JPH01320991A - Ｄ−ホモフエニルアラニン類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＤ−ホモフェニルアラニン及びその誘導体の製
造方法に関する。

Ｄ−ホモフェニルアラニン類は、医薬、主トシてアンジ
オテンシン変換酵素阻害剤、或いは中枢神経用薬剤など
の製造における重要な中間体である。

〔従来の技術〕

Ｄ−ホモフェニルアラニン類の製造法としては、ラセミ
体のＮ−ホルミルホモフェニルアラニンをブルシンで分
割する方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍｌ、Ｌ４弘ａ４
ｓ（ｔ９ａ７−ｔ９ａｓ）、ｌ及びＮ−アセチル体を光
学活性フェネチルアミンを用いジアステレオマー塩を形
成させ光学分割する方法（特開昭６３−６３６４６）と
いった分割法が知られている。また、Ｄ−アスパラギン
酸誘導体をアリール化合物にフリーデルクラフッ反応さ
せた後、還元する合成法が公知である（　Ｊ、’　Ｏｒ
ｇ。

Ｃｈｅｍ、　、５２．５１４３（１９８７））。

〔本発明が解決しようとする課題〕

Ｎ−ホルミル体やＮ−アセチル体の光学分割法では、ホ
モフェニルアラニン類を一旦誘導体とした後、光学活性
塩基で光学分割し、更に加水分解するといった工程的煩
雑さに加え、未利用のＬ−体の回収、再利用が必要とな
るなど、収率を向上させるためには操作的難点を有して
いる。また、合成的方法は、高価なり一アスパラギン酸
を必要とする点、Ｄ−ホモフェニルアラニン類の実際的
製造法としては、原料の安価な入手に難点がある上、煩
雑な合成操作が避けられない。

〔課題を解決する為の手段〕

本発明者らは、Ｄ−ホモフェニルアラニン類の安価な工
業的な製造法を開発すべく鋭意検討を重ねた結果、フェ
ニルプロピオンアルデヒド類から容易に誘導できるヒダ
ントイン化合物を用いるという極めて効率的な製造法を
見い出し、本発明を完成した。

本発明の要点は次式で表わされる。

（ＤＬ、ＤまたはＲ体）　　　　　　　　　（Ｒ体）（
Ｒ体）　　　　　　　　　　　　（Ｒ体）（Ｒ体）　　
　　　　　　　　　　（Ｒ体）（式中、Ｘは水素、ヒド
ロキシ基、低級アルコキシ基を示す。） すなわち本発明は、５−フェネチルヒダントイン類に、
ヒダントイン環を立体特異的に加水分解してＮ−カルバ
モイル−Ｄ−ホスフェニルアラニン類を生成させる能力
を有する微生物の菌体または菌体処理物をｐＨ７〜１０
の水性媒体中で作用させることを特徴とするＮ−カルバ
モイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類の製造方法及び、
Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類を鉱酸
酸性水性媒体中ジアゾ化処理することにより脱カルバモ
イル化して、Ｄ−ホモフェニルアラニン類とすることを
特徴とするＤ−ホモフェニルアラニン類の製造方法及び
Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類をＤ−
ホモフェニルアラニン類に変換する能力を有する微生物
の培養液、菌体または菌体処理物をＮ−カルバモイル−
Ｄ−１ｔモフエニルアラニン類に作用させて脱カルバモ
イル化することによりＤ−ホモフェニルアラニン類トす
ることを特徴とするＤ−ホモフェニルアラニン類の製造
方法に関する。

本発明の方法を利用することにより、安価な微生物酵素
源を用いてＤＬ−５−フェネチルヒダントイン類の全量
をほぼ定量的にＤ体のＮ−カルレノ（モイル−ホモフェ
ニルアラニン類に変換させることも可能である。Ｎ−カ
ルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類は、鉱酸酸性
水性媒体中ジアゾ化処理することにより高収率でＤ−ホ
モフェニルアラニン類に変換することができる。また、
Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類ヲ脱カ
ルバモイル化する能力のある微生物酵素源を用いて、Ｎ
−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類をＤ−ホ
モフェニルアラニン類に変換スることも可能である。

本発明で原料として用いられる５−フェネチルヒダント
イン類は、通常は、化学合成で得られるＤＬ体を使用す
るのが適当である。例えば、ＤＬ−５−フェネチルヒダ
ントインは、公知のヒダントイン合成法（別名　Ｂｕｃ
ｈｅｒｅｒ　−Ｂｅｒｇ法）によりβ−フェニルプロピ
オンアルデヒドから容易に合成できる。

ＤＬ−５−フェネチルヒダントイン類に作用させる微生
物としては、５−フェネチルヒダントイン類のヒダント
イン環を立体特異的に加水分解してＮ−カルバモイル−
Ｄ−ホモフェニルアラニン類を生成させる能力を有する
もので、自然界に存在する野生株、公的な微生物保存機
関に保存されている菌株、あるいはそれらから人工的に
変異誘導した微生物などから、前記能力の有無を調べる
ことによって選択されるものである。

この能力の検定方法としては、例えば次のような方法が
用いられる。先ず微生物の培養物２ｍｌを遠心して菌体
を集め、それを２ｍｌの０．９％食塩水で洗浄後、再び
遠心分離して菌体を集菌する。

この分離した菌体（湿重量４０〜２ｏｏｍｙ）を濃度０
．５％のＤＬ−５−フェネチルヒダントイン懸濁液２ｍ
ｌに加えてｐＨ７〜１０、温度８０〜４０℃に保って１
０〜４０時間反応させる。反応Ｌ　ａ宜希釈しｐ−ジメ
チルアミノベンズアルデヒドの濃塩酸溶液を加えて発色
させ、その液を遠心分離して菌体等の不溶物を除き、次
いで上澄の吸光度を４４　Ｑ　ｎｍで測定して反応液中
のＮ−力ルバモイルーホモフェニルアラニン生／ｊｔｆ
ｉｔヲ求メる。

