JPH04504802A - 微生物のための沈澱テスト - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 微生物のための沈澱テスト 発明の技術分野 本発明は、特定の酵素の存在により特徴ずけられる特定の微生物または微生物群 用の改良アッセイ法に関するものである。このアッセイは、ポリマーマトリック ス内にあるまたは固体担体表面上にある色素形成性基質を使用する。該色素は該 酵素により開裂された際に沈澱する。本発明は、更に色素形成性基質、ポリマー 系および固体担体を含む酵素検知デバイスをも包含する。

発明の背景 ヒト胃腸管疾患は様々な微生物に起因して起こる。感染の共通の媒介物は汚染さ れた食物および水である。このような疾病の発生率を減するために、ヒトが消費 するための食物および水の衛生上の品位が継続的にテストされる。多数の異なる 腸内病原体のテストに代わる、指標生物の存在に対する実験室テスト法がある。

大腸菌型の細菌が、典型的には衛生上の品位の主な指標とし使用される。という のは、これらが温血動物の胃腸管に通常関連してることを示唆し、かつヒトが消 費するには不適当であることを示している。

大腸菌型の細菌は、ラクトースを醗酵して酸性かつガス状の最終生成物（Ｃｏ１ およびＨ２）にするその能力のために、他の微生物および腸内細菌科のその類縁 歯と区別される。い（っかの非大腸菌型細菌はラクトースを同一の最終生成物に 醗酵し得るが、大腸菌アッセイにおけるこれら微生物の生育は、テストに使用し た微生物学的培地の選択性のために、通常最小化もしくは防止される。

典型的には、サンプル中の大腸菌型の細菌の存在は液状の微生物学的育成培地に 物質を添加し、得られる混合物を細菌の生育を助長する温度でインキュベートす ることにより決定される。サンプルと育成培地との混合物のインキュベートは重 要である。というのは、このアッセイが該サンプルの低濃度の大腸菌型細菌によ る汚染を検出し得る必要があるからである。該混合物のインキュベートの結果、 大腸菌型細菌は培養物１ｍｌ当たり約１０’〜１０”細胞なる密度にまで増殖さ れ、ここで該細菌の存在は多数の方法の何れかにより検出し得る。大腸菌型細菌 の検出に使用されている様々な液体微生物学的生育培地は２つの共通する性質を 有している。即ち、これらは二単糖ラクトースを含み、かつ非大腸菌型微生物の 生育を選択的に阻害する化学試薬を含む。選択は重要である。というのは、サン プルが必ず様々な微生物を含んでおり、また該アッセイの成功は非大腸菌型の細 菌により過度の成長が抑制されていることに依存するからである。

大腸菌アッセイは固体または液体培地の何れかを使用して実施できる。固体培地 を使用するアッセイは生菌数の計数を可能とする。サンプルを固体培地に添加し 、大腸菌の明確なコロニーを計数する。また、サンプルを液状培地に添加するこ ともできる。大腸菌群は特徴的な代謝最終生成物の形成を通して検出される。こ の液体培地形式は定性的または定量的の何れであってもよい。該固体培地形式は 、少量（例えば、１ｍｌ当たり１０微生物未満）の大腸菌群を含むサンプルまた はコロニーの可視化を不明確にする粒状物質（例えば、食物または乳製品）を含 むサンプルに対して好ましい。

ブロスまたは寒天中での大腸菌群のアッセイは２つの別々の段階、即ち推定的（ ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｖｅ）および確認的（ｃｏｎｆ　ｉｒｍｅｄ　）段階で行わ れる。まず、推定的アッセイは考えられる大腸菌群の存在の指標を与える。該確 認段階では、推定的に正の培養物または典型的なコロニーを第二のより選択的な 培地で継代培養する。原理的には、確認的培地は誤った正の結果を排除する。こ のアッセイの該２段階は完了までに４８〜９６時間を要する。従って、当分野で は時宜にかなった方法で、正確な結果を得ることが要求されている。

一般に、検出は大腸菌型細菌の代謝経路の最終生成物にもとずいている。例えば 、大腸菌型細菌の酸の生成は、一般に培地中にｐＨ指示薬を配合することにより 検出している。酸の生成は液状培地、例えばクラークス（Ｃ１ａｒｋｅ’　ｓ） 培地内のブロモクレゾールパープル指示薬の紫から黄色への色の変化により検出 できる。酸産生はコロニーの形成により検出し得、該コロニーの中央部は固体培 地、例えばバイオレットレッド胆汁寒天培地（ＶＲＢＡ）およびマツコンキー（ ＭａｃＣｏｎｋｅｙ　）寒天培地中の指示薬ニュートラルレッドと該酸との反応 により暗色となっている。

更に、ガス状最終生成物は通常液状培地中での気泡の存在により検出される。こ の気泡は培養チューブ内の小さな倒立させた試験管または倒立させたバイアルも しくは培養装置の特定の部分に捕集することができる。例えば、バイオコントロ ールコリトラック（ＢｉｏＣｏｎｔｒｏｌ　Ｃｏ１１Ｔｒａｋ”）製品は培養装 置の頂部に取りつけられたドーム内に気泡を捕集する。固体育成培地を含むペト リフィルム（Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ”；　３Ｍ）は細菌コロニーノ近接部分ノ気泡 ヲ捕集する。あるいはまた、ガス状最終生成物は、水素の電気化学的検出、放射 性標識ラクトースの醗酵により遊離される１４ＣＯｔの放射能検出、あるいは醗 酵を通して生成される有機化合物のインピーダンス測定（ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒ ｉｃ）またはガスクロマトグラフィー検出などの非可視的手段により検出するこ とも可能である。

大腸菌群のもう一つの検出法は、代謝最終生成物ではな（むしろ大腸菌群関連酵 素活性の検出にもとず（ものである。一般に、酵素アッセイ法は時間のかかる培 養テスト手法を利用した確認的結果に匹敵する大腸菌型細菌の定量的評価を与え 得る。酵素、β−ガラクトシダーゼはラクトースの醗酵に利用される細菌酵素で ある。β−ガラクトシダーゼはラクトースを加水分解し、その構成糖をグルコー スとガラクトースに分解する。大腸菌型細菌は典型的にこの酵素を表現する。例 えば、ワージン（Ｗａｒｒｅｎ）等のＡｐｐｌ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９７８．３５．　ｐｐ、　１３ ６−４１は大腸菌群のテスト法に係わり、該方法は水中における排泄物大腸菌群 を定量するために色素産生β−ガラクトシダーゼ基質、０−ニトロフェニル−β −Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）を使用している。ワージン（Ｗａｒｒｅｎ）等 の文献において、黄色の反応生成物０−ニトロフェノール（ＯＮＰ）の出現はテ ストサンプル中の大腸菌群の初期濃度の逆数に関連している。

製品、コリラード（Ｃｏｌｉｌｅｒｔ　”）（アクセスメディカル（Ａｃｃｅｓ ｓＭｅｄｉｃａｌ））では飲料水中の大腸菌群の検出に０ＮＰＧ酵素指示薬を使 用している。水のサンプルは０ＮＰＧを含有する基本生育培地を可溶化するため に使用される。培地中で生育する細菌超厚のβ−ガラクトシダーゼは０ＮＰＧを 加水分解して、ガラクトースを生成し、これは生育用の唯一の炭素源およびエネ ルギー源として機能する。

ＯＮ生成は酵素活性を示す。２４時間のインキュベート後の、１０ｍ１の液体培 地全体に渡る黄色の存在は該水サンプル中に大腸菌型細菌が存在することを示す 。

螢光発生β−ガラクトシダーゼ基質、フルオレセイン−β−Ｄ−ガラクトシドは もう一つの活性測定用の指示薬である。カンデル（Ｃｕｎｄｅｌｌ）等はＰｒｏ ｃ、　Ｗａｔｅｒ　Ｒｅｕｓｅ　Ｓｙｍｐ、、１９７９．３．　ｐｐ、　１８９ ５−９９において、該フルオレセイン−β−ローガラクトシドを含む培地中で大 腸菌型細菌をインキュベートするアッセイを提示している。

