JPH01221396A - ８因子の精製に使用するペプチド - Google Patents
８因子の精製に使用するペプチドInfo
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- JPH01221396A JPH01221396A JP63291064A JP29106488A JPH01221396A JP H01221396 A JPH01221396 A JP H01221396A JP 63291064 A JP63291064 A JP 63291064A JP 29106488 A JP29106488 A JP 29106488A JP H01221396 A JPH01221396 A JP H01221396A
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- Japan
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- peptide
- amino acid
- factor viii
- acid sequence
- factor
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、■因子の精製に使用できる■因子のアミノ酸
配列に基づくペプチドに関する。
配列に基づくペプチドに関する。
従来技術
血友病を持つ個体の血液は、それが適切に凝固しないと
いう結果によって欠陥を有する。主な種類の血友病は、
■因子の欠乏から来るものであり、■因子は血液凝固過
程に含まれる一連の蛋白質の一つである。外因性の■因
子は、凝固不足を直すために■因子欠乏の血友病患者に
投与することができる。
いう結果によって欠陥を有する。主な種類の血友病は、
■因子の欠乏から来るものであり、■因子は血液凝固過
程に含まれる一連の蛋白質の一つである。外因性の■因
子は、凝固不足を直すために■因子欠乏の血友病患者に
投与することができる。
■因子の精製のために種々の方法が開発されてきた。し
かし、高収量の■因子を得る■因子の改良精製法が要望
されている。
かし、高収量の■因子を得る■因子の改良精製法が要望
されている。
発明の目的
そこで、本発明は、高収量の■因子を得る■因子の改良
精製法及びそれに使用するペプチドを提供することを目
的とする。
精製法及びそれに使用するペプチドを提供することを目
的とする。
発明の構成
本発明は■因子の精製に■因子のアミノ酸配列に基づく
ペプチドを使うことによってこの目的を達成し、■因子
を温和な条件で精製でき、その結果■因子の収率を改善
することを可能とした。
ペプチドを使うことによってこの目的を達成し、■因子
を温和な条件で精製でき、その結果■因子の収率を改善
することを可能とした。
本発明は、■因子の精製に使用できる■因子のアミノ酸
配列に基づくペプチドから成る。これらのペプチドは、
■因子の精製のためにモノクローナル抗体またはその他
の抗体を励起する（ｒａｉｓｅ）のに使用できる。これ
らのペプチドはまた、■因子の精製のためにモノクロー
ナル抗体またはその他の抗体から■因子を溶出させるの
にも使用できる。
配列に基づくペプチドから成る。これらのペプチドは、
■因子の精製のためにモノクローナル抗体またはその他
の抗体を励起する（ｒａｉｓｅ）のに使用できる。これ
らのペプチドはまた、■因子の精製のためにモノクロー
ナル抗体またはその他の抗体から■因子を溶出させるの
にも使用できる。
特に好ましいのは、下記の配列のペプチドである。
ＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳ
そのアミノ酸配列は、■因子の配列の３５１−２６５の
アミノ酸残基のそれである。
アミノ酸残基のそれである。
もう一つの好ましいものは、下記の配列のポリペプチド
である。
である。
ＥＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫ
このアミノ酸配列は、■因子の配列の１６６０−１、６
７４のアミノ酸残基のそれである。
７４のアミノ酸残基のそれである。
本発明はまた、■因子の精製に使用できる■因子のアミ
ノ酸配列に基づくペプチドの少なくとも３個のアミノ酸
残基の逐次サブセット（ｓｅｑｕｅｎｔｉａＩ ５ｕｂ
ｓｅｔ）を含むペプチドを含む。
ノ酸配列に基づくペプチドの少なくとも３個のアミノ酸
残基の逐次サブセット（ｓｅｑｕｅｎｔｉａＩ ５ｕｂ
ｓｅｔ）を含むペプチドを含む。
本発明はさらに、■因子のアミノ酸配列に基づくペプチ
ドおよびそのペプチドの少なくとも３個のアミノ酸の逐
次サブセットを使って精製された■因子を！Ｆ１％１す
る方法を含む。
ドおよびそのペプチドの少なくとも３個のアミノ酸の逐
次サブセットを使って精製された■因子を！Ｆ１％１す
る方法を含む。
本発明はさらに、組換えＤＮＡ法または合成ぺ、プチド
法によって、■因子のアミノ酸配列およびそのペプチド
の少なくとも３個のアミノ酸の逐次サブセットに基づく
ペプチドを製造する方法をふくむ・。
法によって、■因子のアミノ酸配列およびそのペプチド
の少なくとも３個のアミノ酸の逐次サブセットに基づく
ペプチドを製造する方法をふくむ・。
上記のように、本発明は■因子の精製に使用できる■因
子のアミノ酸配列に基づくペプチドを包含する。これら
のペプチドは、■因子の精製のためにモノクローナル抗
体またはその他の抗体を励起するのに使用できる。これ
らのペプチドはまた、■因子の精製のためにモノクロー
ナル抗体またはその他の抗体から１因子を溶出させるの
にも使用できる。
子のアミノ酸配列に基づくペプチドを包含する。これら
のペプチドは、■因子の精製のためにモノクローナル抗
体またはその他の抗体を励起するのに使用できる。これ
らのペプチドはまた、■因子の精製のためにモノクロー
ナル抗体またはその他の抗体から１因子を溶出させるの
にも使用できる。
下記の説明は、本発明の具体例を製造し使用する方法の
詳細を示す、この説明は、本発明の例示であり、本発明
を限定すると解釈されるべきものではなく、当業者の考
えられる範囲内にあるような改変は本発明の範囲に入る
ものと考えられるべきである。
詳細を示す、この説明は、本発明の例示であり、本発明
を限定すると解釈されるべきものではなく、当業者の考
えられる範囲内にあるような改変は本発明の範囲に入る
ものと考えられるべきである。
■因子のアミノ酸配列に基づく種々のペプチドおよびこ
のペプチドの少なくとも３個のアミノ酸残基の逐次サブ
セットが、本発明に使用するのに適している。例えば、
ＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳおよびＥＥ Ｉ ＤＹ
ＤＤＴ Ｉ ＳＶＥＭＫＫ（７）ペプチドおよびこれら
のペプチドのどれかの少なくとも３個のアミノ酸残基の
逐次サブセットを使用できる。
のペプチドの少なくとも３個のアミノ酸残基の逐次サブ
セットが、本発明に使用するのに適している。例えば、
ＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳおよびＥＥ Ｉ ＤＹ
