JPH01218593A - 脂肪酸エステルの合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の目的） 本発明は本発明者らが先に開発した脂肪酸エステルの酵
素による製造方法を工業的に、より有利に実施できる改
良された方法を提供することにある。

（従来の技術） えばコレステリック液晶（特開昭５２−２４９９２号公
報参照）や、医薬化粧用親水性基剤（特開昭５２−７９
０３０号公報参照）等として各種分野で広く用いられて
いる。

また高級アルコール類の脂肪酸エステル類は、医薬化粧
用親水性基剤として古くから用いられてきている。

従来かかる脂肪酸エステル類は、もっばら有機合成法に
より製造されていたが、一般に有機合成法では過酷な反
応条件が採用され、しかも副反応が起きる弊害は避けら
れず、反応に引き続き、複雑な目的物の単離精製操作が
必要となる。特にステロールの水酸基はセカンダリ−で
あり、しかもこの水酸基はステロイド骨格に近接してい
るために、通常の脂肪族セカンダリ−アルコールと比較
しても反応性が低下しており、そのためステローされて
いた。

本発明者らは上記過酷な反応条件を要し、高価でかつ不
安定な反応試薬等を必要とする有機合成によることなく
、所望のエステル類をより温和な条件で有利に品質よく
、かつ収率よく製造できる方法を提供することを目的と
して鋭意研究を重ねた結果、先に特定の酵素がスチロー
ルエステル類の合成を触媒することを見いだし、この知
見に基づき酵素による脂肪酸エステルの合成法を発明し
、特許出願した。（特開昭６１−２０４１９７、特開昭
６１−２００９９７、特開昭６２−４８３９１、特開昭
６２−１６６８９５、特願昭６ｌ−２００９９７） しかしながら、これらには次のような問題点があり、工
業的な実施のために改善が必要であつた。

１、耐熱性でかい従来のリパーゼは、一般の酵素とくら
べてその安定性が低く、特に水溶液中では不安定であっ
た。そのため酵素当りに仕込む原料基質の量を大きくす
ると、所定の合成率に到達するまでの間に失活してしま
い、充分高い合成率を得るためにば大量のリパーゼ□を
用いる必要があった。その結果、酵素当りの生産量が低
くなり、また１バツチ生産量が小さくなり原料仕込など
の非生産時間が増加し生産性が低かった。

２、本発明者らが先に出願した基質液と酵素溶液で安定
な乳化分散液をつくりその後は静置して反応させるる方
法（特願昭６１−２００９９７）は、分散液中の無数の
王マルジョンの水／油界面で反応が起こるため、継続的
攪拌を必要としないという点で優れた方法であったが、
同時にエステル化の進行に伴い生成する水の移動が制限
され反本質的に水を必要とし心水の制御が不可能である
ため、充分に高い合成率が得られず、また安ｔな分散液
の調製のために特殊な乳化機を必要とした。

３、固定化操作が繁雑で、担体ゲルの粒状化が困難であ
り、固定化のスケールアップに特殊な装置が必要。

４、常温で固体または半固体の基質を用いる場合、耐熱
性の乏しい酵素では反応温度を高くできないため、その
流動性の改善に大量の溶媒を必要とする。

（発明が解決しようとする問題点） そこで本発明者らは、従来技術の持つこれらの問題点を
解決すべく研究開発を進めた結果以下の知見を見いだし
、これらの問題を解決するに至った。

ス属由来のリパーゼから選択される酵素が、本発明の条
件下で安定であり、寿命が長いこと。

２、上記酵素がステロイド２骨格に近接した立体障害を
持つセカンダリ−の水酸基のエステル合成を触媒できる
こと。

３、継続的混合により、生成する水に動きを与え基質の
疎水性により、水を反応の場から効果的に排除できるこ
と。

４、上記酵素が従来のステロールエステル合成能をもつ
リパーゼと異なり、水／油２相系の場合よりも非水系で
大きな反応速度を示すこと。

５、非水系で連続的に脱水し゛てやることにより、大き
な反応速度を得ると同時に、反応の平衡をずらし、更に
合成側に進められること。

すなわち本発明は、耐熱性でセカンダリ−の水−Ｘフニ 酸基からなるエステル結合を加水分解できるシユウドモ
ナス属由来のリパーゼから選択される酵素を用いて、ア
ルコール成分と酸成分を含む基質液を、上記酵素と継続
的に混合・接触反応させることを特徴とする脂肪酸エス
テルの合成法に間するものである。

