JPH0121960B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は食品、水等の微生物検査方法に関し、
更に詳細には蛍光分析法を利用して迅速に微生物
検査を行う方法に関する。 近年、生鮮食品、加工食品を問わず、食品の微
生物による汚染を防止する必要性が社会的に強く
求められるようになつており、食肉製品、清涼飲
料、魚肉ねり製品などの食品中には大腸菌群を含
んではならないことが法的に定められている。従
つて加工食品を製造し、販売する場合には厳重な
微生物学的な品質管理が必要であり、これらの微
生物を検査することは極めて重要なこととなつて
いる。しかし、加工食品の製造工程の微生物管理
および製品検査のための微生物の検出には少なく
とも24時間以上を要する。もし、この検出のため
の時間が縮少出来れば食品衛生上のトラブルの未
然防止、食品製造工程の衛生管理上の問題点の早
期発見と早期対応等が可能となり、加工食品製造
の上でのメリツトは極めて大きい。また、加工食
品の製造に限らず臨床微生物検査の分野や医薬品
製造業および多くの製造業での水質管理等の微生
物検査を要する分野等でも検査時間が短縮されれ
ば大きなメリツトを生ずることは今更言うまでも
ない。 従来行なわれている菌数検査法としては寒天平
板塗抹法、寒天平板混釈法、あるいは液体培地段
階希釈法（最確法）などが広く一般に用いられて
いる。これら従来法は何れも検体を一定の割合で
希釈し栄養培地に接種培養し、微生物の増殖が肉
眼で判定出来るまで生育させる必要がある為に、
菌数測定に要する時間は最低24時間必要である。
因みに食品衛生法で定められている大腸菌群の検
査法は食品により異なるが、乳糖ブイヨンまたは
ブリリアントグリーン乳糖ブイヨン（BGLB）、
デソキシコール酸培地または遠藤培地などで24時
間（プラス・マイナス２時間）培養し、そこで大
腸菌群陽性と判定されないものはさらに48時間
（プラス・マイナス３時間）まで培養を行つて判
定を行なうと定められている。また水質汚濁防止
法では排水の大腸菌群数をデソキシコール酸ナト
リウムを含む寒天培地を用いて18時間ないし20時
間培養し出現した定型的集落数より求めることが
定められている。又、水質汚濁に係る環境基準の
保全のための大腸内細菌群数を測定する方法とし
ては昭和46年12月28日環境庁告示第59号により最
確法を用いて測定することが定められている。 最近、微生物数を迅速に検出する方法として
は、微生物の増殖に伴う培地のインピーダンスの
変化、培養液のPHの変化、消費酸素量あるいは発
生炭酸ガス量等を測定し、これらと微生物数の相
関から微生物数を求める方法が研究されている
が、何れの場合も、微生物が培地１ml当り10⁵個
以上にならないと検出が出来ず、また、検体由来
の非生物物質により上記の量は変化することがあ
り、微生物の検出限界、検出精度の点から満足出
来る方法とはいえず実用化されるに至つていな
い。また、この他に、検体を直接顕微鏡観察し微
生物数を求める方法もあるが、この場合、微生物
の生死を識別出来ないこと、検体由来の非微生物
夾雑物と微生物の区別がつきにくいことなどから
直接顕微鏡観察による微生物検出方法も満足出来
る方法とはいえない。 本発明者らはかかる事情に鑑み検体中の微生物
生菌数を極めて短時間で検出する方法を開発する
ことを目的として種々研究を重ねた結果、細菌、
酵母又は糸状菌等いわゆる一般菌が非蛍光性ウン
ベリフエロン誘導体を水解して蛍光性のウンベリ
フエロン又はその誘導体を遊離し、この時の反応
液の蛍光の強さ、即ち、ウンベリフエロン誘導体
の水解活性が一般生菌数と良く比例し、この関係
に基づいて検体中に含まれる微量の微生物を極め
て迅速に検出できることを発見し本発明を完成す
るに至つた。 即ち、本発明は一定量の検体を含む被験体に非
蛍光性ウンベリフエロン誘導体を加えて反応せし
め、反応液の蛍光度を測定し、該蛍光度に基づい
