JPH06153985A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH06153985A JPH06153985A JP4328971A JP32897192A JPH06153985A JP H06153985 A JPH06153985 A JP H06153985A JP 4328971 A JP4328971 A JP 4328971A JP 32897192 A JP32897192 A JP 32897192A JP H06153985 A JPH06153985 A JP H06153985A
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 リポプロテイン結合性凝固系インヒビター
（ＬＡＣＩ）の特定部位を認識するモノクローナル抗体
の提供。 【構成】下記アミノ酸配列 で表わされるポリペプチドを認識するモノクローナル抗
体、及びそれを用いたＬＡＣＩの精製法。
（ＬＡＣＩ）の特定部位を認識するモノクローナル抗体
の提供。 【構成】下記アミノ酸配列 で表わされるポリペプチドを認識するモノクローナル抗
体、及びそれを用いたＬＡＣＩの精製法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血液凝固インヒビター
の特定部位に結合するモノクローナル抗体に関するもの
である。さらに詳しくは、組織因子インヒビター（Tiss
ue Factor Inhibitor : ＴＦＩ）、リポプロテイン結合
性凝固系インヒビター（LipoproteinAssociated Coagul
ation Inhibitor：ＬＡＣＩ）あるいは組織因子経路イ
ンヒビター（Tissue Factor Pathway Inhibitor ：ＴＦ
ＰＩ）の特定部位に結合するモノクローナル抗体に関す
るものである。
の特定部位に結合するモノクローナル抗体に関するもの
である。さらに詳しくは、組織因子インヒビター（Tiss
ue Factor Inhibitor : ＴＦＩ）、リポプロテイン結合
性凝固系インヒビター（LipoproteinAssociated Coagul
ation Inhibitor：ＬＡＣＩ）あるいは組織因子経路イ
ンヒビター（Tissue Factor Pathway Inhibitor ：ＴＦ
ＰＩ）の特定部位に結合するモノクローナル抗体に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】外因系血液凝固は、血液が組織トロンボ
プラスチン（以下、組織因子あるいはＴＦと呼ぶ）に接
触することによって開始される。組織因子（ＴＦ）は、
膜タンパク質であって、特に脳及び胎盤に多量に存在す
る。ＴＦと接触するとVII 因子またはその活性型VII ａ
因子がＴＦと複合体を形成し、ついで蛋白分解的にＸ因
子がＸａ因子に活性化される。
プラスチン（以下、組織因子あるいはＴＦと呼ぶ）に接
触することによって開始される。組織因子（ＴＦ）は、
膜タンパク質であって、特に脳及び胎盤に多量に存在す
る。ＴＦと接触するとVII 因子またはその活性型VII ａ
因子がＴＦと複合体を形成し、ついで蛋白分解的にＸ因
子がＸａ因子に活性化される。
【０００３】ＴＦによって開始する外因系血液凝固の調
節に関するこれまでの研究で、ＴＦを血清とともにイン
キュベーションするとそのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性が
抑制されることが明らかにされている。この因子の少く
とも１つは組織因子インヒビター（ＴＦＩ）あるいはリ
ポプロテイン結合性凝固系インヒビター（ＬＡＣＩ）と
定義されるものである。
節に関するこれまでの研究で、ＴＦを血清とともにイン
キュベーションするとそのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性が
抑制されることが明らかにされている。この因子の少く
とも１つは組織因子インヒビター（ＴＦＩ）あるいはリ
ポプロテイン結合性凝固系インヒビター（ＬＡＣＩ）と
定義されるものである。
【０００４】また最近の研究によれば、ＴＦは動脈硬化
巣に集積するマクロファージ（単球由来）が産生してい
ることが免疫化学的に調べられている。この産生された
ＴＦによって血液凝固系が活性化され、血小板の凝集・
血管への粘着、及びフィブリンの形成・器質化がおこ
り、動脈硬化が進展するものと考えられている。
巣に集積するマクロファージ（単球由来）が産生してい
ることが免疫化学的に調べられている。この産生された
ＴＦによって血液凝固系が活性化され、血小板の凝集・
血管への粘着、及びフィブリンの形成・器質化がおこ
り、動脈硬化が進展するものと考えられている。
【０００５】従って、ＴＦの阻害物質であるリポプロテ
イン結合性凝固系インヒビター（以下ＬＡＣＩと称す）
は、動脈硬化や血栓症との関連において、重要な役割を
行なっているものと考えられる。
イン結合性凝固系インヒビター（以下ＬＡＣＩと称す）
は、動脈硬化や血栓症との関連において、重要な役割を
行なっているものと考えられる。
【０００６】従って、ＬＡＣＩの作用機構を明らかに
し、また蛋白の構造・活性の相関を解明することができ
れば、基礎医学、臨床医学の領域において非常に重要な
意味を持つと考えられる。
し、また蛋白の構造・活性の相関を解明することができ
れば、基礎医学、臨床医学の領域において非常に重要な
意味を持つと考えられる。
【０００７】Broze らによれば、Hep Ｇ２細胞（ヒト
ヘパトーマ セルライン）が、血清（血漿）中に存在す
るＴＦＩと同様の特性を有する抑制成分を分泌すること
が示されている（Broze et al; Blood，69，150-155 (1
987)）。またＬＡＣＩについてはNature，vol,338,518-
520(1989) にアミノ酸配列及び２次構造が記載されてい
