JPH01227059A - 免疫分析による化学物質の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫分析による化学標識化合物の検出方法お
よびこの検出を現場で行ないうる分析キットに関するも
のである。特に本発明は、限定はしないが液体製品、特
にたとえば潤滑油のような油系製品における標識化合物
の検出に向けられる。

〔従来の技術〕

世界中の多くの地域で多くの異なる製品に関し経験され
る主たる問題製品偽造である。

全世界において販売業者は、消費者が成る種の物質を他
の物質から区別しうるよう肉眼上明確な外観を持った物
質を販売する。その結果、消費者は物質の肉眼上明確な
外観を成る種の品質基準と関連させることを知り、これ
らの物質がその基準に満足すれば、肉眼上明確な外観を
備えた物質を他の物質に優先して購入する。

消費者が特定の肉眼上明確な外観を備えた物質を選択し
始めると、販売業者は製品偽造の問題を受易くなる。

偽造品は、真正製品の材料が備えた外観と混同するよう
な肉眼上明確な外観を有する物質で構成される。偽造品
に加えられた肉眼上明確な外観を認めた消費者は、真正
製品を購入しているという期待の下にこの物質を購入す
る。

肉眼上明確な外観を有する物質を供給するには多くの方
法が知られている。一般に、肉眼上明確な外観はこの物
質に直接に施されるか、或いは物質に関連した物品（た
とえばラベル、包装もしくは容器）に施される。たとえ
ば肉眼上明確な外観は明確な形状もしくは輪郭、明確な
標識、或いはこれら両者の組合せとすることができる。

特に好適な肉眼上明確な外観は商標である。

偽造品の材料は真正製品の材料と同一または異なるもの
とすることができる。しばしば、偽造品の材料は同一で
あるが、品質が劣っている。

製品偽造を行ないうる多くの方法が存在する。

１つの方法において、製品偽造者はその偽造物質に真正
製品の外観からコピーした肉眼上明確な外観を施す、他
の方法においても製品偽造者は、真正製品の材料に与え
た肉眼上明確な外観に影響を及ぼすことなく真正製品の
材料を品質低下させたり或いは代用したりする。

この種の問題の１例は、真正製品に偽造者の油を添加す
ることにより潤滑油などの油系製品を品質低下させるこ
とである。この種の品質低下は油製遺業者に対し経済的
被害を及ぼすだけでな（、その結果体じうる性能上の低
下は消費者にも被害をもたらし、したがって真正製品の
世評にも害を及ぼす。

製品に染料を混入してこの問題を解消する方法が従来捉
案されている。この種の方策は容易に模倣される。しか
しながら肉眼的手段で容易には検出しえない標識を混入
すれば、製品劣化したと思われる製品の試料は製品劣化
の程度を決定しうるようたとえばクロマトグラフ技術に
よる物理的分析のため基礎実験室に戻す必要が生ずる。

その結果体ずる遅延は、たとえば容易に利用しうる支援
実験施設が存在しない地域における販売業者には不便で
あって、偽造者を阻止する技術の効果を低下させる。

製品偽造の試みを検知すべく現場で用いうる方法につき
明らかに要望が存在する。

ヨーロッパ特許出願公開第ＥＰ−Ａ−０２６０８２９号
公報は、物質中の塩素化フェノール（特にペンタクロル
フェノール）を同定すると共にこれら物質における化学
勧賞の濃度を決定すべ（使用しうるモノクローナル抗体
およびポリクローナル抗体を開示している。その明細書
の冒頭には、ペンタクロルフェノールを殺虫剤または保
存料として物質に添加することが記されている。しかし
ながらＥＰ−Ａ〜０２６０８２９号公報は、製品（すな
わち肉眼上明確な外観を備えた物質）中の塩素化フェノ
ールの同定を開示していない、さらにＥＰ−Ａ−０２６
０８２９号公報は、標識化合物としての塩素化フェノー
ルの使用についても開示していない。

特にＥＰ−Ａ−０２６０８２９号公報は、真正製品を偽
造品から区別する目的で塩素化フェノールを真正製品と
関連させることを開示していない。

カナダ国、オタワにおける１９８６年８月１０〜１５日
にわたる「殺菌剤化学に関する第６回国際会議」にてＭ
、？、ライス等により提示された「ピレスロイド殺虫剤
の免疫分析法の開発」と題する議事録には、ｍ−フェノ
キシ安息香酸とジクロルビニルシクロプロパンカルボン
酸との淡白結合体、並びにこれら蒼白結合体を用いて作
成されたポリクローナル抗体が開示されている。さらに
紅茶、水および土壌におけるサイペルメトリン代謝物、
ｍ−フェノキシ安息香酸およびジクロルビニルシクロプ
ロパンカルボン酸の分析についても開示された。しかし
ながら、標識化合物としてｍ−フェノキシ安息香酸もし
くはジクロルビニルプロパンカルポン酸のいずれかを用
いることは開示されておらず、また肉眼上明確な外観を
備えた全ゆる物質におけるこの種の化合物の免疫分析に
よる検出についても開示されなかった。