本発明でいうエステル合成とは、生成物が脂肪酸エステ
ルであるような反応であり、いわゆるアシドリシス、ア
ルコリシスのようなエステル交換反応も含んでいる。

本発明で耐熱性のリパーゼとは水溶液での６０°Ｃで６
０分処理後の残存相対分解活性が６０％以上のもののこ
とである。セカンダリ−の水酸基からなるエステル結合
を加水分解できるリパーゼとは、グリセライドのβ位を
加水分解できる酵素のなかから選択されるが、そのスチ
ロールの水酸基に対する反応性にはさまざまの違いが認
められるため、グ・す、セライトのβ位を加水分解でき
るこ、二、″ とは必要条件ではあっても十分条件ではない。

その起源としては例えばシユウドモナス・フルオレセン
ス会バイオタイプＩ　（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｏｎｕｓｆｌ
ｏｒｅｓｃｅｎｓ　ｂｏｉｔｙｐｅ　　Ｉ、Ｎｏ、１０
２１　　微工研菌寄　第５４９６号）、シユウドモナス
・メヒチカ・リポリチカ（Ｐｓｅｕｄｏ＊ｏｎｕｓ　ｍ
ｅｐｈｉｔｉｃａ＋ｔｐｏ＋ｙｔｔｃａ、微工研　菌寄
　第１５２０号）などを例示できる。

これらの酵素はいろいろな形態のものを使用できる０例
えば、精製された酵素粉末またその水溶液、酵素生産能
を有する微生物菌体もしくはその乾燥物、培養液そのも
のおよびその粗酵素液などが使用できる。

さらにこれらの酵素はイオン交換樹脂（ダウエックスＭ
ＷＡ　１　、ダウエックス６６など）、吸着性樹脂（ア
ンバーライトＸＡＤ−２、アンバーライトＸＡＤ−８、
クーヴモソーブ１０１など）など４・上、！・ノ の適当な担体に固定化して用いることもできる。

固定化は酵素溶液を樹脂とともにｌ夜　振トウし、バッ
ファーで洗浄後適当に乾燥して使用するか、またはグル
タルアルデヒドで架橋した後洗浄して使用すればよい、
（特公昭５９−２０３５７参Ｍ） 反応に固定化酵素を用いた場合には酵素は更に安定化し
、また反応液からの酵素の回収が容易となる。

また、基質であるアルコール成分としては、コレステロ
ール、βコレスタノール、エルゴステロール、カンペス
テロール、βシトスチロールなどのステロール類、ラノ
ステロール、ジヒドロラノステロールおよびこれらの混
合物としての羊毛ロウより分離精製して得られるイソコ
レステロールＣ′、゛・ コール類゛、およびそれらのエステル類が用いられる。

該アルコール類は飽和でも不飽和でもよく、また直鎖で
も分枝鎖状でもよく、更に１級でも２級以上でもよく、
これらの混合物でもよい。

炭素数は長鎖の方が疎水性が大きくなるため疎水性界面
を作りやすく、反応の平衡も合成側となるため好ましく
、炭素数１２以上が特に好ましい。

分枝鎖状アルコールとしては、一般式 及び一般式 で表される物、及びこれらの混合物、例えばラノリンア
ルコール、およびこれから各種の成分を分画して誘導さ
れる誘、−コ梅を例示できる。

また、脂肪族−α、−β−ジオール類、脂肪族−α、ω
−ジオール類等も例示できる。

更に分校鎖状合成アルコール類としては、ヘキサデシル
アルコール（エッソスタンダード社）、エヌジエコール
１ＢＯＡ、１６０Ｂ、１８１Ａ。

２０ＯＡ、２００Ｃ（いずれも新日本理化社）ファイン
オキソコール１８００（日産化学社）、ダイヤドール１
８Ｇ（三菱化成社）、オクチルドデカノール（ヘンケル
社）等を例示できる。

本発明において他方の原料とする酸成分としては、以下
の脂肪酸および脂肪酸のグリセリンエステルおよび炭素
数１−３２の脂肪族アルコールエステル類のいずれでも
よい。