る。
ヘパトーマ セルライン）が、血清（血漿）中に存在す
るＴＦＩと同様の特性を有する抑制成分を分泌すること
が示されている（Broze et al; Blood，69，150-155 (1
987)）。またＬＡＣＩについてはNature，vol,338,518-
520(1989) にアミノ酸配列及び２次構造が記載されてい
る。
【０００８】一方モノクローナル抗体は単一の抗原決定
基に対して特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗
体を安定的に産生できるという利点から抗原蛋白質の機
能及び構造の解析あるいは免疫測定（ＥＩＡ，ＲＩＡ）
に近年、一般的に広く利用されるようになってきた。特
に生理活性を有する蛋白質の機能解析、分子解析には当
該蛋白の機能に関与する部位、または特殊な構造部位を
認識する抗体を見出すことが有力な手段となり得る。
基に対して特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗
体を安定的に産生できるという利点から抗原蛋白質の機
能及び構造の解析あるいは免疫測定（ＥＩＡ，ＲＩＡ）
に近年、一般的に広く利用されるようになってきた。特
に生理活性を有する蛋白質の機能解析、分子解析には当
該蛋白の機能に関与する部位、または特殊な構造部位を
認識する抗体を見出すことが有力な手段となり得る。
【０００９】ＬＡＣＩの特定部位を認識するモノクロー
ナル抗体については、従来報告がなかった。これは、血
液中にＬＡＣＩは微量に存在するものと考えられ、また
血液中のリポプロテインと結合性があることから、極め
て精製が困難であったためであると思われる。
ナル抗体については、従来報告がなかった。これは、血
液中にＬＡＣＩは微量に存在するものと考えられ、また
血液中のリポプロテインと結合性があることから、極め
て精製が困難であったためであると思われる。
【００１０】そこで本発明者らは、ＬＡＣＩの３個のク
ーニッツ（Kunitz）ドメインと呼ばれる構造部位に着目
し、各クーニッツドメインに対応する部分合成ペプチド
を抗原として研究を進めた結果、本発明のモノクローナ
ル抗体を見出した。
ーニッツ（Kunitz）ドメインと呼ばれる構造部位に着目
し、各クーニッツドメインに対応する部分合成ペプチド
を抗原として研究を進めた結果、本発明のモノクローナ
ル抗体を見出した。
【００１１】
【発明の構成】すなわち本発明は、ＬＡＣＩのＮ端から
２番目のクーニッツ部位（以下、Ｋ２部位と称す）のア
ミノ酸配列： Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ …［Ｉ］ のポリペプチドを認識し、結合するモノクローナル抗体
であり、血液凝固系のインヒビターであるＬＡＣＩを、
抗凝固活性を維持したまま精製することを可能とするモ
ノクローナル抗体である。
２番目のクーニッツ部位（以下、Ｋ２部位と称す）のア
ミノ酸配列： Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ …［Ｉ］ のポリペプチドを認識し、結合するモノクローナル抗体
であり、血液凝固系のインヒビターであるＬＡＣＩを、
抗凝固活性を維持したまま精製することを可能とするモ
ノクローナル抗体である。
【００１２】ここで、本明細書において、アミノ酸配列
はＩＵＰＡＣ―ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用さ
れた方法により略記するものとし、たとえば下記の略号
を用いる。
はＩＵＰＡＣ―ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用さ
れた方法により略記するものとし、たとえば下記の略号
を用いる。
【００１３】Ａｌａ Ｌ―アラニン Ａｒｇ Ｌ―アルギニン Ａｓｎ Ｌ―アスパラギン Ａｓｐ Ｌ―アスパラギン酸 Ｃｙｓ Ｌ―システイン Ｇｌｎ Ｌ―グルタミン Ｇｌｕ Ｌ―グルタミン酸 Ｇｌｙ グリシン Ｈｉｓ Ｌ―ヒスチジン Ｉｌｅ Ｌ―イソロイシン Ｌｅｕ Ｌ―ロイシン Ｌｙｓ Ｌ―リジン Ｍｅｔ Ｌ―メチオニン Ｐｈｅ Ｌ―フェニルアラニン Ｐｒｏ Ｌ―プロリン Ｓｅｒ Ｌ―セリン Ｔｈｒ Ｌ―スレオニン Ｔｒｐ Ｌ―トリプトファン Ｔｙｒ Ｌ―チロシン Ｖａｌ Ｌ―バリン
【００１４】本発明のモノクローナル抗体を用いて精製
されたＬＡＣＩは後述の実施例で示される如く、分子量
３９，０００〜４２，０００を有する。他のクーニッツ
部位を認識する抗体を用いて精製した場合は、ＬＡＣＩ
の他に挟雑蛋白が存在するが、本発明のモノクローナル
抗体を用いた場合は、単一のバンドとなる。
されたＬＡＣＩは後述の実施例で示される如く、分子量
３９，０００〜４２，０００を有する。他のクーニッツ
部位を認識する抗体を用いて精製した場合は、ＬＡＣＩ
の他に挟雑蛋白が存在するが、本発明のモノクローナル
抗体を用いた場合は、単一のバンドとなる。
【００１５】しかして本発明はまた、ヒトＬＡＣＩに対
する上記モノクローナル抗体を不溶性担体と結合させた
吸着体に、ヒトＬＡＣＩ含有混合物を接触せしめて、該
吸着体にヒトＬＡＣＩを結合せしめることを特徴とする
ヒトＬＡＣＩ含有混合物からの高い抗凝固活性を有する
ヒトＬＡＣＩの高純度な分離方法及び精製方法である。
する上記モノクローナル抗体を不溶性担体と結合させた
吸着体に、ヒトＬＡＣＩ含有混合物を接触せしめて、該
吸着体にヒトＬＡＣＩを結合せしめることを特徴とする
ヒトＬＡＣＩ含有混合物からの高い抗凝固活性を有する
ヒトＬＡＣＩの高純度な分離方法及び精製方法である。
【００１６】本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞はケーラーとミルシュタインの方法
［Kohler & Milstein; Nature: 256，495-497 (1975)］