大腸菌型細菌はフローサイトメトリーにより定量的に測定される。

該基質のフルオレセイン部分はβ−ガラクトシダーゼによる開裂の後に該細胞内 に濃縮され、紫外線の照射下で該細胞に螢光を発せしめる。米国特許第４．２４ ２．４４７号は螢光発生基質を使用した大腸菌群の評価用の螢光アッセイを開示 している。特に、該米国特許第４．２４２．４４７号は、水サンプルと螢光発生 基質とを油と共に乳化して、大腸菌型細菌含有油滴を形成する方法を開示してい る。

β−ガラクトシダーゼ活性は該螢光発生基質を開裂し、螢光検出器により計数し 得る螢光性油滴を形成する。カンデル（Ｃｕｎｄｅｌｌ）等はＤｅｖ、　Ｉｎｄ 、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９７９．２０．　ｐｐ、　５７１−７７におい て、顕微鏡スライド上に油−包封細胞を生成する同様な技術を開示している。螢 光性液滴は螢光顕微鏡下で計数される。このカンデルの方法は下水サンプルに対 して利用されている。このカンデル法の感度は１０’細胞／ｍｌである。

細菌Ｅ、コリは、大腸菌型細菌とは別にアッセイし得る一種の大腸菌である。存 在するＥ、コリは排泄物汚染のより信頼性の高い指標と考えられる。また、ある 種のＥ、コリ菌株はヒトおよび動物の病原体である。標準的なＥ、コリ検出法で はＥＣブロス中で正の推定的培養物を継代培養し、４５．５°Ｃにてインキュベ ートする。ガス発生が正のＢＣ培養物を、次に識別寒天培地上で画線培養する。

単離体を生化学的特性化により同定する。

リルーβ−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）が食品および水サンプル中のＥ。

皿の検出に使用される。このＬ三ユ検出法は、培養物を植えつけ、ＭｔｌＧの存 在下に標準的方法でインキュベートすることからなる。２４時間のインキュベー ト中に発生する螢光はＥ、コリの存在を示す。というのは、Ｅ、コリからのβ− グルクロニダーゼがＭｔｌＧを螢光性生成物に開裂するからである。か（して、 このＭＵＧ含有培地の使用はＥ、コリの検出時間を短縮することを可能とする。

不幸にも、ＭＵＧは高価な試薬であり、また大容量のサンプル、例えば水のサン プルは大量のＭＵＧの使用を必要とし、このテストを著しく高価なものとする。

一般に推奨されるＭＵＧの濃度は最終培養物１ｍｌ当たり５０−１００μｇであ る。食品および水質テストのための典型的な容量はそれぞれ９０および１００　 ｍｌである。かくして、ＭＵＧの価格は食品テストおよびＰＡ型の水質テストの ためには魅力のないものとしている。

それぞれ大腸菌群およびＢ、コリの存在を測定するための手段として、β−ガラ クトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼ活性をアッセイすることができる。酵 素検出アッセイは層酵最終生成物の検出に勝る利点を有する。まず、酵素アッセ イ法はより感度が高い。１つの酵素が多（の基質分子を開裂する。１つの酵素に より開裂される基質の各分子は螢光性または着色されたリポータ生成物を生成す る。従って、この信号は酵素により増幅される。ある種の基質を使用することに より、１０４程度の代謝活性細胞が２４時間以内に信号を成形できる。

これとは対照的に、２４時間以内に可視性の気泡を形成するには約１０７〜１０ ′個の代謝活性細胞を必要とする。というのは、ラクトースのβ−ガラクトシダ ーゼ開裂は、代謝の生理的調節による化学量論的な量の酸およびガス状最終生成 物を生じないからである。該ラクトース中の炭素の大部分は細胞バイオマス中に 組み込まれ、醗酵中の酸化ＮＡＤの再生には利用されない。酸およびガス産生の 細菌超厚の醗酵酵素は該醗酵過程の最終段階にあり、厳密に調節されている。例 えば、ピルベート・フォルメートリアーゼは好気的条件下では不活性であり、培 地が嫌気性となった時にのみ活性化される。ガス産生におけるキー酵素であるフ ォルメートデヒドロゲナーゼは酸素の存在下では、あるいは培地のｐＨが６以上 である場合には合成されない。ヒドロゲナーゼ活性および合成は別の酸化剤、例 えば酸素、硝酸塩および亜硝酸塩により受動的に調節される。従って、嫌気生活 、酸性ｐＨおよび外部酸化剤のない生育条件は、達成されないか、あるいはゆっ くりと達成されるに過ぎない。更に、培地中の多くのラクトースが、酸−および ガス−産生酵素が活性となる時点で開裂される。従って、β−ガラクトシダーゼ 用の酵素アッセイは醗酵経路の調節の問題を回避し、各基質開裂の発生毎にリポ ータ基を生成する。

大腸菌群に属する属の嫌気性菌株の存在は、ガス検出アッセイ手順を更に複雑に する。これらの菌株はβ−ガラクトシダーゼ活性を有するが、ラクトースからガ スを生成しない。従って、β−ガラクトシダーゼ活性測定アッセイのみがこの大 腸菌群の嫌気性菌株を検出し得る。

２４時間以内のインキュベートにより大腸菌−関連酵素を検出することが可能で ある。β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼアッセイの結果は、大 腸菌群およびＥ、コリの確認的存在と相関関係をもつ。２４時間酵素アッセイ− 正の大腸菌群培養物のアリコートを別の培地、例えばエオシンメチレンブルー寒 天およびインキュベートした寒天上で画線培養した場合、典型的な大腸はβ−ガ ラクトシダーゼ−正の培養物からの系統的に同定されたコロニーである。Ｅ、コ リはβ−グルクロニダーゼ−正の培養物からの系統的に同定された微生物である 。これらの観測は、該標準的な大腸菌アッセイの第一インキュベート段階（推定 的）が４８時間から２４時間に短縮されること、および第二のインキュベート段 階（確認的）が不要であることを示している。結局、大腸菌群およびＥ、コリ用 の酵素アッセイは確認上の結果を得るに要する時間を７２時間程度減少すること を可能とし、同時により一層改良された感度を与えることを可能とする。

食品および乳製品のサンプルには、大腸菌群の検出の問題が付きまとう。大量の 食品が供給されており、そのいくつかの物理／化学的性質は酸性のまたはガス状 の最終生成物の検出あるいはある種の酵素アッセイを困難にする。例えば、脱脂 粉乳などの食品サンプルによる濁度のために、気泡をブロス内で検出することは 困難である。乾燥チーズ、チリ粉末または緑色もしくは黄色の野菜などの食物製 品に関連する色は、基質として０ＮＰＧを使用するβ−ガラクトシダーゼアッセ イにおけるＯＮＰなどの着色されたりボークもしくはｐＨ指示薬の色を不明瞭に する。更に、食品は本来的に酸性であり得、あるいはサンプルの調製中に気泡を 内部に取り込む可能性がある。最後に、食品の化学的特性はアッセイを妨害する 可能性がある。食品は培養ブロスに追加の栄養分を与え、これら栄養分は非大腸 菌型細菌により代謝されて、ガス状のあるいは酸性の最終生成物を形成して、誤 った正の結果に導く可能性がある。例えば、ケーキミックスまたは他の甘味を付 与した製品はかなりの量の二車糖類および単糖類を含み、これらは非大腸菌群に より酸および／またはガスに転化される。