このようにして比較的高い変換率を示した菌株について
は、実験規模を大きくして再度５−フェネチルヒダント
インの加水分解反応を行ない、生成シたＮ−カルバモイ
ル−ホモフェニルアラニンがＤ体であると認められた菌
株を本発明に使用する微生物として採用する。

本発明で使用する微生物は、細菌、放線菌、かび、酵母
および不完全菌の中から上記の検定に合格するものが選
ばれる。例えば、細菌に属するものとしては、アクロモ
バクタ−属、アエロバクタ−属、アエロモナス属、アグ
ロバクテリウム属、アルカリ土類金属、アルスロバクタ
−属、バチルス属、プレビバクテリウム属、コリネバク
テリウム属、エンテロバクタ−属、エルウィニア属、エ
シェリヒア属、クレブシーラ属、ミクロバクテリウム属
、ミクロコツカス属、プロタミノバクタ−属、プロチフ
ス属、サルチナ属、セラチアＩＸ、キサントモナス属な
ど、放線菌に属するものとしては、アクチノミセス属、
アクチノプラネス属、ミコバクテリウム属、ロートコカ
ス属、ストレプトミセス属など、かびに属するものとし
ては、アスペルギルス属、バエシロミセス属、ペニシリ
ウム属など、酵母に属するものとしては、キャンデイダ
属、ハンゼヌラ属、ビヒア属、ロードトルラ属、トルロ
プシス属などがある。

本発明の方法は、微生物の菌株またはその処理物の形態
で菌体内酵素の作用を利用するものであるが、この酵素
は天然栄養源を含有する通常の培地で微生物を培養する
ことによって菌体内に生成蓄積させることができる。培
養は通常液体培地で行なわれるが、固体表面培養によっ
ても行なうことができる。培地には、通常、資化し得る
炭素源、窒素源および各微生物の生育に必要な無機塩な
らびに栄饗素とを含有させるが、更に各種のピリミジン
系核酸塩基類またはそれらの誘導体、或いは各種のヒダ
ントイン類を０，０５〜０．８％添加シテ所望の酵素を
適応的に増強させることが望ましい。

酵素誘導効果の高いピリミジン系核酸塩基類としては、
ウラシル、シトシンおよびチミンがあり、それらの誘導
体としてはジヒドロウラシル、ジヒドロチミンなどがあ
る。またヒダントイン類の中では、ヒダントイン、ＤＬ
−５−メチルヒダントインなどが望ましい。しかし多く
の微生物に共通して、実用的に最も好ましい酵素誘導基
質はウラシルである。培養条件は、使用する微生物の至
適生育条件に応じて温度２０〜６５℃、ｐＨ４〜１１の
範囲が用いられる。培養中には通気撹拌を行なって微生
物の生育を促進させることもできる。

５−フェネチルヒダントイン類の加水分解反応には、前
記のようにして培養した微生物を培養物、菌体または菌
体処理物の形態で使用する。通常、微生物の培養液をそ
のまま反応に使用することができるが、培養液中の成分
が障害になる場合には、培養液から分離した菌体を使用
すればよい。菌体は、生菌体のままで使用目的を達する
が、貯蔵あるいは取扱いの便宜から凍結乾燥菌体として
用いることもできる。また菌体そのものでなく、菌体破
砕物や菌体抽出物のような菌体処理物の状態で使用する
ことも可能である。更に、上記の菌体または菌体処理物
を公知の方法で固定化したものも使用することができる
。

５−フェネチルヒダントイン類に微生物の培養物、菌体
または菌体処理物を作用させるには、通常水性媒体中で
両者を混合する方法が用いられる。

５−フェネチルヒダントイン類の反応液中での濃度につ
いては特に制限はないが、１〜３０％程度の高濃度では
基質は完全に溶解しない。しかし、反応の進行に伴って
５−フェネチルヒダントイン類が逐次溶解していくので
何ら支障にはならない。

本発明において用いられる微生物酵素の真の基質はＤ体
であり、Ｄ体の５−フェネチルヒダントイン類のみが選
択的に加水分解されて、カルバモイル体に変換される。

一般に、５−置換ヒダントインは、容易にラセミ化しや
すい性質を有することが知られているが、本酵素反応条
件のような穏和な条件においても、基質である５−フェ
ネチルヒダントイン類は、実際、グ素反応中、常にラセ
ミ化状態にあり、酵素反応の進行に伴ってＤ体が消費さ
れても、加水分解されないＬ体の迅速なうセミ化により
反応系には常にＤ体が補給される。

このようにラセミ化反応が酵素反応と併行して進むとい
うことから、Ｌ体も間接的な基質とみなすことができる
。従って、反応の出発物質である５−フェネチルヒダン
トイン類は、ＤＬ体、Ｌ体またはＤ体のいずれであって
も使用することができる。

