JPH01225482A - アミノペプチダーゼ及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、新規なアミノペプチダーゼ及びその製造方
法、該酵素を生産する微生物、該酵素又は該微生物を使
用するＤ−アミノ酸の製造法、並びに該酵素又は該微生
物を使用するアミノ酸Ｎ−置換アミドの製造法に関する
。Ｄ−アラニンアルキルアミドは、人工甘味料の合成原
料として有用である（特公昭６１−９３２０明細書）。

〔従来の技術〕

アミノペプチダーゼとは、ペプチドのＮ末端よりアミノ
酸を順次遊離するエキソペプチダーゼのことをいう（（
ＥＣ３，４，１１，）　　ｒ酵素ハンドブック」、ｐ、
５３１−５３６、朝倉書店１９８２）、アミノペプチダ
ーゼは、通常、Ｌ−アミノ酸よりなるペプチドにＬ立体
特異的に作用してＬ−アミノ酸を遊離する。

それらのうちＤ−アミノ酸をＮ末端とするペプチドに非
立体特異的に作用するアミノペプチダーゼもわずかに知
られているが、一般にその反応速度はＬ−アミノ酸より
なるペプチドに対する反応速度よりはるかに遅い。

ロビンソンら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋２０２、１（１９５３）
）　、ホプスら（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏ−ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、　
１１４．５６７（１９６６））、ミナミウラら（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｅｒａ＋ｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏ−ｇｙ、　３３．６５３（１９６９））、プ
ランスコツトら（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ＋　７５＋　１８５（１９７４））は、各種
生物由来のアミノペプチダーゼが、Ｌ−アミノ酸からな
るペプチドに作用するのみならず、Ｄ−アミノ酸をＮ末
端とするペプチドに対してもわずかに作用することを報
告しているが、これらは、Ｄ−アミノ酸からなるペプチ
ドにのみ特異的に作用するアミノペプチダーゼではない
。

チイエリーら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａ５ｉｃ　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＋５、２９９（１９８６））は
、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　）属細菌の産生ずるアシルアミド・アミドヒドロラ
ーゼ（ＥＣ３，５，１，４）がＤ−アラニンアミドにも
作用することを報告しているが、Ｄ立体特異的な加水分
解ではない。又、この酵素はアミノペプチダーゼではな
い。

特開昭５７−１３０００、特開昭５９−１５９７８９、
特開昭６０−３６４４６、特開昭６２−５５０９７、特
開昭６２−２５３３９７には、各種微生物によるＤＬ−
アミノ酸アミド又は、Ｌ−アミノ酸アミドの、対応する
し一アミノ酸への酵素的加水分解法が記載されているが
、酵素化学的見地から、いかなる酵素が関与しているの
かについて記載されていない、又、Ｄ−アミノ酸アミド
含有物のＤ立体特異的な加水分解については全く記載さ
れていない。

特開昭６１−９６９８９はロドコッカス・エリスロポリ
ス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　　ｅｔ旦肚並虹ｎ）菌体
によるＤ−アラニンアミド、Ｄ−バリンアミド、Ｄ−ア
ミノ酪酸アミド、Ｄ−ロイシンアミド、Ｄ−セリンアミ
ド、又はＤ−スレオニンアミドを対応するＤ−アミノ酸
へ酵素的に加水分解する方法を特許請求し、実施例にお
いては、Ｄ−アラニンアミド、Ｄ−バリンアミドおよび
Ｄ−ロイシンアミドを対応するＤ−アミノ酸へ酵素的に
加水分解する方法を記載しているが、酵素化学的見地か
ら、いかなる酵素が関与しているのかについて記載され
ていない、又、Ｄ−アミノ酸アミド含有物のＤ立体特異
的な加水分解については全く記載されていない。

特開昭６１−２７４６９０には、シュードモナス・フロ
ーレツセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓ　）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ
ｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒ　ｔｈｒｏ　ｏｌｉｓ）　、
及び、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　
　ｍｅｒｃｅｓｃｅｎｓ）菌体によるＤ−メチオニンア
ミド、Ｄ−グルタミンアミド、Ｄ−スレオニンアミド、
Ｄ−ロイシンアミド、Ｄ−フェニルアラニンアミド、Ｄ
−チロシンアミド、およびＤ−バリンアミドのそれぞれ
対応するＤ−アミノ酸への加水分解法が記載されている
が、酵素化学的見地からいかなる酵素が関与しているの
かについて記載されていない。又、記載されている加水
分解反応はＤ−アミノ酸アミドを原料とするものであり
、Ｄ−アミノ酸アミドとＬ−アミノ酸アミドとの混合物
のＤ立体特異的な加水分解については全く記載されてい
ない。

特公昭６１−６８には、Ｄ−アミノ酸を含むオリゴペプ
チドに作用するストレプトマイセス属に属する放線菌由
来のＤ−アミノ酸ペプチダーゼの製造法が記されている
が、本酵素はペプチドのＣ末端に作用するカルボキシペ
プチダーゼ様酵素であって、Ｄ−アミノ酸に特異的なア
ミノペプチダーゼではない。

従って、Ｄ−アミノ酸誘導体に特異的なアミノペプチダ
ーゼは従来全く知られておらず、又、該酵素を用い、Ｄ
−アミノ酸アミド含有物を原料としてＤ立体特異的な加
水分解を行い、Ｄ−アミノ酸を合成する方法については
全く知られていない。

酵素あるいは微生物を用いてＤ−アミノ酸を合成する方
法は、ストレプトマイセス属に属する放線菌由来のＤ立
体特異的なアミノ酸アシラーゼを用いてＮ−アセチルＤ
Ｌ−アミノ酸を光学分割し、Ｄ−フェニルグリシンやＤ
−バリンを合成する方法（それぞれ、特公昭５３−３６
０３５及び特開昭６３−３９５９８）、ヒダントイン化
合物のシュードモナス属細菌によるＤ立体特異的加水分
解による方法（特公昭５６−１９１１）　、α−ケト酸
を原料としてＤ−アミノ酸トランスアミナーゼとアミノ
基供与体再生系を利用するＤ−アラニンを除くＤ−アミ
ノ酸の合成方法（特開昭６２−２０５７９０）等が゛挙
げられる。

しかしながら、Ｄ−アミノ酸アミド含有物を原料とし、
Ｄ−アミノ酸アミドに特異的な酵素を用いてＤ−アミノ
酸を合成する方法は全く知られていない。

ところで、ペプチドの合成は化学合成法によるものが主
であるが、保護基を必要とする、ラセミ化及び副反応が
起きやすい等の問題点を有している。一方、近年、ペプ
チダーゼ、プロテアーゼ等のアミド結合加水分解酵素を
触媒として用い、逆反応条件でペプチド合成を行う技術
が開発されている。酵素によるペプチド結合合成反応は
反応条件が温和であり、化学合成法が有する上記の問題
点を回避することができる優れた方法である。

酵素法によるペプチド合成法は、これまでトリプシン、
α−キモトリプシン、ペプシン、パパイン、サーモライ
シン、ズブチリシン、プロナーゼ等のエンドペプチダー
ゼや、エキソペプチダーゼであるカルボキシペプチダー
ゼ等を用いてきた。

酵素によるペプチド合成の重要な方法として、ペプチド
結合の加水分解の逆反応及び、アミノ酸アルキルエステ
ルのアミツリシス法が挙げられるが、いずれの合成法に
おいても、基質の酸部分となるアミノ酸誘導体のアミノ
基はことごとく保護されていなければならなかった。一
方、ペプチドのＮ末端よりアミノ酸を順次遊離するエキ
ソペプチダーゼであるアミノペプチダーゼをペプチド合
成に利用する研究は従来知られていなかった。

Ｄ−アミノ酸は天然には稀なアミノ酸である。

天然の蛋白は、Ｌ−アミノ酸から出来ており、従って、
それらの加水分解酵素をペプチド結合合成反応に用いる
手法はＬ−アミノ酸からなるペプチド合成法として発達
してきた。既知の蛋白質加水分解酵素を用いる、Ｄ−ア
ミノ酸を含むペプチドの合成反応が報告されている。例
えば、モリハラら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、　８４．１２７７（１９７８））は、
Ｚ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−ロイシンアミドのα−
キモトリプシンの触媒による合成法を示した。それ以来
、ストイネバとベトコツ（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、　
１８３．１０３（１９８５））、ウェストとウォング（
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓ
Ｌｒｙ、　５Ｌ　２７２８（１９８６））、パルバスと
ウォング（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
５ｏｃｉｅｔｙ＋Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｎ
ｃａｔｉｏｎｓ、　１９８７１５３３）％マルゴリンと
クリバッフ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ
　ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、　１０９．３８０
２（１９８７））　、マトスら（Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　９．２３３（１９８７））
は、α−キモトリプシンあるいはリパーゼを触媒として
用いるＤ−アミノ酸を含むペプチドの合成法を記載して
いる。しかし、これらのエンドペプチダーゼを用いる合
成法は、ことごとく酸部分のアミノ酸誘導体のアミノ基
が保護された化合物を基質としており、そのアミノ基が
遊離である化合物を基質とする合成については全く記載
されていない。又、これらの合成では、Ｄ−アミノ酸は
アミン部分に含まれており、本発明とは異なる。