−グルクロニダーゼアッセイ用の基質を適当に選択することは重要である。例え ば、β−ガラクトシダーゼは基質０ＮＰＧを開裂して黄色の生成物ＯＮＰを生成 する。しかしながら、食物製品に固有のあるいはこれに添加されたある種の色は 該ＯＮＰリポータ生成物の黄色を不明瞭にする。この黄色を不明瞭にする可能性 のある食物製品には、赤身肉のヘモグロビン、葉菜および植物のクロロフィル、 果実および植物中のβ−カロチンおよび他の黄色およびオレンジ色の色素、香辛 料中の天然色素、並びに天然および人工着色料などが含まれる。濁った水および 高い有機質含有量を有する水も淡黄色の正のＯＮＰ反応を不明瞭にする。更に、 標準的な微生物学的育成培地成分、例えば蛋白またはイースト氷解物などは該培 地に黄色または金色を付与しＯＮＰの存在を不明瞭にする可能性がある。例えば 、標準的な方法の大腸菌用培地、ラウリル硫酸トリプトース（ＬＳＴ）ブロスは 黄金色の色調を有する。ＬＳＴＳロブロス中び他の補充培地中で０ＮＰＧ−型の 酵素アッセイを実施した結果、移しい数の誤った負の結果が得られた。

０ＮＰＧの使用に関連した付随的な問題は該ＯＮＰ関連生成物の有害な性質であ る。ＯＮＰは揮発圧の化合物であり、公知の呼吸系、眼および皮膚の刺激物であ る。ＯＮＰの存在は培養物の取り扱いに関連する能率およびガラス器具の洗浄を 研究者にとって有害なものとする。また、ＯＮＰの使用は、有害な廃物の投棄に 係わる問題をも生ずる。

同様に、β−グルクロニダーゼアッセイはＭＵＧを使用し、これは螢光信号を発 生する。食品に関連する色素は該螢光信号を減衰することが観測されている。例 えば、チリ粉末中の色素はりボーク生成物の螢光反応を不明瞭にする。ＭＵＧに 係わるさらなる問題は、最大の螢光を与えるｐＨ範囲がラクトース醗酵の際に達 成されるｐＨ範囲外にあることである。ＭＵＧはｐＨ１０以上で最大の螢光を与 える。また、ラクトース醗酵で生成する酸類は典型的に該大腸菌培地のｐＨを５ 〜６に低下し、これは螢光反応を不明瞭にする。最後に、既に述べたように、発 色性物質を使用するβ−グルクロニダーゼアッセイは、い（つかの型のサンプル による妨害を被る。

従って、β−グルクロニダーゼのための通常の酵素アッセイは食品サンプルに起 因するｐＨおよび妨害の問題を有し、ある種の食品に対して使用するには不適当 である。

螢光発生物質、例えばＭＵＧは食品サンプル中のＬ三ユの検出用の寒天に使用さ れてきた。この螢光開裂生成物、４−メチルウンベリフェロン、は可溶性で、か つＢ、　ｍｌ　ＩＪから寒天（固体培地）中に拡散して、どのコロニーが酵素β −グルクロニダーゼを含み、どのコロニーがこれを含まないかを決定することを 困難にしている。

もう一つの煩雑さは、異なる型のサンプル用の培養用ブロスの最終体積が１ｍ１ ＝１１の範囲で変動することにある。各テストに対して、培地中の該発色性また は螢光性基質のモル濃度は一定である必要がある。このために、高価なテスト試 薬が大量に消費される。食品加工業者にとっては、全ての大腸菌群のテストが単 一のアッセイで実施でき、全てのテストサンプルにまたがる結果を、その大きさ とは無関係に容易に読み取ることができ、かつテスト試薬を経済的なものとする ことが有利であろう。

典型的な食品加工業者または水処理施設は搬入されるおよび搬出される食品、処 理水、排水または環境サンプルをテストする。

従って、０ＮＰＧ−またはＭＵＧ−にもとずくアッセイは、ある型のサンプルの みに対して妥当であるにすぎない。かくして、種々のサンプル、例えば食品、濁 ったおよび／または着色した水および環境サンプルに対して有効なかつ関連する 種々のテスト法に伴う諸欠点を解消し得るアッセイに対する需要がある。

インジゴ形成性（ｉｎｄｉｇｏｇｅｎｉｃ）基質、５−ブロモ−４−クロロ−３ −インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ　）がβ−ガラクトシダーゼ 活性を発現するＥ、コリコロニーの検出用の固体培地として使用されている。β −ガラクトシドはＸ−Ｇａ１をガラクトースとインドリル誘導体とに開裂する。

このインドリル誘導体は二量体化して、強い青色を呈する置換インジゴを形成す る。

フランブトン（Ｆｒａｍｐｔｏｎ）等はＪ、　Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｔ、、　１９８ ８．５１．１）ｌ）。

４０２−０４において、人為的に菌を植えつけた生の鶏肉ミンチ中のＢ、コリを 他の細菌コロニーから識別するために、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ ル−β−Ｄ−グルクロニダーゼ（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を補充したベブトンータージト ール（ｔｅｒｇｉ　ｔｏｌ　）寒天を開示している。レイ（Ｌｅｙ）等は、Ａｎ ｎ、　Ｍｅｅｔ、　Ａｍ、　Ｓｏｃ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　Ａｂｓｔｒａ ｃｔ　Ｇａ５：２８８．１９８８において、グリセロール培地および３−インド リル−β−Ｄ−グルクロニド基質を用いる膜濾過技術を利用した、水および下水 中のＥ、コリを計数する方法を開示している。Ｂ、コリコロニーは半固体培地に おいて青色に見える。ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）等は、Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖ ｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９８８．５４．　ｐｐ、　１８７４− ７５ニおいて、具申および排水中のＥ、コリの検出のためにＸ−Ｇｌｕｃを使用 したボアプレート（ｐｏｕｒ　ｐｌａｔｅ）法を開示している。

製品ペトリフィルム（Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ”）（３Ｍ）はＬ三旦の検出のために 固体培地とＸ−Ｇｌｕｃとを使用している。Ｌ三旦コロニーは青色になる。

インドール生成化合物、Ｘ−Ｇａ　ｌおよびＸ−Ｇｌｕｃが高価であるために、 β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼ活性の検出のために広範には 利用されておらず、しかも比較的少量の体積で使用されている。従って、当分野 では、食品および水質のテストに対して、経済的に少量のＸ−Ｇａ１およびＸ− Ｇ　ｌｕｃを使用することを可能とするβ−ガラクトシダーゼテスト系に対する 需要がある。

というのは、強い青色がＯＮＰの黄色および他の着色リポータに係わる問題の多 くを解決するからである。

概して、当分野では、酵素アッセイに関連する感度および速度を改良し、嫌気性 大腸菌の検出を可能とし、食品、水および環境サンプルに首尾よく適用でき、取 り扱いおよび投棄の安全性を与え、かつ高価なテスト試薬の消費量の点での経済 性をもたらす大腸菌検出アッセイに対する需要がある。