ＤＤＴ Ｉ ＳＶＥＭＫＫ（７）ペプチドおよびこれら
のペプチドのどれかの少なくとも３個のアミノ酸残基の
逐次サブセットを使用できる。
■因子のアミノ酸配列に基づくペプチドおよびこのペプ
チドの少なくとも３個のアミノ酸残基の逐次サブセット
は、ホートンら、プロシーディング・オプ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、第８２Ｓ、５１
３５頁（１９８５年）に記載されたようにして合成され
る。
チドの少なくとも３個のアミノ酸残基の逐次サブセット
は、ホートンら、プロシーディング・オプ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、第８２Ｓ、５１
３５頁（１９８５年）に記載されたようにして合成され
る。
ペプチドの固相合成の公知の方法においては、所望のペ
プチドはベンズヒドリルアミンまたはクロルメチル化樹
脂（架橋ポリスチレンから誘導され化学品業者から入手
できる）のような不溶性の支持体から出発して組立てら
れる。所望のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸は、
α−アミノ窒素及び他の反応部位に保護基を有しており
、公知のペプチド結合方法を用いて溶液からの樹脂と接
触する。α〜ルアミノの保護基は除かれ（他の保護基が
あればそのまま残る）、所望の配列の次のアミノ酸（適
当な保護基を持った）がつながり、次々にそれが繰り返
される。所望のペプチドが完全に出来上がると、樹脂の
支持体から分離され、すべての保護基が除かれて、ペプ
チドが回収される。適当な保護基の例は、α−アミノ基
にはα−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、システィ
ンのチオール基；アスパラギン酸のβ−カルボン＃Ｒ基
、グルタミン酸のγ−カルボンｆＪ１基およびセリン、
スレオニンおよびチロシンのヒドロキシル基にはベンジ
ル、４−メトキシベンジル、または４−メチルベンジル
； ヒスチジンおよびトリプトファンの環内窒素および
リジンの６−アミノ基にはベンジルオキシカルボニルま
たはその２−クロロまたは３．４−ジメトキシ誘導体：
アスパラギンおよびグルタミンのアミド窒素にはｐ−ニ
トロフェニル、そしてアルギニンのグアニジン基にはニ
トロまたはトシル基である。
プチドはベンズヒドリルアミンまたはクロルメチル化樹
脂（架橋ポリスチレンから誘導され化学品業者から入手
できる）のような不溶性の支持体から出発して組立てら
れる。所望のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸は、
α−アミノ窒素及び他の反応部位に保護基を有しており
、公知のペプチド結合方法を用いて溶液からの樹脂と接
触する。α〜ルアミノの保護基は除かれ（他の保護基が
あればそのまま残る）、所望の配列の次のアミノ酸（適
当な保護基を持った）がつながり、次々にそれが繰り返
される。所望のペプチドが完全に出来上がると、樹脂の
支持体から分離され、すべての保護基が除かれて、ペプ
チドが回収される。適当な保護基の例は、α−アミノ基
にはα−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、システィ
ンのチオール基；アスパラギン酸のβ−カルボン＃Ｒ基
、グルタミン酸のγ−カルボンｆＪ１基およびセリン、
スレオニンおよびチロシンのヒドロキシル基にはベンジ
ル、４−メトキシベンジル、または４−メチルベンジル
； ヒスチジンおよびトリプトファンの環内窒素および
リジンの６−アミノ基にはベンジルオキシカルボニルま
たはその２−クロロまたは３．４−ジメトキシ誘導体：
アスパラギンおよびグルタミンのアミド窒素にはｐ−ニ
トロフェニル、そしてアルギニンのグアニジン基にはニ
トロまたはトシル基である。
ここでは説明のために、既知のアミノ酸の略記法を使用
する。その完全な表を下記に示す。
する。その完全な表を下記に示す。
−字および三字のアミノ酸の略記法
Ａ Ａｌａ アラニン
ＣＣｙｓ システィン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニンＧ Ｇｌ）
ｌ グリシン ＨＨｌｓ ヒスチジン １ １’ Ｉ ｅ イソロイシンＫ Ｌｙｓ
リジン Ｌ Ｌｅｕ ロイシン Ｍ Ｍｅｔ メチオニン Ｎ Ａｓｎ アスパラギン Ｐ Ｐｒｏ プロリン Ｑ Ｇｌｎ グルタミン ＲＡｒｇ アルギニン Ｓ Ｓｅｒ セリン Ｔ Ｔｈｒ スレオニン Ｖ Ｖａｔ バリン Ｗ Ｔ ｒ ｐ ）リプトファンＹ Ｔｙ
ｒ チロシン Ｂ Ａｓ ｘ Ａｓ ｐ又はＡｓｎ、識別不能
Ｚ Ｇｌｘ Ｇｌｕ又はＧｌｎ、識別不能Ｘ
ｘ 分析不能または非定形アミノ酸 ■因子の完全なアミノ酸配列は、すでに分析されている
（ベハールら、ヒト■因子の構造、ネーチャー、第３１
２巻、３３７−３４２頁（１９８４年）参照）。このよ
うな情報で、■因子のアミノ酸配列に基づくペプチドお
よびそのペプチドの少なくとも３個のアミノ酸の逐次サ
ブセットの表現のために、ヌクレオチド配列を適当なベ
クトルに挿入することができる。■因子のフラグメント
をクローンするための組換えＤＮＡ法については、ウッ
ドら、ネーチャー、第３１２巻、３３０−３３６頁（１
９８４年）およびラージら、ネーチャー、第３１２巻、
３４２−３４６頁（１９８４年）を参照されたい。
ｌ グリシン ＨＨｌｓ ヒスチジン １ １’ Ｉ ｅ イソロイシンＫ Ｌｙｓ
リジン Ｌ Ｌｅｕ ロイシン Ｍ Ｍｅｔ メチオニン Ｎ Ａｓｎ アスパラギン Ｐ Ｐｒｏ プロリン Ｑ Ｇｌｎ グルタミン ＲＡｒｇ アルギニン Ｓ Ｓｅｒ セリン Ｔ Ｔｈｒ スレオニン Ｖ Ｖａｔ バリン Ｗ Ｔ ｒ ｐ ）リプトファンＹ Ｔｙ
ｒ チロシン Ｂ Ａｓ ｘ Ａｓ ｐ又はＡｓｎ、識別不能
Ｚ Ｇｌｘ Ｇｌｕ又はＧｌｎ、識別不能Ｘ
ｘ 分析不能または非定形アミノ酸 ■因子の完全なアミノ酸配列は、すでに分析されている
（ベハールら、ヒト■因子の構造、ネーチャー、第３１
２巻、３３７−３４２頁（１９８４年）参照）。このよ
うな情報で、■因子のアミノ酸配列に基づくペプチドお
よびそのペプチドの少なくとも３個のアミノ酸の逐次サ
ブセットの表現のために、ヌクレオチド配列を適当なベ
クトルに挿入することができる。■因子のフラグメント
をクローンするための組換えＤＮＡ法については、ウッ
ドら、ネーチャー、第３１２巻、３３０−３３６頁（１
９８４年）およびラージら、ネーチャー、第３１２巻、
３４２−３４６頁（１９８４年）を参照されたい。
種々のモノクロナール抗体が、本発明に使用するのに適
している０例えば、■因子を結合する能力をもったモノ
クローナル抗体が使用できる。また、■因子のアミノ酸
配列に基づくペプチドおよびそのペプチドの少なくとも
３個のアミノ酸の逐次サブセットに対して励起されたモ
ノクローナル抗体も使用できる。
している０例えば、■因子を結合する能力をもったモノ
クローナル抗体が使用できる。また、■因子のアミノ酸