マルゴリンら、（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｔｃ
ａｎ　ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、　１０９．７
８８５（１９８７））には、Ｎ−ホルミルＤ−アラニン
２−クロロエチルエステルヲ酸部分とし、Ｄ−アラニン
アミド等をアミン部分とするズブチリシンを触媒とする
合成を報告している。

しかしながら、これらの報告にあるＤ−アミノ酸アミド
の酵素的合成法においては、ことごとく酸部分に保護基
を必要としており、本発明とは異なる。又、酸部分にＤ
Ｌ−アミノ酸誘導体を用い、立体選択的なアミツリシス
によるＤ−アミノ酸アミド合成法は知られていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明は、今まで存在することが全く知られてい
なかったＤ−アミノ酸誘導体に特異的なアミノペプチダ
ーゼ、該酵素の新規な製造方法、該酵素を利用するＤ−
アミノ酸の新規な製造法、並びに該酵素を用いて、酸部
分のアミノ酸誘導体を立体選択的にＤ−アミノ酸アミド
に導く新規なり一アミノ酸アミドの製造法を提供しよう
とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、該酵素を生産する新規な微生物及び該酵
素の新規な製造方法を開発するために、Ｄ−アミノ酸誘
導体に特異的に作用するアミノペプチダーゼ活性を有す
る菌株を広範囲にスクリーニングしたところ、多くの細
菌が新規なり一アミノ酸アミノペプチダーゼを生産する
ことを見出した。

従って本発明は、Ｄ−アミノ酸誘導体に特異的に作用す
ることを特徴とするアミノペプチダーゼ；アミノペプチ
ダーゼを生産する細菌を培養し、この培養物から前記酵
素を採取することを特徴とする前記酵素の製造方法；前
記酵素又は該酵素の含有物を下でＤ−アミノ酸誘導体に
作用させてＤ−アミノ酸を生成せしめ、該Ｄ−アミノ酸
を採取することを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法；
並びに前記酵素又は該酵素の含有物の存在下でＤ−アミ
ノ酸誘導体とアミンとを反応せしめてＤ−アミノ酸Ｎ−
置換アミドを生成せしめ、これを採取することを特徴と
するＤ−アミノ酸Ｎ−置換アミドの製造方法を提供する
ものである。

〔具体的な説明〕

」上と微±１ 本発明において使用する微生物としてはＤ−アミノ酸に
特異的なアミノペプチダーゼを生産ができるものであれ
ばよく、このような微生物は保存菌のなかから選択する
ことができる場合もあり、また自然界から分離すること
ができる。

このような微生物としては、保存菌株中に見出されたア
クロモバクタ−・シクロクラスラス（Ａｃｈｒｏｍｏｂ
ａｃｔｅｒ　ｃ　ｃｌｏｃｌａｓｔｅｓ）　ＩＡＭ　１
０２３、アクロモバクタ−・プリカッラス（Ａｃｈｒｏ
ｍｏｂａｃｔｅｒｄｅｌｉｃａｔｕｌｕｓ　）　ＩＡＭ
　１４３３、フラボバクテリウム・ム・スアベロレンズ
（Ｆ、　　５ｕａｖｅｒｏｌｅｎｓ）　ＩＦＯ３７５２
、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅ
ｕｓ）　ＩＦＯ３００１、バシルス・スフエリカス（Ｂ
、　　肛匝肛圏ｕ）ＩＦＯ３３４１、バシルス・スフエ
リカスＩＦＯ３５２７、バシルス・チアミノリティカス
（肩エ　旦凰社赳江ｔｉｃｕｓ）　ＩＡＭ　１０３４　
、バシルス・ステアロサーモフィラス（Ｂ、　　ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）　ＩＦＯ１２５５０
ｓミクロコツカス８０ゼウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ
　　ｒｏｓｅｕｓ）ＩＰｏ　３７６Ｂ、ミクロコツカス
・ｓ　ｐ　、（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ、）　５Ｃ
ＲＣ４１４、コリネバクテリウム・スベドニカム（−如
ｍ助ａｃｔｅｒ土明　且皿並に憇）　　ＩＦＯ３３０６
、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ姐匹紅匹ｓａ）　ＩＦＯ３０８０、シュードモナ
ス・プチダＩＦＯ１２６５３（Ｐ、　　匹旦組）、プロ
タミノバクタ−０ルーバー（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃ
ｔｅｒ　　ｒｕｂｅｒ　）　ＩＦＯ３７０８、マイコバ
クテリウム・スメグマヂス（」１丑肋坦μｍ岨　↓」邊
ａｔｉｓ　）　ＩＦＯ３０８２、ストレプトマイセス・
グリセオラス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ■１ｓｅｏｌ
ｕｓ　）　ＩＦＯ３４０３、及びストレプトマイセス・
フルビシムス（Ｓ　ｔｒｅ　ｔｏｗ　ｃｅｓ　　ｆｕｌ
ｖｉｓｓｉｍｕｓ　）ＩＦｏ　１３４８２を挙げること
ができる。これらの保存菌はそれぞれ前記の寄託番号の
もとにＩＦＯ又はＩＡＭから自由に入手することができ
る。

セルロモナスに属する微生物としてはセルロモナスｓ　
ｐ　、　５ＣＲＣ６３１（京都大学農学部保存菌ＡＫＵ
−６７６、ヤマダら、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎ
ｄ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　４６
．２３２５．１９８２より入手）を挙げることができる
。セルロモナスｓ　ｐ　、　５ＣＲＣ６３１が工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第９９１δ号（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−’１　’ｌ　ｌ　８）として寄託されてい
る。ミクロコツカスに属する微生物としてはミクロコツ
カスｓ　ｐ　、　５ＣＲＣ４１４（京都大学農学部保作
画ＡＫＵ−５１０，オカダら、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌ　ａｎｄＢｔｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
＋　ｓｏ、　１７６＋　１９６６より入手）を挙げるこ
とができる。ミクロコツカスＳｐ。

５ＣＲＣ４１４が工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第９？１７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−？’７　／　７
）として寄託されている。

アクロモバクタ−に属する微生物としては、例えば本発
明者により分離された新菌株アクロモバクタ−ｓ　ｐ　
、　５ＣＲＣＣ１−３８、アクロモバクタ−ｓｐ。

５ＣＲＣＣ１−１６、アクロモバクタ−ｓ　ｐ　、　５
ＣＲＣＣ１−１７を挙げることができる。これらの菌株
の菌学的性質は非常に近似しており、これらの代表株と
して９９／６＞　として寄託されている。アルスロバク
タ−に属する微生物としては、例えば本発明者により分
離された新菌株アルスロバクタ−ｓｐ。

５ＣＲＣＣ２−９、アルスロバクタ−ｓ　ｐ　、　５Ｃ
ＲＣＮ１−３１を挙げることができる。これらの菌株の
菌学的性質は非常に近似しており、これらの代表株とじ
てアルスロバクタ−ｓ　ｐ　、　５ＣＲＣＮ１−３１が
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第９ｑノ
５号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９７ｉ　ｆ）として寄託されてい
る。

これらの菌株の分離源はいずれも神奈川県相模市である
。

前記の新規な菌株は第１表に示すような菌学的性質を有
する。

以下余白 上記の国学的性質に基づきチエスターとクーパー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ、　９＋　４２５（１９７９）　）及び、Ｍ
ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ４ｔｈ　ｅｄ、、　ｐ　３３０、（１９８５
）の記述に従って、前記５ＣＲＣＣ１−３８，５ＣＲＣ
Ｃ１−１６，５ＣＲＣＣ１−１７の菌株を次のように同
定した。すなわち、ダラム陰性、胞子の生成無し、短桿
菌、運動性、好気的、オキシダーゼ陽性、及びグルコー
スからの酸の生成無し。

このような性質からアクロモバクタ−属に属する細菌で
あることが明らかである。一方、Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓＭ
ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ　１ｓｔ　ｅｄ−＋Ｖｏ１．２．、　ｐ
　１２６６の分類基準に従って５ＣＲＣＣ２−９及び５
ＣＲＣＮ１−３１を次の様に同定した。すなわち、ダラ
ム陽性、コリネホルム型、非運動性、好気性、カタラー
ゼ陽性、ペプチドグリカンにリジンが含まれるミコール
酸陰性。このような性質からアルスロバクタ−属に属す
る細菌であることが明らかである。