〔発明の要点〕

本発明によれば、製品に関連した肉眼上検出しえない実
質的に水溶性の標識化合物の存在を検出するに際し、前
記標識化合物の試料を水性媒体中に加えかつ試料中の標
記化合物をこのｔｌ！化合物に対し特異的な免疫分析に
より同定することを特徴とする検出方法が提供される。

〔好適実施！１様の説明〕 標識化合物は広範な種類の方法で製品と連携させうろこ
とが了解されよう、たとえば標識化合物は、製品の全部
もしく１部に或いは製品に関連したラベル、包装もしく
は容器の全体もしくは１部に存在させることができる。

一般に、ｍｓ化合物は製品と混合されるが、代案として
製品とは独立して存在させることもでき、たとえば標識
は製品包製もしくはラベルに存在させることができる。

製品は固体もしくは流体とすることができる。

固体製品の例は医薬錠剤、カプセルもしくは粉末；たと
えば殺虫剤、除草剤、殺凹剤および胛料のような！ｊ４
薬の固体組成物；たとえば布地のような繊維品；たとえ
ばレコード、テープカセット、フロッピーディスクおよ
びコンパクトディスクのような記録物；たとえばテレビ
セット、コンピュータおよびラジオのような電気製品；
自動車部品およびカメラなどを包含する。

流体製品の例はたとえば潤滑油、ガソリン、ディーゼル
油および液化石油製品のような油系製品；塗料：香料；
化粧品；たとえばブドウ酒、ウィスキー、シェリー酒、
ジンおよびウオツカのような飲料水；たとえばシロップ
、乳液および懸濁液のような液体医薬組成物；液体農薬
組成物；並びに工業溶剤などを包含する。好ましくは製
品は液体であり、好ましくはたとえば潤滑油のような油
系製品である。

！！識化合物は、肉眼的に検出できずかつ実質的に水溶
性とすべきである。標識化合物はさらに免疫分析により
検出できねばならず、かつこれが標識する製品に対し相
容性でなければならないことが了解されよう、好ましく
は、これは無毒性である。免疫分析技術の当業者は、！
識化合物として使用するのに適した化合物を同定するの
に困難がない。

一般に、標識化合物として使用するのに通した化合物は
炭素原子と水素原子と酸素および窒素がら選択される１
個もしくはそれ以上の異原子からなる有機化合物、並び
にその塩類である。必要に応じ、さらに１個もしくはそ
れ以上の他の異原子、たとえば塩素、臭素もしくは沃素
原子のようなハロゲン原子、燐原子または硫黄原子を存
在させることもできる。好適化合物はカルボン酸、カル
ボン酸エステル、ケトン、アルコール、フェノール、ア
ミン、アニリン、ニトリルおよびエーテル、並びにその
塩類である。特に好適な化合物は芳香族カルボン酸、た
とえば安息香酸；フェノール；多価アルコールおよびフ
ェノールのエーテル；アミノ酸；ペプチド；蛋白質；脂
質；炭水化物、たとえば糖類および多糖類；核酸；並び
にポリ核酸、たとえばデオキシリボ核酸およびリボ核酸
である。

製品がたとえば潤滑油のような油系製品である場合、標
識化合物として使用する化合物は好ましくは−２，５〜
＋５．０１好ましくは−１，５〜４．５、特に好ましく
は０〜４．０の範囲のｌｏｇ　Ｐを有する〔本明細書中
で使用するｌｏｇ　Ｐは、２５°Ｃのオクタツールと水
との間における化合物の分配係数の対数を意味する〕、
たとえば、ｍ−フェノキシ安息香酸は３．９のｌｏｇ　
Ｐを有する。

特定の光学活性型の化合物に対し選択的である抗体を産
生させることができる。特に掻く微量の化合物しか分析
用に入手しえない場合には慣用の分析技術によって光学
活性型の化合物をそれぞれ区別するのが困難であるため
、光学活性標識化合物の使用が特に有利である。

標識化合物として使用するの適した化合物はｍ−フェノ
キシ安息香酸であると判明したが、標識される製品に対
し化合物が相容性でありかつ非阻害性である限り広範な
種類の化合物がこの種の目的に適していることが了解さ
れよう、たとえば標識化合物としての油適合性、水適合
性および固体適合性の化合物の使用が、標識される製品
に応じて実現される。