該脂肪酸には炭素数１−３２の下記各種の飽和の奇数又
は偶数直鎖脂肪酸、分枝鎖状脂肪酸、不飽和のモノエン
、ジエン、トリエン脂肪酸、オキまた上記脂肪酸エステ
ル類を構成するアルコール成分は、グリセリン及び炭素
数１−３２の脂肪族アルコールであり、これらの脂肪酸
エステル類は酵素により一旦、構成成分に加水分解され
、その後反応に関与すると考えられ、エステル交換率は
反応の平衡によって左右される。

該アルコールには、１級及び２級の直鎖又は分枝鎖状ア
ルコールが含まれ、そのうち炭素数が１６迄のもの、特
に炭素数１−４の脂肪族アルコールは、疎水性が低くな
るため反応の平衡が原料アルコールエステルの分解側に
なり、従って目的エステルのエステル交換率かたかくな
り好ましい。

上記脂肪酸のグリセリンエステル類は、モノエステル、
ジエステル、トリエステルのいずれでもよく、これらの
混合物でもよい。

は天然、または合成−゛ア油脂（グリセライド）、天然
、または合成のワックス等も含まれる。この天然油脂と
しては、例えばアマニ油、オリーブ油、カカオ脂、米糠
油、大豆油、椿油、菜種油、パーム油、パーム核油、ヒ
マシ油、棉実油、木ろう、ヤシ油、らっかせ□い油、ひ
まわり油等の植物油、牛脂、乳脂、羊脂、牛脚油、鯨油
、タラ肝油、いわし油、オレンジラツフイー油、にしん
油等の動物油及びこれらの硬化油などを例示できる。

また天然ワックスとして例えば、鯨ロウ、いぼたロウ、
カーナバロウ、カンデリラロウ、糠ロウ、セラックロウ
、ミツロウ、モンタンロウ、羊毛ロウ、綿ロウ等を例示
できる。

上記脂肪酸エステル類は、その１種を単独で、または２
種以上を混合して本発明の反応に利用できる。（特開昭
６１−２０４１９７、特開昭６１なお基質の一方がグリ
セライド、オレイン酸メチルの様な脂肪酸エステルの場
合には、反応初期は原料脂肪酸エステルの加水分解のた
めに水を必要とするが、反応初期に系内に水が存在すれ
ば原料脂肪酸エステルの分解の方が合成に先行して起こ
ることから、初期分解の終了後、脱水することにより問
題なく使用できる。

本発明において、原料とする基質が常温で固体であり、
そのままでは流動状態が悪い場合には、酵素活性を阻害
しない溶媒、たとえばヘキサン、ヘプタン、オクタン、
イソオクタン（ｆｏｅ）、シクロヘキサン、デカン、ヘ
キサデカン、流動パラフィン、スクワラン、スクワレン
、プリスタン、およびこれらの混合溶媒、たとえばアイ
ビーツルベン）１０１６（出光石油化学社製）、アイ望
ましい。

本発明に使用する基質は、単に流動すればよく、本発明
は飽和濃度以上の未溶解部のあるスラリー状での実施に
適し、スラリー状の基質を使用した場合、反応により消
費された基質は、反応系内にスラリーとして過剰に存在
する未溶解の基質が溶解することにより補給される。

８５％もの高濃度であっても、基質阻嘗はみとめられな
い。

本発明では耐熱性酵素を使用するので、通常の酵素を使
用する場合よりも反応温度を高くできる。そのため、基
質の溶解度は高くなり、また反応速度についても大きく
なる。（３７°Ｃと６０゛Ｃではｓｏ’　ｃの反応速度
の方が約２倍近く大きくなる場合がある。）シかしなが
ら、あまり高・：ｒ−’Ｌ 活性寿命が址・くなるなどの不利もあや、反応温度の設
定は、基質溶解度、活性寿命、基質比、基質量、反応方
式、エネルギーコストなどの諸条件を考慮して決定する
必要がある。

基質のモル比については、どちらが多くてもよく、比が
大きいほうが反応速度は速くなる。しかしながら、あま
りモル比を大きくとると、精製工程での負担が大きくな
る６通常酸成分の方が安価であるので酸成分過剰とし、
モル比は１から３の範囲が好ましい。