なお、これらの菌株に変異を生じさせて一層生産性の高
い菌株を得ることもできる。また、これらの菌株の細胞
中に存在するアミノペプチダーゼの生産に関与する遺伝
子を切り出し、これを適切なベクター例えばプラスミド
に挿入し、このベクターを用いて適当な宿主、例えばエ
ッシェリッヒき同種宿主を形質転換することにより、本
発明のアミノペプチダーゼ生産株を人為的に創成するこ
ともできる。

（２）　　、の１′　法 前記の微生物を培養して本発明のアミノペプチダーゼを
製遺しようとする場合、基礎栄養培地として、この発明
の微生物が増殖し得るものであればいずれを使用しても
よい。この培地は、窒素源として例えば硫安、酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類を含有
する。また、この培地には必要に応じて炭素源としてグ
ルコース、澱粉、グリセリン等を加えることができる。

この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム、塩化
ナトリウム、硫酸マグネシュウム等を加えることが好ま
しい。また、酵素の誘渾物質となりうる少量のＤ−アミ
ノ酸アミドを添加することも好ましい。Ｄ−アミノ酸ア
ミドの添加料は基礎培地の組成、培養する菌株の性質に
より異なるが、およそ０．０１〜５％である。

培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いてもよいが
、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、振
盪培養、通気・撹拌培養等により好気的条件下で培養を
行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、アミノペ
プチダーゼが生産される温度範囲内であればいずれの温
度でも良いが、好ましくは２５〜４５℃である。ｐＨは
５〜１１、好ましくは６〜１０の範囲である。培養時間
は酵素活性が発現される時間を選べば良いが好ましくは
６〜７２時間である。

次に得られた培養物から本発明のアミノペプチダーゼが
採取されるが、精製法として通常の酵素精製法を用いる
ことが出来る。遠心分離等によって、粗酵素を得、さら
にこれに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプトマイシンを
加えて処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー等を行ない、さらに硫酸アンモニウム等の塩やポリ
エチレングリコール等の添加による結晶化等の公知の方
法によって均一の結晶酵素標品を単離することが出来る
。

この方法において使用されるアミノペプチダーゼの使用
形態は特に限定されない０例えば、精製された酵素を使
用することができるのは無論のこと、細胞を含有する培
養液、培養生菌体、アセトン等によって脱水処理された
風乾菌体、菌体破砕物、種々の段階まで精製された部分
精製物を使用することが出来る。さらにこれらの酵素ま
たは酵素含有物をポリアクリルアミド、光架橋性樹脂、
ポリウレタン樹脂、カッパカラギーナン、アルギン酸ナ
トリウム、イオン交換樹脂、半透膜、高分子酵素修飾剤
等により固定化したものを使用することが出来る。

のゞ 本発明においては次の方法により力価を測定した。トリ
ス−ＨＣｌ（＋）Ｈ８，０）　５０．１７＋１０１　、
　Ｄ−アラニンアミド５μｍｏｌ　ｓ及び適当料のサン
プルを０．５ｔｎ１になるように混合し、３０℃におい
て１０分間反応せしめた後、沸騰水中に３分間浸して反
応を停止し、生成したＤ−アラニンを以下の方法によっ
て定量した。すなわち、上記反応液０．５−に、フェノ
ール１０．６μｍｏｌ　％　４−アミノアンチピリン０
．７９μｍ１１０１　％パーオキシダーゼ５単位を加え
て、１．５−とし、３０℃において５分間保温した後、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを０．１４単位加えて１．６
−とし、３７℃において６０分間振盪した。

これを沸騰水中に３分間浸して反応を停止し、５００ｎ
ｍにおける吸光度を測定して、検量線より反応液中のＤ
−アラニン量を求めた。１分間当り１μｍｏｌのＤ−ア
ラニンを生成する酵素量を１単位とした。

Ｄ−アラニン−ｐ−ニトロアニリドを基質とするアミノ
ペプチダーゼ活性は次のように測定した。

すなわち、Ｄ−アラニン−ｐ−ニトロアニリド１０μｍ
ｏｌ、リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１００μｍｏｌ及び
酵素を含む反応液１＠ｌを３０℃において１０分間保温
した後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定して、ｐ−ニ
トロアニリンの吸光系数から反応液中のＤ−アラニン量
を求めた。一方し−アラニンアミドに対する酵素活性は
、次のように測定した。すなわち、Ｌ−アラニンアミド
５μｌｌｌ０１、トリス−塩酸（ｐＨ８，０）　５０μ
ｔａｏｌ　、、及び酵素を含む反応液０．５−を３０℃
において１０分間保温した後、沸騰水中に３分間浸して
反応を停止し、生成したし一アラニンを以下の方法によ
って定量した。すなわち、グリシン−ＭＣＩｌ　−ＫＯ
Ｈ（ｐＨ１０，４）　１００μｍｏｌ。

ＮＡＤ”　２．５　μｍｏｌ　％上記反応液及びＬ−ア
ラニン脱水素酵素０．５単位を含む反応液１ｍｊを３０
℃において５分間保温し、生成したＮＡＤＨに由来する
３４０ｎｍにおける吸光度の増加を分光光度計により測
定して、検量線より反応液中のし一アラニン量を求めた
。１分間当り１μｍｏｌのＬ−アラニンを生成する酵素
量を１単位とした。

」］ユ」１ト閃１貫 本発明のアミノペプチダーゼの１例として、５ＣＲＣＣ
１−３８により生産されるアミノペプチダーゼは次の性
質を有する。

（１）作用：次式に示す反応を触媒する。

Ｄ−アミノ酸アミド＋Ｈ，０ 一−→　Ｄ−アミノ酸十ＮＨ。

（２）基質特異性：本酵素は、Ｄ−アラニンアミドを最
も良好な基質とする。Ｎ末端が遊離であるＤ−アラニン
とアンモニアとのアミド及び、Ｄ−アラニンと各種アル
キルアミンとのアミド、Ｄ−アラニンのエステル、並び
に、ペプチド等が基質となる。この１例を次の第２表に
示す。

以下余白 第一」ニー表 基質特異性 基　　　質　　　　　　　　相対活性 （３）至適ｐＨ：　ｐＨ８，５付近が至適である。

（４）　　ｐ）Ｉ安定性：各ｐＨの緩衝液（０，０５Ｍ
）中、３０℃にて１時間保温した後の残存活性を測定し
た場合、ｐＨ７，０〜１０．０付近が安定である。

（５）至適温度：４５℃付近における活性が最大である
。

（６）温度安定性：　０．　Ｉ　Ｍ　Ｉ７７酸緩衝液（
ｐＨ８，０）中、各温度において１０分間処理した後の
残存活性を測定したところ、４５℃で８０％の活性が残
存していた。

（７）吸収スペクトル：　２７８ｎｍに極大吸収を有す
る。

（８）　　金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金
属イオン及びＰＣＭＢ等のＳＨ阻害剤によって活性が阻
害される。

（９）等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合、約４．２である。

ａＯ分子量：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫＧ３
０００ＳＷ）により約１２２，０００と算出される。

αＤ　サブユニットの分子量：　５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により約５９．０００と算出される
。

亜　均一性：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫＰｈ
ｅｎｙｌ−５Ｐ讐）により第５図Ａに示す如く単一のピ
ークを与える。また、ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（１０，０％、ｐＨ７，２）により第１図に示
す如く単一のバンドを与える。

（５）Ｄ−アミノ　の１′ 本発明はまた、Ｄ−アミノ酸の製造方法を提供する。こ
の方法においては、アミノペプチダーゼ、又はそれを含
有する物を使用してＤ−アミノ酸の誘導体をＤ−アミノ
酸に転損し、このＤ−アミノ酸を採取する。

本発明のアミノペプチダーゼは次の反応：（Ｄ−アミノ
酸誘導体）　　　　（Ｄ−アミノ酸）（Ｉ） を触媒することができ、この反応を利用してＤ−アミノ
酸誘導体からＤ−アミノ酸を製造することができる。

本発明の方法はＤ−アラニンの製造のために最も効果的
に利用することができるが、Ｄ−２−アミノ酪酸、Ｄ−
バリン、Ｄ−ノルバリン、Ｄ−フェニルグリシン、Ｄ−
ホモフェニルアラニン等の製造のためにも適用すること
ができる。