て微生物数を測定することを骨子とする迅速微生
物検査方法である。 本発明でいう一般生菌とは、食品、水、医薬品
等に存在する主として生きた好気性細菌ならびに
真菌であり、例えば、シユードモナス属、フラボ
バクテリウム属、アクロモバクター属、アルカリ
ゲネス属、アセトバクター属、エシエリシヤ属、
プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、エル
ウイニア属等に属するグラム陰性桿菌、アルスロ
バクター属、ブレビバクテリウム属、コリネバク
テリウム属、ストレプトコツカス属、ミクロコツ
カス属、バチルス属、スタフイロコツカス属、ラ
クトバチルス属等に属するグラム陽性細菌、サツ
カロミセス属、キヤンデイダ属、トルラ属、ピヒ
ア属、ハンゼヌラ属等に属する酵母菌、あるいは
アスペルギルス属、ペニシリウム属、ノカルデイ
ア属等の糸状菌等、標準寒天培地上に生育する微
生物群をいう。 本発明でいう大腸菌群とは、グラム陰性の無芽
胞桿菌で乳糖を分解してガスを発生する好気性又
は通性嫌気性の細菌群で、上記微生物のうち、エ
シエリシヤ属、エルウイニア属、セラチヤ属、プ
ロテウス属、又はサルモネラ属等に属する細菌群
をいう。 本発明で使用される非蛍光性ウンベリフエロン
誘導体はウンベリフエロン（７−ヒドロキシクマ
リン）又は４−メチルウンベリフエロンの誘導
体、たとえば、４−メチルウンベリフエリルフオ
スフエイト（MUP）、４−メチルウンベリフエリ
ル−α−Ｄ−グルコピラノサイド（MUGul）、４
−メチルウンベリフエリルアセトアミド−β−Ｄ
−グルコピラノサイド（MUAG）、４−メチルウ
ンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトサイド
（MUβGal）、４−メチルウンベリフエリル−α
−Ｄ−ガラクトサイド（MUαGal）、４−メチル
ウンベリフエリルアラビノサイド（MUAla）、
４−メチルウンベリフエリルピロフオスフエイト
（MUPP）、４−メチルウンベリフエリルアセテ
イト（MUAce）等が挙げられる。 微生物検査に供されるものは生鮮食品、加工食
品、冷凍食品、廃水、飲料水、河水、清涼飲料、
乳製品、血液、尿、生体組織、医薬品、化粧品等
あらゆるものが対象となり、固体、液体等の種類
を問わず検査することができる。 検査に際しての検査の処理法は従来行われてい
る微生物検査法に定められている手順に従つて行
えば良い。 微生物検査に供する検体が食品等の固形物であ
るときには、これに無菌水等を加えてホモゲナイ
ズした後、要すれば適度に希釈して供され、検体
が水、廃水等溶液の場合にはそのまま被験液と
し、この被験液に基質を10^-3〜10^-4M加えて20〜
50℃、PH４〜８で30分〜６時間程度反応を行う。
反応液中に微生物が10²〜10⁴個／mlが生存してい
ると、前述の基質は加水分解されて蛍光性のウン
ベリフエロン誘導体、例えば、４−メチルウンベ
リフエロン（４−MU）が遊離されるので、この
蛍光の強さを常法に従つて測定する。蛍光度は反
応液中の微生物数と良く比例するので、あらかじ
め蛍光度と菌数の関係を求めておけば、この関係
を利用して検体中の菌数を迅速に検出することが
できる。４−MUは360nｍの波長の紫外線を照射
すると励起されて450nｍの蛍光を発し、この蛍
光は10^-8Mあれば、蛍光分析によつて測定するこ
とができる。尚、検体を培養液で培養する場合に
は培地にあらかじめ蛍光性ウンベリフエロン誘導
体を加えて培養することが望ましく測定時間を短
縮することができる。４−MUを10^-8遊離せしめ
る微生物数は反応液中10³〜10⁴個／mlであるの
で、本発明の方法に従えば、微生物検査を１〜２
時間で行うことが可能である。 実験例 一般菌のうちから特定の菌株を選び、非蛍光性
ウンベリフエロン誘導体に対する水解活性を調べ
た。 0.5％ペプトン水（PH7.0）に10^-3Mの４−メチ
ルウンベリフエロン誘導体を加え、3.0ml宛試験