によって得られる。
イブリドーマ細胞はケーラーとミルシュタインの方法
［Kohler & Milstein; Nature: 256，495-497 (1975)］
によって得られる。
【００１７】すなわち、前記アミノ酸配列［Ｉ］で表わ
される、ＬＡＣＩの部分合成ペプチドでマウスを免疫し
た後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と
融合させ、得られたハイブリドーマ細胞はマイクロタイ
タープレートに固定された前記ペプチドと反応する抗体
に対し、系統的に検査し、選択される。
される、ＬＡＣＩの部分合成ペプチドでマウスを免疫し
た後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と
融合させ、得られたハイブリドーマ細胞はマイクロタイ
タープレートに固定された前記ペプチドと反応する抗体
に対し、系統的に検査し、選択される。
【００１８】本発明のモノクローナル抗体はかかる新規
なハイブリドーマ細胞が産生する産生物から得られ、ヒ
トＬＡＣＩのＫ２部位に対し、特異的に作用する。
なハイブリドーマ細胞が産生する産生物から得られ、ヒ
トＬＡＣＩのＫ２部位に対し、特異的に作用する。
【００１９】本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＬＡ
ＣＩのＫ２部位に対し高度に特異的に結合する性質を有
するため、ヒトＬＡＣＩを抗凝固活性を維持したまま分
離・精製する場合、非常に有利である。すなわち、不溶
性担体に本発明におけるモノクローナル抗体の１種類を
固定化し、血液または、他のヒトＬＡＣＩ含有混合物、
あるいはそれらの粗抽出物、粗精製物及び溶液からヒト
ＬＡＣＩを吸着、分離し、適当な緩衝液（例えば、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ
７．４）で洗浄後、溶液をカオトロピックイオンを含む
溶液等（例えば３Ｍ ＮａＳＣＮ，ｐＨ７．０）に置き
換えて高活性のヒトＬＡＣＩを溶出することができる。
ＣＩのＫ２部位に対し高度に特異的に結合する性質を有
するため、ヒトＬＡＣＩを抗凝固活性を維持したまま分
離・精製する場合、非常に有利である。すなわち、不溶
性担体に本発明におけるモノクローナル抗体の１種類を
固定化し、血液または、他のヒトＬＡＣＩ含有混合物、
あるいはそれらの粗抽出物、粗精製物及び溶液からヒト
ＬＡＣＩを吸着、分離し、適当な緩衝液（例えば、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ
７．４）で洗浄後、溶液をカオトロピックイオンを含む
溶液等（例えば３Ｍ ＮａＳＣＮ，ｐＨ７．０）に置き
換えて高活性のヒトＬＡＣＩを溶出することができる。
【００２０】次に本発明におけるモノクローナル抗体を
製造する具体的方法について詳細に説明する。
製造する具体的方法について詳細に説明する。
【００２１】Ａ．抗原 本発明において用いられる抗原としては、下記式［Ｉ］ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ …［Ｉ］ で表わされるアミノ酸配列を有する合成ペプチド、特
に、該ペプチドをＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin
）などのキャリアー蛋白に結合したものが好ましい。
に、該ペプチドをＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin
）などのキャリアー蛋白に結合したものが好ましい。
【００２２】Ｂ．上記抗原によるマウスの免疫 雌Balb／ｃマウスを用いることができるが、他の系（st
rain）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画及
び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が
形成されるように選ばれるべきである。例えば、５０μ
ｇの抗原を２週間間隔でマウスの腹腔に３回免疫後、さ
らに３０μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日後に融
合のために脾臓細胞をとり出す。
rain）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画及
び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が
形成されるように選ばれるべきである。例えば、５０μ
ｇの抗原を２週間間隔でマウスの腹腔に３回免疫後、さ
らに３０μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日後に融
合のために脾臓細胞をとり出す。
【００２３】Ｃ．細胞融合 上記の如く免疫したマウスの脾臓を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対骨髄腫細
胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０8 個の脾臓細胞について０．５〜１．５mlの
融合媒体の使用が適当である。
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対骨髄腫細
胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０8 個の脾臓細胞について０．５〜１．５mlの
融合媒体の使用が適当である。
【００２４】細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は良く
知られているが、本発明ではＰ３―Ｘ６３―Ａｇ８―Ｕ
１細胞（Ｐ３―Ｕ１）［Yelton, D.F et al, Current.