基質としてのＤ−アミノ酸誘導体として、前記反応式（
Ｉ）中のＸの種類に応じて、Ｄ−アミノ酸アミド、Ｎ−
置換Ｄ−アミノ酸アミド、Ｄ−アミノ酸エステル、Ｎ−
末端がＤ−アミノ酸であるペプチド等を使用することが
できる。Ｎ−置換Ｄ−アミノ酸の置換基の代表的なもの
としては低級アルキル基、例えばメチル基、エチル基、
プロピル基等が挙げられ、従って基質としてＤ−アミノ
酸Ｎ−低級アルキルアミド、例えばＤ−アミノ酸−Ｎ−
メ、チルアミド、−Ｎ−エチルアミド、−Ｎ−プロピル
アミド等を使用することができる。さらに、Ｎ−置換基
として芳香族基を含有する基を有する誘導体、その他第
２表に示した種々のアミドを使用することができる。基
質エステルとしては、例えばＤ−アミノ酸のα−カルボ
キシル基が低級アルカノールによりエステル化されたも
の、例えばメチルエステル、エチルエステル、プロピル
エステル等を使用することができる。基質ペプチドとし
ては、Ｄ−アミノ酸−Ｇｌｙ　、　Ｄ−アミノ酸−Ｄ　
−Ａｌａ　−Ｄ　−Ａｌａ　、　Ｄ−アミノ酸−Ｌ　−
Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ等、第２表に示した種々のペプチド
を使用することができる。

しかしながら、Ｄ−アミノ酸を工業的に製造するために
は安価な基質を用いることが好ましく、このためにはＮ
−非置換Ｄ−アミノ酸アミド、例えばＤ−アラニンアミ
ド、Ｄ−２−アミノ酪酸アミド等を用いるのが好ましい
。本発明に用いられるＤ−アミノ酸アミドは、例えば、
公知の方法に従ってそれぞれのＤ−アミノ酸メチルエス
テルを合成し、続いて、アンモニアガスと反応せしめる
か、あるいは、ストレッカー決により合成したα−アミ
ノニトリルを化学的あるいは酵素的に水和して得ること
ができる。また、ＤＬ−アミノ酸アミドの酵素による光
学分割の際に副生ずるＤ−アミノ酸アミドを用いること
もできる。

原料としては前記のＤ−アミノ酸誘導体のみならず、Ｄ
−アミノ酸誘導体とＤ−アミノ酸誘導体。

とのＬ−アミノ酸誘導体との混合物を使用することもで
きる。この混合物を使用する場合、本発明の方法によれ
ば、Ｄ−アミノ酸誘導体が立体特異的にＤ−アミノ酸に
転換され、Ｄ、Ｌ−アミノ酸誘導体混合物を原料として
立体異性的に純粋なり一アミノ酸を容易に製造すること
ができる。

本発明の方法においては、反応触媒としてアミノペプチ
ダーゼ又はその含有物を使用する。ここで、アミノペプ
チダーゼとは、前記のごとき基質にＤ立体異性的に作用
してＤ−アミノ酸を生成する酵素を意味し、アミノペプ
チダーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ
、アシダーゼ、アミラーゼ、等と通称されるものを含む
。この様な酵素として、前記のごとき微生物により生産
される酵素を挙げることができる。しかしながら、本発
明の方法においては、純粋に単離された酵素のほかに、
アミノペプチダーゼの酵素活性を有する任意の材料を使
用することができる。この様な酵素活性材料として、例
えば前に挙げた微生物のブロス、すなわち培養菌体と培
地との混合物、分離された培養菌体、培養上清、菌体処
理物等を使用することができる。菌体処理物としては、
乾燥菌体、アセトン、エタノールのごとき溶剤で処理さ
れた乾燥菌体、菌体破砕物、酵素の製造方法の項（２）
で記載した酵素の精製過程の任意の段階で得られる部分
精製物、等が挙げられる。また、前記の菌体又は種々の
菌体処理物を常用の酵素固定化法により固定した固定化
酵素品を使用することもできる。固定化担体は、ポリア
クリルアミド、光架橋性樹脂、ポリウレタン樹脂、カッ
パカラギーナン、アルギン酸ナトリウム、イオン交換樹
脂、高分子酵素修飾剤、あるいは半透膜等を用いること
ができる。

工業的な実施にあたっては、生菌体、固定化菌体等を用
いるのが有利である。

反応液中のアミノペプチダーゼの量は基質、例えばＤ−
アミノ酸アミドの濃度等によって異なり特に限定されな
いが、通常１〜１００，０００単位とするのが便利であ
る。

原料のＤ−アミノ酸誘導体、例えばアミドの添加量は、
反応液中の前記酵素の濃度等により異なり、反応を阻害
しない程度であれば特に限定されないが、１〜５００ｇ
／ｊ２とするのが便利である。

低濃度で使用する場合には遊離塩基の形で使用すること
ができるが、比較的高濃度で使用する場合には例えば、
塩酸塩やトシル酸塩等の形で使用するのがｐｉｔ調整の
観点から好ましい。Ｄ−アミノ酸誘導体もしくはその含
有物又はその塩はバッチ式反応においては反応開始時に
一度に添加することもでき、又反応の進行と共に複数回
に分割して、もしくは連続的に添加することもできる。

反応媒体としては、水、アセトン、アセニトリル、ＤＭ
ＳＱ　、　ＤＭＦ等を含む緩衝作用を有する水溶液を用
いることができる。緩衝液としては、例えば、トリス−
ＨＣβ緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール＝ＨＣ１緩
衝液、ＨＥＰＥＳ　−Ｎａ０１１緩衝液、ＴＲＩＣＩＮ
Ｅ−ＮａＯＨ緩衝液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリ
ウム緩衝液、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液等を使用すること
ができる。また、ケトン、エーテル、炭化水素、芳香族
オレフィン、ハロゲン化炭化水素、有機酸エステル、ア
ルコール、ニトリル等水と混合しない有機溶媒をも用い
ることもできる０例えば、メチルブチルケトン、イソプ
ロピルエーテル、石油エーテル、ヘキサン、ヘプタン、
シクロヘキサン、四塩化炭素、クロロフォルム、二塩化
メチレン、トリクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キ
シレン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、ヘキサ
ノール、オクタツール等を水と共存させて使用すること
ができる。また、それらの有機溶媒の混合物を使うこと
もできるし、水を飽和させた有機溶媒、緩衝作用を有す
る水溶液との二層系あるいは、ミセル、逆ミセル、エマ
ルジョンとして反応させることもできる。

反応のｐＨとしては、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６
〜１０とする。

反応の温度も反応のｐＨと同様に考えることができるが
、通常は２０〜６０℃、好ましくは２５〜５０℃である
。

反応時間は、特に限定されないが、反応混合物の基質濃
度、酵素力価等、に依存して基質Ｄ−アミノ酸アミド含
有物が充分な収率でＤ−アミノ酸に転換されるまで反応
を維持する。

生成したＤ−アミノ酸は任意に常法によって精製採取す
ることができる。例えば、反応終了後に、トリクロロ酢
酸を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体（存在する場合に
は）と共に濾過し、濾液からイオン交換樹脂等により精
製し、結晶化する。

（６）Ｄ−アミノ　Ｎ−アミドのＵ合法本発明はさらに
、Ｄ−アミ人酸Ｎ−置換アミドの製造方法を提供する。

この方法においては、アミノペプチダーゼ又はそれを含
有する物の存在下でＤ−アミノ酸の誘導体とＮ−置換ア
ミンとを反応せしめることによりＤ−アミノ酸Ｎ−置換
アミドを生成せしめ、これを採取する。

本発明のアミノペプチダーゼは次の可逆反応：（ｎ） を触媒することができ、この反応を利用してＤ−アミノ
酸Ｎ−置換アミドを製造することができる。

この方法は、Ｄ−アラニンＮ−置換アミドの製造のため
に最も効果的に利用することができるが、Ｄ−アミノ酸
部分が例えばＤ−２−アミノ酪酸、Ｄ−バリン、Ｄ−ノ
ルバリン、Ｄ−フェニルグリシン等であるＤ−アミノ酸
Ｎ−置換アミドの製造のためにも使用することができる
。

基質であるＤ−アミノ酸誘導体としては、Ｄ−アミノ酸
の製造方法（５）において記載したＤ−アミノ酸誘導体
を使用することができ、反応性の観点から、Ｄ−アミノ
酸のエステル、例えばメチルエステル、エチルエステル
、プロビルエステル等が好ましい。基質原料としては、
前記のごときＤ−アミノ酸誘導体を使用することができ
、またこれらのＤ−アミノ酸誘導体とＬ−アミノ酸誘導
体との混合物を使用することができる。Ｄ、Ｌ−混合物
を使用する場合、酵素がＤ立体特異的に作用して、Ｄ−
アミノ酸Ｎ−置換アミドが選択的に生成する。

もう一方の基質であるアミンとしては、−級炭素、二級
炭素又は三級炭素にアミノ基が結合したアミンが使用さ
れる。Ｎ−置換基としてはアルキル基、シクロアルキル
基、シクロアルキル−アルキル基、アリール基、アラル
キル基、複素環基等が挙げられる。アルキル基は例えば
直鎖又は分岐鎖のアルキル基、例えばメチル基、エチル
基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソ
ブチル基、３−ペンチル基等を包含する、炭素原子数１
〜．２０個のアルキル基であることができる。

またシクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シ
クロヘキシル基等が挙げられる。シクロアルキル−アル
キル基としては、例えばジシクロプロピルメチル基、フ
ェンチル基、ｔ−ブチルシクロプロピルメチル基等が挙
げられる。また、アリール基としては、例えばフェニル
基が挙げられ、アラルキル基としてはベンジル基が挙げ
られる。

複素環基としては例えばテトラヒドロチオフェン−３−
イル基、チエクン−３−イル基、テトラメチル−１，１
−ジオキソエタン−３−イル基等が挙げられる。これら
の基はさらに他の置換基により置換されていてもよい。

この方法において使用する酵素又はその含有物としては
、Ｄ−アミノ酸の製造方法（５）において記載した種々
の形態のものを使用することができる。

反応媒体としては、Ｄ−アミノ酸の製造方法（５）にお
いて記載した種々の媒体を使用することができる。Ｄ−
アミノ酸Ｎ−置換アミド合成反応においては基質のアミ
ノ酸エステルや生成物のＤ−アミノ酸Ｎ−置換アミドが
、酵素的、非酵素的に加水分解を受ける可能性があるの
で、水の存在を極力少なくした方がよく、有機溶媒中で
の反応が特に望ましい。

基質であるＤ−アミノ酸誘導体及びアミンの添加量は、
反応液中の前記酵素の濃度等により異なり、反応を阻害
しない程度であれば特に限定されないが、１〜５００ｇ
／ｊ！とするのが便利である。

低濃度で使用する場合には遊離塩基の形で使用すること
ができるが、比較的高濃度で使用する場合には例えば、
塩酸塩、やトシル酸塩等の形で使用するのがｐＨ調整の
観点から好ましい、基質は、バッチ式反応においては反
応開始時に一度に添加することもでき、又反応の進行と
共に複数回に分割して、もしくは連続的に添加すること
もできる。

反応のｐＨとしては、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐ）１
６〜１０とする。

反応の温度も反応のｐＨと同様に考えることができるが
、通常は２０〜６０℃、好ましくは２５〜５０℃である
。

反応時間は、特に限定されないが、反応混合物の基質濃
度、酵素力価等に依存して基質アミノ酸アミドあるいは
アミノ酸エステルが充分な収率でＤ−アミノ酸Ｎ−置換
アミドに転換されるまで反応を維持する。

生成したＤ−アミノ酸Ｎ−置換アミドは任意に常法によ
って精製採取することができる。例えば、反応終了後に
、菌体や固定化した酵素剤（存在する場合には）を濾過
し、濾液中に含まれるＤ−アミノ酸Ｎ−置換アミドを溶
媒抽出やイオン交換樹脂等により精製し、結晶化する。

次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。

グルコース０．１％、トリプトン０．５％、酵母エキス
０．５％、ＫＪＰＯｔ　０．１％を含有し、ｐＨ７，０
に調製した培地１０リツターを１２０℃、１５分間加熱
殺菌した。これにアクロモバクタ−ｓ　ｐ　．ＳＣＲＣ
Ｃ１−３８（微工研菌寄第タクｌ乙号）を接種し、３０
℃で約１８時間振とう培養して湿重量約９０ｇの菌体を
得た。菌体を生理的食塩水で洗浄した後、０．１　ｍＭ
　ＥＤＴＡ及び５　ＭＭ　２−メルカプトエタノ−ルを
含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）３００−に懸濁し、９
　ＫＨｚにおける超音波処理を約２０分（計約２．５時
間）行ない菌体を破砕した。破砕菌体は１４，０００Ｘ
ｇ、２０分間の遠心分離で除去し、アミノペプチダーゼ
を含む素抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン
硫酸を３．８ｇ加えて、３０分撹拌した後、１４，００
０ｘ　ｇ、２０分間の遠心分離で沈澱を除去した。この
上清に固形硫酸アンモニウムを加え３０％硫酸アンモニ
ウム飽和とした。３０分撹拌の後、生成した沈澱を１４
．０００Ｘ　ｇで２０分間の遠心分離で除去した。この
上清に固形硫酸アンモニウムを加え９０％硫酸アンモニ
ウム飽和とした。１４，０ＯＯＸ　ｇで２０分間の遠心
分離で得られる、酵素活性を有する沈澱を少量の０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、さらに０．
１ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含む０．ＯＩＭ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で透
析した。この酵素液をあらかじめ０．１　ｍＨのＥＤＴ
Ａ及び５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＤＢＡＥ
−１−ヨパール６５０Ｍのカラムに通過させ、０．１　
ａ＋ＭのＥＤＴＡ、　５　ｍＭの２−メルカプトエタノ
ール、及び０．１　ＭのＭａｃｅを含む０．ＯＩＭＩＪ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出した。活性区分を集め
、０．１　ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプト
エタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロ
キシアパタイトのカラムに通過させ、０．１　ｍＭのｆ
！ＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む
０．０１Ｍから０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の
直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。この活性区分を
集め、３０％飽和となるように硫安を加えた後、あらか
じめ０．１ｍＭのＥＤＴＡ、　５　ｍＭの２−メルカプ
トエタノール、及び３０％飽和の硫安を含む０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したブチルトヨバ
ールのカラムに通過させ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５
ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む３０％から０％
飽和の硫安を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）の直線的な濃度勾配で酵゛素を溶出させた。

活性区分を集め、０．１　ｎ＋ＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭ
の２−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で透析後、約３−に濃縮し、０．１
ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプトエタノール
及び０、１　Ｍ　ＮａＣｊ＋を含む０．０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したセファデックスＧ−２
００によるゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。こ
うして、アミノペプチダーゼを約４．４００倍に精製し
た。この精製課程における比活性及び回収率を第３表に
示す。

１、　無細胞抽出液　　　　３３９　　６２４０　　　
　０．０５４３２、　プロタミン処理　　　４３５　　
６Ｂ５０　　　　０．０６３５３、硫安分画（３０−９
０％）　　３４４　　４９７０　　　　０．０６９２４
、　　ＤＥＡＥ−１−ヨパール　　２９９　　　３０４
　　　　　０．９８４この酵素はＰｈｅｎ、ｙ−５ＰＷ
カラムクロマトグラフイーにより単一のピークを与え（
第１図）、及び５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動において均一であることが証明された（第２図）。

グルコース０．１％、トリプトン０．５％、酵母エキス
０．５％、ＫＪＰＯ４０，１％を含有し、ｐＨ７，０に
調製した培地２０リツターを１２０℃、１５分間加熱殺
菌した。これにアクロモバクタ−ｓｐ．ＳＣＲＣＣ１−
３８（微工研菌寄第り９／６号）を接種し、３０℃で約
１８時間振とう培養して湿重量約１８６ｇの菌体を得た
。菌体を生理的食塩水で洗浄した後、０．１　ｎ＋Ｍ　
ＥＤＴＡ及び５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含むリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）３００−に懸濁し、９　ＫＨ
ｚにおける超音波処理を約２０分（計約５時間）行ない
菌体を破砕した。破砕菌体は１４．ＯＯＯＸｇ、２０分
間の遠心分離で除去し、アミノペプチダーゼを含む素抽
出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を７．
６ｇ加えて、３０分撹拌した後、１４，０ＯＯＸ　ｇ、
　２０分間の遠心分離で沈澱を除去した。この上清に固
形硫酸アンモニウムを加え３０％硫酸アンモニウム飽和
とした。３０分撹拌の後、生成した沈澱を１４．０ＯＯ
Ｘ　ｇで２０分間の遠心分離で除去した。この上清に固
形硫酸アンモニウムを加え９０％硫酸アンモニウム飽和
とした。

１４．０ＯＯＸ　ｇで２０分間の遠心分離で得られる、
酵素活性を有する沈澱を少量の０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）に溶解し、さらに０．１ｍＭのＥＤＴＡ
及び５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で透析した。この酵素液
をあらかじめ０．１　ｍＨのＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−
メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で平衡化したＤＥＡＥ−）ヨバール６５０
　Ｍのカラムに通過させ、０．１　ｍＭのＥＤＴＡ、　
　５　ｎ＋Ｍの２−メルカプトエタノール、及び０．１
ＭのＮａＣ１を含む０．０１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で溶出した。活性区分を集め、３０％飽和となる
ように硫安を加えた後、あらかじめ０．１ｍＭのＥＤＴ
Ａ、　　５　ｍＭの２−メルカプトエタノール、及び３
０％飽和の硫安を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で平衡化したブチルトヨパールのカラムに通過さ
せ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプト
エタノールを含む３０％から０％飽和の硫安を含む０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の直線的な濃度勾配
で酵素を溶出させた。

活性区分を集め、０．１ｍＭのＥＤＴ八及び５ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で透析した。こうして、アミノペプチダ
ーゼを約１　、５００倍に、収率はぼ１００％で部分精
製した。この精製課程における比活性及び回収率を第４
表に示す。