製品が液体である場合、標識化合物は好ましくはその存
在がその後の分析によってのみ検出されうるように無色
かつ液体製品中に可溶性である。

さらに、これは好ましくは無臭である。

好ましくは、極く微量の標識が使用される。典型的には
、標識化合物は製品に対し１　ｐｐｂ〜２５ｐｐ−の範
囲の濃度で混入させる。好ましくは、濃度は１００ｐｐ
ｂ〜１５ｐｐｍ、より好ましくは１〜１０ｐｐ−の範囲
である。たとえば、標識化合物の濃度は約１０ｐｐｍま
でとすることができ、かつ標識化合物に応じて数ｐｐｂ
でさえ検出に充分である。

２５ｐｐ■もしくはそれ以下の標識化合物の濃度を検出
する能力が、本発明による方法の格別の利点である。し
たがって、極く少量の標識化合物しか使用する必要がな
い。

他の面によれば、本発明は−２５〜５．０の範囲のｌｏ
ｇ　Ｐを有する１ｐｐｂ　〜２５ｐｐｍの肉眼上検出し
えない実質的に水溶性の標識化合物を含む油系製品を提
供する。

標識化合物を製品と共に水性媒体中に混入すれば、免疫
分析をその試料につき直接に、必要に応じ濾過して固体
を除去した後に行なうことができる。或いは、標識化合
物は水溶液中に導入せねばならない。

一般に、水溶液中への標識化合物の試料の添加は、製品
からの標識化合物の溶剤抽出；水性溶剤による製品の希
釈；濾過；蒸発；並びに標識化合物の固相抽出；たとえ
ばイオン交換樹脂もしくはたとえばシリカによるクロマ
トグラフィーを用いた標識化合物の精製から選択される
１つもしくはそれ以上の工程を含む、標識された油系製
品の場合、溶剤抽出が必要であると思われる。

分析前に製品から標識化合物を抽出するために選択され
る溶剤は、勿論製品および標識の性質に依存する。製品
および標識の性質に応じて、溶剤は一般に水；炭化水素
、たとえばベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサン、
ヘプタンおよびオクタン；スルホキシド、たとえばジメ
チルスルホキシド；ハロゲン化炭化水素、たとえばクロ
ルベンゼン、塩化メチレン、クロロホルムおよび四塩化
炭化水素；エーテル、たとえばジエチルエーテル、ジオ
キサンおよびテトラヒドロフラン；アミド、たとえばジ
メチルホルムアミドおよびジメチルアセタミド；ニトリ
ル、たとえばアセトニトリル；アルコール、たとえばメ
タノール、エタノールおよびプロパツール；エステル、
たとえば酢酸エチ“ル；並びにケトン、たとえばアセト
ンのうち１種もしくはそれ以上で構成される。好ましく
は、溶剤は水および／または水混和性の有機溶剤で構成
される０ｍ−フェノキシ安息香酸で標識された潤滑油を
試験する場合、適する抽出溶剤はたとえばヘキサンのよ
うな油剤の希釈剤と水混和性の有機溶剤（たとえばアセ
トニトリル）と水との混液である。必要に応じ、抽出溶
剤はさらにたとえばトリス緩衝剤〔トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノ−メタン〕のような緩衝塩を含むことも
できる。

使用された溶副系は、好ましくはその後の免疫分析に直
接使用するのに適した水相にて抽出標識化合物を生成す
る。

免疫分析は、選択標識か対する予０１１１製された抗体
を用いて行なわれる。この種の抗体は、特定化合物に対
し特異性であるモノクローナルもしくはポリクローナル
抗体を得ることができる公知技術によって生成される。

好ましくは、モノクローナル抗体が使用される。

抗体は異質化合物（抗原）、に対する動物の露出に呼応
してＢ−リンパ球として知られた抗体産生細胞により動
物中で産生される蛋白質である。これらの抗体は、その
産生を刺戟した特定化合物に対し特異的に結合する。

抗体産生細胞は、動物を免疫性化合物で免疫化した際の
動物の肺臓で生ずる。必ずしも全ての化合物が免疫性で
ない、一般に、２，０００未満の分子量を有する化合物
は免疫性でない、しかしながら、この種の化合物（ハプ
テンとして知られる）に対し特異性である抗体は、この
ハプテンを大型の免疫性キャリヤ（たとえば炭水化物も
しくは蛋白質）に化学結合させかつ得られた免疫性結合
体で動物を免疫化することによって得ることができる。

免疫性キャリヤに対するハプテンの結合は、二官能性分
子を２工程の化学反応で用いて達成することができる。

これは、ハプテンとキャリヤとの間にスペーサアームを
形成して免疫反応を向上させる。化合物をキャリヤまた
は二官能性分子に化学結合させるには、それ自身が官能
基を持たねばならない、好適官能基はアミノ基、ヒドロ
キシル基およびカルボキシル基である。

