して３７°Ｃで２０
分間保温して、ゲルを溶解した。次いで、トリプシンを
２０単位添加し、３７°Ｃで１分間保持した。
顕微鏡下で細胞集落が各細胞に分散していることを確認
後、無菌処理の０．９％食塩水を加え１００ ｍｌとし
た。本液中の細胞数は３．７Ｘ１０”であった。
後、無菌処理の０．９％食塩水を加え１００ ｍｌとし
た。本液中の細胞数は３．７Ｘ１０”であった。
そのうち生細胞は９２％であった。
本実施例に示すように、高い生残率で、かつ高い収率で
ゲル中の細胞を分散状態で回収できる。
ゲル中の細胞を分散状態で回収できる。
実施例４
実施例３と同じ方法及び条件で、ゲル包括、固定化粒子
の培養、粒子の固液分離を行った０次いでゲルの加水分
解及び蛋白分解酵素で処理する際、培養に用いたものと
同組成の液体培地５０−を添加し、槽底部から０．００
１ｃｍ／ｓｅｃの速度で弱く通気しながら、３７℃に保
持した。顕微鏡下で細胞集落が個々の細胞に分散してい
ることを確認し、細胞濃度２．０ＸｌＯ’細胞／＠ｌの
液１３０＠ｌを得た０本液中細胞の生残率は実施例１よ
りも高い９５．７％を示した。
の培養、粒子の固液分離を行った０次いでゲルの加水分
解及び蛋白分解酵素で処理する際、培養に用いたものと
同組成の液体培地５０−を添加し、槽底部から０．００
１ｃｍ／ｓｅｃの速度で弱く通気しながら、３７℃に保
持した。顕微鏡下で細胞集落が個々の細胞に分散してい
ることを確認し、細胞濃度２．０ＸｌＯ’細胞／＠ｌの
液１３０＠ｌを得た０本液中細胞の生残率は実施例１よ
りも高い９５．７％を示した。
比較例１
実施例１と同方法及び同一条件下によりローラビンで培
養した。次いで、実施例１と同方法及び同一条件で固定
化後、粒子を培養し粒子を回収した。実施例１が２段階
の酵素処理で細胞をゲル中から抽出分離するのに対し、
本比較例では従来法の一例として、粒子に水２〇−添加
しこれをホモジナイザーで破砕した（１０００ｒｐｍ、
２ｍ１ｎ処理）。破砕液を濾過し、ゲル破片と液とに分
離した。液中の細胞濃度は０．５ Ｘ １０”／−であ
り、生残率は２１％であった。また、顕微鏡観察では、
細胞が分散せず、単細胞と認められるものはわずか２２
％であった。
養した。次いで、実施例１と同方法及び同一条件で固定
化後、粒子を培養し粒子を回収した。実施例１が２段階
の酵素処理で細胞をゲル中から抽出分離するのに対し、
本比較例では従来法の一例として、粒子に水２〇−添加
しこれをホモジナイザーで破砕した（１０００ｒｐｍ、
２ｍ１ｎ処理）。破砕液を濾過し、ゲル破片と液とに分
離した。液中の細胞濃度は０．５ Ｘ １０”／−であ
り、生残率は２１％であった。また、顕微鏡観察では、
細胞が分散せず、単細胞と認められるものはわずか２２
％であった。
従って、本発明は、比較例にくらべ、細胞回収率、生残
率、分散度において格段に優れている。
率、分散度において格段に優れている。
本発明により、ゲル中に包括された状態で増殖した集落
中の細胞を失活させずにかつ収率よ（細胞単位で液中に
懸濁化することが可能となり、ゲル包括固定化培養方法
における培養を効率的にサイクル化することが可能とな
る。
中の細胞を失活させずにかつ収率よ（細胞単位で液中に
懸濁化することが可能となり、ゲル包括固定化培養方法
における培養を効率的にサイクル化することが可能とな
る。
第１図は本発明のゲル包括固定化培養装置の一例を示す
構成図である。 ゛ 符号の説明 ■・・・液体培地貯槽、２・・・液体培地、３・・・液
体培地移送配管、４・・・空気圧縮機、５・・・空気移
送配管、６・・・培養排気排出用配管、７・・・細胞ゲ
ル包括粒子、８・・・細胞ゲル包括粒子貯槽、９・・・
細胞ゲル包括粒子移送配管、１０・・・培養排気、１１
・・・培養液、１２・・・培養液移送配管、１３・・・
固液分離装置、１４・・・培養濾液、１５・・・細胞ゲ
ル包括粒子、１６・・・細胞ゲル包括粒子移送配管、１
７・・・ゲル加水分解反応槽、１８・・・細胞ゲ７１＜
包括粒子、１９・・・ゲル加水分解反応液、２０・・・
蛋白加水分解反応槽、２１・・・蛋白加水分解反応液、
２２・・・蛋白加水分解反応液移送配管、２３・・・ゲ
ル包括粒子調製槽、２４・・・ゲル化剤・細胞混合液滴
下ノズル、２５・・・ゲル包括粒子・凝固剤混合液、２
６・・・ゲル包括粒子・凝固剤混合液移送配管、２７・
・・固液分離装置、２８・・・凝固剤溶液、２９・・・
ゲル包括粒子、３０・・・ゲル加水分解酵素水溶液貯槽
、３１・・・ゲル加水分解酵素水溶液、３２・・・ゲル
加水分解酵素水溶液移送配管、３３・・・蛋白加水分解
酵素水溶液貯槽、３４・・・蛋白加水分解酵素水溶液、
３５・・・蛋白加水分解酵素水溶液移送配管、３６・・
・混合槽、３７・・・ゲル化剤・細胞混合液、３８・・