１、無細胞抽出液　　　　１１７０　　５９２０　　　
０．１９７２、プロタミン処理　　　１４９０　　４１
７０　　　０．３５７３、硫安分画（３０−９０％）　
　１４３０　　２４１０　　　０．５９４４、　　ＤＥ
ＡＲ−）ヨパール　　１３７０　　　２７９　　　４．
９２５、ブチル−トヨバール　１２００　　　４０．０
　３０．０実隻孤３．　アクロモバク　−ｓ　　、　５
ＣＲＣＣ１−３８のＤＬ−アラニンアミド塩酸塩９３４
■（０，００７５■ｏｌ）を０．２　Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）７５−に溶解し、０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で透析したアミノペプチダーゼ２１０単
位（実施例２において部分精製した比活性３０単位／■
の酵素）を加えて、３７℃で１時間保温した。反応液中
に生成したＤ−アラニンをアンバーライトＩＲＡ−４０
０（Ｃ１−）カラムに吸着させ、水洗後、ＩＮ塩酸で溶
出させた。

この溶液を減圧下ｆＩ縮し、Ｄｏｗｅｘ　５０　ＷＸ　
８　（Ｈ”　）カラムに吸着させ、水洗後、ＩＮアンモ
ニア水で溶出させた。減圧下：ａ縮し、Ｄ−アラニンを
３１３■（４ｓ、ｊ％）得た。得られたＤ−アラニンは
水−メタノール−イソプロビルアルコール−エーテルで
再結晶し、市販のＤ−アラニンとスペクトルデータを比
較した。

ＪｊＪＡυｌ　　（α）　　＝−１４，１５°　（ｃ＝
６．６．１Ｎ　ＨＣｊｔ　）（標品〔α）８０−−１４
〜−１５°（Ｃ・６゜ＩＮ　ＨＣｊｔ　））。

二重　　　２８９〜２９１℃　（標品２９１〜２９３℃
）。

４．７５（ｂｒ）　　。

ＭＳ、　ｌ１ｌｅ　　４４　（２１％）、　５７（２２
％）、　７５（２９％）。

９０（１００％１Ｍ＋）。

云」しＨｌｌ 計算値　　　実測値 Ｃ４０，４４４０，２４ Ｉ（７，９２８，１２ Ｎ　　　１５．７２　　　１５．５５ グルコース０．１％、トリプトン０．５％、酵母エキス
０．５％、Ｋ２ＨＰＯ４，０，１％を含有し、ｐＨ７，
０に調製した培地２００−を１２０℃、１５分間加熱殺
菌した後、フラボバクテリウム・スアベロレンズＩＦＯ
３７５２を接種し、２０時間培養した。菌体を生理的食
塩水で洗浄した後、実施例１と同様にして菌体を破砕し
、破砕菌体を遠心により除去した。。

上清を０．０１Ｍリン酸緩衝液に１晩透析し、無細胞抽
出液を得た。

ＤＬ−アラニンアミド塩酸塩２．４９ｗ　（２０μｍｏ
ｌ）、リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１００　ｔｔ　ｍｏ
ｌ　、上記無細胞抽出液２００バ、Ｄ−シクロセリン１
０μｍｏｌを１−中に含む反応液を３０℃で１０分反応
させた。煮沸により反応停止後、反応液中に含まれるＤ
−アラニンをＤ−アミノ酸酸化酵素を用いて定量したと
ころ０．４６μｍｏｌのＤ−アラニンを含んでいた。

一方反応液中に含まれるし一アラニンをＬ−アミノ酸脱
水素酵素を用いて定量したところ０．０４８μｍｏｌの
Ｌ−アラニンを含んでいた。

以下余白 ！！ｆｌＪ１４．　　アクロモバク　−ｓ　　、　５Ｃ
ＲＣＣ１−３８Ｄ−アラニンメチルエステル塩酸塩Ｑ、
　１１１１１１１０１％３−アミノペンタン０．５１１
１１０１％アミノペプチダーゼ１３．２単位（実施例２
において部分精製した比活性３０単位／■の酵素）を水
１−中に含む反応液を３０℃で保温した０反応液中に生
成したアミノ酸アミドは、常法によりペーパークロマト
グラフィーを行い、ニンヒドリン噴霧により発色させ、
スポットを抽出した後、別途化学合成したアミノ酸アミ
ドを標準サンプルとして作成した検量線より定量した。

その結果、反応時間７．５分を経過した時、収率７８％
で、Ｄ−アラニン−３−アミノペンタンアミドが生成し
ていた。

実ｌ舅５．　アクロモバク　−ｓ　　、　５ＣＲＣＣ１
−３８アクロモバクタ−ｓ　ｐ　、　５ＣＲＣＣ１−３
８由来の酵素をフクイとタナ力（Ａｄｖａｎｃｅ　ｉｎ
　Ｂｉｏｃｈｅｏ＋１ｃａｌ　Ｈｎｇｉ−ｎｅｅｒｉｎ
ｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２！ＬＨ１９８４）
）の方法に従って光架橋性樹脂ＥＮＴＧ−３８００でフ
ィルム状に固定化し、さらに細かく裁断した。Ｄ−アラ
ニンメチルエステル塩ｅｔ！塩０．１　ｍｍｏｌ、　３
−アミノペンタンＱ、　５　ｆｆ１ｏ＋ｏｌ、アミノペ
プチダーゼ０．９４単位（実施例２において部分精製し
た比活性３０単位／■の酵素）を含む固定化酵素０．５
ｇを加えて反応液１−とし、３０℃で保温した。反応１
２０分後、実施例４の方法に従って定量したところ、反
応液中には、収率２４％でＤ−アラニン−３−アミノペ
ンタンアミドが生成していた。

同様に、光架橋性樹脂ＥＮＴＰ−２０００で固定化した
酵素を用いて、反応１８０分後、収率３３％でＤ−アラ
ニン−３−アミノペンタンアミドを合成した。

同様に、ウレタン樹脂ＰＵ−６で固定化した酵素（１，
６単位）を用いて、上記の反応組成で６０分反応したと
ころ、収率２９％でＤ−アラニン−３−アミノペンタン
アミドが合成できた。

以下余白 尖ｌ奥６．アクロモバクタ−ｓ　　、　５ＣＲＣＣ１−
３８アクロモバクタ−ｓ　ｐ　．ＳＣＲＣＣ１−３８由
来の酵素をフクイとタナ力（Ａｄｖａｎｃｅ　ｉｎ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉ−ｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２９＋１（１９８４））の
方法に従ってウレタン樹脂ＰＵ−６で固定化し、さらに
細かく裁断した。Ｄ−アラニンメチルエステル塩酸塩０
．１　ｍｍｏｌ、　３−アミノペンタン０．５　ｍｍｏ
Ｌアミノペプチダーゼ１．６単位（実施例２において部
分精製した比活性３０単位／■の酵素）を含む固定化酵
素０．２ｇを酢酸ブチル、ベンゼン、トリクロロエタン
、トルエン、及びイソプロピルエーテルのそれぞれ水飽
和溶液のうち１種、１ｍｊ中に加え、３０℃で保温した
。反応６０分後にＤ−アラニン−３−アミノペンタンア
ミドは収率それぞれ、１００゜１００．９０，６２．２
２％で合成された。

１Ｊ１７．　　アクロモバク　−ｓ　　、　５ＣＲＣＣ
１−３８−アクロモバクタ−ｓ　ｐ　、　５ＣＲＣＣ１
−３８由来の酵素をウレタン樹脂ＰＵ−６で固定化し、
さらに細かく裁断した。Ｄ−アラニンメチルエステル塩
酸塩、ＤＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−アラ
ニンメチルエステル塩酸塩の内いずれかを０．１ｍｍｏ
ｌ、３−アミノベンクン０．５１１１１Ｉ０１、アミノ
ペプチダーゼ１．６単位（実施例２において部分精製し
た比活性３０単位／■の酵素）を含む固定化酵素０．２
ｇと共に酢酸ブチル水飽和溶液１−中に加え、３０℃で
保温した。Ｄ−アラニンメチルエステル塩酸塩を基質と
した反応液では１２０分後、収率９５％でＤ−アラニン
−３−アミノペンタンアミドが生成していた。

ＤＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩を基質とした反応
液では１２時間後、収率５０％でＤ−アラニン−３−ア
ミノペンタンアミドが生成していた。Ｌ−アラニンメチ
ルエステル塩酸塩を基質とした反応液では１２時間後で
も全くＤ−アラニン−３−アミノペンタンアミドが生成
しなかった。

アクロモバクタ−ｓ　ｐ　、　５ＣＲＣＣ１−３８由来
の酵素をＰｔ１−６ウレタンブレボリマーで固定化し、
０．１ＭのＤＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩及び０
．５Ｍの３−アミノベンクンを含む、水飽和の酢酸ブチ
ル１０−に２．０ｇ加え、３０℃で６時間振とうした。