水性媒体中で５−フェネチルヒダントイン類の立体特異
的加水分解反応を行なう際に、実用上好ましいｐＨの範
囲は７〜１０であり、特に好ましいのは８〜９である。

活性の高い微生物を使用して、このような条件で反応を
行なえば非常に高収率で目的物を得ることができる。ｐ
Ｈ７未満では反応速度は極めて小さく、ｐＨ１０を超え
ると好ましくない副反応を生じるので、いずれも実用性
には乏しい。ｐＨ７〜１０が好ましい理由としては、本
発明で利用される微生物酵素の至適ｐＨが８〜９付近に
あること、ｐＨが増すにつれて基質の溶解度が増すこと
、ならびにヒダントイン環のラセミ化反応がアルカリ性
において効果的に促進されることなどによって結果的に
５−フェネチルヒダントイン類からＮ−カルバモイル−
Ｄ−ホモフェニルアラニン類への変換速度が増大するこ
とにある。反応の進行に伴って媒体のｐＨが低下するの
で、反応中、継続的に中和剤を添加して至適ｐＨに保持
することが望ましい。中和剤としては、アンモニア、苛
性ソーダ、苛性カリ、炭酸ソーダなどが適当である。そ
の他、目的に応じて水性媒体に有機溶媒や界面活性剤を
添加して反応を行なわせることもできる。反応温度は、
使用する微生物の酵素に適した温度が採用されるが、通
常２０〜７０℃の範囲内にある。

Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類ヲ脱カ
ルバモイル化し、Ｄ−ホモフェニルアラニン類に変換す
る方法としては、水酸媒体中、鉱酸の存在下、亜硝酸を
作用させる、いわゆるＶａｎｓｌｙｋ　法を基礎原理と
する化学的方法と、Ｎ−カルバモイルーＤ−ホモフェニ
ルアラニン類を酵素的にＤ−ホモフェニルアラニン類に
変換することのできる微生物または当該酵素を利用する
酵素的方法がある。

Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類に作用
させる微生物としては、Ｎ−カルバミル−Ｄ−ホモフェ
ニルアラニン類のカルバモイル基を除去してＤ−ホモフ
ェニルアラニン類を生成させる能力を有するもので、自
然界に存在する野生株、公的な微生物保存機関に保存さ
れている菌株、あるいはそれらから人工的に変異誘導し
た微生物などから、例えば、以下の方法によって選ぶこ
とができる。

くデカルバミラーゼの検定方法〉 この能力の検定方法としては、例えば次のような方法が
用いられる。まず微生物の培養物２ｍｌを遠心分離して
菌体を集め、それを２ｍｌの０，９％食塩水で洗浄後、
再び遠心分離して菌体を集菌する。この分離した菌体を
濃度０．５％のＮ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルア
ラニン溶液に加えてｐＨ６，５〜７．５、温度３０〜５
０℃に保って１０〜４０時間反応させる。反応後、シリ
カゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ｎ−ブタノ
ール／酢酸／水＝　４　／　１　／　１　’）によりホ
モフェニルアラニン生成の有無をニンヒドリン発色によ
り検討し、生成の確認されたものについては更に遠心分
離により菌体を除き、その上澄液中のホモフェニルアラ
ニン生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量す
るといった方法が採用できる。

本発明で使用する微生物は、アエロバクタ−属、アエロ
モナス属、アグロバクテリウム属、プレビバクテリウム
属、バチルス属、フラボバクテリウム属、シュードモナ
ス属、サルチナ属およびセラチア属に属するものなどが
ある。これらの微生物の中で、脱カルバモイル活性が比
較的高いアグロバクテリウム・スピーシーズ　ＫＮＫ　
　７１２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１９００）　　の菌学的
諸性質は以下の通りである。

（ａ）形態 （１）細胞の形および大きさ：　０．５−１．ＯＸ　２
．０−４．０μｍ、桿菌 （２）細胞の多形性の有無：なし く３）運動性の有無、鞭毛の着生状態：あり、５ｕｂ−
ｐｏｌａｒ （４）胞子の有無：なし く５）グラム染色性：陰性 （ｂ）　　各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養：良好な生育、円形、隆起性、
辺縁平滑、表面平滑湿潤、白〜 クリーム色、光沢、不透明、液状 （２）肉汁寒天斜面培養：旺盛な生育、接種線に一様に
生育、隆起厚、表面平滑湿潤、 辺縁平滑、白〜クリーム色、光沢、不 透明、培地に変化なし く３）肉汁ゼラチンせん刺培養：微弱な生育、せん刺線
に沿った生育、せん刺線周辺に 生育、ゼラチンを液化しない、白〜ク リーム色、透明度変化なし、培地に変 化なし く４）肉汁液体培養：中程度の生育、にごり不均一、フ
ロック形成、表面生育なし く５）　　リドマス・ミルク：　　ｗｅａｋ　ａｃｉｄ
（Ｃ）　　生理学的性質 （１）　　硝酸塩の還元：　＋ （２）脱窒反応　　：　＋ （８）ＭＲテスト　：　＋ （４）ＶＰテスト　二　− （５）インドールの生成：　− （６）硫化水素の生成　二　− （７）デンプンの加水分解二　− （８）クエン酸の利用　ニー（シモンズ培地）（９）　
　無機窒素源　：＋（硝酸塩、アンモニウム塩）αＯウ
レアーゼ　二　− ａｎ　　オキシダーゼ：　＋ ■　カタラーゼ　：　＋ α３　生育の範囲　：　　２０−８７℃、ｐＨ６，５−
８，５０４酸素に対する態度　：　好気性 Ｑ５　０−Ｆテスト：　０ αＧ　糖からの酸及びガスの生成：酸の生成−、ガスの
生成−（Ｄ−グルコース） αη　マロン酸の利用二　− （至）　フェニルアラニンのデアミナーゼ反応ニー０１
　デカルボキシラーゼ反応ニー（リジン）ω　アルギニ
ンジヒドロラーセ反応ニーＱ１Ｊ　　カゼインの分解性
　二　− ■　ＤＮＡの分解性　　二　− 器　栄養要求性　　　　：　なし くハ）炭水化合物の資化性　： Ｄ−グルコース　　：　＋ Ｌ−アラビノース　：　＋ サッカロース　　　：　＋ Ｄ−フラクトース　：　＋ マロンネート　　　：　− セロビオース　　　：　＋ エタノール　　　　：　− Ｄ−キシロース　　：　＋ Ｄ−タートレートニー ソルビトール　　　：　＋ サイトレート　　　二　− ラクトース　　　　　：　＋ Ｄ−マンニトール　：　＋ メソ−イノシトール：　＋ ラフィノース　　　：　＋ Ｌ−ラムノース　　：　＋ マルトース　　　　　：　＋ α−メチル−Ｄ−グルコシド　：　　＋Ｄ−マンノース
　　：　＋ ゼラチン　　　　　二　− Ｎ−アセチルグルコサミン：　十 グルコネート　　　：　− カプレート　　　　　二　− アジペート　　　　　：　− フェニルアセテート二　− メタノール　　　　二　− （至）卵黄反応　二　− （至）　β−ガラクトシダーゼ　：　＋勾　エクスリン
の加水分解　：　＋ （至）チトクローム・オキシダーゼ：　＋翰　ツインの
分解　ニー（ツイン８０）（１）　３−ケト−乳糖の生
成　二　−以上の菌学的性質を、バージエイ式分類（Ｂ
ｅｒｇｅｙ”ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１８ｔｈ　ｅｄ
、）に基いて検索すると・　リゾビウム科（Ｒｈ１ｚｏ
ｂｉａｃｅａｅ）　　ｙグロバクテリウム属（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）に属する０本酵素的方法は、微
生物の菌体またはその処理物の形態で酵素の作用を利用
して、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類
の脱カルバモイル化を行なうものであるが、この酵素は
天然栄養源を含有する通常の培地で微生物を培養するこ
とによって菌体内に生成蓄積させることができる。