・ゲル化剤・細胞混合液移送配管、３９・・・ゲル化剤
貯槽、４０・・・ゲル化剤、４１・・・ゲル化剤移送配
管。 −Ｃ：％Ａｎ−
構成図である。 ゛ 符号の説明 ■・・・液体培地貯槽、２・・・液体培地、３・・・液
体培地移送配管、４・・・空気圧縮機、５・・・空気移
送配管、６・・・培養排気排出用配管、７・・・細胞ゲ
ル包括粒子、８・・・細胞ゲル包括粒子貯槽、９・・・
細胞ゲル包括粒子移送配管、１０・・・培養排気、１１
・・・培養液、１２・・・培養液移送配管、１３・・・
固液分離装置、１４・・・培養濾液、１５・・・細胞ゲ
ル包括粒子、１６・・・細胞ゲル包括粒子移送配管、１
７・・・ゲル加水分解反応槽、１８・・・細胞ゲ７１＜
包括粒子、１９・・・ゲル加水分解反応液、２０・・・
蛋白加水分解反応槽、２１・・・蛋白加水分解反応液、
２２・・・蛋白加水分解反応液移送配管、２３・・・ゲ
ル包括粒子調製槽、２４・・・ゲル化剤・細胞混合液滴
下ノズル、２５・・・ゲル包括粒子・凝固剤混合液、２
６・・・ゲル包括粒子・凝固剤混合液移送配管、２７・
・・固液分離装置、２８・・・凝固剤溶液、２９・・・
ゲル包括粒子、３０・・・ゲル加水分解酵素水溶液貯槽
、３１・・・ゲル加水分解酵素水溶液、３２・・・ゲル
加水分解酵素水溶液移送配管、３３・・・蛋白加水分解
酵素水溶液貯槽、３４・・・蛋白加水分解酵素水溶液、
３５・・・蛋白加水分解酵素水溶液移送配管、３６・・
・混合槽、３７・・・ゲル化剤・細胞混合液、３８・・
・ゲル化剤・細胞混合液移送配管、３９・・・ゲル化剤
貯槽、４０・・・ゲル化剤、４１・・・ゲル化剤移送配
管。 −Ｃ：％Ａｎ−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、水和性ゲル中に動物細胞を包括固定化し、これを液
体培地中で培養することにより動物細胞をゲル中で増殖
させるゲル包括固定化培養方法において、種細胞の調製
を次の各工程により行うことを特徴とする動物細胞のゲ
ル包括固定化培養方法： １）動物細胞を水和性ゲルに包括固定化してなる固定化
物を培養することにより得られるゲル中に動物細胞の集
落を有する固定化物を含む培養液を、ゲル骨格を加水分
解できる加水分解酵素と接触させ、ゲルを加水分解する
第１工程。 ２）第１工程で得られたゲル加水分解処理培養液と蛋白
加水分解酵素とを接触させてゲル加水分解酵素を失活さ
せることにより、種細胞として使用し得る細胞懸濁液を
得る第２工程。 ２、第１工程及び第２工程を低分子栄養成分及び酸素の
存在下で行うことを特徴とする請求項１記載の動物細胞
のゲル包括固定化培養方法。 ３、水和性ゲル中に動物細胞を包括固定化し、これを液
体培地中で培養することにより動物細胞をゲル中で増殖
させるゲル包括固定化培養方法において、種細胞の調製
を次の各工程により行うことを特徴とする動物細胞のゲ
ル包括固定化培養方法： １）動物細胞を水和性ゲルに包括固定化してなる固定化
物を培養することにより得られるゲル中に動物細胞の集
落を有する固定化物を含む培養液を、固液分離して、固
定化物を回収する第１工程。 ２）第１工程で得られる固定化物を、ゲル骨格を加水分
解できる加水分解酵素と接触させ、ゲルを加水分解する
第２工程。 ３）第２工程で得られたゲル加水分解処理物と蛋白加水
分解酵素とを接触させてゲル加水分解酵素を失活させる
ことにより、種細胞として使用し得る分散状態の細胞を
得る第３工程。 ４、第２工程を低分子栄養成分及び酸素の存在下で行う
ことを特徴とする請求項３記載の動物細胞のゲル包括固
定化培養方法。 ５、水和性ゲル中に動物細胞を包括固定化し、これを液
体培地中で培養することにより動物細胞をゲル中で増殖
させるゲル包括固定化培養方法において、種細胞の調製
を次の各工程により行うことを特徴とする動物細胞のゲ
ル包括固定化培養方法： １）動物細胞を水和性ゲルに包括固定化してなる固定化
物を培養することにより得られるゲル中に動物細胞の集
落を有する固定化物を含む培養液を、固液分離して、固
定化物を回収する第１工程。 ２）第１工程で得られる固定化物を機械的に破砕する第
２工程。 ３）第２工程で得られる破砕処理固定化物を、ゲル骨格
を加水分解できる加水分解酵素と接触させ、ゲルを加水
分解する第３工程。 ４）第３工程で得られたゲル加水分解処理物と蛋白加水
分解酵素とを接触させてゲル加水分解酵素を失活させる
ことにより、種細胞として使用し得る分散状態の細胞を
得る第４工程。 ６、第３工程を第２工程で得られる破砕処理固定化物に
低分子栄養成分を含む水溶液及び酸素を供給しながら行
うことを特徴とする請求項５記載の動物細胞のゲル包括
固定化培養方法。 ７、細胞ゲル包括粒子貯槽、培養槽、ゲル加水分解反応