基質比（アルコール成分の初発ミリモル数／酵素の合成
単位）が小さい場合には合成速度は充分に早いが、基質
交換の頻度が高くなり非生産時間が増加する。

基質比が大きい場合、系内は基質大過剰の状態であると
考えられ、酵素−基質複合体のターンオ合成率に達する
時間は基質量の増加にともない遅くなるが、基質交換の
回数は少なくなり、活性持続期間中の非生産時間は減少
する。

耐熱性のない通常のリパーゼの場合、水溶液中では不安
定であるが、耐熱性酵素は耐熱性だけでなく水溶液中で
の安定性もより大きくなっている。そのため基質比を大
きくとっても所定の合成率に到達するまでの時間におけ
る失活は少ないので、合成率は高くなり、充分大きな基
質比でも実施可能である。

基質比をどのくらいにするかは、１バツチの生産量、時
間、経費を考えて、酵素当り、時間当たり、単位装置当
りのエステル合成量が最大になるように決定すべきであ
る。

本発明が対象とする基質は、基本的に疎水性の強い基質
である。そのため水を大量に使用する水ていると考えら
れる。

これが本発明が対象とする脂肪酸エステルの合成反応の
平衡が反応系内の水を少なくするという制御を行わなく
ても、また水／油２相系においても、一方的に合成側に
偏っている理由である。

しかしながら、脂肪酸エステルの合成は分解との可逆反
応であり、反応生成物の１っである水を反応系内より除
去することは、反応を更に合成側に進める上で非常に有
効である。したがって反応系は従来のステロールエステ
ル合成能をもつリパーゼと同様に水を大量に含む２相系
であってもよいが、水を含まない非水系の方が反応の平
衡論の面からはより適当と考えられた。

一方反応速度の面からは従来のステロールエステル合成
能のある、耐熱性のないリパーゼの場合、水を制限した
非水ｉ：ｍｉ条件下での反応速度−・β・・・ は、水／油２相系の場合゛よりも低くなることが知られ
ていた。（一般゛の夛すセライド合成の場合は、水分濃
度が充分低くなければ、反応平衡の関゛係で見かけ上、
合成反応はほとんど進行しない。

そのため充分な反応速度を得るためには、種々の工夫を
して適゛当な水分濃度に調整する必要かあ□ る、） 従゛−゛っ゛てゝン″”ｖｔｔ”＊”が粉末であ゛れば
そ゛のまま使えばよいが、培養液そのもの、″または少
し精製した粗□酵素液の形で用いるときには、継続的な
混合攪拌を行いな゛がら反応系を適当な方法°で脱水し
てやることが、反□応を合成側に進めると同時に反ボ遼
度を高くすることにもつながり好ましい。

″（ν・人　−ト　　徹　色） 存在が保湿性の向上の点で好ましいため９０％程度の合
成率で充分であるが、より高純度のエステルが望まれる
場合にはさらに脱水工程を付加することに・より、容易
に合成率を高くすることができる。

脱水は継続的な混合・攪拌のもと、反応系を減圧にする
か、または不活性ガスを吹き込むことにより、容易に達
成される。いずれの場合にも、水と同時に留去される溶
媒については、コンデ・ンサーで凝縮させセットリング
タンクに静置して水層を分離した後、環流管を用いるな
どの適当な手、段により反応系に戻すことが好ましい。

この方法に用いられる反応器としては、その形状にとく
に制限はなく、酵素と液状の基質が継続的に混合でき、
これらが充分接触する形式のもの（作用） 本発明が対象とする基質は、基本的に疎水性の強い基質
である。そのため水を大量に使用する水／油２相系にお
いても、基質の疎水性ゆえに水が排除され、実質的な反
応の場は疎水的−墳になっていると考えられる。

従って、水／油２相系においても反応の平衡は一方的に
合成側に偏っている。

リパーゼによる脂肪酸エステルの合成は分解との可逆反
応であり、生成物である氷を系外へ除去すれば、必然的
に反応は合成側に進行する。

加えて、本発明の酵素は従来のスチロールエステル合成
能をもつ酵素とは異なり、非水系での反応速度の方が水
／油２相系より′も大きい、そのたることができる。

しかも本発明の酵素は耐熱性であるため、より安定であ
り、本発明の条件下での活性の持続期間が長くなってお
り、またセカンダリ−の水酸基からなるエステル結合を
加水分解できるため、ステロールのような立体障害をも
つアルコールをはじめ、種々の基質に作用できる。