配列に基づくペプチドおよびそのペプチドの少なくとも
３個のアミノ酸の逐次サブセットに対して励起されたモ
ノクローナル抗体も使用できる。
モノクローナル抗体Ｃ５（ファルチャーら、ヒト■因子
プロ凝析体蛋白質：モノクローナル抗体が前駆体生成物
の関係および機能性エピトープを定義する。ジャーナル
・オブ・クリニカル・インベスティゲーション、第７６
巻、１１７−１２４頁（１９８５年）に既に記載されて
いる）は、■因子と結合し、そうすることによって■因
子の活性を中和する高親和性の抗体である。
プロ凝析体蛋白質：モノクローナル抗体が前駆体生成物
の関係および機能性エピトープを定義する。ジャーナル
・オブ・クリニカル・インベスティゲーション、第７６
巻、１１７−１２４頁（１９８５年）に既に記載されて
いる）は、■因子と結合し、そうすることによって■因
子の活性を中和する高親和性の抗体である。
モノクローナル抗体Ｃ５を産生ずるハイブリドーマ細胞
系を生産するためには、フロイントの完全アジュバント
中の精製■；Ｃ因子またはトロンビン分解精製■：Ｃ因
子１μｇを腹膜的注射してＢａＩｂ／ｃマウスを免疫に
した。フロイントの不完全アジュバント中の１０−およ
び５０μｇの追加免疫（ｂｏｏｓ ｔｅｒｓ）を１週間
間隔で与えた。最後に、融合の３日前にアジュバントな
しで１００．ｌｊｇの追加免疫を与えた。４週間目に、
マウスの肺臓細胞を、ブラウンら、ジャーナル・オプ・
バイオロジカル・ケミストリー、第２５５巻、４９８０
−４９８３頁（１９８０年）に記載された方法でＰ３Ｘ
６３マウス血漿サイトーマ細胞と融合させた。細胞培養
およびマウス腹水中でのモノクローナル抗体の産生は、
本質的にリューら、ジャーナル・オブ・イミュノロジー
、第１２４巻、２７２８−２７３６頁（１９８０年）に
よった。抗体は、リンブロータイターチク（カリフォル
ニア州、イングルウッド、フロー・ラボラトリーズ）の
プレート中での同相試験およびエングバルおよびパール
マン、イミュノケミストリー、第８巻、８７１−８７４
頁（１９７１年）に記載されたようなパーオキシダーゼ
−抗体泡合体（カリフォルニア州、バーリンガム、ザイ
メソド・ラボラトリーズ）を使う酵素結合免疫吸着剤検
出システムを使って選択した。
系を生産するためには、フロイントの完全アジュバント
中の精製■；Ｃ因子またはトロンビン分解精製■：Ｃ因
子１μｇを腹膜的注射してＢａＩｂ／ｃマウスを免疫に
した。フロイントの不完全アジュバント中の１０−およ
び５０μｇの追加免疫（ｂｏｏｓ ｔｅｒｓ）を１週間
間隔で与えた。最後に、融合の３日前にアジュバントな
しで１００．ｌｊｇの追加免疫を与えた。４週間目に、
マウスの肺臓細胞を、ブラウンら、ジャーナル・オプ・
バイオロジカル・ケミストリー、第２５５巻、４９８０
−４９８３頁（１９８０年）に記載された方法でＰ３Ｘ
６３マウス血漿サイトーマ細胞と融合させた。細胞培養
およびマウス腹水中でのモノクローナル抗体の産生は、
本質的にリューら、ジャーナル・オブ・イミュノロジー
、第１２４巻、２７２８−２７３６頁（１９８０年）に
よった。抗体は、リンブロータイターチク（カリフォル
ニア州、イングルウッド、フロー・ラボラトリーズ）の
プレート中での同相試験およびエングバルおよびパール
マン、イミュノケミストリー、第８巻、８７１−８７４
頁（１９７１年）に記載されたようなパーオキシダーゼ
−抗体泡合体（カリフォルニア州、バーリンガム、ザイ
メソド・ラボラトリーズ）を使う酵素結合免疫吸着剤検
出システムを使って選択した。
プレートは、１ウエルあたり１１００ｎの精製■：Ｃ因
子または精製１０ンビン分解■：Ｃ因子でコーティング
した。クローンはまた、ｌウェルあたり１１００ｎのヒ
トフィブリノーゲンでコーティングしたプレート、１０
０ｎＨのヒトフィブロネクチンでコーティングしたプレ
ート、および１００ｎＨのヒトフォン・ビルプラント因
子でコーティングしたプレートに対してスクリーニング
した。それぞれの蛋白質は、免疫原の潜在的な不純物で
ある。
子または精製１０ンビン分解■：Ｃ因子でコーティング
した。クローンはまた、ｌウェルあたり１１００ｎのヒ
トフィブリノーゲンでコーティングしたプレート、１０
０ｎＨのヒトフィブロネクチンでコーティングしたプレ
ート、および１００ｎＨのヒトフォン・ビルプラント因
子でコーティングしたプレートに対してスクリーニング
した。それぞれの蛋白質は、免疫原の潜在的な不純物で
ある。
■二〇因子でコーティングしたプレート上でのみ陽性で
あったクローンは、また改良カスバー試験法（カスパー
ら、Ｔｈｒｏｓ＋ｂ、 Ｄｉａｔｈ、 Ｈａｅｍｏｒ
ｒｈ、 、第３４巻、８６９−８７２頁（１９７５年
）参照）を使って血漿■：Ｃ因子の活性を阻害する能力
を試験した。培養液上澄液は、等容のプールした正常な
ヒトの血漿で培養した。この血漿は、ファルチャーら、
プロシーディング・オブ・ザ・ナシコナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス、第７９巻、１６４８−１６５２頁
（１９８２年）に記載された方法で試験緩衝液に１：ｌ
Ｏまたは１：２０にうすめ、これにｐ Ｈ６，５の０．
５Ｍクエン酸ナトリウムを２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）加え
て造っておいたものである。培養は、３７℃で２時間行
い、そのあと試料の■：Ｃ因子因子プロ凝析性活性験し
た。クローンＣ５からの培養液上澄液は、対照（抗■：
Ｃ因子を含まない上澄液）の培養液に比べて７５％の残
存血漿■：Ｃ因子活性を阻害した。
あったクローンは、また改良カスバー試験法（カスパー
ら、Ｔｈｒｏｓ＋ｂ、 Ｄｉａｔｈ、 Ｈａｅｍｏｒ
ｒｈ、 、第３４巻、８６９−８７２頁（１９７５年
）参照）を使って血漿■：Ｃ因子の活性を阻害する能力
を試験した。培養液上澄液は、等容のプールした正常な
ヒトの血漿で培養した。この血漿は、ファルチャーら、
プロシーディング・オブ・ザ・ナシコナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス、第７９巻、１６４８−１６５２頁
（１９８２年）に記載された方法で試験緩衝液に１：ｌ
Ｏまたは１：２０にうすめ、これにｐ Ｈ６，５の０．
５Ｍクエン酸ナトリウムを２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）加え
て造っておいたものである。培養は、３７℃で２時間行
い、そのあと試料の■：Ｃ因子因子プロ凝析性活性験し
た。クローンＣ５からの培養液上澄液は、対照（抗■：
Ｃ因子を含まない上澄液）の培養液に比べて７５％の残
存血漿■：Ｃ因子活性を阻害した。
培養液上澄液は、市販の抗血清（インデイアナ州、エル
クハート、マイルス・ラボトリーズ・インコーポレーシ
ョン）を使ってアガロースゲル中での二重拡散によって
免疫グロブリン網および亜綱について試験された。マウ
ス腹水の蛋白質Ａ−セファロース・クロマトグラフィー
にュージャージー州、ビス力タウエー、ファーマシア・
ファインケミカルス）は、エイら、イミュノケミストリ