発明の概要 本発明は、特定の微生物および／または微生物群のアッセイに有用な、該特定の 微生物および／または微生物群に関連する酵素のアッセイ法並びに酵素指示デバ イスを包含する。−局面においては、本発明の方法は、サンプルおよび酵素指示 デバイスを育成培地に添加し、許容される温度の下でインキュベートし、該酵素 指示デバイス上の結果を読み取ることを含む。好ましくは、該生育培地は液体で ある。もう一つの方法は、生育培地にサンプルを添加し、該サンプルおよび生育 培地を、微生物の育成に許容される温度の下で、該育成培地内で微生物の成長の 痕跡がみられるまでインキュベートし、酵素指示デバイスを該育成培地に添加し くここで、該酵素指示デバイスは固体担体上のポリマー系に色素−形成性または 螢光発生基質を含み、あるいは固体担体上で乾燥された色素−形成性または螢光 発生基質を含み、かつ該色素形成性基質は酵素により開裂されて着色沈澱を形成 もしくは螢光を発生する）、該サンプル、生育培地および酵素指示デバイスを許 容温度にて、酸化性環境で約１〜約４８時間インキュベートし、該酵素指示デバ イス上での色の変化または螢光反応により、該特定の微生物または微生物群の存 在を視覚的に検出することを含む。好ましくは、酸化剤を該酵素指示デバイスと 共に該育成培地に添加する。本発明の酵素指示デバイスは、好ましくはポリマー 系に色素−形成性または螢光発生基質を含むものである。また、該酵素指示デバ イスは、固体担体の表面に付着された色素−形成性または螢光発生基質を含むも のである。より詳しくいえば、該酵素指示デバイスは、更に固体担体成分をも含 み、ここで該ポリマー系中の色素−形成性または螢光発生基質は該固体担体系の 表面上に１状に適用されている。該固体担体は液体の表面に浮遊していて、とり たてて酸化剤を使用しな（とも酸化性環境として空気を利用し得るようにするこ とが好ましい。

本発明のもう一つの局面では、特定の微生物または微生物群に関連する酵素のア ッセイ法が提供され、該方法はサンプルを育成培地に添加し、ポリマー系内の色 素−形成性基質を添加しくここで、該色素−形成性基質は該酵素により開裂され た場合に、該ポリマーと結合して沈澱を形成する）、該ポリマー中の該色素−形 成性基質を該サンプルおよび該育成培地と接触させ、該サンプル、育成培地およ び該ポリマー中の該色素−形成性基質を、特定の微生物または微生物群の生育に 許容される温度の下でインキュベートし、該ポリマーと結合し、かつ着色された 沈澱の存在を検出することを含む。

該色素−形成性基質は酵素作用により開裂された場合に不溶性の沈澱を生成する 。好ましくは、該色素−形成性基質は以下の式で示される置換インジゴ誘導体で ある。

ＲＩ　Ｏ−糖 ここで、各Ｒはハロゲンまたは水素原子である。該ハロゲン原子は、塩素、臭素 または沃素である。Ｒ３、ＲｔおよびＲ３が全てＨである場合、生成される色素 沈澱はインジゴである。

該色素−形成性基質は水性系に対して不溶であり、生育培地に暴露された場合に 該ポリマーから該色素−形成性基質が滲出されるのを防止し、もしくは該固体担 体の表面に出て来るのを防止することが好ましい。このようにして、各テストに 必要とされる色素−形成性基質の量を減じることにより、経費を維持することが 可能である。従って、使用する色素−形成性基質の量はテストの規模またはサン プルの大きさには無関係である。更に、特定の微生物または微生物群の酵素アッ セイによる分析は、従来の生育法と比較して、より一層迅速かつ高感度なアッセ イ系および純粋な培養検出法が提供される。

本発明の方法および本発明の酵素指示デバイスの使用の利点は、該色素−形成性 基質を、溶液全体に渡り分散させるというよりも、画成された反応表面上で有効 利用することを可能とする。該反応表面は固体担体部材またはポリマーマトリッ クスの表面である０その結果培養物の容積とは無関係のアッセイが与えられ、か くして試薬消費の経済性が導かれる。第二に、インジゴ生成基質からの該不溶性 インジゴ色素−形成性基質の色は青乃至紫の範囲にあり、この色は食品またはあ る種の水に関連する顔料もしくは濁りにより隠蔽もしくは減衰されることはない 。かくして、該インジゴ生成基質は食品および水サンプル両者の大腸菌型細菌の 検出を可能とする。第三に、このインジゴ生成性基質は、酵素アッセイに関連す る速度および感度をもたらす。第四に、β−ガラクトシダーゼアッセイはラクト ース醗酵経路の下方部分での酵素調節に関連する問題を排除する。第五に、酵素 アッセイは、該酵素が色素−形成性基質の加水分解を実施した時点毎に、ガラク トシド部分のみの開裂が終了する該経路の終端においてではな（、該経路の第一 段階において信号を発生する。

本発明のもう一つの局面では、特定の微生物および微生物群に関連した酵素のア ッセイは、（ａ）液状生育培地にサンプルを添加し；（ｂ）画成された反応表面 上に色素−形成性または螢光発生基質を添加し、ここで該基質は該酵素により開 裂された場合に沈澱または螢光性副生成物を形成し；（Ｃ）該サンプル、生育培 地および基質を該特定の微生物および微生物群の生育に許容される温度にてイン キュベートし；（ｄ）該画成された反応表面上または回りの培地中における着色 された沈澱の存在または螢光の存在により、該特定の微生物および微生物群の存 在を検出する各工程を含む。好ましい態様において、該螢光発生基質は４−メチ ルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドである。

図面の簡単な説明 添付図は、ブロモクロロインジゴを生成するための、ブロモクロロインドリルガ ラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）の加水分解の反応経路を示すものである。ブロモクロ ロインドリルガラクトシドは、まず該特定の微生物または微生物群由来のβ−ガ ラクトシダーゼにより開裂されてガラクトース基が除去され、かつブロモクロロ インドキシルを生成し、これは酸化反応により三量化されて、高度に着色された 青緑色の沈澱、ブロモクロロインジゴとなる。酸化は、溶液中の酸化剤によりま たはブロモクロロインドキシルの空気への暴露により行うことができる。

発明の詳細な説明 本発明は、特定の微生物および／または微生物群に関連する酵素の検定法に関す る。好ましくは、該特定の微生物はＢ、　ｍｌ　Ｕであり、かつ該微生物群は大 腸菌型細菌である。該酵素β−ガラクトシダーゼは該大腸菌型細菌に特徴的なも のであり、またβ−グルクロニダーゼ活性はＢ、コリに特徴的なものである。該 色素−形成性基質は、好ましくはポリマー系に混合され、かつ酵素により開裂さ れた場合には不溶性の沈澱を形成する。また、該色素−形成性基質は固体担体部 材に付着させることも可能であり、該担体部材も該不溶性の沈澱を形成するため の表面であり得る。好ましくは、該色素−形成性基質は水性液体、例えば生育培 地に不溶性であって、該生育培地全体に渡り該色素−形成性基質が分散するのを 防止し、代わりに該ポリマー系または該固体担体部材の表面に該色素−形成性基 質を集中させる。

該色素−形成性基質の、高度に着色された沈澱の生成反応は、糖基を開裂するた めの特定の酵素および該開裂された色素−形成性基質から高度に着色された二量 体の沈澱を形成するための酸化性環境を必要とする。該酸化性環境は該ポリマー 中の色素−形成性基質を空気に暴露させるか、あるいは該生育培地に酸化剤を添 加することにより生成することができる。酸化剤の例は、過酸化水素、ＮＯ３− 、Ｆｅ”、Ａｇ＋、ピロガロール、Ｃｕ＋などを包含する。