また高い基質濃度でも基質阻害がなく、さらにより高い
反応温度を採用できることから溶媒の使用量を少なくす
ることもでき、装置効率の増大が可能となる。

高濃度の基質スラリーを使用することにより、溶解して
いる基質は反応の進行に伴い消費され減少するが、それ
に見合った量の基質が自動的に反応系内に溶解して補給
される。　　　　　・粘度は上昇するがそれにも゛か°
かねらず反応はすみやかに進行する。

非水系において酵素は溶解せず、懸濁粒子として存在す
るため、反応後、ロカまたは遠心分離により容易に反応
液より分離、回収できる。この回収した酵素はそのまま
次の反応に使用できる。

固定化した酵素についても同様である。固定化酵素を用
いた場合は反応中に容器の壁に付着して基質との接触が
不充分になるという欠点は解消される。

また基質液と酵素溶液を用いて安定な乳化分散液を調整
する方法には、静置した分散液中の無数の水／油界面を
反応の場とするために、生成した水の移動が制限され、
充分高い合成率が得られないという問題があった。安定
な乳化分散液を調整し静置した水／油界面を反応の場と
するのではな°１・、１］・ｌ く、酵素と基質液を、ｔａ続的に混合・接触反応させ糞
− ることにより、生成する水に動きを与え、基質の疎水性
により、水が反応の場より排除されるのを促進すること
ができる。また継続的混合は酵素の分散、系外への水の
除去にも重要である。

以下の実施例おいては、特記ない場合は、反応は内径３
ｃｍ、高さ５ｃｍの内蓋付きネジロガラス瓶を反応容器
く以下反応瓶という）として、２０ｍｍｘ３００ｃｐｍ
の振トウ培養機（いわしや生物科学社製のＲＭＲ−９−
２０）を用いて、３７°Ｃの恒温室内で行い、基質は以
下のものを使用した。

コレステロール（ｃ　ｈ　ｏ） ；コレステミール　ＵＳＰ、吉川製油社製、オレイン酸
（ＯＡ） ；エキストラオレイン＃８０、日本油脂社製、；シユウ
ドモナス・フルオレセンス・バイオタイプＩ　（Ｎｏ、
１０２１．１ｍ工研　菌寄第５４９５号）由来のリパー
ゼ Ｂｌａ　　粉末、　４．２ＥＵ／ｇ ７０００Ｕ／ｇ Ｂｉｂ　　粗酵素液、０．７８ＥＵ／ｇ１３００Ｕ／ｍ
１ Ｂｌｃ　　粉末、１０２４ＥＵ／ｇ ２３８０００Ｕ／ｇ ；シユウドモナス・メヒチ力・リポリチカ（微工研　菌
寄第５２０号）由来のリバ・−ゼＭｌ　　粉末、０．１
７ＥＵ／ｇ ２１６０Ｕ／ｇ また合成率（Ａ％）はＴＬＣ−Ｆ　Ｉ　Ｄ　（イアトロ
スキャン、ヤトロン社Ｎ）を用いて、各成分のた。

Ａ％＝ＡＲｓ″ＸＩ　００／　　（ＡＲｓ＋ＡＲｃ）ｋ
だし、 Ａ％　；面積基準合成率 ＡＲｓ；生成エステルのピーク面積 ＡＲｃ；未反応アルコール成分のピーク面積また、既知
濃度の標準溶液を同様に測定することにより、面積基準
合成率（Ａ％）−モル基準合成率（Ｍ％）との換算表を
作成した。Ａ％が５゜５％から９３，０％の範囲では下
式により近領できた。（相間係数＝０．９９６） Ｍ％＝０．７６３ＸＡ％＋５．３１ 以下、合成率は特記なき場合はＡ％で示した。

ＴＬＣ−Ｆ　Ｉ　Ｄ定量法 採取した反応液約１ｍｌにイソオクタンを添加度チャー
ジする。これを適当な溶媒系、例えばヘキサン／エーテ
ル／蟻酸＝５６／１４１０．３の溶媒系で展間し、各成
分を分離する。展開後、１００℃で数分乾燥し展間溶媒
を除去した後、イアトロスキャンＴＨ−１０により、反
応液中の各脂質成分のピーク面積を求める。