動物を免疫性物質で免疫化した場合、広範な種類の異な
る抗体産生細胞が刺戟される。この種の反応により産生
された抗体はポリクローナル抗体として知られる。

特定化合物に対し産生されたポリクローナル抗体は、必
ずしも全てがこの化合物に対し同じ特異性を以て結合す
るとは限らない、しかしながら、同一の特異性および親
和性を以て全て化合物に結合するような抗体を得ること
ができる。これらの抗体はモノクローナル抗体として知
られる。

この種のモノクローナル抗体を得るには、抗体産生細胞
を先ず最初に免疫化した動物の肺臓から割出する０次い
で、これらの細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイプリド
ーマを形成させる。融合は、たとえばポリエチレングリ
コールでの処理によって達成することができる。このハ
イプリドーマはたとえば先駆体の抗体産生細胞のような
抗体を産生しうるが、永久的なものでない、これらはイ
ンビトロで連続増殖することができる。抗体産生細胞と
融合させるのに適した多数の骨髄腫細胞が知られており
、かつ当業者に容易に入手できる。容易に入手しうる適
する骨髄腫細胞の例はＰＸ３−６３−ＡＣ３−６５３で
ある。この細胞は、たとえばアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクシラン（米国メリーランド州ロンクビル
在）からＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ１５８０として入手する
ことができる。

抗体産生細胞と骨髄腫細胞とが融合した後、得られたハ
イブリドーマ細胞を未融合の細胞から分離すると共に、
反復制限希釈によってクローン化させる０次いで、クロ
ーン化したハイプリドーマを試験して、どれが所望の抗
体を産生ずるかを決定する。ご試験は、たとえば競合性
の酵素結合免疫吸着分析（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）によって行
なうことができる。化合物に対する特異性および親和性
は、ＥＬＩＳＡ試験系に遊離化合物を添加することによ
り、固相に結合する化合物に対するモノクローナル抗体
の結合を阻止する遊離化合物の能力を測定して評価する
ことができる。

特定ハイプリドーマが選択された後、モノクローナル体
は容易に周知技術を用いて多量に産生させることができ
る。所望に応じ、これらの抗体は酸素、たとえば西洋ワ
サビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼで
標識することができる。

化合物に対するポリクローナル抗体およびモノクローナ
ク抗体を産生させる技術は当業者に周知されている。こ
の主の技術が記載されている刊行物の例は、それぞれＨ
，パン・ブナキスおよびＪ、Ｌ。

ランボンにより編集されたメソッズ・オブ・エンチモロ
ジー、第７０巻および第７３巻「免疫化学技術、部Ａお
よびＢ〔アカデミツクブレス社により１９８０年に出版
（部Ａ）および１９８１年に出版（部Ｂ）〕、並びにＧ
、コーラ−およびＣ，ミルスタインによるネーチャー、
第２６５巻、第４９５頁（１９７５）を包含する。

他の面によれば、本発明はｍ−フェノキシ安息香酸に対
する新規なモノクローナル抗体をも包含する。

本発明による方法は、試料中の標識化合物を定性的また
は定量的に同定することからなっている。

好ましくは、この方法は標識化合物を定量的に同定する
。この方法において、品質劣化の程度を確認することが
できる。

抗体との接触による標識化合物の分析は好ましくは競合
性の酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）によって行な
われるが、酵素媒介免疫分析およびサンドイッチ免疫測
定分析を包含する他の免疫分析法も用いることができる
０分析結果の実際の検出は、比色手段またはたとえば化
学ルミネッセンスもしくは蛍光のような選択的検出手段
とすることもできる。

この種の検出法は、複雑な実験装置が必要とされないた
め現場での操作に適していることが了解されよう、すな
わち本発明の他の面によれば、製品に関連した肉眼上検
出しえない実質的に水溶性の標識化合物の存在を検出す
る分析キットにおいて、前記標識化合物の試料を水性媒
体中に加える手段と、標識化合物に対し特異性の抗体を
含む免疫分析手段と、免疫分析を監視する検出手段と、
分析の結果を真正製品から期待ささる結果と比較する手
段とからなることを特徴とする分析キットが提供される
。

水性媒体に標識の試料を加える手段は、標識を水溶液中
に導入するのに必要な任意の溶剤および／または望まし
くない固体を除去するための濾過手段および／または固
相抽出カラム（たとえばイオン交換樹脂またはシリカの
ようなりロマトグラフィー媒体を含有するカラム）で構
成することができる。

免疫分析手段は、適当量で供給されるモノクローナル抗
体もしくはポリクローナル抗体で構成することができる
。さらに、これは固相に結合しうるハブテンを含むこと
もできる。