槽、蛋白加水分解反応槽、ゲル包括粒子調製槽、ゲル包
括粒子分離槽を具備することを特徴とする動物細胞のゲ
ル包括固定化培養装置。 ８、ゲル加水分解反応槽及び蛋白加水分解反応槽に対す
る低分子栄養成分及び酸素の供給手段を設けたことを特
徴とする請求項７記載の動物細胞のゲル包括固定化培養
装置。 ９、培養槽とゲル加水分解反応槽間に固液分離槽を設け
たことを特徴とする請求項７記載の動物細胞のゲル包括
固定化培養装置。 １０、ゲル加水分解反応槽に対する低分子栄養成分及び
酸素の供給手段を設けたことを特徴とする請求項９記載
の動物細胞のゲル包括固定化培養装置。 １１、ゲル加水分解反応槽に供給されるゲル包括粒子の
破砕手段を設けたことを特徴とする請求項７記載の動物
細胞のゲル包括固定化培養装置。 １２、ゲル加水分解反応槽に対する低分子栄養成分及び
酸素の供給手段を設けたことを特徴とする請求項１１記
載の動物細胞のゲル包括固定化培養装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63039600A JPH01215281A (ja) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | 動物細胞のゲル包括固定化培養方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63039600A JPH01215281A (ja) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | 動物細胞のゲル包括固定化培養方法及び装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01215281A true JPH01215281A (ja) | 1989-08-29 |
Family
ID=12557604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63039600A Pending JPH01215281A (ja) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | 動物細胞のゲル包括固定化培養方法及び装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01215281A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05192135A (ja) * | 1992-01-21 | 1993-08-03 | Hitachi Ltd | 動物細胞の担体からの剥離及び移植方法 |
| WO2024157558A1 (ja) * | 2023-01-24 | 2024-08-02 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 細胞凝集塊の製造方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61502513A (ja) * | 1984-06-01 | 1986-11-06 | カライオン テクノロジイ インコ−ポレ−テツド | 透過性ゲル内における組織の培養および生成 |
-
1988
- 1988-02-24 JP JP63039600A patent/JPH01215281A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61502513A (ja) * | 1984-06-01 | 1986-11-06 | カライオン テクノロジイ インコ−ポレ−テツド | 透過性ゲル内における組織の培養および生成 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05192135A (ja) * | 1992-01-21 | 1993-08-03 | Hitachi Ltd | 動物細胞の担体からの剥離及び移植方法 |
| WO2024157558A1 (ja) * | 2023-01-24 | 2024-08-02 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 細胞凝集塊の製造方法 |
| JP7540811B1 (ja) * | 2023-01-24 | 2024-08-27 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 細胞凝集塊の製造方法 |
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