培地には通常、資化し得る炭素源、窒素源および各微生
物の生育に必要な無機塩ならびに栄養素とを含有させる
が、更に各種のＮ−カルバモイル−Ｄ−α−アミノ酸類
を添加して所望の酵素を適応的に増強させることが望ま
しい。培養条件は、使用する微生物の至適生育条件に応
じて温度２０〜６５℃、ｐＨ４〜１１の範囲が用いられ
る。培養中には通気撹拌を行なって微生物の生育を促進
させることもできる。

Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類の脱カ
ルバモイル化反応には、前記のようにして培養した微生
物を培養物、菌体または菌体処理物の形態で使用する。

通常、微生物の培養液をそのまま反応に使用することが
できるが、培養液中の成分が障害になる場合には、培養
液から分離した菌体を使用すればよい。菌体は生菌体の
ままで使用目的を達するが、貯蔵あるいは取扱いの便宜
から凍結乾燥菌体として用いることもできる。また菌体
そのものでなく、菌体破砕物や菌体抽出物のような菌体
処理物の状態で使用することも可能である。無論、固定
化酵素としても利用できる。

Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類に微生
物の培養物、菌体または菌体処理物を作用させるには、
通常、水性媒体中で両者を混合する方法が用いられる。

Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類の反応
液中での濃度については特に制限はない。反応に用いる
Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類の形態
としては、５−７エネチルヒダントイン類に、ヒダント
イン環を不斉的に開裂加水分解する能力を有する微生物
の培養液、菌体または菌体処理物を作用させるコトに、
ｋ　’ｌ　（ｌたＮ−カルバモイル−Ｄ−ポモフェ０″
アラ０ン類を含む反応液のままでもよく、それらの反応
液から遠心分離等により菌体または菌体処理物、未反応
基質等を除いた上澄であってもよい。また、反応液から
単離したＮ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン
類であってモ全＜問題はない。

水性媒体中で、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルア
ラニン類の脱カルバモイル化を行なつ際に、実用上好ま
しいｐＨの範囲は６．５〜８．０であり、特に好ましく
はｐＥＩ６．５〜７．５である。活性の高い微生物を使
用して、このような条件で反応を行なえば非常に高収率
で目的物を得ることができる。反応の進行に伴って媒体
のｐＨが上昇するので、反応中、継続的に中和剤を添加
して至適ｐＨに保持することが望ましい。中和剤として
は、塩酸、硫酸などが適当である。その他、目的に応じ
て水性媒体に有機溶媒や界面活性剤を添加して反応を行
なわせることができる。反応温度は、使用する微生物の
酵素に適した温度が採用されるが、通常２０〜７０℃の
範囲にある。

脱カルバモイル化反応によって生成したＤ−ホモフェニ
ルアラニン類の単離は、濃縮、中和、イオン交換樹脂処
理などの公知の方法を利用すればよい。すなわち、中性
またはアルカリ性での不溶物を除去後、濃縮、中和等に
よりＤ−ホモフェニルアラニン類を沈澱として得ること
ができる。

さらに、ヒダントイン環の立体特異的な加水分解を接触
する微生物酵素のｐＨなどの至適反応条件と脱カルバモ
イル反応を接触する微生物酵素の至適反応条件が異る場
合が普通なので、それぞれのステップをわけて反応させ
るのが好ましい場合が多い。

微生物によっては、双方の酵素を持っているものもある
が、その場合いずれの酵素とも活性が強いとは限らぬ場
合があるので、ヒダントイン環の氷解に最もすぐれた活
性をもつ微生物と脱カルバミル反応に最もすぐれた活性
をもつ微生物を組合せて使用するのが効果的な場合も多
い。