免疫分析の結果を監視する検出手段は、たとえば着色反
応を生ぜしめかつ／または測定する手段とすることがで
きる。たとえば検出手段は酵素と、二の酵素用の基質と
で構成することができる。酵素はハブテン、抗−ハブテ
ン抗体または抗−ハブテン抗体に対して作用する第２の
抗体に結合することができる。酵素の例は西洋ワサビペ
ルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを包含す
る。

基質の例はＯ−フェニレンジアミンニ塩酸塩；アメルラ
イト・シグナル試薬（アメルシャム・インターナショナ
ル・ＰＬＣ社から入手できる）；およびｐ−ニトロフェ
ノールホスフェートを包含する。たとえば分光光度計、
ルミノメータまたはフルオロメータのような外部検出装
置も用いることが了解されよう、このようにして、標識
化合物の存在だけでなく存在量をも決定して、製品にお
ける品質劣化の程度を示すことができる。

免疫分析の結果を真正製品から期待される結果と比較す
る手段は、真正製品で期待される結果を記載した説明書
（たとえば色度表、検量表または検量曲線を包含する）
とすることができ、或いは標識された真正製品と同一の
標識物質の試料（未知試料と共に分析することができる
）で構成することができる。

キットには、好ましくは真正製品の材料に施した肉眼上
明確な外観の表示を設ける。たとえばキットには真正製
品の材料を示す商標の表示を施すことができる。

キット型で分析手段を供給する能力は、たとえば製品供
給源から遠隔の環境に存在する製品分配業者のような人
間が現場で実験施設に輔ることなく製品の信憑性を迅速
に検査しうるよう補償する。

〔実　施　例〕

以下、実施例により本発明をさらに説明する。

ｍ−フェノキシ安息香酸の一連の蛋白結合体（ハプテン
、以下ｒＰＢＡ、と称する）を作成し、その際先ず最初
に化学合成によってＰＢＡから適する反応性誘導体を作
成し、次いでこの誘導体を蛋白質と結合させた。これら
誘導体をＣＩ４放射能標識を用いて作成し、その後に蛋
白結合体をを監視して試薬の除去を検査すると共にハプ
テンによる蛋白の負荷量を計算しうるようにした。

＜ｉ）　Ｐ　　　　憬 ｍ−フェノキシ安息香酸をベンゼン中で塩化チオニルと
反応させて対応の塩化ベンゾイルを生成させ、これを次
いで水酸化ナトリウムの存在下に４−アミノ酪酸と反応
させ、次いで酸加水分解して式Ｉ： 〔式中、Ｒは−（ＣＨｚ）　ｓ　ＣＯＯＨである〕の誘
導体（ａ）を生成させた。

中間塩化ベンゾイルを水酸化ナトリウムの存在下に（ｂ
）グリシンおよび（Ｃ）グリシルグリシンと反応させ、
次いで酸加水分解することにより（ｂ）Ｒが−ＣＨ，Ｃ
０ＯＨである式Ｉの誘導体および（ｃ）Ｒが−ＣＨ，Ｃ
０ＮＨＣＨ，ＣＯ○Ｈである式Ｉの誘導体を生成させる
ことにより、さらに２種の誘導体を作成した。

さらに、４−アミノ酪酸ベンジルと３−　（３’−ジメ
チルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミドとを
水性テトラヒドロフラン中で反応させることによりＲが
−（ＣＨｓ）ａｃｏ　ＯＣＨｓＰ　ｈである式Ｉの化合
物を生成させ、次いでテトラヒドロフラン中にて木炭上
のパラジウム触媒を用いる水添分解により誘導体（ａ）
を生成させることによって式Ｉの誘導体（ａ）を作成し
た。

これら誘導体を、化学量論量の重炭酸もしくは炭酸ナト
リウムを均質溶液が得られるまで添加した水およびテト
ラヒドロフラン中で添加しかつ次いで蒸発乾固させるこ
とにより、ナトリウム塩（水中に容易に溶解する）まで
変換させた。

（ｉｉ）蓋工１１色体１日カに 上記（ｉ）に記載したように作成したナトリウム塩とし
ての誘導体をそれぞれ水中に溶解し、ｐＨ８に調整しか
つ０°Ｃまで冷却した。さらに０°Ｃまで冷却された３
−（３’−ジメチルアミドプロピル）−１−エチルカル
ボジイミドの溶液を誘導体ナトリウム塩に添加し、かつ
２分間静置してイソ尿素カルボン酸塩を完全に生成さ　
　　　、せた。

次いで各誘導体を、蒸留された脱イオン水に溶解させか
つ濾過された次の蛋白質の１種に結合させた： 牛血清アルブミン（分子量的６８．０００）、雛Ｔグロ
ブリン（分子量１２５．０００〜７５０．０００）、笠
貝ヘモシアミン（分子量３，０００，０００〜７，００
０，０００）。