Topics in Microbiology and Immunology, 81,１(1978)
参照］が好ましい。
知られているが、本発明ではＰ３―Ｘ６３―Ａｇ８―Ｕ
１細胞（Ｐ３―Ｕ１）［Yelton, D.F et al, Current.
Topics in Microbiology and Immunology, 81,１(1978)
参照］が好ましい。
【００２５】好ましい融合促進剤としては、例えば、平
均分子量１０００〜４０００のポリエチレングリコール
を有利に使用できるが、この分野で知られている他の融
合促進剤を使用することもできる。
均分子量１０００〜４０００のポリエチレングリコール
を有利に使用できるが、この分野で知られている他の融
合促進剤を使用することもできる。
【００２６】Ｄ．融合した細胞の選択 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞が混在する融合処理物を未融合の
マウス骨髄腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融
合の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週間）培養
する。培地は、薬物抵抗性（例えば８―アザグアニン抵
抗性）で未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの
（例えばＨＡＴ培地）が使用される。この選択培地中で
は未融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細
胞は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）
死滅する。これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親
細胞の腫瘍性と、親脾細胞の性質を合せ持つため、選択
培地中で生存できる。
合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞が混在する融合処理物を未融合の
マウス骨髄腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融
合の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週間）培養
する。培地は、薬物抵抗性（例えば８―アザグアニン抵
抗性）で未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの
（例えばＨＡＴ培地）が使用される。この選択培地中で
は未融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細
胞は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）
死滅する。これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親
細胞の腫瘍性と、親脾細胞の性質を合せ持つため、選択
培地中で生存できる。
【００２７】Ｅ．各容器中の抵抗の確認 かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、その培養
上清を採取し、前期式［Ｉ］の合成ペプチドに対する抗
体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immuno-Sor
bent Assay）によりスクリーニングする。
上清を採取し、前期式［Ｉ］の合成ペプチドに対する抗
体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immuno-Sor
bent Assay）によりスクリーニングする。
【００２８】Ｆ．目的の抗体を産生するハイブリドーマ
細胞のクローン化 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化した後、抗体は２つ
の異なった方法で産生させることができる。その第１の
方法によれば、ハイブリドーマ細胞を一定時間適当な培
地で培養することにより、その培養上清からそのハイブ
リドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を得ること
ができる。第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は
同質遺伝子、または半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に
注射することができる。一定時間後の宿主動物の血液中
及び腹水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモ
ノクローナル抗体を得ることができる。
細胞のクローン化 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化した後、抗体は２つ
の異なった方法で産生させることができる。その第１の
方法によれば、ハイブリドーマ細胞を一定時間適当な培
地で培養することにより、その培養上清からそのハイブ
リドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を得ること
ができる。第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は
同質遺伝子、または半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に
注射することができる。一定時間後の宿主動物の血液中
及び腹水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモ
ノクローナル抗体を得ることができる。
【００２９】Ｇ．ヒトＬＡＣＩ含有混合物からのヒトＬ
ＡＣＩの分離・精製 本発明のヒトＬＡＣＩに対するモノクローナル抗体を不
溶性担体に固定化または結合させて吸着体を得る。その
際使用される不溶性担体としては、モノクローナル抗体
を用いた測定試薬または測定用キットの基材として一般
的に使用されるものであればよい。例えば材質としてセ
ファローズ、ポリアクリルアミド、セルロース、デキス
トラン、またはマレイン酸ポリマーあるいはこれらの混
合物が好ましく用いられる。これら不溶性担体の形態と
しては、粉末状、粒状、ペレット状、ビーズ状、繊維状
など種々の形態であることができる。また一般に血漿、
またはその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹
状のくぼみを有するプレート（ウエル）を用いることが
有利である。