（発明の効果） 本発明によれば、−綴代（ＩＩＩ） （Ｘｌｉ前述に同じ） で表わされるヒダントイン化合物から、−綴代（ＩＩ１
）（Ｘは前述に同じ） で表わされる光学活性な化合物を製造する立体選択的な
方法を提供することができる。

（実施例） 実施例１ 表１に示す微生物を保存スラントからブイヨン寒天スラ
ントに移植し、３３℃で２４時間培養した。一方、下記
の組成からなる液体培地を調製し、大型試欽管に１０℃
Ｍずつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行なっ
た。

培地組成： 肉１キス　　　　０．５％（重電％） ペプトン　　　　１．０％ 酵母エキス　　　０．５％ Ｎａ１ｌ　　　　　　Ｏ，１５％ ウラシル　　　　０．１％ ｐ　Ｈ７，０ これらの液体培地に、前記のブイヨン寒天スラント上に
生育した微生物を夫々−白金耳接稲して、３３℃で２４
時間振盪培養を行なった。これらの培養液から菌体を遠
心分離し、０．９９食塩水１０ｍ１で洗滌した後、再び
遠心分離して集菌し、０．９％食塩水ｓ、　ａ　ｒＢに
懸濁させて下記の反応液成分として使用した。

反応液組成： （１）ＤＩ、−５−フェネチルヒダントインを０．６％
含有し、ｐＨ７，６に調整した基質懸濁液８、８　ｍ　
１ （２）　　ｐＨ７，６のリン酸緩衝液　　　　　３．８
　ｍ　＃（８）前記菌体懸濁液　　　　　　　　　８．
８ｍｌ上記（１）（２）（３）を共栓付大型試験管に分
注して混合し、緩く振盪しながら３８℃で４０時間反応
させた。反応後、反応液を遠心分離し、その上清を得テ
、生成したＮ−カルバモイル−ホモフェニルアラニン量
を高速液体クロマトグラフィーにより分離定量した（カ
ラム：日本分光Ｆｉｎｅｐａｋ　８　Ｉ　Ｌｏｌ　Ｂ、
４．６　Ｘ　２５０　ｍｍ１３６　ｍＭ　　ＫＨ２ＰＯ
４を含む０．０２　Ｍ−Ｈ８ＰＯ４（ｐＴ（２，５）　
ニアセトニトリル＝７：３、検出２１０ｎｍ）。その結
果、反応液中のＮ−カルバモイル−ホモフェニルアラニ
ン生成量は、各微生物について夫々表１に示す通りであ
った。

更ニ、反応液の一部に、Ｎ−カルバモイル・ホモフェニ
ルアラニンと当量の亜硝酸ナトリウムを加えて硫酸酸性
中で脱カルバモイル反応を行なった。こうして得られた
ホモフェニルアラニンを含む溶液を、光学異性体分離カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析（
カラム：０ＲＯＷＮＰＡＫ　Ｃ！ＲＯ，４Ｘ　１５０　
ｍｍ、０．１Ｍ−ＨＣｌ０４（ｐＩ（１，５）、４０℃
）することにより、反応Ｈ中に生成したＮ−カルバモイ
ル−ホモフェニルアラニンはいずれの場合もＤ体である
ことが確認された。

表１ 表　１　（つづき） 表　１　（つづき） 表　１　　（つづき） 実施例２ 下記の組成からなる液体培地を調製し、大型試験管に１
０ｍＮずつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行
なった。

培地組成ニ ゲルコース　　　　　　２．０　　％（重量％）ソイビ
ーン・ミール　　１．０　　％ 酵母エキス　　　　　　０，２５％ （ＮＨ４）２８０４　　　　　０．１　　％０ａＣＯ３
０，５％ に２ＨＰＯ４０，４％ ウラシル　　　　　　０．３％ １）　Ｈ７，０ 表２に示す微生物を予め保存スラントからベネット寒天
スラントに移植して３０℃で７０時間培養し、それらの
菌体を夫々前記液体培地に一白金耳接種して３０℃で７
２時間振盪培養した。これらの培養液から菌体を遠心分
離し、以下実施例１と同様の処理を行なって菌体懸濁液
を調製した。

そして、それらの菌体懸濁液を用いて実施例１と同様の
反応液組成で、ＤＬ−５−フェネチルヒダントインの加
水分解反応を３３℃で４０時間行なった。反応後も実施
例１と同様に分析を行ない、反応Ｗ　中のＮ−カルバモ
イル−ホモフェニルアラニン生成世を求めた。その結果
を表２に示す。

更に、実施例１と同様の操作により、生成したＮ−カル
バモイル−ホモフェニルアラニンは、いずれの場合もＤ
体であることが確認された。

表２ 実施例３ 下記の組成からなる液体培地を調製し、大型試験管に１
０ｍ１ずつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行
なった。

培地組成ニ ゲルコース　　　　　　１０．０　％（重量％）ペプト
ン　　　　　　　０．２　　％ ＫＮＯＢ　　　　　　　　　□、２　　％（ＮＨ４）Ｈ
２ＰＯ４１，０５ Ｍｇ８０４・７Ｈ２００，０５％ Ｃａｃ１２　　　　　　　０．０１％ ウラシル　　　　　　　０．２　　％ ｐ　Ｈ６，０ 表３に示す微生物を予め保存スラントからベネット寒天
スラントに移植して２８℃で７０時間培養し、それらの
菌体を夫々前記の液体培地に一白金耳接種して２６℃で
４０時間振盪培養した。これらの培養液から菌体を分離
し、以下実施例１と同様の処理を行なって菌体懸濁液を
調製した。そして、これらの菌体懸濁液を用いて実施例
１と同様の反応液組成で、ＤＬ−５−フェネチルヒダン
トインの加水分解反応を３３℃で４０時間行なった。