充填は、溶液を１分間にわたり蛋白質へ攪ｔｕシなから
添加することによって、行なし）、力）つ混合物を５℃
に数時間保って結合を完結させた。必要に応じ、ｐＨを
８に調整した。加えた蛋白質を、透析液を毎日交換しな
がら５〜７日間にわたり塩水燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，３
）で透析し、力）つ負荷量をＣ１４放射能測定により決
定した。

ＰＢＡと牛血清アルブミンとの結合体（蛋白質１モル当
り１５モルのＰＢＡ）を用し）て、抗体を産生させた。

ＰＢＡ−牛血清アルブミンは、実施例１の（ｉ）におけ
る誘導体（ａ）を実施例１の（ｉｉ）における手順で用
いて作成した。

６匹のネズミ（Ｂａｌｂ／ｃ、雌）を、完全フロイント
アジユバシトおよびＰＢＡ結合体の１：１エマルジヨン
（０，１ａｄ、５０μｇ）を、皮下注射して免疫化した
。各動物には３回の１週間間隔で不完全アジュバントを
さらに３回注射した。同様な方式で、さらに６匹の動物
に、より多量の結合体（２００μｇ）を接種した。１２
匹の動物からの血清試料を、酵素結合免疫吸着分析（Ｅ
ＬＩＳＡ）によりＢＰＡに対する特異結合につき試験し
た。

最高の血清濃度の抗体を産生ずる動物から肺臓を副出し
、かつ肺細胞をＰＸ３−６３−ＡＣ３−６５３骨髄腫細
胞〔米国メリーランド州ロックビル在、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションからＡＴＣＣＮｏ、Ｃ
ＲＬ　１５８０として入手できる〕との融合に使用した
。ハイブリドーマ細胞を１０枚の９６穴の微小測定板に
分配した。細胞増殖の後、上澄組繊培養液を抗体産生に
つきＥＬＩＳＡにより試験した。遊離ＰＢＡを試験系へ
添加してＥＬ　Ｉ　ＳＡ法における固相ＰＢＡ標的に対
する抗体の結合の阻止を決定することにより、特異性を
評価した。数個の陽性穴部からの細胞を増殖させて細胞
保存物を作成し、次いで制限希釈によってクローン化さ
せた。さらに細胞増殖させた後、得られた上澄液を上記
と同様に試験し、かつ数個の陽性穴部の内容物を増殖さ
せかつ再びクローン化させた。第２回のクローン化の後
に陽性と同定された穴部における細胞を増殖させて、予
備分析を行なうのに充分なモノクローナル抗体を含有す
る上澄液を生成させた。

中庸の時間要件に充分なモノクローナル抗体を発生させ
るべく、５種のクローナル細胞ハイブリドーマを抗体リ
ッチな腹水液の生成につき選択した。ハイプリドーマ１
種当り１０匹のブリスタン処理された雌Ｂａ１ｂ／ｃネ
ズミにはそれぞれ１０７個までのハイブリドーマ細胞を
腹腔内接種した。

腹水液を収穫し、集めかつ凍結貯蔵した。

さらに攪拌組織培養容器にてインビトロでハイブリドー
マ細胞を増殖させることにより抗体を作成した。

これらクローナル細胞ハイブリドーマの１種の試料をヨ
ーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カ
ルチャー（ＥＣＡＣＣ）　［英国テリスベリ−５Ｐ４０
ＪＧ、ボートン・タウン在、　ＰＨＬＳ応用微生物研究
センター］に１９８９年１月１０日付けで寄託し、受託
番号８９０１１００１を受けた。

１０ｐｐｍのｍ−フェノキシ安息香酸を含有する標識さ
れた潤滑油（シェル社の登録商標リムラＸとして入手で
きる）を作成した０種々異なる割合の標識油および品質
低下してない油を含有する一連の２ｄ試料を作成した。

各油試料から分析用として次の方法によりＰＢＡを抽出
した。

゛　１′のＰＢＡの １、　真正品の試験を行なうべき油試料を、密封自在な
容器に入れた。５倍容積のへキサンと１容積の０．０５
　Ｍ　）リス／ＨＣ１（Ｐ　Ｈ７，５＞における２０％
アセトニトリルとを次いで油に添加し、かつ容器を密封
した０次いで、混合物を１分間振とうしかつ得られた懸
濁物を分離させた。これには約３０秒間を要した。

λ　分離した混合物の下相から使い捨てプラスチックピ
ペットにより１部を採取して、３ｄのＮ　Ｈｔボンド・
エルート・カラム（ジョーンズ・クロマトグラフィー社
から得られたイオン交換樹脂カラム）に加えた。抽出物
の試料を圧力をかけてカラムに通過させ、次いでこのカ
ラムを４Ｘ１ｊｌｉｌの薫留水で洗浄した。