管（20ml容）に分注し、ミリポアフイルターを濾
過した。これに下記の微生物菌体を10〜100個宛
接種し、細菌については30℃、糸状菌および酵母
は25℃で夫々24時間振盪培養を行つた。培養液中
の菌数は菌株によつて差が有るが１ml当り10^-6〜
10^-9個であつた。

【表】 このようにして得られた培養液にアルカリを加
えてPHを11.0に調節し、次いで遠心分離して不溶
性物質を除去し、360nｍの紫外線を照射して励
起させ、450nｍに於る蛍光を蛍光光度計で測定
し、４−MUの生成量を求めた。その結果を第１
表に示す。

【表】 第１表に示すようにMUPはすべて菌株によつ
て水解され、活性も強く、これについでMUPP、
MUAG、MUGul、MUAce、MUGal、MUAla、
等をかなりのものが水解した。従つて一般菌を測
定する目的にはこれらのものが使用されるが、特
にMUPが望ましい基質である。更に感度と確実
性を高めるためにはこれらのものを２種以上混合
して使用することが望ましく、測定時間も短縮す
ることができる。これに対してMUGal、
MUAla、等は大腸菌群によつて特異的に水解さ
れるので、大腸菌群を選択的に測定するのに使用
できる。 基質の水解を触媒する酵素は菌体的に存在する
ものも有るのでこのような場合には菌体内酵素を
常法に従つて抽出することが望ましく、自己消化
法、酵素分解法等の処理を施すことにより感度を
上げることができる。更に、少数の菌数を正確に
測定するには、検体中の微生物菌体を濃縮する方
法、反応時間を長くする方法等が有る。しかしな
がら、これらの方法ではある程度までは有効であ
るが、より正確に測定するには、最確法に又は培
養法に従つて検査すると良い。 従来、大腸菌群を最確法で測定する方法では被
験液を1/10に連続４段階希釈した検水を各々５本
ずつブリリアントグリーンラクトースブイヨン
（BGLB）発酵管培地に移殖し35−37℃で48時間
（±３時間）培養後各希釈検体について何本ガス
が発生したかを調べ、最確数表を用いて検体100
ml中の大腸菌群を測定する方法で、寒天平抹法な
どに比べて小数の菌数を正確に測定する方法とさ
れている。 これに対し、本発明の方法では、希釈した検水
について夫々５本宛のMU誘導体を含んだ培地で
２〜12時間培養し、培養液上清について蛍光の有
無を調べ、蛍光を有する培養液数に基づき、最確
数表を用いて検定する。 又、検体によつては４−MU誘導体を培養液に
添加して１〜２時間反応してこの反応液の蛍光を
測定することもできる。 この時に使用する栄養培地は一般生菌数を検査
する場合には一般生菌測定用に使用される通常の
培地、例えば、ペプトン水、ハート・インフエー
ジヨン・ブロス、ニユートリエントブロス等が使
用され、糸状菌を選択的に検出するには糸状菌の
生育に適した培地、例えば、ツアペツクドツクス
培地、麦芽培地、ポテトデキストロース培地、コ
ーンミール培地等が用いられる。 尚、酵母・糸状菌を選択的に培養するには、細
菌類の生育を抑える薬剤、例えばクロランフエニ
コール・ペニシリン等を培地に添加すれば良い。 検体中の特定の微生物、例えば大腸菌群のみを
検出したい時には、栄養培地にデソキシコール酸
ナトリウム、あるいは肝汁酸を添加し大腸菌群以
外の微生物の生育を抑制すれば良い。この他、培
地に各種抗生物質又はアザイド類のような薬剤を
添加し、微生物のこれらに対する感受性又は抵抗
性の差を利用したり、更にこれらの手法を適宜組
合せることにより測定対象菌を選択的に測定する
ことも可能である。 基質として４−メチルウンベリフエリルガラク
トサイドを使用して大腸菌群を測定する場合に
は、培地中にガラクトシダーゼの誘導物質である
ラクトースイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノサイド（IPTG）、プロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノサイド（PTG）又はMUGal等