ＡＣＩの分離・精製 本発明のヒトＬＡＣＩに対するモノクローナル抗体を不
溶性担体に固定化または結合させて吸着体を得る。その
際使用される不溶性担体としては、モノクローナル抗体
を用いた測定試薬または測定用キットの基材として一般
的に使用されるものであればよい。例えば材質としてセ
ファローズ、ポリアクリルアミド、セルロース、デキス
トラン、またはマレイン酸ポリマーあるいはこれらの混
合物が好ましく用いられる。これら不溶性担体の形態と
しては、粉末状、粒状、ペレット状、ビーズ状、繊維状
など種々の形態であることができる。また一般に血漿、
またはその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹
状のくぼみを有するプレート（ウエル）を用いることが
有利である。
【００３０】前記吸着体を用い、これにヒトＬＡＣＩ含
有混合物を接触せしめると、該吸着体に固着したモノク
ローナル抗体とヒトＬＡＣＩとが結合して、結果的にヒ
トＬＡＣＩが該吸着体に結合する。かくすることにより
ヒトＬＡＣＩを分離または除去することが可能である。
有混合物を接触せしめると、該吸着体に固着したモノク
ローナル抗体とヒトＬＡＣＩとが結合して、結果的にヒ
トＬＡＣＩが該吸着体に結合する。かくすることにより
ヒトＬＡＣＩを分離または除去することが可能である。
【００３１】また前記の如くしてヒトＬＡＣＩを吸着体
に結合させ、出来れば残余の混合物を洗浄して除去し、
次いで吸着体に結合したヒトＬＡＣＩをカオトロピック
イオン（ＳＣＮ- ）等を含む適当な溶液と接触または洗
滌すると、ヒトＬＡＣＩは該吸着体から離脱し、これを
単離することによって抗凝固活性を有するヒトＬＡＣＩ
を単離することができる。
に結合させ、出来れば残余の混合物を洗浄して除去し、
次いで吸着体に結合したヒトＬＡＣＩをカオトロピック
イオン（ＳＣＮ- ）等を含む適当な溶液と接触または洗
滌すると、ヒトＬＡＣＩは該吸着体から離脱し、これを
単離することによって抗凝固活性を有するヒトＬＡＣＩ
を単離することができる。
【００３２】かくして前記本発明の分離法によれば、ヒ
トＬＡＣＩを含有する混合物からのヒトＬＡＣＩの除
去、該混合物からのヒトＬＡＣＩの分離及び精製、該混
合物中のヒトＬＡＣＩの含有量の測定などが極めて簡単
な操作で達成される。
トＬＡＣＩを含有する混合物からのヒトＬＡＣＩの除
去、該混合物からのヒトＬＡＣＩの分離及び精製、該混
合物中のヒトＬＡＣＩの含有量の測定などが極めて簡単
な操作で達成される。
【００３３】以下、実施例により本発明を更に詳しく説
明する。
明する。
【００３４】
【実施例１】合成ペプチド―ヘモシアニン（ＫＬＨ）複合体の作製 ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin ）０．３mgと合成
ペプチド［アミノ酸配列；Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ］１mgを
０．５mlの蒸留純水に溶解した。この溶液にＥＤＣＩ
（１―ethyl ―３― (３―dimethylaminopropyl)carbod
iimide―ＨＣｌ）３０mgを加え、遮光して室温で１晩反
応させた。反応液を蒸溜水２リットルに対して充分に透
析した。かくして合成ペプチド結合ＫＬＨ溶液（約０．
６mg／ml濃度）を得た。該溶液を抗原として免疫に用い
た。
ペプチド［アミノ酸配列；Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ］１mgを
０．５mlの蒸留純水に溶解した。この溶液にＥＤＣＩ
（１―ethyl ―３― (３―dimethylaminopropyl)carbod
iimide―ＨＣｌ）３０mgを加え、遮光して室温で１晩反
応させた。反応液を蒸溜水２リットルに対して充分に透
析した。かくして合成ペプチド結合ＫＬＨ溶液（約０．
６mg／ml濃度）を得た。該溶液を抗原として免疫に用い
た。
【００３５】
【実施例２】マウスの免疫 実施例１で得られた合成ペプチド結合ＫＬＨ溶液（０．
６mg／ml）０．５mlと完全フロインド アジュバント
（Complete Freund´s Adjuvant）０．５mlとを連結し
た２本の注射筒を用いて混合し、この混合液を２匹のマ
ウスの腹腔に０．５mlずつ投与した。
６mg／ml）０．５mlと完全フロインド アジュバント
（Complete Freund´s Adjuvant）０．５mlとを連結し
た２本の注射筒を用いて混合し、この混合液を２匹のマ
ウスの腹腔に０．５mlずつ投与した。
【００３６】２週間後に、同様にマウスの腹腔に上記混
合液を０．５mlずつ投与した。続いて４週間後に合成ペ
プチド結合ＫＬＨ溶液（０．６mg／ml）０．５mlと不完
全フロインド アジュバント（Incomplete Freund´s A
djuvant）０．５mlとを混合し、この混合液を上記マウ
スの腹腔に０．５mlずつ投与した。４週間後に合成ペプ
チド結合ＫＬＨ溶液５０μｇ／１００μｌを上記２匹の
マウスに静脈内投与し、その３日後に脾臓を摘出し、以
下、実施例３に示すように細胞融合を行なった。
合液を０．５mlずつ投与した。続いて４週間後に合成ペ
プチド結合ＫＬＨ溶液（０．６mg／ml）０．５mlと不完
全フロインド アジュバント（Incomplete Freund´s A
djuvant）０．５mlとを混合し、この混合液を上記マウ
スの腹腔に０．５mlずつ投与した。４週間後に合成ペプ
チド結合ＫＬＨ溶液５０μｇ／１００μｌを上記２匹の
マウスに静脈内投与し、その３日後に脾臓を摘出し、以
下、実施例３に示すように細胞融合を行なった。
【００３７】
【実施例３】細胞融合及び目的とするモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞の選択と取得 摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（Ｐ３Ｕ１）とを約６：１の割合で混合し、５０％ポリ
エチレングリコール１５４０を融合促進剤として細胞融
合を行なった。融合後の細胞は１×１０6 cells ／mlの
細胞濃度となるように１０％牛血清を含むＲＰＭＩ １
６４０培地に懸濁し、９６ウエル マイクロプレートに
１ウエルあたり１００μ１ずつ分注した。
ハイブリドーマ細胞の選択と取得 摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（Ｐ３Ｕ１）とを約６：１の割合で混合し、５０％ポリ
エチレングリコール１５４０を融合促進剤として細胞融
合を行なった。融合後の細胞は１×１０6 cells ／mlの
細胞濃度となるように１０％牛血清を含むＲＰＭＩ １
６４０培地に懸濁し、９６ウエル マイクロプレートに
１ウエルあたり１００μ１ずつ分注した。
【００３８】ハイブリドーマ（融合細胞）は、ＣＯ2 イ