ー、第１５ｔ！、４７９−４３６頁（１９７８年）に記
載された方法で行った。ｔ＃！！ｌた抗体は、ｙＭ−１
（１３）１！を使って加圧限外濾過撹拌セル（マサチュ
セッッ州、デンバース、アミコン・コーポレーシヨン）
中で４１し、小分けして一７０℃で冷凍保存した。蛋白
質Ａ−セファロースで精製したモノクローナル抗体は、
改良カスパー試験法（カスパーら、Ｔｈｒｏｍｂ、 Ｄ
ｊａｔｈ、 Ｈａｅｍｏｒｒｈ。
クハート、マイルス・ラボトリーズ・インコーポレーシ
ョン）を使ってアガロースゲル中での二重拡散によって
免疫グロブリン網および亜綱について試験された。マウ
ス腹水の蛋白質Ａ−セファロース・クロマトグラフィー
にュージャージー州、ビス力タウエー、ファーマシア・
ファインケミカルス）は、エイら、イミュノケミストリ
ー、第１５ｔ！、４７９−４３６頁（１９７８年）に記
載された方法で行った。ｔ＃！！ｌた抗体は、ｙＭ−１
（１３）１！を使って加圧限外濾過撹拌セル（マサチュ
セッッ州、デンバース、アミコン・コーポレーシヨン）
中で４１し、小分けして一７０℃で冷凍保存した。蛋白
質Ａ−セファロースで精製したモノクローナル抗体は、
改良カスパー試験法（カスパーら、Ｔｈｒｏｍｂ、 Ｄ
ｊａｔｈ、 Ｈａｅｍｏｒｒｈ。
、第３４巻、８６９−８７２頁（１９７５年）参照）を
使って血崇■：Ｃ因子プロ凝析体活性を阻害する能力に
ついて試験した。
使って血崇■：Ｃ因子プロ凝析体活性を阻害する能力に
ついて試験した。
ベプチ）’ＥＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫは、またマ
ウス内でモノクローナル抗体を励起するのにも使用され
た。ペプチドＥＥ Ｉ ＤＹＤＤＴ Ｉ ＳＶＥＭＫＫ
へのモノクローナル抗体の調製のための免疫原は、ゲル
タールアルデヒドを使って担体蛋白質であるキイホール
・リンペット・ヘモシアニン（Ｋ Ｌ Ｈ）にポリペプ
チド切片を結合させることによって調製した。等重量の
ポリペプチドと担体蛋白質を燐酸塩緩衝の塩水（ＰＢＳ
ｉ−塩基性燐酸ナトリウム１．６ ｇ 、二塩基性燐酸
ナトリウム８．４ ｇ 、塩化ナトリウム６１．４ ｇ
を蒸留水に溶かして７１とする。ｐ Ｈ７，２）に溶か
し、担体蛋白質の最終濃度を溶液１ｍｌあたり２ｍｇと
した。
ウス内でモノクローナル抗体を励起するのにも使用され
た。ペプチドＥＥ Ｉ ＤＹＤＤＴ Ｉ ＳＶＥＭＫＫ
へのモノクローナル抗体の調製のための免疫原は、ゲル
タールアルデヒドを使って担体蛋白質であるキイホール
・リンペット・ヘモシアニン（Ｋ Ｌ Ｈ）にポリペプ
チド切片を結合させることによって調製した。等重量の
ポリペプチドと担体蛋白質を燐酸塩緩衝の塩水（ＰＢＳ
ｉ−塩基性燐酸ナトリウム１．６ ｇ 、二塩基性燐酸
ナトリウム８．４ ｇ 、塩化ナトリウム６１．４ ｇ
を蒸留水に溶かして７１とする。ｐ Ｈ７，２）に溶か
し、担体蛋白質の最終濃度を溶液１ｍｌあたり２ｍｇと
した。
２５％ゲルタールアルデヒドの原液２００ｍ１をＰＢ３
１３ｍｌに加えて新しいゲルタールアルデヒドの使用溶
液を調製した。つぎに、新しいゲルタールアルデヒドの
使用溶液１２４μｌを担体ペプチド溶液１． Ｏｍ １
に加えた。できた溶液を一夜室温で撹拌し、蒸留水に対
して少なくとも６時間透析して親油性化した。
１３ｍｌに加えて新しいゲルタールアルデヒドの使用溶
液を調製した。つぎに、新しいゲルタールアルデヒドの
使用溶液１２４μｌを担体ペプチド溶液１． Ｏｍ １
に加えた。できた溶液を一夜室温で撹拌し、蒸留水に対
して少なくとも６時間透析して親油性化した。
完全フロイント・アジュバント中１００μｇの免疫原の
腹膜内注射でＢａ１ｂ／ｃマウスを免疫にした。
腹膜内注射でＢａ１ｂ／ｃマウスを免疫にした。
不完全フロイント・アジュバント中１００μｇの追加免
疫を１週間の間Ｍで３遇間与えた。融合の３日前にアジ
ュバントなしに最後の２００μｇの追加免疫を与えた。
疫を１週間の間Ｍで３遇間与えた。融合の３日前にアジ
ュバントなしに最後の２００μｇの追加免疫を与えた。
約８週間あとに、肺臓を摘出し、マウス肺臓細胞をＰ３
Ｘ６５３−ＡＣ８，６５３（マウス骨髄腫細胞系）と融
合させた。
Ｘ６５３−ＡＣ８，６５３（マウス骨髄腫細胞系）と融
合させた。
Ｐ３Ｘ６５３−ΔＧ ８．６５３は、（融合の前に）ダ
ルベツコの改良イーグル培地（高グルコース）９０％と
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％から成る培地中で対数的
増殖状態に保った。推奨されている下記の補助剤を上記
培地４７５ｍ１に加え。
ルベツコの改良イーグル培地（高グルコース）９０％と
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％から成る培地中で対数的
増殖状態に保った。推奨されている下記の補助剤を上記
培地４７５ｍ１に加え。
た：グルタミン（ｌｏｏｘ）５ｍｌ、ピルビン酸ナトリ
ウム（１００ｘ）５ｍｌ、非必須アミノ酸（１００ｘ）
５ｍｌ、ペンーストレソブーフンギゾン（１００ｘ）５
ｍｌ、および８−アザグアニン６．６ Ｘ １０−３Ｍ
（５０ｘ） １０ｍ ｌ、肺臓および骨１Ｆ１１ｉ
Ｌ１の細胞は、融合の前にダルベツコの改良イーグル培
地でＦｎＳなしに、充分に洗浄した。
ウム（１００ｘ）５ｍｌ、非必須アミノ酸（１００ｘ）
５ｍｌ、ペンーストレソブーフンギゾン（１００ｘ）５
ｍｌ、および８−アザグアニン６．６ Ｘ １０−３Ｍ
（５０ｘ） １０ｍ ｌ、肺臓および骨１Ｆ１１ｉ
Ｌ１の細胞は、融合の前にダルベツコの改良イーグル培
地でＦｎＳなしに、充分に洗浄した。
細胞は、ｌ ｍ ｌの４０％ＰＥＧ１５００と１分間融
合させた。つぎに、細胞を増殖培地で１＝２に１分間で
希釈した。さらに、細胞は増殖培地で１：５に２分間で
希釈した。つぎに、細胞は９゜ＯＲＰＭで１０分間遠心
分離した。上澄液を除いて、その細胞をＨＡＴ培地に懸
濁させて選択し、９６ウエルのプレート上に置いた。Ｈ
ＡＴ培地は、ダルベツコの改良イーグル培地（高グルコ
ース）９０％、ＦＢＳ １０％およびこの二成分の４０
５ｍ１に対して下記の推奨補助剤を含むものであった。
合させた。つぎに、細胞を増殖培地で１＝２に１分間で
希釈した。さらに、細胞は増殖培地で１：５に２分間で
希釈した。つぎに、細胞は９゜ＯＲＰＭで１０分間遠心
分離した。上澄液を除いて、その細胞をＨＡＴ培地に懸
濁させて選択し、９６ウエルのプレート上に置いた。Ｈ
ＡＴ培地は、ダルベツコの改良イーグル培地（高グルコ
ース）９０％、ＦＢＳ １０％およびこの二成分の４０
５ｍ１に対して下記の推奨補助剤を含むものであった。
グルタミン（１００ｘ）５ｍｌ、ＮＣＴＣＩ０９ ５０
ｍ１．ピルビン酸ナトリウム（１００ｘ）５ｍｌ、非必
須アミノ酸（１００ｘ）５ｍｌ。
ｍ１．ピルビン酸ナトリウム（１００ｘ）５ｍｌ、非必
須アミノ酸（１００ｘ）５ｍｌ。
ペンーストレソプーフンギゾン（１００ｘ）５ｍｌ、（
ハイポキサンチン１０−”Ｍ＋チミジン１．６・ ×１
０４Ｍ）（１００ｘ）５ｍｌ、ウシ・インシュリン（２
（１３），Ｕ、／ｍ＋）（１００ｘ）５ｍｌ、オキサロ