リパーゼの分解活性は山田らの方法（日農化誌３６．８
６０−８６４．１９６２）に準じ、ポリビニルアルコー
ルを乳化剤としたオリーブ油エマルジョンを基質とし、
ｐｉ（＝７．０で６ｏ”　ｃで測定、１分間に１Ｍモル
の脂肪酸を遊離する酵素量を１分解単位（Ｕ）とした。

酵素の合成活性は次のように定義した。標準条件におい
て１分間に１８モルのコレステロールオレイン酸エステ
ルを合成する力価を、１合成重位（Ｅ　Ｕ）とした。

標準条件 コレステロール１００ｍｇ、オレイン酸２１９ｍｇ、イ
ソオクタン　３ｍｌを基質溶液として、合成率（Ａ％）
が２０％から６０％の間に入るようにＯ，１Ｍ燐酸バッ
ファーに溶解調整した酵素溶液を加え、２０ｍｍｘ３０
０ｃｐｍの振トウ培養機（いわしや生物科学社製のＲＭ
Ｒ−Ｓ−２０）を用いて３７℃で４０分間反応させる°
、ただし、低力価の酵素の場合は反応時閉を長くして測
定した。

実施例１ コレステロール（ｃｈｏ）１．４８１６ｇ、オレイン酸
（ＯＡ）１．６０１８ｇ、イソオクタン（ｉｏｃ）１０
．０ｍｌからなる基質液を反応瓶第１表 実施例２ 酵＊８１ａを各々３ｍｌの０．１Ｍの燐酸バッファーｐ
Ｈ＝７．０　（ＰＢＸ）にとかして反応瓶に添加した以
外は実施例１と同様にして反応させた。その結果を第２
表に併記した。

実施例１と２の結果から明らかに非水系の方が合成速度
が早いことがわかる。

Ｂｌａの合成単位は４．２ＥＵ／ｇであるが非水系の条
件で測定した場合は２５．ＩＥＵ／ｇとなり、２相系に
くらべて約６倍であった。

実施例２のＮｏ、１の反応を継続した結果、６８時間で
合成率は９７．４％であった。２相系でも反応速度は遅
いが最終合成率が充分高くできることがわかる。

□＋１ 耐熱性リパーゼＢ近”ｃ　（１０２４ＥＵ／ｇ）６．３
ｍｇを１　ｍ　ｌのＯ，ＩＭ燐酸バッファーｐＨ＝６．
０　（ＰＢ８）にとかし、蒸留水およびＰＢ６で洗浄口
力したダウエックス６６　１ｇにくわえ、８′″Ｃで１
夜振トウし吸着させた。その後８＠Ｃで１６０μＬの２
５％グルタルアルデヒド溶液を加え、１０分間振トウし
、２０％亜硫酸水素ナトリウム水溶液０．２ｍｌを加え
、１０分閏娠トウ後、ＰＢ６で洗浄・ロカして固定化酵
素を調製した。

上記固定化酵素を反応瓶に入れ、モル比がＯＡ／ｃｈｏ
＝３、ｉｏｃ　　１０ｍ１の基質液を加え反応させた。

反応後、反応液をロカにより除去し、回収した固定化酵
素に新たに基質液を加え繰り返し反応させた。このよう
にして行った長期間の繰り返し反応の結果を第３表に示
した。

−：’ｌ　、１．、、ｌ　、＋、警　。　表−１−−−
・ この後も更に繰り返しを続け、４３回目（調製間の反応
を行ったところ合成率は９４．６％であった６ ４３回目までの累積合成エステル量は１８．０９１　ｇ
　（０，０２７８モル）であり、合成単位当たり４３１
Ｏマイクロモルのエステルが合成できたことになる。

この結果より、本発明の酵素の固定化は特殊な装置を必
要とせず、スケールアップが容易であること、寿命が長
いこと、酵素当たりの合成量が４３１０倍と高く経済的
な合成法であることがわかる。

実施例４ 別途反応させて得た合成率８９．８％の反応液（初発原
料仕込モル比＝１．５）を脱溶剤したもの１００ｇとｉ
　０　ｃ　２００　ｍ　ｌを第１図の反応部属し、ガス
吹き込みノズル（６）より窒素ガスを吹き込み反応させ
た。酵素と基質は吹き込んだガスによる循環流により混
合、接触され反応が進行した。エステル合成ににともな
い生成した水は吹き込んだガスに随伴して水蒸気となっ
てガス出口（９）より除去された。水蒸気とともに気化
する１０ｃの大部分は凝縮器（１）で凝縮し、系内に戻
った。窒素ガスに含まれて系外へ除去された１０ｃはそ
の相当量を適宜反応系に補充した。