ンキュベーター（５％ＣＯ2 ，３７℃）中で培養し、ヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地
（ＨＡＴ培地）で培地交換を行ない、ＨＡＴ培地中で増
殖させて、脾臓細胞と骨髄腫細胞からなるハイブリドー
マのスクリーニングを行った。
ンキュベーター（５％ＣＯ2 ，３７℃）中で培養し、ヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地
（ＨＡＴ培地）で培地交換を行ない、ＨＡＴ培地中で増
殖させて、脾臓細胞と骨髄腫細胞からなるハイブリドー
マのスクリーニングを行った。
【００３９】ハイブリドーマの培養上清中の抗体は、前
記合成ペプチドを吸着させたマイクロタイタープレート
を用い、ＥＬＩＳＡ法により検出した。抗体産生陽性ウ
エルのうちハイブリドーマの増殖能、及び前記合成ペプ
チドに対する結合性の強い、８ウエルについて限界希釈
法によるクローニングを２回繰り返して行なった。ＥＬ
ＩＳＡ法により、抗体産生能が高く抗原結合性が強いモ
ノクローン４個を選別した。得られたクローンは、１０
％ＤＭＳＯを含む９０％牛血清溶液中に懸濁させ、液体
窒素中に保存した。各クローンの産生するモノクローナ
ル抗体は、クローンをBalb／ｃマウスの腹腔内で増殖さ
せ、その腹水からプロテインＡ―セファロース４Ｂカラ
ムを用いて精製した。
記合成ペプチドを吸着させたマイクロタイタープレート
を用い、ＥＬＩＳＡ法により検出した。抗体産生陽性ウ
エルのうちハイブリドーマの増殖能、及び前記合成ペプ
チドに対する結合性の強い、８ウエルについて限界希釈
法によるクローニングを２回繰り返して行なった。ＥＬ
ＩＳＡ法により、抗体産生能が高く抗原結合性が強いモ
ノクローン４個を選別した。得られたクローンは、１０
％ＤＭＳＯを含む９０％牛血清溶液中に懸濁させ、液体
窒素中に保存した。各クローンの産生するモノクローナ
ル抗体は、クローンをBalb／ｃマウスの腹腔内で増殖さ
せ、その腹水からプロテインＡ―セファロース４Ｂカラ
ムを用いて精製した。
【００４０】
【実施例４】精製モノクローナル抗体のクラスの決定 マウス腹水から精製した各クローンのＩｇＧについてオ
クタロニー法によりサブクラスを選定した。
クタロニー法によりサブクラスを選定した。
【００４１】
【表１】 ２Ｇ９Ｆ１はＫ２合成ペプチドに対して強い結合性を示
す抗体であった。２Ｇ９Ｅ９、２Ｇ９Ｆ１及び２Ｇ９Ｇ
８は同一エピトープを認識した。２Ｇ９系と２Ｃ１Ｂ１
とは異なるエピトープを認識した。
す抗体であった。２Ｇ９Ｅ９、２Ｇ９Ｆ１及び２Ｇ９Ｇ
８は同一エピトープを認識した。２Ｇ９系と２Ｃ１Ｂ１
とは異なるエピトープを認識した。
【００４２】
【実施例５】ヒト肝細胞（Hep Ｇ２）無血清培養上清からのモノクロ
ーナル抗体カラムによるＬＡＣＩの精製 実施例４記載のモノクローナル抗体２Ｇ９Ｆ１ ５mgを
ブロムシアン（ＣＮＢｒ）活性化セファロース（ファル
マシア（株））にカップリングさせ、抗体セファロース
カラム２．５mlを作製した。続いてヒト肝細胞（Hep Ｇ
２）の無血清培養上清（ＩＴＥＳ―ｅＲＤＦ培地）１リ
ットルを該カラムに４０ml／時間の流速で通し、接触せ
しめた。０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Tween ２０及
び１０Ｕ／mlアプロチニンを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ―
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２００mlでカラムを洗浄後、３Ｍ
ＮａＳＣＮ（ｐＨ７．０）１５mlでカラムに吸着した
蛋白を溶出した。溶出した画分の総蛋白量は、約３０μ
ｇであった。
ーナル抗体カラムによるＬＡＣＩの精製 実施例４記載のモノクローナル抗体２Ｇ９Ｆ１ ５mgを
ブロムシアン（ＣＮＢｒ）活性化セファロース（ファル
マシア（株））にカップリングさせ、抗体セファロース
カラム２．５mlを作製した。続いてヒト肝細胞（Hep Ｇ
２）の無血清培養上清（ＩＴＥＳ―ｅＲＤＦ培地）１リ
ットルを該カラムに４０ml／時間の流速で通し、接触せ
しめた。０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Tween ２０及
び１０Ｕ／mlアプロチニンを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ―
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２００mlでカラムを洗浄後、３Ｍ
ＮａＳＣＮ（ｐＨ７．０）１５mlでカラムに吸着した
蛋白を溶出した。溶出した画分の総蛋白量は、約３０μ
ｇであった。
【００４３】該蛋白０．３μｇを２―メルカプトエタノ
ールで還元処理後、１０〜２０％（グラジエント）ゲル
濃度のＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲルに適用し、電気
泳動を行なった。泳動後のゲルは、銀染色法により蛋白
を検出した。その結果、モノクローナル抗体２Ｇ９Ｆ１
（Ｋｄ＝０．８×１０-9Ｍ）を用いてヒト肝細胞セルラ
イン（Hep Ｇ２）培養上清（無血清）から単離したＬＡ
ＣＩは、分子量が３９，０００〜４２，０００の蛋白物
質であった。結果をまとめて図１に示す。
ールで還元処理後、１０〜２０％（グラジエント）ゲル
濃度のＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲルに適用し、電気
泳動を行なった。泳動後のゲルは、銀染色法により蛋白
を検出した。その結果、モノクローナル抗体２Ｇ９Ｆ１
（Ｋｄ＝０．８×１０-9Ｍ）を用いてヒト肝細胞セルラ
イン（Hep Ｇ２）培養上清（無血清）から単離したＬＡ
ＣＩは、分子量が３９，０００〜４２，０００の蛋白物
質であった。結果をまとめて図１に示す。
【００４４】
【比較例１】第１及び第３のクーニッツ部位（Ｋ１及び
Ｋ３）を認識するモノクローナル抗体の製造は、下記ア
ミノ酸配列を有する合成ペプチドを用い、実施例１〜４
の手順に準拠して行った。
Ｋ３）を認識するモノクローナル抗体の製造は、下記ア
ミノ酸配列を有する合成ペプチドを用い、実施例１〜４
の手順に準拠して行った。
【００４５】Ｋ１認識モノクローナル抗体作成用ポリペ
プチド： 配列： Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ
プチド： 配列： Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ
【００４６】Ｋ３認識モノクローナル抗体作成用ポリペ
プチド： 配列： Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ かくして得られたモノクローナル抗体を用いて、実施例