反応後も実施例１と同様に分析を行ない、反応液中のＮ
−カルバモイル−ホモフェニルアラニン生成量を求めた
。その結果を表３に示す。

更に、実施例１と同様の操作により、生成したＮ−カル
バモイル−ホモフェニルアラニンは、いずれの場合も０
体であることが確認された。

表３ 実施例４ 下記の組成からなる液体培地を調製し、大型試験管に１
０ｍ＃ずつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行
なった。

培地組成： ショ糖　　　　　　１０．０％（重量％）酵母エキス　
　　　　０．２％ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４０，２％ ＫＨ２ＰＯ４０，１％ Ｍｇ８０４・７Ｈ２００，１％ ０ａＣＯ３０，２％ ウラシル　　　　　　０．２％ ｐ　Ｅ［７，６ 表４に示す微生物を予め保存スラントから麦汁寒天スラ
ントに移植して３０℃で２４時間培養し、それらの菌体
を夫々前記液体培地に一白金耳接種して３０℃で４０時
間振盪培養した。これらの培養液から菌体を遠心分離し
、以下実施例１と同様の処理を行なって菌体懸濁液を調
製した。そして、これらの菌体懸濁液を用いて、実施例
１と同様の反応液組成で、ＤＬ−５−フェネチルヒダン
トインの加水分解反応を３３℃で４０時間行なった。

反応後も実施例１と同様に分析を行ない、反応液中のＮ
−カルバモイル−ホモフェニルアラニン生成量を求めた
。その結果を表４に示す。

更に、実施例１と同様の操作により、生成したＮ−カル
バモイル−ホモフェニルアラニンは、いずれの場合もＤ
体であることが確認された。

表４ 実施例５ 実施例１と同様の組成からなる液体培地を調製し、５０
０ｍ１容肩付振盪フラスコに１００ｍＪずつ分注し、１
２０℃で２０分間蒸気殺菌を行なった。これに綿栓をし
た大型試験管にて、同一組成培地１０！Ｍで３３℃で２
４時間培養したバチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉ　１
ｌｕｓ　５ｐｅｃｉｅｓ）　ＫＮＫｌ　０８　（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−８８７）を２．０　ｍｌ接種し、３３℃で２
４時間振盪培養を行なった。この培養液１００ｒｌを２
００ｍ６容四ツロ丸底フラスコに入れ、窒素通気下、撹
拌しなからＤＬ−５−フェネチルヒダントイン１．Ｏｙ
を加え、３７℃で２００時間反応せた。反応中１．　Ｏ
Ｎ　−ＮａＯＨ溶液を用いて反応系のｐＨ８，７に継続
的に調節した。

反応後、液のｐＨを７．０に調整して遠心分離を行ない
、未反応基質や菌体等の不溶物を除去した。

こうして得られた上澄液の一部をとり実施例１と同様に
高速液体クロマトグラフィーで分析した結果、生成Ｎ−
カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン量は、１．０
４ｙであり、変換率は９６％であった。

更に上澄液のｐＨを濃塩酸で１．５〜２に調整するとＮ
−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニンが沈澱して
析出した。この沈澱を戸数し、更にエタノールで再結晶
して無色針状結晶０．９４９を得た。〔α）、＝−１７
，２°（ｃ＝ｔ、ｏ、ＭｅＯＨ）実施例６ 実施例５と全く同様にバチルス・スピーシーズＫＮＫ　
１０８を用いて実施した菌体反応液１００ｍ１　（含有
Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン１．０４
．ｆ）に、亜硝酸ナトリウム０．３２ｇを溶解し、これ
を４０℃の２Ｍ−Ｈ２ＢＯ３水溶液８６ｍＪｌ！中へ撹
拌下６時間かけて連続的に添加した。更に、亜硝酸ナト
リウム０．８２ｙを含む水溶液を２時間かけて添加し、
その後、１時間反応した。反応液を高速液体クロマトグ
ラフィーで分析したところ、ｏ、ｓｏｐのＤ−ホモフェ
ニルアラニンの生成が認められた（変換率９５％）。

上記反応液に活性炭０．６ｙを加え１時間撹拌後、濾過
水洗し、得られた泥液をｌ０Ｎ−ＮａＯＨを用いてｐＨ
５，８に調整した。冷却後、析出した結晶を戸数水洗し
、５０℃で減圧乾燥して、Ｄ−ホモフェニルアラニン０
．７５ｆを得た。〔α〕＝一４６．０’（Ｃ＝１、ＩＮ
−Ｆ［Ｏｌ　）実施例７ 実施例５と全く同様にして培養したバチルス・スピーシ
ーズＫＮＫ　　１０８（７）培養液１０００ｍ１ｔを遠
心分離して集菌し、０．９％食塩水１０００ｍｌで洗滌
したのち再び遠心分離して集菌し、０．２　Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，５）　２００ｍ１ｌ　ニ懸濁した。

この菌体懸濁液を１ｏ分間超音波処理した後、遠心分離
し、上清を得た。この上清１ｏｏｍｌを２００ｍ１容四
ツロ丸底フラスコに入れ、窒素通気下、撹拌しながらＤ
Ｌ−５−フェネチルヒダントイン１．Ｏｙを加え、３７
℃で２００時間反応せた。反応中１．０Ｎ−ＮａＯＨ溶
液を用いて反応系の１）Ｈを８．７に継続的に調節した
。反応後、反応液の一部をとり実施例１と同様に高速液
体クロマトグラフィーで分析した結果、生成Ｎ−カルバ
モイル−Ｄ−ホモフェニノげラニンは０．９８ｙであリ
、変換率は９０％であった。