最も好ましくは、該酸化剤は０．１０よりも大きな酸化還元電位を有し、かつ生 育中の微生物に対して有害作用を回避し得る濃度で使用される。

該色素−形成性基質は、好ましくは以下の式で示される置換インジゴ誘導体であ る。

Ｒ１（＞糖 ここで、各Ｒはハロゲンまたは水素原子である。該糖基は任意の単糖類、その誘 導体、またはアルデヒド酸である。好ましくは、該糖基はガラクトシドまたはグ ルコシドであり、該アルデヒド酸はグルクロン酸である。最も好ましくは、該糖 またはアルデヒド酸はβ−結合により酸素に結合している。該置換インジゴ色素 の例は、ガラクトースおよびグルクロン酸とβ−り結合している３−インドリル −１５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−１５−ブロモ−３−インドリル −１５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−１および５−アイオド−３−イ ンドリル−誘導体を含む。該基質は無色であるが、適当な酵素により加水分解さ れた場合には、該基質のインドキシルまたは置換インドキシル部分が酸化されて 、例えば添付図に示したように、強く着色された不溶性のインジゴ沈澱またはイ ンジゴ誘導体を形成する。該三量化反応は酸化性の環境を必要とする。更に、酵 素による開裂後に有色の不溶性生成物を形成する非インジゴ生成β−糖基質は本 発明の方法および本発明の酵素指示デバイスに使用することができる。

別の態様において、特定の微生物または微生物群の培養物は育成培地で生育でき 、もしくは特定の微生物または微生物群に対して推定的に正の結果を与えた。特 定の微生物または微生物群に関連する特定の酵素のアッセイのための本発明の酵 素指示デバイスは育成培地でサンプルを生育した後、該育成培地中に添加するこ とができる。例えば、色素−形成性基質はポリマー系と混合でき、次いで固体担 体の頂部で層に形成し得る。あるいは、該色素−形成性基質は固体担体部材の表 面上に付着させることもできる。該固体担体は、これを液体育成培地の表面上に 維持すべく浮遊性のプラスチックであることが好ましい。また、色素−形成性基 質はポリマー材料、例えばラテックスと混合して全体に渡り該色素−形成性基質 を含むマトリックスを形成することも可能である。該色素−形成性基質を含むラ テックス製マトリックスは液体育成培地中に落とし込むか、あるいは該液体育成 培地の表面上に懸垂させることができる。

該色素−形成性基質が空気と接していない場合には、該色素−形成性基質と共に あるいはその添加の直ぐ後に、該育成培地に発色溶液を添加すべきである。該発 色溶液は酸化剤、例えば過酸化水素、Ａｇ＋、Ｈｇ＋＋、Ｉｓ−、ＩＯ４−、過 硫酸、Ｐｄ”、ニトロベンゼン類、アゾベンゼン類、キノン類、２−クロロ−２ −ニトローブロノぐン、ＫＪｅ（ＣＮ）ｓ　、インドロン類、およびｐ−ヒドロ キシメル力すベンゾエート（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｒｃａｒ　１ｂｅｎｚｏａ ｔｅ　）などを含む。好ましく（ま、更に該発色溶液は沈澱促進剤および細胞浸 透剤をも含む。該細胞浸透剤はインジゴ発生基質の該細胞内への侵入を容易にし て、迅速な該基質の再編成およびより迅速な該細胞からの該インドキシルまたは インジゴの分泌をもたらす。細胞浸透剤の例は、トルエン、アニオン性および非 イオン性洗浄剤、および七チルトリメチルアンモニウムプロミドを包含する。該 沈澱促進剤は生成した沈澱の固体担体および／またはポリマーマトリックスから の移動の防止を助長する。沈澱促進剤の一例はアルカリ性洗浄剤の混合物、例え ば濃度０．１％〜１．０％でｐＨが８．０〜１Ｏ６０のドデシル硫酸ナトリウム である。この沈澱促進剤は濁りまたは強い発色反応の停止作用を示す育成培地で 使用することが好ましい。

本発明の酵素指示デバイスは色素−形成性基質、例えばＸ−Ｇａ１を溶媒、例え ばジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）　、メチルセロソルブ（２−メトキシエタ ノール）、またはＤＭＳＯに溶解し、次いで液状ポリマー系、例えばラテックス と混合することにより製造し得る。

乾燥して固体または半固体状態に転化し得る他の接着型ポリマーは、例えばエチ レンビニルアセテート（ＥＶＡ）　、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）　、およ びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を包含する。ＥＶＡは塩化メチレンに可溶性 のポリマーである。また、溶媒、例えば塩化メチレン中で液化し得るポリマー系 は該色素−形成性基質と混合すべき該接着型のポリマーを液化するのに有用であ る。色素−形成性基質とポリマーとの混合物は乾燥して固体または柔軟な固体に 成形する。好ましくは、極めて粘稠な状態にある該液状の色素−形成性基質とポ リマーは固体担体の表面上に層状に成形し得る。最も好ましくは、固体担体は液 体表面上で浮遊し得る多孔性のプラスチック材料製のものである。

更に、溶媒中の該色素−形成性基質は、直接固体担体部材の表面に添加し、乾燥 （溶媒の蒸発）することができる。また、該色素−形成性基質は溶媒、例えばＤ ＭＦから、試薬例えば塩化メチレンを加えることにより沈澱させることができ、 この場合該色素−形成性基質は不溶性である。次いで、該沈澱は直接固体担体部 材上に層状に形成される。

色素−形成性基質の濃度は、与えられた表面積および該反応容積で可視的応答を 与えるのに十分な値である。例えば、孔径７０μで、径１７２インチかつ厚み１ ７１６インチのポリエチレン製円形固体担体部材上のＸ−Ｇａ１の濃度は約５０ μｇ〜約１ｍｇの範囲内である。

該固体担体は液体の表面上で浮遊でき、該液体表面の下方に維持されてもよく、 あるいは例えば培養物容器または培養物容器のクロージヤーに物理的に取りつけ ることにより、液状育成培地の表面近傍に機械的に配置することも可能である。

該固体支持体を該液体−気体界面にもしくはその近傍に配置することにより、空 気中の酸素の極近傍に位置させてインドキシルのインジゴへの酸化を容易にし、 結果として該アッセイの速度並びに感度を改善することを可能とする。更に、該 固体支持体および最終的な着色位置が該培地の頂部に局在している場合には、該 反応は該培養ブロスにより不明瞭化されず、かつ読み取りが容易となる。該固体 支持体が該液体の表面下に位置する場合には、該色素−形成性基質の酸化を容易 にするために発色溶液を添加することが好ましい。

大腸菌型細菌をテストする場合、該培地、例えばＬＳＴＳロブロス中常の成分は 可溶性基質、例えば０ＮＰＧの発色反応を妨害する恐れがある。従って、０ＮＰ Ｇは透明な培地内でのみテストすることができ、結果として弱い反応を読み取る ことを可能とする。ここで、実際上任意の寸法の固体担体上への該色素−形成性 基質の組み込みはサンプルの寸法とは無関係に、使用する試薬を保存することを 可能とする。同一の固体担体およびポリマー系と結合した色素−形成性基質の表 面積を任意の体積の培養物に対して使用することができる。というのは、該基質 と細菌酵素との反応は該培地の全容積に渡ってではなく画成された表面積内でお こるからである。

発生する青色は通常の微生物学的培地成分により不明瞭化されないので、ポリマ ー系内の該色素−形成性基質を使用したアッセイは複雑な培地、例えばＬＳＴＳ ロブロス中施することができる。酸化性環境の存在下での該色素−形成性基質の 加水分解により生じた不溶性の青色の沈澱は該固体支持体の表面に維持され、そ の結果反応生成物はかなり小さなより観察の容易な空間に集中される。

該沈澱の局在化は該テストの読み取りを容易にし、その感度を高める。該酵素ア ッセイの固体支持体への局在化は試薬利用上の経済化をもたらす。

更に別の局面では、本発明の方法並びに酵素指示デバイスは、最確数（ＭＰＮ） 法を利用した、食品または水サンプル中の大腸菌型細菌の数を評価する定量的ア ッセイにおいても利用し得る。ＭＰＮ大腸菌アッセイは、ポリマー系、例えばラ テックス中の色素−形成性基質を標準的な大腸菌培地、例えばＬＳＴグロスに配 合することにより達成される。該サンプルの調製は標準的な方法で行う。