反応液を減圧濃縮し、４ＮＨ（Ｊ／酢酸エチルを加えて
塩酸塩とした。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮後
、縮合生成物を単一に精製し、８７．９■（収率４５．
２％、理論収率９０．４％）得た。

生成物はさらにトリエチルアミン存在下、（Ｂｏｃ）　
ｚＯでＢｏｃ化し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー　（Ｈｅｘａｎｅ／酢酸エチル＝１／１）で精製しＢ
ｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ（を１０５■得た。

得られたＢｏｃ化Ｄ−アラニン−３−アミノペンタンア
ミドはスペクトルデータに於いて標品のそれとよく一致
した。

１．４〜１．５２（ｓ、４８）　、１．４６（ｓ、９Ｈ
）、　３．７０（ｍ、　ＩＨ）　。

４．１３（５ｔｈ、ＬＨ）　５．２３（ｂｒ、１ｔｌ）
、６．１０（ｂｒ、ＩＨ）。

１３６９、１２５２．１１６９．１０６９．１００２．
６０９（Ｋｂｒ）。

止立光皮　〔α〕３°＝　＋５０．５６°（ｃ＝１．２
５．ＣＨＣＪ　３）（標品【α）　ｉｓＯ＋　５０．９
０°（ｃ＝１．２１．ＣＨＣ１ｚ’）。

アクロモバクタ−ｓ　ｐ　、　５ＣＲＣＣ１−３８の生
菌体２００■（０，０４２単位）の光架橋性樹脂ＩＩ！
ＮＴＧ−３８００固定化物、Ｄ−アラニンメチルエステ
ル塩酸塩０．１ｍｍｏｌｓ　３−アミノペンタン９．５
　ｍｍｏｌを含む水飽和の酢酸ブチルからなる反応液１
−を、３０℃で保温したところ、２４０分後に、収率３
８％でＤ−アラニン−３−アミノペンタンアミドが合成
できた。

アクロモバクタ−ｓ　ｐ　、　５ＣＲＣＣ１−３８のア
セトン乾燥菌体１００■（４単位）、Ｄ−アラニンメチ
ルエステル塩酸塩０．１　ｍｍｏＬ　３−アミノペンタ
ン０、５　ｍｍｏｌを含む水飽和の酢酸ブチルからなる
反応液１ｍｌを、３０℃で保温したところ、２４０分後
に、収率５％でＤ−アラニン−３−アミノペンタンアミ
ドが合成できた。

以下余白 １ｍ１ｏ、アクロモバク　−ｓ　　、　５ＣＲＣＣ１−
３８アクロモバクタ−ｓ　ｐ　、　５ＣＲＣＣ１−３８
由来の酵素（実施例２において部分精製した比活性３０
単位／■の酵素）をウレタン樹脂ＰＵ−６で固定化し、
さらに細かく裁断した。Ｄ−アラニンメチルエステル塩
酸塩０．１１１１１０１％　ｎ−ブチルアミン、あるい
はベンジルアミンの内１種Ｑ、　５　ｍｍｏＬアミノペ
プチダーゼ１．６単位を含む固定化酵素０．２ｇを酢酸
ブチル水飽和溶液１−中に加え、３０℃で８時間保温し
た′、Ｄ−アラニンｎ−ブチルアミド、Ｄ−アラニンベ
ンジルアミドの収率は、それぞれ、７０、及び１４％で
あった。なお、収率は別途合成したＤ−アラニンアルキ
ルアミドを対照として算出した。すなわち、サンプルを
常法によりダンシル化し、これをヘキサンを溶媒とする
下降法でペーパークロマトグラフィーを行い、蛍光を発
するスポットを切取り、メタノール抽出して２０５ｎｍ
における吸光度から検量線を作成して算出した。

以下余白 １１、アクロモバク　−ｓ　　、　５ＣＲＣＣ１−３８
アクロモバクタ−ｓ　ｐ　、　５ＣＲＣＣ１−３８由来
の酵素をウレタン樹脂ＰＵ−６で固定化し、さらに細か
く裁断した。Ｄ−アラニンアミド塩酸塩、ＤＬ−アラニ
ンアミド塩酸塩、Ｌ−アラニンアミド塩酸塩の内いずれ
かを０．１　ｍｍｏｌ、　３−アミノペンクン０、５　
ｍｍｏｌｓアミノペプチダーゼ１．６単位（実施例２に
おいて部分精製した比活性３０単位／■の酵素）を含む
固定化酵素０．２ｇと共に酢酸ブチル水飽和溶液１−中
に加え、３０℃で保温した。Ｄ−アラニンアミド塩酸塩
を基質とした反応液では４８０分後、収率９７％でＤ−
アラニン−３−アミノペンタンアミドが生成していた。

ＤＬ−アラニンアミド塩酸塩を基質とした反応液では６
００分後、収率４８％でＤ−アラニン−３−アミノペン
タンアミドが生成していた。Ｌ−アラニンアミド塩酸塩
を基質とした反応液では２４時間後でも全くＤ−アラニ
ン−３−アミノペンタンアミドが生成しなかった。

以下余白 次ｍ又− グリセロール０．１％、トリプトン０．５％・酵母エキ
ス０．５％、ＫｔＨＰＯ＆　０．１９／６　Ｄ　−７ラ
ニンアミド塩酸塩を含有し、ｐＨ７，０に調製した培地
１００ｍ／を、１５分間加熱殺菌した後、各種の菌株を
接種し、３０℃で約１６時開拡とう培養した。菌体を生
理的食塩水で洗浄した後、０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）に懸濁し、９　ＫＨ，における超音波処理を
５分間行なった。破砕菌体を遠心分離で除去し、素抽出
液を得た。この素抽出液を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）に対して４℃で１晩透析した。このようにし
て得た酵素液中のＤ−アラニン−ｐ−二トロアニリドお
よびＬ−アラニンアミドに対するアミノペプチダーゼ活
性を「〔具体的な説明〕（３）力価の測定」に記した方
法で測定した。その結果を第５表に記す。

皇１■建ｋ　入ｍ目旧ｍ鉦店 （ｉ）β−ベンジルオキシ−Ｎ−ベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−アスパルチル−Ｄ−アラニン−３−アミノペ
ンタンアミドの合成酵素反応により合成したＤ−アラ；
ζフィーアミノベンタンアミド・塩酸塩８５■（０，５
６８ｍｎ＋ｏｌ）及びＺ−Ｌ−晶０：ｎ（□６７．７い
オヤウー、７．オヤウヵルボニルーし一アスパラギン酸
）２０３ｍｇ　（０，５７ｎ＋ｍｏｌ）をアルゴン雰囲
気下ＤＭＦ　１０−に溶解させた０反応部合物に水冷下
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール７７　＋ｎｇ（０，
５７ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン５７．６ｍｇ
（０，５７ｍｍｏｌ）を加えた。次いで反応液を一２０
℃に冷°却し、ジシクロへキシルカルボジイミド１１８
［（０，５７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液５−を滴下した。

室温まで徐々に昇温し、−晩撹拌後、生成したジシクロ
ヘキシル尿素を濾別した。反応液を減圧上下濃縮し、塩
化メチレンを加え、さらに生じた結晶を濾別した。塩化
メチレン層を５％炭酸水素ナトリウム、水、２規定塩酸
、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥及び活性炭で脱色を行なった。溶媒を留去後、
塩化メチレン−ヘキサンで再結晶を行ない、無色結晶を
２４４■（８６，４％）得た。

（ｍ、　４Ｈ）　、　０．８１〜０．９５（ｍ、２８）
　１．３６（ｄ、３Ｈ）、２．７９（ｄｄ、ＬＨ）、　
３．０１〜３．２２（ｍ、２Ｈ）、　４．３８〜４．４
８（ｍ、１８）　４．５７〜４．６３（ｍ、ＩＨ）、　
５．０６〜５．１８（ｍ、４Ｈ）５．８６（ｄ、１１１
）、６．２９（ｄ、ＩＨ）、６．８５（ｄ、ＬＨ）　７
．２９〜７．４０（ｍ、ｌ０Ｈ）。

（ｉｉ）Ｌ−アスパルチル−〇−アラニンー３−アミノ
ペンタンアミドの合成 アルゴン雰囲気下、２保護ジペプチド２５２■（０，４
９７ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍｌ）に溶解し、１
０％Ｐｄ−Ｃ（１０■）を加え、水素置換をした。−晩
室温で撹拌後、生成物をセライトで濾過し、減圧Ｒ縮し
、水−メタノールより再結晶すると無色固体のジペプチ
ド１３３■（９９，８％）を単一品として得た。