９２時間後の合成率は９９．９％であった。この結果よ
り、９０％程度の反応液からでも耐熱性酵素を用い、継
続的な混合のもと生成した水を除去することにより、本
発明の方法により簡単に充分高い合成率を得られること
がわかる。

実施例５ 実施例４と同じ反応液−（オイル１００ｇ、ｉｏｃ　　
２００ｍ１）を・第２図の反応装置の反応部（６）に入
れ、培養液を濃縮してえられた粗酵素溶液Ｂｌ　ｂ　（
０，７８ＥＵ／ｍｌ）を５０ｍ１添加した。ノズル（１
）より窒素ガスを吹き込みながら攪拌機（７）を用いて
５４０ｒｐｍで攪拌し、反応器全体を４５＠Ｃに保ち、
凝縮器上部（２）をアスピレータ−につないで反応系全
体を減圧として反応を行った。水と１０Ｃは窒素ガスの
吹き込みと減圧により蒸気となって気化し、凝縮ＩＩ　
（３）により凝縮、落下し静置部（４）で水と１０Ｃと
に分離する。液ＷＡより上のｆｏｅは液面差により自動
的に反応系内に還流された。静置部にたまった水は抜き
出しノズル（５）より適宜抜き出した。このようにして
２０時間尺応させた０合成率は９・９．８％であった。

実施例６ 第４表に示すアルコール成分０．２５８ミリモル、酸成
分０．７７６ミリモル、ｊｏｃ３ｍｌを基質液として反
応瓶に入れ、Ｂｌｃ３．６ｍｇをＰＨ１８ｍｌにとかし
た酵素溶液を添加して反応を行った。基質基、反応時間
、合成率を第４表に示した。なお使用した記号は実施例
７中で説明する。

第４表 実施例７ 第５表に示したアルコール成分０．２５８ミリモル、酸
成分のうちグリセライドは０．２５８ミリモル、オレイ
ン酸メチルの場合は０．５１６ミリモル、および１０Ｃ
・３ｍｌ・を基質液として反応瓶に入れ、Ｂｌｃ　　−
３，６ｍｇｔ−ＰＨ１８ｍ１にとかした酵素溶液を添加
して反応を行った。

基質基、反応時間、合成率を第５表に示した。

、第５表 式により合成率を求めた。

反応式は　ＣＯ＋Ｘ−＋ＣＸ＋ＣＯ＋ｃｈ。

ただし、第４．５表中で新たに使用した記号を下記に示
す。

ＳＡ；ステアリン酸 ｉｓＡ；イソステアリン酸（エメリー社製）Ｃａｐ、Ａ
；カプリン酸 Ｐｒｏ、Ａ；プロピオン酸 ０、ａｌｃ；オレイルアルコール ）ＩＰＡ　；αヒドロキシパルミチン酸Ｓ、ａｌｃ；ス
テアリルアルコール Ｌａｕ、ａ；ラウリルアルコール Ｎにエヌジェコール２００Ａ （新日本理化社８１） ＬＡＨＨ；ラノリンアルコールＨＨ （吉川製油社８１） ＣＯ；コレステロールオレイン酸エステルＣ，Ｐｒｏ；
コレステロールプロピオン酸エステル ０、ｏｉｌ；オリーブ油 Ｔａ１ｌ；牛脂 ＭＯ；オレイン酸メチルエステル 実施例６．７の結果より本発明の酵素がステロール、飽
和または不飽和高級アルコール、分枝アルコール、これ
らの混合物、ステロールエステルなどの各種基質をアル
コール成分とし、また各種脂肪酸、グリセライド、脂肪
酸エステルなどを酸成分としてエステル合成（直接エス
テル合成、アルコリシス、アシドリシス）できることが
わかる。

Σご− ｃｈｏ　　１．４６１６ｇ−オリーブ油　１．６６１ｇ
、ｉｏｃ　　１０ｍ１を基質液として反応瓶に入れ、Ｂ
ｉｂ　　８．４ｍｌを添加して反応させた。２０時間後
のコレステロールオレイン酸エステルの合成率は９１．
８％であり、オリーブ油は完全に分解していた。大きな
基質比でもオリーブ油を用いてエステル交換が出来るこ
とがわかる。