を添加することが望ましい。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
温度は通常の一般菌の生育に適した温度範囲（10
〜40℃）で行えば良い。特定の微生物を目的とす
る場合には、その特定の微生物に適した培養条件
を選んで培養すれば良く、例えば大腸菌のみを選
択的に検出しようとする時には生育温度差を利用
して44.5±0.2℃で培養することが望ましい。 最適法以外でも、実施例４に示すように、検体
を栄養培地で一定時間培養した後の培養液につい
て菌数と４−MUの生成量との相関関係を求めて
おけば、検体中の菌数を直接測定することも可能
である。 上述のように、本発明は超微量の酵素活性を測
定する蛍光分析法を利用した微生物検出法であ
り、食品、化粧品、医薬品あるいは環境保全分野
などで広く利用できるものである。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 河水、井戸水、食品工場廃水、都市下水を10ml
宛各４点をサンプリングし、遠心分離により集菌
し、これにMUPを10^-3M含むPH7.0のリン酸緩衝
液5.0mlを加え、37℃で2.0時間保持した。次い
で、反応液を遠心分離して不溶物を除去し、上清
液のPHを11.0に調節し、実験例に示したのと同じ
方法で反応液中に生成される４−MUの量を求め
た。一方、各検水中に含まれる一般菌数を常法に
従い、標準寒天培地を用いて求めた。両者の関係
は第２表に示すとおりである。

【表】

【表】 第２表に示すように、生菌数と４−MUの値と
の間には相関関係が有ることが認められる。この
関係を用いることにより各種検水中の生菌数を簡
単に検査することができる。 実施例 ２ 市販のポテトサラダ10ｇを秤量し、無菌水90ml
を加えてホモゲナイズ（20000rpm.1分間）し、
これを検体とした。 これを0.1ml、0.01ml、0.001ml取り、これを
夫々、３本の４−MUPを10^-3M含んだ0.5％ペプ
トン水（PH7.0、9.0ml）に加え、30℃で12時間振
盪培養した。培養液にアルカリを加えてPHを10.5
に調節した後、遠心分離して不溶性物質を除去
し、上清液の蛍光の有無を判定し、最確数表を用
いて菌数を求めた。同じ検体を同様に標準培地
（酵母エキス0.25％、ペプトン0.5％、グルコース
0.1％、PH7.1）を用いて夫々48時間培養し、生育
の有無を濁度でもつて判定し、最確数表を用いて
菌数を求めた。同様にして市販のマカロニサラ
ダ、スパゲツテイサラダについてテストし、その
結果を第３表に示した。

【表】 上記ポテトサラダについて、MUPの代りに
MUP10^-3M、MUGul10^-3M、および
MUGal10^-3Mを含む培地を用いる他は同じ方法
で測定した所、10時間の培養で上記結果が得られ
た。 実施例 ３ 大腸菌（Esherichia coli ATCC25922）を0.05
％のデソキシコール酸ナトリウムおよび10^-2Mの
IPTGを含むハート・インフエージヨン・ブロス
を用いて37℃で８時間培養した。これを水で順次
希釈し、１ml当り10^-2〜10^-8個の懸濁液とし、遠
心分離して集菌し、これに４−MUGalを３×
10^-4M含むリン酸緩衝液を5.0ml宛添加し、40℃
で１時間反応した。次いで反応液のPHを10.5とし
た後、除菌して上清液の蛍光度を測定し、反応液
中の４−MUの生成量を求めた。反応液中の大腸
菌数と４−MUの生成量の関係を第１図に示す。
第１図の縦軸は４−MUの生成量（×10^-7M）、
横軸は菌数を示す。第１図に示すように菌数は４
−MUの生成量に良く比例している。 尿路感染症と診断された５名の患者の尿を夫々
5.0ml宛常法通り採取し、5.0mlのハートインフエ
ージヨン培地（0.05％デソキシコール酸、