１　次いで、カラムを塩水中の０．０５％（ｖ　／　ｖ
　）ツイーン２０の溶液２ｄで溶出させた。この溶液は
全ての結合ＰＢＡを溶出させた０次いで、それぞれ回収
されたＰＢＡ溶液を競合酵素結合免疫吸着分析（ＥＬ　
Ｉ　ＳＡ）に次の方法でかけた。

免疫分丘抜（比色手段による検出） １、　プラスチック穴部／チューブを、実施例１に記載
したように作成したＰ’ＢＡ−雛Ｔグロブリン結合体の
一定量で被覆した。この被覆を行なうため、１０Ｍｇ／
ａｌの濃度における測定量の１００μ！結合体を穴部／
チューブに入れた。

次いで、これを慎重に制御された温度にて一定時間培養
し、かつ吸着により再現性あるレベルの被覆が得られた
。この被覆時間の後、穴部を洗浄しかつ４°Ｃで貯蔵す
ることができた。

Ｚ　分析すべきＰＢＡ含有溶液を、実施例２に記載した
ように作成された特異性モノクローナル抗体の所定量の
存在下に、予備Ｍ！覆された穴部に入れた。抗体の試料
を１　：　１０００の希釈率で用いた０分析の基礎は、
溶液中のＰＢＡと穴部の表面上に結合体として固定され
たＰＢＡとの間のこの抗体の結合競合性である。一定時
間の後、穴部内の溶液を除去しかつ穴部を洗浄した。

洗浄後に穴部に残留する抗体は固定化ＰＢＡに結合した
ものであり、したがって残留する抗体のレベルは遊離溶
液中に予め存在させたＰＢＡのレベルに逆比例する。

３、第２の抗体−酵素結合体の溶液を穴部に添加した。

この第２の用いた抗体−酵素結合体は、１　：　１００
０の希釈率にて穴部１個当り１００μｌのＩｇＧ（ウサ
ギ抗−ネズミ免疫グロブリンＧに結合したアルカリホス
ファターゼ、ＩＣＮバイオロジカルス社から入手できる
）とした。

この結合体は、穴部内の固定化した結合体に結合して残
留した一次抗体の全てに結合する。第２の抗体−酵素結
合体を過剰添加し、かつ再び未結合の物質を洗浄除去し
た。洗浄後、穴部内に残留する第２の抗体−酵素結合体
の量は、上記工程２にて結合した一次抗体のレベルに正
比例する。

４、第２の抗体−酵素結合体の酵素に対する基質を含有
した溶液を穴部に添加し、かつ発色生成物の形成を測定
することにより酵素の存在量を測定した。基質は１０％
ジェタノールアミン緩衝液（ｐＨ９，８）における１■
／ｄの濃度のｐ−二トロフェニルホスフェート・ニナト
リウム塩（シグマ１０４ホスフアターゼ基質としてシグ
マ・ケミカル・カンパニー社から入手できる）とした、
黄色生成物の形成を、垂直ビームの可視光線吸収分光光
度計（ＭＲ６１０マイクロプレートリーダ：ダイナチク
社）を用いて４０５ｎｍで測定した。

種々異なる割合の標識油を含有する油試料の比色分析に
関する２群（ＡおよびＢ）の結果を下記第１表に示す、
これらの結果を、試料中の標識油の％とじて表わす。

Ｊ−１−表 試料Ｎｏ、　　　１　２　３　４　５　６　７　８　９
　１０計算値　　７５　２５．１００　０　５０　０　
７３１００　１０　５０実測群Ａ　　４７　１４１００
　０　５０　０　２９１００　０　４２実測群Ｂ　　７
６　３３　９３　０　５５　０　２２１１８　３１　５
５３種までの潤滑油の偽造試料を試験するのに適した分
析キットを組み立てた。このキットは次のもので構成し
た： （１）ＰＢＡ−［１γグロブリン結合体（下記するよう
に作成）で被覆された５本のプラスチック管；（２）５
個のイオン交換樹脂カラム（ジッーンズ・クロマトグラ
フィー社から得られる３ＩＩｉのＮＨ。