実施例８ 実施例５と全く同様にして培養したバチルス・スピーシ
ーズＫＮＫ　　１０８の培養液１１００ｒを遠心分離し
て集菌し、０．９％食塩水１００ｒｒＶで洗滌したのち
再び遠心分離して集菌し、０．９％食塩水８ｍｌに懸濁
した。この懸濁液にアクリルアミド１．５ｇとＮ、Ｎ−
メチレンビスアクリルアミド８０ｍｌを加えて溶解させ
、窒素ガスを通じて酸素を追い出した後、５％β−ジメ
チルアミノプロピオニトリル１ｒｒｌと０．００５％リ
ボフラビン１ｍＪｌ’を加えて、室温で蛍光灯下に放置
した。１時間後、生成した菌体含有ゲルを８ｍｍ角程度
に切断し、０．９％生理食塩水で洗滌し、ゲル固定化物
を調製した。この固定化物を２００　ｍ６容スピナーフ
ラスコに入れ、０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５
）１００ｒＭ’を加え、窒素通気下、撹拌しなからＤＬ
−５−フェネチルヒダントインｉ、ｏｙを加え、３７℃
で２００時間反応せた。反応中１．　ＯＮ　−ＮａＯＨ
溶液を用いて反応系のｐＨを８．７に継続的に調節した
。反応後、反応液の一部をとり実施例１と同様に高速液
体クロマトグラフィーで分析した結果、生成Ｎ−カルバ
モイルＤ−ホモフェニルアラニン量はｏ、ｒｓｙであり
、変換率は６７％であった。

実施例９ 下記の組成からなる液体培地を調製し、大型試験管に１
０ｍ１ずつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行
なった。

培地組成二 肉エキス　　　　　　３　％　（重量％）ペプトン　　
　　　１　％ ＮａＣ１Ｏ，３％ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２０５０ｐｐｍ ｐ　Ｈ７，０ この培地にミリポアフィルタ−で除菌したＮ−カルバモ
イル−Ｄ−（４−ヒドロキシフェニル）グリシン１０％
溶液（ｐＨ７，０）の０．２　ｍｌを無菌的に添加した
。

表５に示す微生物を予め保存スラントからブイヨン寒天
スラントに移植して８０’Ｃで２４時間培養し、それら
の菌体を夫々前記液体培地に一白金耳移植して、３３℃
で４８時間振盪培養した。これらの培養液から菌体を遠
心分離し、以下実施例１と同様の処理を行なって菌体懸
濁液を調製し、下記の反応液成分として使用した。

反応液組成： （１）　　Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニ
ンを０．６％含有し、ｐＨ６，９に調整した基質溶液　
　　　　　　　　　　　８．８ｍ１（２）　　Ｔ）　Ｈ
６，９のリン酸緩衝液　　　８．’ａｍｌ（３）前記菌
体懸濁液　　　　　　　ａ、　ａ　ｍ　ｉ上記（ＩＸ２
）（８）を共栓付大型試＠管に分注して混合し、緩く振
盪しながら、３３℃で４８時間反応させた。反応後、反
応液を遠心分離し、その上清を得て、生成したＤ−ホモ
フェニルアラニンｆｌ、実施例１と同様に高速液体クロ
マトグラフィーにより分離定量した。その結果、反応液
中のＤ−ホモフェニルアラニン生成量は、各微生物につ
いて夫々表５に示す通りであった。

表　　５ 実施例１０ 実施例９と同様の組成からなる液体培地を調製し、５０
０℃Ｍ’容肩付振盪フラスコに１００ｒｌ’Ｖずつ分注
し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行なった。この培地
にミリポアフィルタ−で除菌したＮ−カルバモイル−Ｄ
−（４−ヒドロキシフェニル）グリシン１０％溶液（ｐ
Ｔ−Ｉ７．０）の２ｍｌを無菌的に添加した。これに綿
栓をした大型試験管にて、同一組成培地１０ｍ＃で３０
℃で２４時間培養したアグロバクテリウム・スピーシー
ズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｐｅｃｉｅｓ）　
Ｋ　Ｎ　Ｋ　７１２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１９００）を
２．０　ｍｌ接種し、３３℃で２４時間振盪培養を行な
った。この培養液１００ｍ１を遠心分離して集菌し、０
．９％食塩水ＩＱＯｍｌで洗滌したのち再び遠心分離し
て集菌した。こうして得られた菌体を、実施例５と同様
の操作によって得られた菌体反応液（Ｎ−カルバモイル
−Ｄ−ホモフェニルアラニン１．０４ｆ含有）に懸濁し
、この菌体懸濁液を四ツロ丸底フラスコに入れ、撹拌し
ながら４８℃に保って２０時間反応させた。反応中り、
０Ｎ−ＨＯ１溶液を用いて反応系のｐＨを６．９に継続
的に調節した。反応後、液のｐＨを９．０に調整して遠
心分離を行ない、菌体等の不溶物を除菌した。こうして
得られた上澄液の一部をとり実施例１と同様に高速液体
クロマトグラフィーで分析した結果、生成り一ホモフェ
ニルアラニン量は０．８２９であり、変換率は９８％で
あった。