アセテート（１０−’Ｍ） （１００Ｘ）５ｍｌ、お
よびアミノプテリン（２Ｘ１０−’Ｍ）（５０ｘ）１０
ｍｌ、選択のあと四週間、細胞を増殖培地−ＨＴ（選択
培地からアミノプテリンを除いたもの）中に保持した。
ハイポキサンチン１０−”Ｍ＋チミジン１．６・ ×１
０４Ｍ）（１００ｘ）５ｍｌ、ウシ・インシュリン（２
（１３），Ｕ、／ｍ＋）（１００ｘ）５ｍｌ、オキサロ
アセテート（１０−’Ｍ） （１００Ｘ）５ｍｌ、お
よびアミノプテリン（２Ｘ１０−’Ｍ）（５０ｘ）１０
ｍｌ、選択のあと四週間、細胞を増殖培地−ＨＴ（選択
培地からアミノプテリンを除いたもの）中に保持した。
限界希釈法でサブクローニングを行った。増殖のあった
ウェルは、ＥＬＩＳＡ法で試験した。試験プレートは、
１１００ｎ／ウエルの免疫原でコーティングした。５０
μｌの培養液上澄液を試験した。上澄液が免疫原に対し
て陽性であった細胞の入ったウェルは、１０％Ｃ０ｆｆ
１中３７℃で増殖させた。
ウェルは、ＥＬＩＳＡ法で試験した。試験プレートは、
１１００ｎ／ウエルの免疫原でコーティングした。５０
μｌの培養液上澄液を試験した。上澄液が免疫原に対し
て陽性であった細胞の入ったウェルは、１０％Ｃ０ｆｆ
１中３７℃で増殖させた。
腹水の生産のため、マウスを細胞注射の少なくとも４日
前に、０．５ ｍ ｌのプリスチンで感作した。
前に、０．５ ｍ ｌのプリスチンで感作した。
細胞は、ＦＢＳを含まない培地０．５ ｍ ｌに混ぜて
腹膜内に注射した（５Ｘ１０’／マウス）。腹水は、マ
ウスが鼓腸したときに採取した。マウス腹水中に含まれ
るモノクローナル抗体Ｊ３１Ｂ３は、ＩｇＧ−１型であ
る。
腹膜内に注射した（５Ｘ１０’／マウス）。腹水は、マ
ウスが鼓腸したときに採取した。マウス腹水中に含まれ
るモノクローナル抗体Ｊ３１Ｂ３は、ＩｇＧ−１型であ
る。
下記のマウス腹水からのモノクローナル抗体Ｊ３１Ｂ３
の蛋白質Ａセファロースによる精製は、エイら、イミュ
ノケミストリー、第１５巻、４２９−４３６頁（１９７
８年）に開示されたものの改良法である。使用量は、１
ｃｍＸ１５ｃｍのカラムで約２５−３０ｍｇのＩｇＧ−
１を結合するものであったが、非１ｇＧ蛋白質から約５
０ｍｇのＩｇＧ−１を分離できた。このカラムは、５０
ｍｇのｒｇＧ２ａも結合した。ＩｇＧ２ｂもカラムに結
合するが、ｒｇＭ、ｒｇＡおよびＩｇＢは結合しない。
の蛋白質Ａセファロースによる精製は、エイら、イミュ
ノケミストリー、第１５巻、４２９−４３６頁（１９７
８年）に開示されたものの改良法である。使用量は、１
ｃｍＸ１５ｃｍのカラムで約２５−３０ｍｇのＩｇＧ−
１を結合するものであったが、非１ｇＧ蛋白質から約５
０ｍｇのＩｇＧ−１を分離できた。このカラムは、５０
ｍｇのｒｇＧ２ａも結合した。ＩｇＧ２ｂもカラムに結
合するが、ｒｇＭ、ｒｇＡおよびＩｇＢは結合しない。
４−６ｍ１の腹水を、３０．００Ｏｒｐｍで４５分間遠
心分離した。脂質は、上部で取り除かれた。腹水に２０
重ｆｔ／容量％のしょ糖を添加すると、脂質の除去の助
けになる。０．０２％のＮａ Ｎ ｘを含むｆ４０ｍＭ
のＮ ａ Ｐ Ｏａ １１衝液（ｐＨ＝８）で腹水を２
５２５−３Ｏに希釈した。Ｂ水の希釈は、塩素イオンが
ＫｇＧの結合を阻害するのを防ぐためである。０．０２
％のＮａＮ、を含む１０ｍＭの燐酸塩緩衝塩水中で約２
ｇの蛋白質Ａセファロース（シグマ）を膨潤させＩｃｍ
径のカラムに充填した。カラムを０．０２％のＮａＮ３
を含む１４０ｍＭのＮａＰＯａｌｌ街液中で平衡化した
。カラムに０．０６−０．０８ ｍ ｌ ／分収下で希
釈腹水を負荷させた。負荷のあと、カラムを一夜４℃で
放置してＩｇＧの結合を増加させた。カラムを０．６
０．８ｍｌ／分で下記の順序で洗浄した： １）１４０ｍＭのＮａ ＰＯ４、ｐＨ８，０，２）０、
１ ＭクエンｒＩＩＮ ａ−クエン酸、ｐＨ６，０（Ｉ
ｇＧ−１溶出）、３）０．１ＭクエンＭＮａ−クエン酸
、ｐ Ｈ５，０＝夏ｇＧ２ａおよび少量の残存ＩｇＧ−
１，４）０．１Ｍクエン酸Ｎａ−クエン酸、ｐＨ４，０
（少量の残存量ｇ０２ ａ溶出）および５）０、１ Ｍ
クエン酸Ｎａ−クエン酸、ｐＨ３，０（ＩｇＧ２ｂ溶出
）、カラムをｐ Ｈ３，０の緩衝液で洗浄した後すぐに
、溶出液のＰＨが８．０になるまで０゜０２％のＮａＮ
、を含む１４０ｍＭのＮ ａ Ｐ Ｏａ緩衝液（ｐ Ｈ
８，０）で洗浄した。カラムを４℃で保存した。カラム
の洗浄中に約５ ｍ ｌの両分を捕集した。ｐＨ５，０
の両分にはＩＭ）リス−ＨＣ１（ｐ Ｈ９，０） １
ｍ ｌを加えた。
心分離した。脂質は、上部で取り除かれた。腹水に２０
重ｆｔ／容量％のしょ糖を添加すると、脂質の除去の助
けになる。０．０２％のＮａ Ｎ ｘを含むｆ４０ｍＭ
のＮ ａ Ｐ Ｏａ １１衝液（ｐＨ＝８）で腹水を２
５２５−３Ｏに希釈した。Ｂ水の希釈は、塩素イオンが
ＫｇＧの結合を阻害するのを防ぐためである。０．０２
％のＮａＮ、を含む１０ｍＭの燐酸塩緩衝塩水中で約２
ｇの蛋白質Ａセファロース（シグマ）を膨潤させＩｃｍ
径のカラムに充填した。カラムを０．０２％のＮａＮ３
を含む１４０ｍＭのＮａＰＯａｌｌ街液中で平衡化した
。カラムに０．０６−０．０８ ｍ ｌ ／分収下で希
釈腹水を負荷させた。負荷のあと、カラムを一夜４℃で
放置してＩｇＧの結合を増加させた。カラムを０．６
０．８ｍｌ／分で下記の順序で洗浄した： １）１４０ｍＭのＮａ ＰＯ４、ｐＨ８，０，２）０、
１ ＭクエンｒＩＩＮ ａ−クエン酸、ｐＨ６，０（Ｉ
ｇＧ−１溶出）、３）０．１ＭクエンＭＮａ−クエン酸
、ｐ Ｈ５，０＝夏ｇＧ２ａおよび少量の残存ＩｇＧ−
１，４）０．１Ｍクエン酸Ｎａ−クエン酸、ｐＨ４，０
（少量の残存量ｇ０２ ａ溶出）および５）０、１ Ｍ
クエン酸Ｎａ−クエン酸、ｐＨ３，０（ＩｇＧ２ｂ溶出
）、カラムをｐ Ｈ３，０の緩衝液で洗浄した後すぐに
、溶出液のＰＨが８．０になるまで０゜０２％のＮａＮ
、を含む１４０ｍＭのＮ ａ Ｐ Ｏａ緩衝液（ｐ Ｈ
８，０）で洗浄した。カラムを４℃で保存した。カラム
の洗浄中に約５ ｍ ｌの両分を捕集した。ｐＨ５，０
の両分にはＩＭ）リス−ＨＣ１（ｐ Ｈ９，０） １
ｍ ｌを加えた。
■因子のアミノ酸配列に基づくペプチドおよびこのペプ
チドの少なくとも３個のアミノ酸の逐次サブセットの、
％１因子を結合する能力あるモノクローナル抗体に、■
因子が結合するのを阻害する能力は、■因子の精製に利
用できる。すなわち、ペプチドＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤ
ＤＤＮＳがモノクローナル抗体Ｃ５の１１因子への結合
を阻害する能力は、ＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳが
■因子の活性の中和から０５を保護する試験で示された
。
チドの少なくとも３個のアミノ酸の逐次サブセットの、
％１因子を結合する能力あるモノクローナル抗体に、■
因子が結合するのを阻害する能力は、■因子の精製に利
用できる。すなわち、ペプチドＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤ
ＤＤＮＳがモノクローナル抗体Ｃ５の１１因子への結合