５に準拠して電気泳動した結果を同様に図１に示す。用
いられた抗体の特性は下記の通りである。
プチド： 配列： Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ かくして得られたモノクローナル抗体を用いて、実施例
５に準拠して電気泳動した結果を同様に図１に示す。用
いられた抗体の特性は下記の通りである。
【００４７】抗Ｋ１抗体：２Ｆ２ Ｄ９，Ｋｄ＝１．０
×１０-9Ｍ（Ｈ鎖：γ2b，Ｌ鎖：κ） 抗Ｋ３抗体：２Ａ１ Ｈ８，Ｋｄ＝１．０×１０-9Ｍ
（Ｈ鎖：γ2b，Ｌ鎖：κ）
×１０-9Ｍ（Ｈ鎖：γ2b，Ｌ鎖：κ） 抗Ｋ３抗体：２Ａ１ Ｈ８，Ｋｄ＝１．０×１０-9Ｍ
（Ｈ鎖：γ2b，Ｌ鎖：κ）
【００４８】
配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｃｙｓ 1 5 Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ10 15 Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ 20
【図１】モノクローナル抗体カラムによって精製したＬ
ＡＣＩのＳＤＳ―ポリアクリルアミド電気泳動の結果及
び分子量を示したものである。
ＡＣＩのＳＤＳ―ポリアクリルアミド電気泳動の結果及
び分子量を示したものである。
レーン 分子量マーカー（上から９７Ｋ，６６Ｋ，６
２Ｋ，３０Ｋ，２０Ｋ，１４Ｋである） レーン Ｋ１認識抗体で精製したＬＡＣＩ（２μｇ） レーン 本発明のＫ２認識抗体で精製したＬＡＣＩ
（２μｇ） レーン Ｋ３認識抗体で精製したＬＡＣＩ（２μｇ）
のパターン
２Ｋ，３０Ｋ，２０Ｋ，１４Ｋである） レーン Ｋ１認識抗体で精製したＬＡＣＩ（２μｇ） レーン 本発明のＫ２認識抗体で精製したＬＡＣＩ
（２μｇ） レーン Ｋ３認識抗体で精製したＬＡＣＩ（２μｇ）
のパターン
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１１月２０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】符号の説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【符号の説明】 レーン 分子量マーカー（上から９７Ｋ，６６Ｋ，４
２Ｋ，３０Ｋ，２０Ｋ，１４Ｋである） レーン Ｋ１認識抗体で精製したＬＡＣＩ（２μｇ） レーン 本発明のＫ２認識抗体で精製したＬＡＣＩ
（２μｇ） レーン Ｋ３認識抗体で精製したＬＡＣＩ（２μｇ）
のパターン
２Ｋ，３０Ｋ，２０Ｋ，１４Ｋである） レーン Ｋ１認識抗体で精製したＬＡＣＩ（２μｇ） レーン 本発明のＫ２認識抗体で精製したＬＡＣＩ
（２μｇ） レーン Ｋ３認識抗体で精製したＬＡＣＩ（２μｇ）
のパターン
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｋ 99:00 8318−4Ｈ
Claims (4)
- 【請求項１】 アミノ酸配列 Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ のポリペプチドを認識し、結合するモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】 リポプロテイン結合性凝固系インヒビタ
ー（Lipoprotein Associated Coagulation lnhibitor：
ＬＡＣＩ）のＮ端から２番目のクーニッツ部位を認識
し、結合するモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 組織因子阻害活性と血液凝固Ｘａ因子阻
害活性とを有する蛋白物質を認識し結合する請求項１記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 上記第１，２及び３項のいずれかのモノ
クローナル抗体を不溶性担体に結合させた吸着体に、ヒ
トＬＡＣＩ含有混合物を接触せしめ、該吸着体にヒトＬ
ＡＣＩを結合せしめることを特徴とするヒトＬＡＣＩ含
有混合物からのヒトＬＡＣＩの分離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4328971A JPH06153985A (ja) | 1992-11-16 | 1992-11-16 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4328971A JPH06153985A (ja) | 1992-11-16 | 1992-11-16 | モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153985A true JPH06153985A (ja) | 1994-06-03 |
Family
ID=18216166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4328971A Pending JPH06153985A (ja) | 1992-11-16 | 1992-11-16 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06153985A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110318356A1 (en) * | 2008-12-22 | 2011-12-29 | Novo Nordisk A/S | Antibodies Against Tissue Factor Pathway Inhibitor |
| US8450275B2 (en) | 2010-03-19 | 2013-05-28 | Baxter International Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| US8466108B2 (en) | 2008-12-19 | 2013-06-18 | Baxter International Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| US8481030B2 (en) | 2010-03-01 | 2013-07-09 | Bayer Healthcare Llc | Optimized monoclonal antibodies against tissue factor pathway inhibitor (TFPI) |