−夜インキユベートした後、試験管内の該ポリマー系における発色を読み取り、 正の試験管につき、標準的なＭＰＮ法に従って確定されたＭＰＮ／ｇまたはＭＰ Ｎ／ｍｌを計算する。食品の微生物学的試Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ａｓ５ ｏｃｉａｔｉｏｎ）、　１９８４）；公定分析法（ＯｆｆｉｃｉａｌＭｅｔｈｏ ｄｓ　ｏｆ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）　（第１４版、アッソシェーションオブオフィ シャルアナリティカルケミスツ（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　０ｆｆｉｃｉ ａｌＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ）、　１９８４）；および水およ び排水の検査のための標準的方法（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ 　ｔｈｅ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗａｔｅｒａｎｄ　Ｗａｓｔｅｗａ ｔｅｒ）　（第１７版、米国公衆衛生協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＰｕｂｌｉｃＨ ｅａｌｔｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）、　１９８１）を参照のこと。

本発明の方法および酵素指示デバイスは、例えば大腸菌型細菌の定量テストで使 用できる。インジゴ生成性ガラクトシド基質は飲料水中の大腸菌のＰＡテストで 使用する培地に配合される。この水のサンプルはポリマー系中に、好ましくは浮 遊性のプラスチック固体担体上の層としての色素−形成性基質を含む培地に添加 する。適当なインキュベート時間の経過後、培養器内で該固体担体部材上の沈澱 したインジゴは該サンプル中に大腸菌が存在することを示す。この手順は、環境 サンプルを大腸菌の存在につき定量的にテストするためにも利用される。例えば 、先端に綿布を取りつけたアプリケータで拭い、ポリマー系に組み込まれた、好 ましくは固体担体部材上に適用されたインジゴ生成性の色素−形成性基質を含む 大腸菌用培地に該アプリケータを置くことにより下水設備の有効性を調べるため に表面または排水管をアッセイすることができる。適当な時間、例えば１〜２４ 時間、細菌の育成に許容される温度でのインキュベートの後、該培養器内に、ま たはより特定的には該固体担体の表面上に沈澱したインジゴの色は該サンプル中 における大腸菌の存在を示す。

上記のような色素−形成性基質の使用の他に、本発明は、付随的な培養物の移動 、試薬の調製もしくは診断法の使用の必要なしに、Ｅ、コリおよび大腸菌型細菌 両者の同時の確認的測定法をも提供する。より詳しくいえば、上記の如き色素− 形成性および螢光発生基質を含む円板を、Ｅ、コリおよび／または大腸菌型細菌 の存在につきテストすべき微生物学的培地を含む容器に添加する。培地と該反応 性円板とを含む該容器を、対象とする微生物の生育に許容される温度にてインキ ュベートする。インキュベートの後、該容器を該反応性円板または回りの培地に おける識別色の存在につき観察する。次いで、該容器を長波長の紫外光（３６０ ｎｍ）に暴露して、回りの培地における螢光の存在につき観察する。該円板上以 下の実施例は例示の目的で与えられるものであり、本発明を限定するものではな い。

実施例１ 本例は、水および排水の標準的検査法（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆ ｏｒｔｈｅ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｓｔｅ ｗａｔｅｒ）　（第１７版、米国公衆衛生協会（Ａｍｅｒｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉ ｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）、　１９８１）に記載されたよう なＰＡ　（存在−不在）法により飲料水中の大腸菌型細菌の検出法を例示す′る 。簡単に言えば、１００　ｍｌの水を容量２５０　ｍｌのビン中の３倍濃度のク ラークス（Ｃ１ａｒｋ’　ｓ）培地５０ｍ１に無菌条件下で加えた。クラークス （Ｃ１ａｒｋ’　ｓ）培地にはｐＨ指示薬を除く改良を施した。インキュベート の後、ラテックスポリマー系中のインジゴ生成性ガラクトシド基質を含むプラス チック担体を該培養器に加えて、該液体表面にこれを浮かべた。該プラスチック 担体上の、ラテックスポリマー系中の該インジゴ生成性ガラクトシド基質はすで に述べたようにして調製した。この混合物を３５°Ｃでインキュベートし、２４ 時間後に、該プラスチック担体をインジゴ形成につき検査した。インジゴ形成− 正の反応は該水サンプル中に大腸菌が確実に存在することを示した。

実施例２ 本例は、本発明の方法を利用して、環境サンプル中の大腸菌型細菌およびＥ、コ リの検出法を例示する。この環境サンプルは下水施設の有効性を検査するために あるいは日常の環境スクリーニングプログラムの一部として採取した。先端に綿 を取りつけたアプリケータを滅菌した希釈剤で湿し、表面を拭うのに使用した。

このスワブを微生物学的ラウリル硫酸トリプトースブロス育成培地内に置いた。

浮遊性の円形プラスチック担体の半面にポリマー系中のインジゴ形成性ガラクト シド基質を層状に適用し、残りの半面にインジゴ形成性グルクロニド基質を層状 に適用し、インキュベート後にこれを培養物に加えた。この混合物を３５°Ｃに て２４時間インキュベートした。該プラスチック担体の半面上のインジゴ生成− 正の反応により、該環境サンプル中における大腸菌型細菌の存在が示された。該 プラスチック担体の両半面上のインジゴ形れた。

実施例３ 本例では、本発明の方法を利用して、最確数（ＭＰＮ）分析により食品または水 サンプル中の大腸菌およびＢ、コリの濃度を見積もる方法を例示する。このＭＰ Ｎ法は食品の微生物学的検査法の概説（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｘａｍｉｎａｔ ｉｏｎｏｆ　Ｆｏｏｄｓ）　（第２版、米国公衆衛生協会（Ａｍｅｒｉｃａｌ　 Ｐｕｂｌｉｃ　ＨｅａｌｔｈＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、　１９８４）；公定分 析法（Ｏｆｆｉｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）（第１４ 版、アッソシエーションオブオフィシャルアナリティカルケミスツ（Ａｓｓｏｃ ｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　０ｆｆｉｃｉａｌ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓ ｔｓ）。

１９８４）；および水および排水の標準的検査法（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈ ｏｄｓｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　 Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ）　（第１７版、米国公衆衛生協会（Ａｍｅｒｉｃａｌ　 Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）、　１９８１）に記載 されている。

水サンプル（１０ｍｌ）を２倍濃度のラウリル硫酸トリプトース（ＬＳＴ）ブロ スｌｏｍｌに無菌条件下で添加した。浮遊性の円形プラスチック固体支持体の半 面にポリマー系中のインジゴ形成性ガラクトシド基質を適用し、残りの半面にポ リマー系中のインジゴ形成性グルクロニド基質を層状に適用し、インキュベート 後にこれを各試験管に加えた。この混合物を３５°Ｃにて２４時間インキュベー トした。

該プラスチック担体の半面上のインジゴ生成−正の反応により、該水サンプル中 における大腸菌型細菌の存在が示される。該プラスチック担体の両半面上のイン ジゴ形成−正の反応により、該サンプル中のＥ、コリの存在が示される。インジ ゴ生成−正の培養物の数は、標準的統計確率表（ＭＰＮ表）を使用して元の水サ ンプル中に存在する大腸菌型細菌およびＬ三旦の数を評価するのに利用した。