北豊光皮　Ｃα〕６°＋　２６．９２°（ｃｍｌ、３０
ｃＨｚＯＨ）。

旦、、ｐ−、２２１〜２２３℃。

１．３９（ｍ、ＩＨ）、　１．５５（ｍ、１８）。

２．５９（ｄｄ、ＬＨ）、　２．７０（ｍ、ＩＨ）。

３．６３（ａ＋、１８）、　４．０８（ｄｄ、１）１）
。

４．３３（ｑ、ＩＨ）、　５．０（ｂｒ）。

Ｔ　Ｒ−ν＠ａｘ　（ＫＢｒ　Ｄｉｓｋ）　３４５０．
３３２０゜２９７５、１６５０．１５７９．１４６０．
１３Ｂ８゜１２８０、１２３０．１１５８．９１８．６
４６゜肢、　ｍ／ｅ　　２９　（２６２）　、　４４　
（１００χ）、　５７（２４χ）。

８８　（４６χ）、　１５９（２６χ）、　２７４（５
χ９Ｍ＋）五ｍ侭 計算値　　　実測値 Ｃ５２，７３５２，１６ Ｈ８，４８８，４Ｏ Ｎ　　　１５．３７　　　１４．９９

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の精製酵素のＰｈｅｎｙｌ−５Ｐ−カラ
ムクロマトグラフィーの溶出プロフィールを示し、本発
明の酵素が均一であることを示すものである。 第２図は本発明の精製酵素の５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果をスケッチしたものであり、本発
明の酵素が均一であることを示す。 以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｄ−アミノ酸誘導体に特異的に作用するアミノペプ
   チダーゼ。 ２、前記Ｄ−アミノ酸誘導体がＤ−アミノ酸アミド、Ｎ
   末端がＤ−アミノ酸であるペプチド、又はＤ−アミノ酸
   エステルである請求項１に記載のアミノペプチダーゼ。 ３、微生物により生産される請求項１記載のアミノペプ
   チダーゼ。 ４、微生物がアクロモバクター（￥Ａｃｈｒｏｍｏｂａ
   ｃｔｅｒ￥）属、コリネバクテリウム（￥Ｃｏｒｙｎｅ
   ｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥）属、フラボバクテリウム（￥Ｆ
   ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥）属、バシルス属（￥Ｂ
   ａｃｉｌｌｕｓ￥）、ミクロコッカス（￥Ｍｉｃｒｏｃ
   ｏｃｃｕｓ￥）属、セルロモナス（￥Ｃｅｌｌｕｌｏｍ
   ｏｎａｓ￥）属、シュードモナス（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
   ｎａｓ￥）属、プロタミノバクター（￥Ｐｒｏｔａｍｉ
   ｎｏｂａｃｔｅｒ￥）属、マイコバクテリウム（￥Ｍｙ
   ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥）属、アルスロバクター（￥
   Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ￥）属、又はストレプトマイ
   セス（￥Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ￥）属細菌である
   請求項３記載のアミノペプチダーゼ。 ５、下記の物性を有する請求項１記載のアミノペプチダ
   ーゼ： （イ）１モルのＤ−アラニンアミド及び１モルの水から
   １モルのＤ−アラニン及び１モルのアンモニアを生成す
   る反応を触媒する； （ロ）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
   約１２２，０００の分子量を有し、ＳＤＳ−ポリアクリ
   ルアミドゲル電気泳動により約５９，０００の分子量を
   有するサブユニットを示す； （ハ）Ｄ−アラニンアミドを良好な基質とする。 ６、請求項１に記載のアミノペプチダーゼの製造方法に
   おいて、該アミノペプチダーゼを生産することができる
   アクロモバクター（￥Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ￥）
   属、コリネバクテリウム（￥Ｃｏｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
   ￥）属、フラボバクテリウム（￥Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅ
   ｒｉｕｍ￥）属、バシルス属（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）
   、ミクロコッカス（￥Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ￥）属、
   セルロモナス（￥Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ￥）属、シ
   ュードモナス（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥）属、プロ
   タミノバクター（￥Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ￥
   ）属、マイコバクテリウム（￥Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
   ｕｍ￥）属、アルスロバクター（￥Ａｒｔｈｒｏ−ｂａ
   ｃｔｅｒ￥）属、又はストレプトマイセス（￥Ｓｔｒｅ
   ｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ￥）属の細菌を培養し、この培養物
   から該アミノペプチダーゼを採取することを特徴とする
   方法。 ７、請求項１に記載のアミノペプチダーゼを生産するこ
   とができるアクロモバクターｓｐ．ＳＣＲＣＣ１−３８
   。 ８、アクロモバクター（￥Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ
   ￥）属、コリネバクテリウム（￥Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
   ｅｒｉｕｍ￥）属、フラボバクテリウム（￥Ｆｌａｖｏ
   ｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥）属、バシルス属（￥Ｂａｃｉｌ
   ｌｕｓ￥）、ミクロコッカス（￥Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
   ｓ￥）属、セルロモナス（￥Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ
   ￥）属、シュードモナス（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥
   ）属、プロタミノバクター（￥Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａ
   ｃｔｅｒ￥）属、マイコバクテリウム（￥Ｍｙｃｏｂａ
   ｃｔｅｒｉｕｍ￥）属、アルスロバクター（￥Ａｒｔｈ
   ｒｏ−ｂａｃｔｅｒ￥）属、又はストレプトマイセス（
   ￥Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ￥）属細菌の培養物、菌
   体、又は菌体処理物をＮ−置換されている場合があるＤ
   −アミノ酸アミド、Ｎ末端がＤ−アミノ酸であるペプチ
   ド、もしくはＤ−アミノ酸エステル、又はこれらの塩、
   あるいはこれらと、対応するＬ−アミノ酸誘導体との混
   合物に作用させて立体特異的にＤ−アミノ酸を生成せし
   めることを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。 ９、Ｄ−アラニンを製造するための請求項８に記載の方
   法。 １０、アクロモバクター（￥Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅ
   ｒ￥）属、コリネバクテリウム（￥Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
   ｔｅｒｉｕｍ￥）属、フラボバクテリウム（￥Ｆｌａｖ
   ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥）属、バシルス属（￥Ｂａｃｉ
   ｌｌｕｓ￥）、ミクロコッカス（￥Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃ
   ｕｓ￥）属、セルロモナス（￥Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａ
   ｓ￥）属、シュードモナス（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
   ￥）属、プロタミノバクター（￥Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂ
   ａｃｔｅｒ￥）属、マイコバクテリウム（￥Ｍｙｃｏｂ
   ａｃｔｅｒｉｕｍ￥）属、アルスロバクター（￥Ａｒｔ
   ｈｒｏ−ｂａｃｔｅｒ￥）属、又はストレプトマイセス
   （￥Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ￥）属細菌の培養物、
   菌体、又は菌体処理物の存在下で、Ｎ−置換されている
   場合があるＤ−アミノ酸アミド、Ｎ末端がＤ−アミノ酸
   であるペプチド、もしくはＤ−アミノ酸エステル、又は
   これらの塩、あるいはこれらと、対応するＬ−アミノ酸
   誘導体との混合物と、アミン又はその塩とを反応せしめ
   て立体特異的にＤ−アミノ酸Ｎ−置換アミド又はその塩
   を生成せしめることを特徴とするＤ−アミノ酸Ｎ−置換
   アミドの製造方法。 １１、Ｄ−アラニンＮ−置換アミドを製造するための請
   求項１０に記載の方法。 １２、前記反応を水性媒体中、有機溶媒中、又は有機溶
   媒を含有する水性媒体中で行うことを特徴とする請求項
   １０又は１１に記載の方法。 １３、請求項１に記載のアミノペプチダーゼを、Ｎ−置
   換されている場合があるＤ−アミノ酸アミド、Ｎ末端が
   Ｄ−アミノ酸であるペプチド、又はＤ−アミノ酸エステ
   ル、又はこれらの塩に作用させて立体特異的にＤ−アミ
   ノ酸を生成せしめることを特徴とするＤ−アミノ酸の製
   造方法。 １４、Ｄ−アラニンを製造するための請求項１３に記載
   の方法。 １５、請求項１に記載のアミノペプチダーゼの存在下で
   、Ｎ−置換されている場合があるＤ−アミノ酸アミド、
   Ｎ末端がＤ−アミノ酸であるペプチド、もしくはＤ−ア
   ミノ酸エステル、又はこれらの塩とアミン又はその塩と
   を反応せしめて立体特異的にＤ−アミノ酸Ｎ−置換アミ
   ド又はその塩を生成せしめることを特徴とするＤ−アミ
   ノ酸Ｎ−置換アミドの製造方法。 １６、Ｄ−アラニンＮ−置換アミドを製造するための請
   求項１５に記載の方法。 １７、前記の反応を水性媒体中、有機溶媒中、又は有機
   溶媒を含有する水性媒体中で行うことを特徴とする、請
   求項１５又は１６に記載の方法。