実施例９ 実施例１と同様の基質液を用いて、Ｂｌａ　　３００　
ｍ　ｇを反応瓶にいれ、反応温度を３７°Ｃまたは６０
０Ｃで４時間反応させた。その結果は３７″Ｃで４４．
５％、６０＠Ｃで７８．３％であった・ 高い反応温度でも効率よく反応でき、反応速度を大きく
できることがわかる。

″実施例１０ ｃｈｏ　　１．４６１６ｇ、ＯＡ　　１．６０１６ｇ、
ｉｏｃ　　１０ｍ１を基質液として反応瓶に入れＢｌａ
　　２１５０ｍｇを添加して２００時間反応せた。２０
時間後の合成率は９８．０％であった。反応液を静置後
、上清をロカし、懸濁している酵素を分離し反応瓶のな
かに戻した。

反応瓶に１回目と同じ基質液を入れ、同様に反応させた
。２回目の合成率は９３．６％であった。

この結果より、非水系の反応では酵素は懸濁粒子になっ
ており、ロカにより簡単に反応液より分離でき、しかも
活性も保存されており再使用の可能なことが判る。

実施例１１ ｃｈｏ　　１．４６１６ｇ、ＯＡ　　１．６０１６リバ
ーゼ（Ｍｌ）を５００ｍｇ加えて１１６時間反応させた
０合成率は９３．９％であった。

（発明の効果） これらの例から本発明の方法により耐熱性の酵素を用い
た場合、活性の持続時間が長くなり、単位酵素当たり、
単位時間当たり、単位装置当りの合成量を飛躍的に大き
くできることは明らかである。

非水系で用いた場合、本発明の酵素は水／油２相系より
も大きい反応速度を示し、加えて反応系より生成する水
を連続的に除去してやることにより、反応の平衡を更に
合成側に進めることができ、短い時間でより高い最終合
成率を得られることができる。

耐熱性酵素であるので、反応温度を高くすることができ
、それによって高い反応速度を得ることができ、また溶
媒の使用量を低減で倉る。

更に本発明によれば直接のエステル合成だけでなくエス
テル交換反応も行うことができ、グリセライド、脂肪酸
低級アルコールエステルなどの分解力も強いので各種の
基質を原料として利用できる。

このことは化学的分解によって熱的劣化を受けていない
天然油脂由来の脂肪酸のエステルを簡単に得られること
を意味しており、経済的な意味は大きい。

本発明の酵素は分校化合物をはじめとして広い範囲の基
質への親和性を持っており、またセカンダリ−アルコー
ルに対する活性も持つので、各種のエステル合成に゛応
、゛用できる。

、−１ また固定化も１１であり、固定化により構造が安定化す
るためにより長寿命であり、スケールアップにも特殊な
装置を必要としない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法で使用される反応器の模式図で
ある。 １、凝縮器　　　　２．蓋 ３、直胴部　　　　４１円錐部 δ、内ＩＩ　　　　　　６．ガス吹き込みノズル７、ガ
ス分散板　　８８反応部 ９、ガス出口 第２図は、本発明の方法で使用される反応器の模式図で
ある。 １、ガス吹き込みノズル　　　２．凝縮器上部特許出願
人　工業技術院長　飯塚　幸三（ｍ１名） 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 第２図 手続補打止動式）　　　　８ １　事件の表示 昭和６３年特許願第４５０６８号 ２　発明の名称 （１１４）工業技術院長　飯　塚　幸　三４　指定代理
人 茨木県つくば市東１丁目１番３号 工業技術院微生物工業技術試験所長 鈴木智雄 ５　復代理人　− 大阪市東区羊野町２の１０　沢の鶴ビル昭和６３年５月
３１日 ７　補正の対象 補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし） 別紙添付の通り　　。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 耐熱性でセカンダリーの水酸基からなるエステル結合を
   加水分解できるシユウドモナス属由来のリパーゼから選
   択される酵素を用いて、アルコール成分と酸成分を含む
   基質液を、上記酵素と継続的に混合・接触反応させ脂肪
   酸エステルを合成することを特徴とする脂肪酸エステル
   の合成法。