食品サンプルをＭＰＮアッセイ前に、連続的１０倍希釈により希釈した。固体食 品サンプルの一部（塊）を無菌希釈剤、パターフイールズ（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅ ｌｄ’　ｓ）緩衝燐酸バッファー９部（容量部）に添加した。この混合物を高速 で２分間ブレンドした。２種の別の１０倍希釈物を１＝１０希釈食品サンプルか ら調製した。該１０倍希釈物の各１ｍｌを１０ｍ１の３種のＬＳＴグロスの試験 管の各々に添加した。浮遊性の円形プラスチック担体の半面にポリマー系中のイ ンジゴ形成性ガラクトシド基質を適用し、残りの半面にポリマー系中のインジゴ 形成性グルクロニド基質を適用し、インキュベート後にこれを各試験管に加えた 。この混合物を３５°Ｃにて２４時間インキュベートした。該プラスチック担体 の半面上のインジゴ生成−正の反応により、該希釈物サンプル中における大腸菌 型細菌の存在が示される。該プラスチック担体の両半面上のインジゴ形成−正の 反応により、該希釈物サンプル中のＥ、コリの存在が示される。インジゴ生成− 正の培養物の数は、標準的統計確率表（ＭＰＮ表）を使の数を評価するのに利用 した。

実施例４ 本例は、インジゴ形成性基質混合物を使用して、推定的に正の大腸菌培養物の全 大腸菌およびＥ、コリについての確認法を説明する。大腸菌型細菌に対する推定 的ガス発生性が正の培養物を、以下の手順に従って大腸菌型細菌およびＥ、コリ の存在につき確認した。浮遊性の円形固体担体の半面にインジゴ形成性ガラクト シド基質を適用し、残りの半面にインジゴ形成性グルクロニド基質を適用し、こ れを該培養物に加えた。酸化剤（過酸化水素、１０％濃度）を該培養物に加えた 。大腸菌ＭＰＮ分析の推定分析部分は実施例３に記載の手順を利用して、食品ま たは水サンプルにつき、ＬＳＴＳログロス中施した。２４〜４８時間後にガス発 生が正の培養物を、上記の浮遊性円形固体担体を使用し、同時に酸化剤を含む発 色剤を添加して確認した。この培養物を３５°Ｃにて約１時間インキュベートし 、該プラスチック担体をインジゴの形成に関して検査した。該円形固体担体の半 面上でインジゴ形成−正である培養物には大腸菌型細菌が存在することが確認さ れたものと考えた。該円形固体担体の両半面上でインジゴ形成−正である培養物 にはＥ、ｍｌりが存在することが確認された。インジゴ形成−負の培養物を更に １時間インキュベートして、再度検査した。２時間たっても依然としてインジゴ 形成−負の培養物は大腸菌型細菌またはＬ三ユの存在につき未確認のままであっ た。

実施例５ 本例は、水および排水の標準的検査法（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆ ｏｒｔｈｅ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｓｔｅ ｗａｔｅｒ）　（第１７版、米国公衆衛生協会（Ａｍｅｒｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉ ｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）、　１９８１）に記載されている ＰＡ　（存在−不在）法による飲料水中の大腸菌型細菌の検出法を例示する。簡 単に言えば、１００　ｍｌの水を容量２５０　ｍｌのビン中の３倍濃度のクラー クス（Ｃ１ａｒｋ’　ｓ）培地５０ｍ１に無菌条件下で加えた。クラークス（Ｃ １ａｒｋ’　ｓ）培地にはｐＨ指示薬を除く改良を施した。インキュベートの後 、ラテックスポリマー系中のインジゴ生成性ガラクトシド基質および螢光発生基 質を含むプラスチック担体を該培養器に加えて、該液体表面にこれを浮かべた。

該プラスチック担体上の、ラテックスポリマー系中の該インジゴ生成性ガラクト シド基質はすでに述べたようにして調製した。この混合物を３５°Ｃでインキュ ベートし、２４時間後に、該プラスチック担体をインジゴ形成につき検査した。

インジゴ形成−正の反応は該水サンプル中に大腸菌が確実に存在することを示し た。

実施例６ 本例は、本発明の方法を利用して、環境サンプル中の大腸菌型細菌およびＥ、コ リの検出法を例示する。この環境サンプルは下水施設の有効性を検査するために あるいは日常の環境スクリーニングプログラムの一部として採取した。先端に綿 を取りつけたアプリケータを滅菌した希釈剤で湿し、表面を拭うのに使用した。

このスワブを微生物学的ラウリル硫酸トリプトースブロス育成培地内に置いた。

浮遊性の円形プラスチック担体にポリマー系中のインジゴ形成性ガラクトシド基 質および螢光発生性グルクロニド基質を層状に適用し、インキュベート後にこれ を培養物に加えた。

この混合物を３５°Ｃにて２４時間インキュベートした。該プラスチック担体上 のインジゴ生成−正の反応により、該環境サンプル中における大腸菌型細菌の存 在が示された。該プラスチック担体を長波長の紫外光（３６６ｎｍ）を照射した 際の該容器中の螢光発生−正の反応により、該サンプル中におけるＥ、コリの存 在が示された。

以上、本発明を明瞭にしかつ理解を容易にする目的で、本発明を例示並びに実施 例により記載してきたが、本発明の精神並びに範囲を逸脱することな（、いくつ かの変更並びに改良が可能であることは明らかであろう。