を阻害する能力は、ＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳが
■因子の活性の中和から０５を保護する試験で示された
。
バルビタール塩水緩衝液（ｐ Ｈ７，５６）に溶かした
ＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳの溶液（２２，５μり
および２２．５μｌのバルビタール塩水をバルビタール
塩水中５μｌのＣ５（合計ｌＯμｇ）と混合し、室温で
一夜培養した。対照としては、バルビタール塩水または
他のペプチドをＴＤＳＥＭＤＶ、ＶＲＦＤＤＤＮＳ１７
）代わりにし他ノヘプチドを２２．５μｌのバルビター
ル塩水の代わりにし、あるいは５μｍのバルビタール塩
水を０５の代わりにした。−夜培養のあと、■因子を含
む正常な血漿５０μｌをＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮ
Ｓ−Ｃ５混合物に加え、３７℃で２時間培養した。つぎ
に正常な血漿に残存する■因子活性を、ＭＬＡエレクト
ラフ００自動凝固タイマーを使って活性化部分トロンボ
プラスチン時間試験で測定した。この試験では、凝固時
間が短いほど試験混合物中に存在する■因子が多い。
ＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳの溶液（２２，５μり
および２２．５μｌのバルビタール塩水をバルビタール
塩水中５μｌのＣ５（合計ｌＯμｇ）と混合し、室温で
一夜培養した。対照としては、バルビタール塩水または
他のペプチドをＴＤＳＥＭＤＶ、ＶＲＦＤＤＤＮＳ１７
）代わりにし他ノヘプチドを２２．５μｌのバルビター
ル塩水の代わりにし、あるいは５μｍのバルビタール塩
水を０５の代わりにした。−夜培養のあと、■因子を含
む正常な血漿５０μｌをＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮ
Ｓ−Ｃ５混合物に加え、３７℃で２時間培養した。つぎ
に正常な血漿に残存する■因子活性を、ＭＬＡエレクト
ラフ００自動凝固タイマーを使って活性化部分トロンボ
プラスチン時間試験で測定した。この試験では、凝固時
間が短いほど試験混合物中に存在する■因子が多い。
代表的な実験では、バルビタール塩水（５０μ＋）と血
漿（５０μｌ）の培養で２回の試験で６６．６秒と６５
．６秒の凝固時間が得られた。これは、■因子が０５で
不活性化されないならば■因子活性の残存量を示すもの
である。もしＣ５とバルビタール塩水が血漿で培養され
たならば、２回の凝固時間は８３．４秒と８４．０秒で
あった。これは、Ｃ５による■因子の不活性化を表す、
しかし、もし１ｍＭ（ＤＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮ
Ｓを２２．５μ！含む混合物で０５が最初に培養された
場合は凝固時間は７１．１秒に減り、Ｃ５の部分的な保
ｍを示しｔ、＝、ＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳの濃
度を６ｍＭに増やすと凝固時間は６７．１秒に減りほぼ
完全なＣ５の中和を示した。
漿（５０μｌ）の培養で２回の試験で６６．６秒と６５
．６秒の凝固時間が得られた。これは、■因子が０５で
不活性化されないならば■因子活性の残存量を示すもの
である。もしＣ５とバルビタール塩水が血漿で培養され
たならば、２回の凝固時間は８３．４秒と８４．０秒で
あった。これは、Ｃ５による■因子の不活性化を表す、
しかし、もし１ｍＭ（ＤＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮ
Ｓを２２．５μ！含む混合物で０５が最初に培養された
場合は凝固時間は７１．１秒に減り、Ｃ５の部分的な保
ｍを示しｔ、＝、ＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳの濃
度を６ｍＭに増やすと凝固時間は６７．１秒に減りほぼ
完全なＣ５の中和を示した。
下記の実施例は本発明をさらに説明するものである。こ
れらの実施例は本発明の範囲を限定しようとするもので
はなく、本発明をよりよく理解するためのものである。
れらの実施例は本発明の範囲を限定しようとするもので
はなく、本発明をよりよく理解するためのものである。
ｌｌｌ上
ペブチｌ’ＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳを■因子の
精製に使用することができる。モノクローナル抗体Ｃ５
または■因子と結合しかつ■因子との結合がペプチドＴ
ＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳまたはそのサブセットで
保護できるような抗体を支持体に結合させる。代表的に
は、これはアガロースのような固相支持体であるが、他
の支持体も有効に使用できる。抗体−支持体からカラム
をｔＡ製し、■因子の源泉をこれに通した。この源泉は
血漿、血漿濃縮物、または組換えＤＮＡ法で製造した■
因子でもよい、つぎに、抗体−カラムを洗浄し、■因子
を抗体−カラムに結合させたままにしておく、つぎに、
ペプチドＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳをカラムに加
える。これで結合している■因子が追い出され、■因子
が高純度で溶出してくる。
精製に使用することができる。モノクローナル抗体Ｃ５
または■因子と結合しかつ■因子との結合がペプチドＴ
ＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳまたはそのサブセットで
保護できるような抗体を支持体に結合させる。代表的に
は、これはアガロースのような固相支持体であるが、他
の支持体も有効に使用できる。抗体−支持体からカラム
をｔＡ製し、■因子の源泉をこれに通した。この源泉は
血漿、血漿濃縮物、または組換えＤＮＡ法で製造した■
因子でもよい、つぎに、抗体−カラムを洗浄し、■因子
を抗体−カラムに結合させたままにしておく、つぎに、
ペプチドＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＤＤＮＳをカラムに加
える。これで結合している■因子が追い出され、■因子
が高純度で溶出してくる。
ペプチドＥＥ Ｉ ＤＹＤＤＴ Ｉ ＳＶＥＭＫＫに対
して培養されたモノクローナル抗体Ｊ３１Ｂ３を臭化シ
アン法でセファロース４Ｂビーズに結合させた。
して培養されたモノクローナル抗体Ｊ３１Ｂ３を臭化シ
アン法でセファロース４Ｂビーズに結合させた。
臭化シアンで活性化したセファロース４Ｂ（シグマ）を
１ｍＭのＩ（ＣＩ中で１５分間膨潤させ、つぎに３００
ｍ１のＬｍＭのＨＣＩで洗浄した。
１ｍＭのＩ（ＣＩ中で１５分間膨潤させ、つぎに３００
ｍ１のＬｍＭのＨＣＩで洗浄した。
結合緩衝液（０，２Ｍ重炭酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化