更に、上澄液のｐＨを濃塩酸で５．８に調整するとＤ−
ホモフェニルアラニンが沈澱して析出した。

この沈澱を戸数し、Ｄ−ホモフェニルアラニンを０．７
Ｏｆを得た。〔α：）、　＝　−４６，０°（Ｃ＝１、
ｔＮ−ａｃｔ） 実施例１１ 実施例６と全く同様にして培養したアグロバクテリウム
・スピーシーズＫＮＫ　　７１２の培養液１００ｍ＃を
遠心分離して集菌し、０．９％食塩水１００ｍ＃で洗滌
したのち再び遠心分離して集菌し、０．２Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６，９）　５０ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁
液を２００℃Ｍ’容四ツ目丸底フラスコに入れ、撹拌し
ながら２％Ｎ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニ
ンを含ム水溶液（ｐＨ６，９）　５０ｍ６を加え、４８
℃で２０時間反応させた。反応中１．０Ｎ−ＨＯＩ溶液
を用いて反応系のｐＨを６．９に継続的に調節した。反
応後、反応液の一部をとり実施例１と同様に高速液体ク
ロマトグラフィーで分析した結果、生成り一ホモフェニ
ルアラニンは１．５Ｅｌ’であり、変換率は９８％であ
った。

実施例１２ 実施例１０と全く同様にして培養したアグロバクテリウ
ム・スピーシーズＫＮＫ　　７１２の培養液１０１００
Ｏを遠心分離して集菌し、０．９％食塩水１０１００Ｏ
で洗滌したのち再び遠心分離して集菌し、０．２　Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，９）２００ｍｌに懸濁した。この
菌体ｇ濁液を１０分間超音波処理した後、遠心分離し上
清を得た。この上清５０ｍ１を２００ｍ１容四ツロ丸底
フラスコに入れ、撹拌しながら２％Ｎ−カルバモイル−
Ｄ−ホモフェニルアラニン水溶液（ｐ）（６，９）５ｏ
ｎＢを加え、４８℃で２０時間反応させた。反応中１．
０Ｎ−ＨＯＩ溶液を用いて反応系のｐＨを６．９に継続
的に調節した。反応後、反応液の一部をとり、実施例１
と同様に高速液体クロマトグラフィーで分析した結果、
生成り一ホモフェニルアラニンは１．４５Ｆであり、変
換率は９０％であった。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｘは水素、ヒドロキシ基、低級ア ルコキシ基を示す。） で表わされる５−フェネチルヒダントイン類に、ヒダン
   トイン環を不斉的に開裂加水分解する能力を有するアク
   ロモバクター属、アエロバクター属、アエロモナス属、
   アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、アルスロバ
   クター属、バチルス属、プレビバクテリウム属、コリネ
   バクテリウム属、エンテロバクター属、エルフイニア属
   、エシエリヒア属、クレブシーラ属、ミクロバクテリウ
   ム属、ミクロコッカス属、プロタミノバクター属、プロ
   テウス属、サルチナ属、セラチア属、キサントモナス属
   、アクチノミセス属、アクチノプラネス属、ミコバクテ
   リウム属、ロードコッカス属、ストレプトミセス属、ア
   スペルギルス属、パエシロミセス属、ペニシリウム属、
   キヤンデイダ属、ハンゼヌラ属、ピヒア属、ロードトル
   ラ属またはトルロプシス属に属する微生物の培養液、菌
   体または菌体処理物を、ｐＨ７〜１０の水性媒体中で５
   −フェネチルヒダントイン類（ I ）に作用させ、式（
   II）▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｘは前記と同じで＊印は不斉炭素 に対して（Ｒ）の立体配置を表わす） で示されるＮ−カルバモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニ
   ン類に変換することを特徴とするＮ−カルバモイル−Ｄ
   −ホモフェニルアラニン類の製造方法。
2. （２）微生物の菌体処理物として、菌体磨砕物または菌
   体抽出物を使用する請求項１記載の製造方法。
3. （３）微生物の菌体または菌体処理物を固定化して使用
   する請求項１または２記載の製造方法。
4. （４）ｐＨを８〜９に保ちながら作用させる請求項１記
   載の製造方法。
5. （５）式（II）で表わされるＮ−カルバモイル−Ｄ−ホ
   モフェニルアラニン類を脱カルバモイル化して式（III
   ） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中、Ｘ及び＊印は前記に同じ） で表わされるＤ−ホモフェニルアラニン類とすることを
   特徴とするＤ−ホモフェニルアラニン類の製造方法。
6. （６）鉱酸酸性水性媒体中ジアゾ化処理して脱カルバモ
   イル化する請求項５記載の製造方法。
7. （７）硫酸酸性水溶液中でアルカリ金属またはアルカリ
   土類金属の亜硝酸塩を用いてジアゾ化処理する請求項６
   記載の製造方法。
8. （８）Ｎ−カルバモイルホモフェニルアラニン類をホモ
   フェニルアラニン類に変換する能力を有するアエロバク
   ター属、アエロモナス属、アグロバクテリウム属、プレ
   ビバクテリウム属、バチルス属、フラボバクテリウム属
   、シュードモナス属、サルチナ属またはセラチア属に属
   する微生物の培養液、菌体または菌体処理物をＮ−カル
   バモイル−Ｄ−ホモフェニルアラニン類に作用させて脱
   カルバモイル化する請求項５記載の製造方法。
9. （９）脱カルバモイル化をｐＨ６．５〜８．０の範囲で
   行なう請求項８記載の製造方法。
10. （１０）請求項１記載の方法で式（II）の化合物を製造
    し、次いで請求項８記載の方法で式（III）の化合物を
    製造する方法。
11. （１１）請求項４記載の方法で式（II）の化合物を製造
    し、次いで請求項９記載の方法で式（III）の化合物を
    製造する方法。
12. （１２）請求項１または４記載の方法で使用する微生物
    と請求項８または９記載の方法で使用する微生物の種類
    が異る請求項１０または１１記載の製造する方法。