国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９００２３４６ ＳＡ　３７０３３

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. １．サンプルを液状育成培地に添加する工程、色素−形成性基質が酵素により開 裂された場合に沈澱を形成する画成された反応領域上に該色素−形成性基質を添 加する工程、 該サンプル、育成培地および色素−形成性基質を特定の微生物または微生物群の 生育に許容される温度にてインキュベートする工程、および 該特定の微生物または微生物群の存在を該画成された反応表面上の着色沈澱の存 在により検定する工程を含む、該特定の微生物または微生物群に関連する酵素の アッセイ法。
2. ２．該色素−形成性基質が酵素で開裂された際に不溶性の沈澱を形成する請求の 範囲第１項記載の方法。
3. ３．該色素−形成性基質が以下の式で示される置換インジゴ誘導体： ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、各Ｒはハロゲンまたは水素原子を表す）である、請求の範囲第２項記 載の方法。
4. ４．該ハロゲン原子が塩素、臭素および沃素からなる群から選ばれる請求の範囲 第３項記載の方法。
5. ５．該糖が単糖類またはその誘導体である請求の範囲第３項記載の方法。
6. ６．該糖がグルクロニド、グルコシドおよびガラクトシドからなる群から選ばれ る請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．該色素−形成性基質が更にポリマー系をも含み、該色素−形成性基質が該ポ リマー系に組み込まれて反応表面を形成する請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．更に固体担体部材を含み、該ポリマー系中の該色素−形成性基質が該固体担 体部材の表面上に層状に適用され、かつ該固体担体部材の表面が上記の反応表面 となる請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．該固体担体が液体表面上に浮遊するプラスチック部材であって、該ポリマー 系中の該色素−形成性基質が該液体上方の空気と接触することを可能とする請求 の範囲第８項記載の方法。
10. １０．該固体担体が、該液体とその上方の空気との両者と接している培養容器の 側部である請求の範囲第８項記載の方法。
11. １１．該固体担体が、物理的に懸垂されて、液体−気体界面に留まっている請求 の範囲第８項記載の方法。
12. １２．該ポリマー系がラテックス、エチレンビニルアセテート、ポリビニルアル コール、ポリビニルピロリドンおよびその組み合わせからなる群から選ばれる請 求の範囲第７項記載の方法。
13. １３．該ポリマー系がラテックスである請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．該特定の微生物がＥ．コリであり、該微生物群が大腸菌群細菌である請求 の範囲第１項記載の方法。
15. １５．該サンプルが水、飲料水、排水、食品、または環境サンプルである請求の 範囲第１項記載の方法。
16. １６．更に、該インキュベートの際に発色溶液を添加する工程を含み、該発色溶 液が酸化剤を含む請求の範囲第１項記載の方法。
17. １７．該酸化剤が、過酸化水素、Ａｇ＋、Ｈｇ＋＋、Ｉ３、ＩＯ４、Ｐｄ＋＋、 過硫酸、ｐ−ヒドロキシマーキュリベンゾエートおよびその組み合わせからなる 群から選ばれる請求の範囲第１６項記載の方法。
18. １８．更に、該発色溶液に沈澱促進剤および細胞浸透剤を添加する請求の範囲第 １６項記載の方法。
19. １９．該細胞浸透剤がトルエン、洗浄剤、セチルトリメチルアンモニウムブロミ ドおよびその組み合わせからなる群から選ばれる請求の範囲第１８項記載の方法 。
20. ２０．該沈澱促進剤がアルカリ性洗浄剤からなる群から選ばれる請求の範囲第１ ８項記載の方法。
21. ２１．サンプルを液状育成培地に添加する工程、該サンプルおよび育成培地を、 特定の微生物または微生物群の生育に許容される温度にて微生物生育の痕跡が認 められるまでインキュベートする工程、 酵素指示デバイスを添加する工程、ここで該酵素指示デバイスは画成された反応 表面上の色素−形成性基質を含み、かつ該色素−形成性基質は該酵素により開裂 されて着色された沈澱を生成する、 該サンプル育成培地および酵素指示デバイスを約１〜約４８時間、許容された温 度にてインキュベートする工程、および該特定の微生物または微生物群の存在を 該酵素指示デバイス上の色の変化により視覚的に検出する工程を含む、該特定の 微生物または微生物群に関連する酵素のアッセイ法。
22. ２２．該色素−形成性基質が以下の式で示される置換インジゴ誘導体： ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、各Ｒはハロゲンまたは水素原子である）である請求の範囲第２１項記 載の方法。
23. ２３．該ハロゲン原子が塩素、臭素および沃素からなる群から選ばれる請求の範 囲第２１項記載の方法。
24. ２４．該酵素指示デバイスが更にポリマー系を含み、該色素−形成性基質が該ポ リマー系に組み込まれて、該反応表面を形成する請求の範囲第２１項記載の方法 。
25. ２５．該ポリマー系がラテックス、エチレンビニルアセテート、ポリビニルアル コール、ポリビニルピロリドンおよびその組み合わせからなる群から選ばれる請 求の範囲第２４項記載の方法。
26. ２６．該ポリマー系がラテックスである請求の範囲第２４項記載の方法。
27. ２７．該酵素指示デバイスが、ジメチルフォルムアミド中に該色素−形成性基質 を溶解し、該色素−形成性基質を液状ポリマー系と混合して、混合物を形成し、 得られる層状の固体担体を乾燥することにより形成される請求の範囲第２４項記 載の方法。
28. ２８．該酵素指示デバイスが固体担体をも含み、該ポリマー系に組み込まれた該 色素−形成性基質が該固体担体の表面に層状に適用されて、該反応表面を形成す る請求の範囲第２４項記載の方法。
29. ２９．該固体担体が透明であるか、濁っているかもしくは白色である請求の範囲 第２８項記載の方法。
30. ３０．該画成された反応表面が固体担体部材を含む請求の範囲第２１項記載の方 法。
31. ３１．該特定の微生物がＥ．コリであり、該微生物群が大腸菌群細菌である請求 の範囲第２１項記載の方法。
32. ３２．該サンプルが水、飲料水、排水、食品、または環境サンプルである請求の 範囲第２１項記載の方法。
33. ３３．該酵素指示デバイスが該育成培地の頂部に添加される請求の範囲第２１項 記載の方法。
34. ３４．更に、該酵素指示デバイスと共に発色溶液を添加する工程を含み、該発色 溶液が酸化剤を含む請求の範囲第２１項記載の方法。
35. ３５．該酸化剤が、過酸化水素、Ａｇ＋、Ｈｇ＋＋、Ｉ３、ＩＯ４、Ｐｄ＋＋、 過硫酸、ｐ−ヒドロキシマーキュリベンゾエートおよびその組み合わせからなる 群から選ばれる請求の範囲第３４項記載の方法。
36. ３６．更に、該発色溶液に沈澱促進剤および細胞浸透剤を添加する請求の範囲第 ３４項記載の方法。
37. ３７．該細胞浸透剤がトルエン、洗浄剤、セチルトリメチルアンモニウムブロミ ドおよびその組み合わせからなる群から選ばれる請求の範囲第３６項記載の方法 。
38. ３８．該沈澱促進剤がアルカリ性洗浄剤からなる群から選ばれる請求の範囲第３ ６項記載の方法。
39. ３９．酵素に関連する特定の微生物または微生物群のアッセイ用の酵素指示デバ イスであって、画成された反応表面上に色素−形成性基質を含み、該色素−形成 性基質が該酵素により開裂されて該反応表面上に着色された沈澱を形成すること を特徴とする上記酵素指示デバイス。
40. ４０．更に、固体担体部材を含み、該固体担体部材が該反応表面を画成する請求 の範囲第３９項記載の酵素指示デバイス。
41. ４１．該固体担体が液体の表面上で浮遊している請求の範囲第４０項記載の酵素 指示デバイス。
42. ４２．該固体担体が液体−空気界面に懸垂されている請求の範囲第４０項記載の 酵素指示デバイス。
43. ４３．該反応表面が培養容器に組み込まれている請求の範囲第４０項記載の酵素 指示デバイス。
44. ４４．該色素−形成性基質が以下の式で示される置換インジゴ誘導体： ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、各Ｒはハロゲンまたは水素原子である）である請求の範囲第３９項記 載の酵素指示デバイス。
45. ４５．該ハロゲン原子が塩素、臭素および沃素からなる群から選ばれる請求の範 囲第４４項記載の酵素指示デバイス。
46. ４６．該酵素指示デバイスが更にポリマー系を含み、該色素−形成性基質が該ポ リマー系に組み込まれて、該反応表面を形成する請求の範囲第３９項記載の酵素 指示デバイス。
47. ４７．該ポリマー系がラテックス、エチレンビニルアセテート、ポリビニルアル コール、ポリビニルピロリドンおよびその組み合わせからなる群から選ばれる請 求の範囲第４６項記載の酵素指示デバイス。
48. ４８．該ポリマー系がラテックスであることを特徴とする請求の範囲第４７項記 載の酵素指示デバイス。
49. ４９．該特定の微生物がＥ．コリであり、該微生物群が大腸菌群細菌である請求 の範囲第３９項記載の酵素指示デバイス。
50. ５０．固体担体部材の表面上で乾燥された色素−形成性基質を含む特定の微生物 または微生物群のアッセイ用酵素指示デバイス。
51. ５１．該色素−形成性基質が以下の式で示される置換インジゴ誘導体： ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、各Ｒはハロゲンまたは水素原子である）である請求の範囲第５０項記 載の酵素指示デバイス。
52. ５２．該ハロゲン原子が塩素、臭素および沃素からなる群から選ばれる請求の範 囲第５１項記載の酵素指示デバイス。
53. ５３．該特定の微生物がＥ．コリであり、該微生物群が大腸菌群細菌である請求 の範囲第５０項記載の酵素指示デバイス。
54. ５４．サンプルを液状育成培地に添加する工程、画成された反応表面上に色素− 形成性基質および／または螢光発光性基質を加える工程、ここで該基質は酵素に より開裂された場合に沈澱または螢光性副生成物を形成する、該サンプル、育成 培地および基質を、特定の微生物または微生物群の生育に許容される温度にてイ ンキュベートする工程、該特定の微生物または微生物群の存在を該画成反応表面 上のまたはその回りの培地中の着色された沈澱または螢光により検出する工程 を含む、該特定の微生物または微生物群に関連する酵素のアッセイ法。
55. ５５．該螢光発光性基質が４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド である請求の範囲第５４項記載の方法。