ナトリウム、ｐ Ｈ９，０）で短時間洗浄したあと、約
１ｍｌの樹脂を結合緩衝液中で５．４ ｍ ｇの精製し
たＪ３１Ｂ３モノクローナル抗体と混合した。
ナトリウム、ｐ Ｈ９，０）で短時間洗浄したあと、約
１ｍｌの樹脂を結合緩衝液中で５．４ ｍ ｇの精製し
たＪ３１Ｂ３モノクローナル抗体と混合した。
樹脂と抗体は回転器上で４℃で一夜混合した。結合は、
結合の前後での上澄液の２８０ｎｍにおける吸収の比較
によって測定した。結合樹脂は、つぎに０．２Ｍのグリ
シンを含む結合緩衝液中で同じ方法で２時間混合して残
存の活性器を保護した。
結合の前後での上澄液の２８０ｎｍにおける吸収の比較
によって測定した。結合樹脂は、つぎに０．２Ｍのグリ
シンを含む結合緩衝液中で同じ方法で２時間混合して残
存の活性器を保護した。
結合樹脂は、つぎに結合緩衝液と酢酸塩緩衝液（０，１
Ｍ＃酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４）
で交互に５回洗浄して非共有結合の抗体を除去した。つ
ぎに、結合樹脂を３Ｍのチオシアン酸ナトリウム１ｍｌ
で（０，１Ｍリシンを含む０゜０５Ｍの酢酸ナトリウム
！１街液中）予備溶出させた。このカオトロピック溶液
は、さらに非共有結合の抗体の除去を確実にした。つぎ
に、結合樹脂を洗浄し、イミダゾール緩衝塩水（０，０
２Ｍイミダゾール、０．１５ Ｍ塩化ナトリウム、０．
０２％アジ化ナトリウム、ｐ Ｈ７，０）中４℃で保存
した。
Ｍ＃酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４）
で交互に５回洗浄して非共有結合の抗体を除去した。つ
ぎに、結合樹脂を３Ｍのチオシアン酸ナトリウム１ｍｌ
で（０，１Ｍリシンを含む０゜０５Ｍの酢酸ナトリウム
！１街液中）予備溶出させた。このカオトロピック溶液
は、さらに非共有結合の抗体の除去を確実にした。つぎ
に、結合樹脂を洗浄し、イミダゾール緩衝塩水（０，０
２Ｍイミダゾール、０．１５ Ｍ塩化ナトリウム、０．
０２％アジ化ナトリウム、ｐ Ｈ７，０）中４℃で保存
した。
つぎに１．１ミリリツトルのＪ３１Ｂ３−セファロース
のカラムを構成し、イミダゾール緩衝塩水で洗浄した。
のカラムを構成し、イミダゾール緩衝塩水で洗浄した。
つぎに、米国特許筒Ｒｅ、３２（１３）１号に述べられ
ている方法に従って精製した０、９単位／ｍｌの■因子
を含む溶液２．５ ｍ ｌをこれに加えた。カラムを通
過する緩衝液中に■因子活性が見られず、すべての■因
子がカラムに結合したことを示す、つぎに、カラムをイ
ミダゾール緩衝塩水および１％ウシ血清アルブミンを含
むイミダゾール緩衝塩水で洗浄した。つぎに、１％ウシ
血清アルブミンを含むイミダゾール緩衝塩水中０．２５
モルの塩化カルシウムの溶液で■因子を溶出させた。■
因子は、二つの５００μｌの両分中にそれぞれ２．２４
単位／ｍｌおよび０．５７単位／ｍｌの濃度で溶出した
。すなわち、■因子はカラムに結合し、溶出するときに
は濃度の高い状態で出てきた０回収率はカラムに入れた
■因子の６２％であった。
ている方法に従って精製した０、９単位／ｍｌの■因子
を含む溶液２．５ ｍ ｌをこれに加えた。カラムを通
過する緩衝液中に■因子活性が見られず、すべての■因
子がカラムに結合したことを示す、つぎに、カラムをイ
ミダゾール緩衝塩水および１％ウシ血清アルブミンを含
むイミダゾール緩衝塩水で洗浄した。つぎに、１％ウシ
血清アルブミンを含むイミダゾール緩衝塩水中０．２５
モルの塩化カルシウムの溶液で■因子を溶出させた。■
因子は、二つの５００μｌの両分中にそれぞれ２．２４
単位／ｍｌおよび０．５７単位／ｍｌの濃度で溶出した
。すなわち、■因子はカラムに結合し、溶出するときに
は濃度の高い状態で出てきた０回収率はカラムに入れた
■因子の６２％であった。
上記の実験は、ペプチドＥＥ Ｉ ＤＹＤＤＴ Ｉ Ｓ
ＶＥＭＫＫに対して培養されたモノクローナル抗体が固
体のマトリックスに結合し、この状態で■因子を溶液か
ら結合させることを示している。さらに、■因子は０．
２５モルの塩化カルシウムで抗体から溶出でき、この薬
剤はきわめて温和なため活性の６２％が回収された。
ＶＥＭＫＫに対して培養されたモノクローナル抗体が固
体のマトリックスに結合し、この状態で■因子を溶液か
ら結合させることを示している。さらに、■因子は０．
２５モルの塩化カルシウムで抗体から溶出でき、この薬
剤はきわめて温和なため活性の６２％が回収された。
ペプチドＥＥＩＤＹＤＤＴＩＳＶＥＭＫＫは■因子の精
製に使用できる。モノクローナル抗体Ｊ３１Ｂ３または
アミノ酸配列ＥＥ Ｉ ＤＹＤＤＴ ＩＳＶＥＭＫＫを
持つペプチドに対して培養され■因子に結合し、■因子
への結合がペプチドＥＥＩＤＹＤＤＴ Ｉ ＳＶＥＭＫ
Ｋで保護されうる抗体を支持体に結合させる。代表的に
は、これはアガロースのような固相の支持体であるが、
他の支持体も有効に使用できる。カラムが抗体−支持体
から作られ、■因子の源泉をこれに通す、この源泉は血
漿、血漿濃縮物、または組換えＤＮＡ法で製造した〜１
因子でもよい。つぎに、抗体−カラムを洗浄し、■因子
が抗体−カラムに結合したままに残す◇つぎに・ペプチ
ドＥＥ Ｉ ＤＹＤＤＴ Ｔ ＳＶＥＭＫＫをカラムに
加える。これで■因子が追い出され高純度で溶出する。
製に使用できる。モノクローナル抗体Ｊ３１Ｂ３または
アミノ酸配列ＥＥ Ｉ ＤＹＤＤＴ ＩＳＶＥＭＫＫを
持つペプチドに対して培養され■因子に結合し、■因子
への結合がペプチドＥＥＩＤＹＤＤＴ Ｉ ＳＶＥＭＫ
Ｋで保護されうる抗体を支持体に結合させる。代表的に
は、これはアガロースのような固相の支持体であるが、
他の支持体も有効に使用できる。カラムが抗体−支持体
から作られ、■因子の源泉をこれに通す、この源泉は血
漿、血漿濃縮物、または組換えＤＮＡ法で製造した〜１
因子でもよい。つぎに、抗体−カラムを洗浄し、■因子
が抗体−カラムに結合したままに残す◇つぎに・ペプチ
ドＥＥ Ｉ ＤＹＤＤＴ Ｔ ＳＶＥＭＫＫをカラムに
加える。これで■因子が追い出され高純度で溶出する。
ンデイション
Claims (25)
- （１）そのペプチドをVIII因子の精製に使用できること
を特徴とするVIII因子のアミノ酸配列に基づくペプチド
。 - （２）VIII因子の精製のためにモノクローナル抗体また
は他の抗体を励起するのに使用できる請求項１のペプチ
ド。 - （３）VIII因子の精製のためにモノクローナル抗体また
は他の抗体からVIII因子を溶出するのに使用できる請求
項１のペプチド。 - （４）そのペプチドが下記のアミノ酸配列：【遺伝子配
列があります】 を有し、そのアミノ酸配列がVIII因子配列のアミノ酸残
基３５１−３６５のそれであることを特徴とする請求項
１、２または３のペプチド。 - （５）そのペプチドが下記のアミノ酸配列：【遺伝子配
列があります】 を有し、そのアミノ酸配列がVIII因子の配列のアミノ酸
残基１６６０−１６７４のそれであることを特徴とする
請求項１、２または３のペプチド。 - （６）請求項１、２または３のペプチドの少なくとも３