| JP2014511685A (ja) * | 2011-04-01 | 2014-05-19 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシー | 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対するモノクローナル抗体 |
| US8962563B2 (en) | 2009-12-21 | 2015-02-24 | Baxter International, Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
-
1992
- 1992-11-16 JP JP4328971A patent/JPH06153985A/ja active Pending
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8466108B2 (en) | 2008-12-19 | 2013-06-18 | Baxter International Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| US9873720B2 (en) | 2008-12-19 | 2018-01-23 | Baxalta GmbH | TFPI inhibitors and methods of use |
| US9777051B2 (en) | 2008-12-19 | 2017-10-03 | Baxalta GmbH | TFPI inhibitors and methods of use |
| JP2015178495A (ja) * | 2008-12-22 | 2015-10-08 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 組織因子経路阻害因子に対する抗体 |
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| US8652471B2 (en) | 2008-12-22 | 2014-02-18 | Novo Nordisk A/S | Methods of treating coagulopathies using antibodies against tissue factor pathway inhibitor |
| JP2012513377A (ja) * | 2008-12-22 | 2012-06-14 | ノヴォ・ノルディスク・アー／エス | 組織因子経路阻害因子に対する抗体 |
| US20110318356A1 (en) * | 2008-12-22 | 2011-12-29 | Novo Nordisk A/S | Antibodies Against Tissue Factor Pathway Inhibitor |
| US8361469B2 (en) * | 2008-12-22 | 2013-01-29 | Novo Nordisk A/S | Antibodies against tissue factor pathway inhibitor |
| US8962563B2 (en) | 2009-12-21 | 2015-02-24 | Baxter International, Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| US8481030B2 (en) | 2010-03-01 | 2013-07-09 | Bayer Healthcare Llc | Optimized monoclonal antibodies against tissue factor pathway inhibitor (TFPI) |
| USRE47150E1 (en) | 2010-03-01 | 2018-12-04 | Bayer Healthcare Llc | Optimized monoclonal antibodies against tissue factor pathway inhibitor (TFPI) |
| US9309324B2 (en) | 2010-03-01 | 2016-04-12 | Bayer Healthcare Llc | Optimized monoclonal antibodies against tissue factor pathway inhibitor (TFPI) |
| US9556230B2 (en) | 2010-03-19 | 2017-01-31 | Baxalta GmbH | TFPI inhibitors and methods of use |
| US8450275B2 (en) | 2010-03-19 | 2013-05-28 | Baxter International Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| US9018167B2 (en) | 2010-03-19 | 2015-04-28 | Baxter International Inc. | TFPI inhibitors and methods of use |
| US10201586B2 (en) | 2010-03-19 | 2019-02-12 | Baxalta GmbH | TFPI inhibitors and methods of use |
| JP2018172411A (ja) * | 2011-04-01 | 2018-11-08 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシーＢａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ | 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対するモノクローナル抗体 |
| JP2014511685A (ja) * | 2011-04-01 | 2014-05-19 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシー | 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対するモノクローナル抗体 |
| JP2021019619A (ja) * | 2011-04-01 | 2021-02-18 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシーＢａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ | 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対するモノクローナル抗体 |
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