10M^-2IPTGを含む）に加えて37℃で30分間保持
した。これを遠心分離して菌体を集め、これに
MUβGalを10^-4M含んだリン酸緩衝液を5.0mlと
トルエン20μを加え、40℃で１時間反応した。
反応液中に生成した４−MUの量を測定し、第１
図の検量線に基づいて夫々の大腸菌群の数を求め
た。一方、デソキシコール酸ソーダ培地を用いる
混釈法による従来法により大腸菌群の数を測定
し、その結果を第４表に対比した。

【表】 実施例 ４ 大腸菌（エシエリシヤ・コリATCC10798K−
12）をブイヨン培地で37℃、20時間前培養し、無
菌水で５段階（10〜10⁵個／ml）に希釈し、その
各1.0mlをイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノサイド（IPTG）を10^-3M含有するブイヨ
ン培地9.0mlに接種し、37℃で1.0〜6.0時間振盪培
養した。この培養液20mlに夫々、20μのトルエ
ンと2.0mlの３×10^-4Mの４−MUGを含むリン酸
緩衝液（0.01M、PH7.0）を加え、37℃で60分間
反応を行つた。各反応液にPH11.0の1Mグリシン
緩衝液を0.5ml宛加え、360nｍの波長の紫外線を
照射して励起させ、450nｍに於ける蛍光を蛍光
光度計で測定し、β−ガラクトシダーゼの作用に
より生成した４−MUの量を測定した。その結果
を第５表に示す。第５表中の大腸菌の菌数につい
てはブイヨン平板寒天培地を用いる平板段階希釈
法で48時間培養して求めたものである。第５表の
関係を利用することにより初発菌数、又は検体中
の大腸菌数を短時間で測定することができる。測
定時間については初発菌数が培地10ml当り１個の
場合であつても５時間の培養とその後、１時間の
酵素反応の合計６時間で検出が可能である。

【表】 実施例 ５ ハート・インフエージヨン・ブロス（HI−培
地）、HI培地に10^-3のIPTG、PTG又は1.0％のラ
クトースを添加した培地各10mlにエシエリシヤ・
コリATCC10798を10²個ずつ接種して５時間培養
し、夫々の培養液について菌数を調べたところ、
10ml当りいずれも1.6×10⁶個であつた。各培養液
のβ−ガラクトシダーゼ活性を実施例１と同様の
方法で測定し、第６表の結果を得た。 第６表 誘導物質の添加効果 誘導物質 ４−MU生成量（Ｍ） 対照（無添加） 1.5×10^-6 IPTG 1.5×10^-5 PTG 1.5×10^-5 ラクトース 8.7×10^-6 次に、上記HI培地にIPTGを加えた培地を用い
て得られた培養液各2.0mlに20μの酢酸エチルを
加え35℃で60分処理又は超音波処理（10KH、10
分間）し、これに2.0mlのMUGal溶液（３×
10^-3M、0.01Mリン酸緩衝液）を加え、37℃で60
分間反応し、生成する４−MUの量を測定した。
その結果を第７表に示す。 第７表 菌体の破壊効果 方 法 ４−MU生成量（Ｍ） 超音波照射 1.5×10^-5 酢エチ添加法 1.5×10^-5 対照（無処理） 1.5×10^-7 第６表および第７表の結果から、β−ガラクト
シダーゼ誘導物質無添加であつても或は酵素の菌
体外への抽出操作を行なわなくとも初発菌数が多
ければ測定することが出来るが、IPTGやPTGを
加えることにより感度が約10倍に増大し、また、
酢酸エチル処理や超音波処理を加えることにより
感度が100倍に増大することから初菌数が少量の
場合にはこれらの操作が有効であることがわか
る。 実施例 ６ 河川水を夫々10ml、１ml、0.1ml、0.01mlずつ
各５本取りIPTGを10^-3Mとデソキシコール酸ナ
トリウムを0.1％含有するハートインフエージヨ
ン培地10mlに移植し37℃で６時間振盪培養し、培
養液の上清について蛍光の有無を調べた。その結
果を第８表に示した。また同じ河川水の大腸菌群
数を環境庁告示第59号に定められている段階希釈
法（最適法）に基づいて測定し、その結果を併記