個のアミノ酸残基の逐次サブセットを含むペプチド。 - （７）請求項４のペプチドの少なくとも３個のアミノ酸
残基の逐次サブセットを含むペプチド。 - （８）請求項５のペプチドの少なくとも３個のアミノ酸
残基の逐次サブセットを含むペプチド。 - （９）組換えＤＮＡ法または合成ペプチド法によって請
求項１、２または３のペプチドを調製する方法。 - （１０）組換えＤＮＡ法または合成ペプチド法によって
請求項４のペプチドを調製する方法。 - （１１）組換えＤＮＡ法または合成ペプチド法によって
請求項５のペプチドを調製する方法。 - （１２）組換えＤＮＡ法または合成ペプチド法によって
請求項６のペプチドを調製する方法。 - （１３）組換えＤＮＡ法または合成ペプチド法によって
請求項７のペプチドを調製する方法。 - （１４）組換えＤＮＡ法または合成ペプチド法によって
請求項８のペプチドを調製する方法。 - （１５）（ａ）VIII因子のアミノ酸配列に基づくペプチ
ドまたはそのペプチドの少なくとも３個のアミノ酸の逐
次サブセットに対して励起されたモノクローナル抗体に
結合した粒子上に、組換えで製造した血漿または市販の
濃厚原料からVIII因子を吸収させ、 （ｂ）吸収されたVIII因子を溶出させ、 （ｃ）高度に精製されたVIII因子を回収する ことを特徴とするVIII因子調製の改良法。 - （１６）モノクローナル抗体が、下記のアミノ酸配列の
ペプチド； 【遺伝子配列があります】 （ただしそのアミノ酸配列はVIII因子の配列のアミノ酸
残基３５１−３６５のそれである）およびそのペプチド
の少なくとも３個のアミノ酸の逐次サブセットに対して
励起されることを特徴とする請求項１５の方法。 - （１７）モノクローナル抗体が、下記のアミノ酸配列の
ペプチド： 【遺伝子配列があります】 （ただしそのアミノ酸配列はVIII因子の配列のアミノ酸
残基１６６０−１６７４のそれである）およびそのペプ
チドの少なくとも３個のアミノ酸の逐次サブセットに対
して励起されることを特徴とする請求項１５の方法。 - （１８）（ａ）VIII因子を結合するモノクローナル抗体
に結合した粒子上に、組換えで製造した血漿または市販
の濃厚原料からVIII因子を吸収させ、 （ｂ）VIII因子のアミノ酸配列に基づくペプチドおよび
そのペプチドの少なくとも３個のアミノ酸の逐次サブセ
ットで吸収されたVIII因子を溶出させ、 （ｃ）高度に精製されたVIII因子を回収する ことを特徴とするVIII因子調製の改良法。 - （１９）工程（ｂ）に使用する溶出剤が下記のアミノ酸
配列のペプチド： 【遺伝子配列があります】 （ただしそのアミノ酸配列はVIII因子の配列のアミノ酸
残基３５１−３６５のそれである）およびそのペプチド
の少なくとも３個のアミノ酸の逐次サブセットであるこ
とを特徴とする請求項１５または１８の方法。 - （２０）工程（ｂ）に使用する溶出剤が下記のアミノ酸
配列のペプチド： 【遺伝子配列があります】 （ただしそのアミノ酸配列はVIII因子の配列のアミノ酸
残基１６６０−１６７４のそれである）およびそのペプ
チドの少なくとも３個のアミノ酸の逐次サブセットであ
ることを特徴とする請求項１５または１８の方法。 - （２１）工程（ｂ）に使用する溶出剤がVIII因子のアミ
ノ酸配列に基づくペプチドおよびそのペプチドの少なく
とも３個のアミノ酸の逐次サブセットであることを特徴
とする請求項１５の方法。 - （２２）工程（ｂ）に使用する溶出剤が塩溶液であるこ
とを特徴とする請求項１５の方法。 - （２３）塩溶液が塩化カルシウム溶液であることを特徴
とする請求項２２の方法。 - （２４）工程（ｂ）に使用する塩化カルシウム溶液の濃
度が約０．２５Ｍないし約０．５Ｍの範囲にあることを
特徴とする請求項２３の方法。 - （２５）工程（ａ）の吸収剤の粒子がアガロースである
ことを特徴とする請求項１５または１８の方法。
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|---|---|---|---|
| US12146187A | 1987-11-17 | 1987-11-17 | |
| US121461 | 1987-11-17 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01221396A true JPH01221396A (ja) | 1989-09-04 |
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|---|---|---|---|
| JP63291064A Pending JPH01221396A (ja) | 1987-11-17 | 1988-11-15 | ８因子の精製に使用するペプチド |
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|---|---|
| EP (1) | EP0317279A3 (ja) |
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| DK (1) | DK640188A (ja) |
| FI (1) | FI885301A7 (ja) |
| IL (1) | IL88309A0 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5096593A (en) * | 1989-12-21 | 1992-03-17 | Kurita Water Industries Ltd. | Separation material derived from glucomannan for blood coagulation factor, preparation and use thereof |
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- 1988-11-16 FI FI885301A patent/FI885301A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1988-11-16 DK DK640188A patent/DK640188A/da not_active Application Discontinuation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5096593A (en) * | 1989-12-21 | 1992-03-17 | Kurita Water Industries Ltd. | Separation material derived from glucomannan for blood coagulation factor, preparation and use thereof |
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| FI885301A0 (fi) | 1988-11-16 |
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