した。

【表】 使用した。
第８表の結果を最確数表で検水100ml中の大腸
菌群数を求めると79コ／100mlであつた。 このように、本発明によれば大腸菌群の検出は
７時間で測定出来、かつ従来から用いられている
最確法の48時間で測定した結果と完全に一致する
ことが確認された。 実施例 ７ 市販のポテトコロツケ100ｇを一夜放置した後
100mlのリン酸緩衝液（PH7.0、0.1M）に加え、
ホモジナイズし、この１ml、0.1ml、0.01ml、
0.001ml取り、デソキシコール酸ナトリウムを0.1
％含有するハートインフエージヨンブロス10mlに
夫々接種し44.5℃で10時間振盪培養を行つた。 この培養液2.0mlに20μのトルエンと2.0mlの
３×10^-4MのMUPを含むリン酸緩衝液（0.01M、
PH7.0）を加え37℃で60分間保持した。各反応液
にPH11.0のグリシン緩衝液0.5mlを加え、除菌後
上清液について蛍光を有する数を求めた。同じ検
体について従来法（最確法）により測定した。そ
の結果を第９表に示す。

【表】

【表】 この第５表の結果を最確数表で検体100ml中の
大腸菌群を求めると両法とも49コ／ｇと完全に一
致することが確認された。 実施例 ８ 果樹園土壌10ｇを秤量し、これに90mlの水を加
えて良くホモゲナイズし、クロロマイセチン
100r／ml、MUP10^-3MおよびMUβGal10^-4M含
んだYM培地（酵母エキス0.05％、マルツエキス
0.05％、PH6.0）に1.0ml、0.1ml、0.01mlを夫々３
本の培地に添加し、27℃、12時間振盪培養した。
得られた培養液のPHを10.5にした後、除菌し上清
について蛍光の有無を調べて蛍光を有する本数を
求め、最確数表を用いて菌数を求めたところ、土
壌10ｇ中の菌数は1500個であつた。同じ検体につ
いて常法通りクロロマイセチンを100r／ml含む
YM寒天培地（酵母エキス0.3％、マルツエキス
0.3％、ペプトン0.5％、グルコース1.0％、寒天
1.5％、PH6.5）を用いて27℃で培養し出現する酵
母のコロニーを測定して求めたところ、土壌10ｇ
中1300個であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は大腸菌の生菌数と４−MU生成量の関
係を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一定量の検体を含む被験液又は検体を栄養培
   地で２〜12時間培養した培養物に非蛍光性ウンベ
   リフエロン誘導体を加えた混合液を一定時間保持
   するか、又は検体を非蛍光性ウンベリフエロン誘
   導体を含む栄養培地で２〜12時間培養した後、混
   合液又は栄養培地中に遊離される蛍光性ウンベリ
   フエロン誘導体の量を測定し、該誘導体の遊離量
   に基づいて検体中の微生物数を測定することから
   なる迅速微生物検査方法。 ２ 非蛍光性ウンベリフエロン誘導体が、４−メ
   チルウンベリフエリルフオスフエイト、４−メチ
   ルウンベリフエリル−α−Ｄ−ガラクトサイド、
   ４−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクト
   サイド、４−メチルウンベリフエリルアラビノサ
   イド、４−メチルウンベリフエリルピロフオスフ
   エイト、４−メチルウンベリフエリルアセテイ
   ト、４−メチルウンベリフエリルアセトアミド−
   β−Ｄ−グルコピラノサイド、４−メチルウンベ
   リフエリルグルコサイドからなる群より選ばれた
   １種又は２種以上の非蛍光性ウンベリフエロン誘
   導体である特許請求の範囲第１項記載の微生物検
   出方法。 ３ 微生物が一般菌である特許請求範囲第１項又
   は第２項記載の微生物検査方法。 ４ 微生物が大腸菌群である特許請求範囲第１項
   又は第２項記載の微生物検査方法。