ボンド・エルート・カラム）； （３）８Ｗ１ノへキサンと２ｄ（７）０．０５Ｍ）リス
／ＨＣＩ（ｐＨ７，５）における４０％アセトニトリル
よりなる５つの１０ｄづつの抽出溶剤；（４）　　１０
ｐｐｍのｍ−フェノキシ安息香酸を含有する潤滑油の１
個の試料（標識された真正製品の試料を代表する）； （５）ｍ−フェノキシ安息香酸を含有しない潤滑油の１
つの試料； （６）、　０．０５％ｗ／ｖのツイーン２０（シグマ・
ケミカル・カンパニー社からカタログＮｏ、Ｐ１３７９
として入手しうるポリオキシエチレン−ソルビタンモノ
ラウレート）を含有する燐酸塩緩衝塩水ＣＰＢＳ、オキ
ソイド社から錠剤形で入手できる）にて１０倍希釈され
た２ｄづつの５個のＰＢＡ特異性モノクローナル抗体； （７）１容量の抗体−酵素結合体（ＤＡＫＯリミテッド
社からカタログＮｏ、Ｐ１６１として入手しうるネズミ
免疫グロブリンに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ結
合したウサギ免疫グロブリンで構成される）； （８）化学ルミネッセンス基ｔ（アメルシャム・インタ
ーナショナル・ＰＬＣ社からカタログＮｏ。

ＬＡＮ４４００として入手しうるアメルライト・シグナ
ル・試薬）； （９）塩水中の０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０（Ｓ
Ｔ）よりなる洗浄溶液： （１０）　Ｍ留水よりなるカラム洗浄液；およびＱｌ）
　　１枚の説明書。

実施例１に記載したように作成したＰＢＡ−雛γグロブ
リン結合体の一定量でプラスチック管を被覆した。この
被覆を行なうため、２０μｇ／ｄの濃度における測定！
５００μ２の結合体をチューブ内に入れた０次いで、こ
れを室温にて３時間培養し、吸着によって再現しうるレ
ベルの被覆を達成した。被覆時間後、これらチューブを
実施例３に記載したような塩水／ツイーン溶液（ＳＴ）
で洗浄し、乾燥させかつ必要とされるまで好ましくは４
℃にて乾燥貯蔵した。

一−′°′　　　　　　−の　　キ・　の土工 １、　分析を行なうには、第１工程は製造業者の指示に
従って化学ルミネッセンス基質を作成することである。

λ　キットに属する潤滑油の２種の試料および３種の「
未知」の潤滑油試料を、実施例３の方法にしたがって５
倍容積の抽出溶剤と５個のイオン交換カラムとを用いて
抽出する０次いで、カラムを２ｄづつのカラム洗浄液で
２回洗浄する。

３、　次いで、各カラムを２ｄの洗浄溶液で２ｄ容積の
ＰＢＡ特異性モノクローナル抗体を含有した小型ガラス
瓶に溶出させる。

４、次いで瓶の内容物を混合し、かつ５種の混合物のそ
れぞれから少なくとも５ＯＯｔｔ１．をＰＢＡ雛Ｔグロ
ブリン結合体で被覆された５本のプラスチック管に移す
、５分後、チューブ内の溶液を放出させ、かつチューブ
を洗浄溶液で１回洗浄する。

ｉ　抗体−酵素結合体の溶液５００１Ｉｊ！を各チュー
ブに添加する。５分間の培養後、チューブの内容物を放
出させかつチューブを洗浄溶液で５回洗浄する。

６、次いで、化学ルミネッセンス基１ｔ（ｌｉｄ）をチ
ューブに添加し、かつ２分間後に携帯型の電池出力のチ
エ−プルミノメータ（ダイノテク・ラボラドリース・リ
ミテッド社から入手できる）を用いるための製造業者の
指針にしたがって光出量を測定する。装置の読取りは、
０〜９９９の範囲の３デジツト数である。

７、　この方法の再現性を、４週間かけて２名の操作員
により行なわれた一例の３５回の分析で評価した。この
一連の実験に関する分析間の変動係数（ｃｖ）は９．１
％であった０分析を正確に行なった場合、陰性比較（よ
り高い読値）に対する陽性比較（より低い読値）の比は
０．６１２±０．０５６（すなわち±１標準偏差（ＳＤ
））であることが判明した。「未知」の油につき、０．
７２５もしくはそれ以上の数値は「恐ら（偽造」の試料
であることを示す。

加鉛ガソリンおよび無鉛ガソリンの１３ａｄづつの試料
を３種のレベルのＰＢＡ（１０，５および２．５ｐｐｍ
）で標識した。これらをトリス緩衝液（２ｄ、０．０５
Ｍ、ｐＨ７，５）で抽出した。抽出物を実施例３に記載
したように分析し、かつ未標識のガソリン抽出物で作成
した標準の検量曲線を用いてＰＢＡを定量した。放射能
標識されたＰＢＡを含有する対応の試料を作成して抽出
効率を測定することができ、かつ実測値と期待値との間
の比較を行なった。それらの結果を下記第２表に示す。

（以下余白） ・９き １ｍ バラセタモール（アセトアミノフェン：ｉｌ和な鎮痛剤
かつ発熱防止剤）およびナプロキセン（非ステロイド系
の抗炎症剤）の標識試料を作成し、これらは２０９ｐ■
の固体ＰＢＡを含有した。それぞれＩｇを、２０ｍのガ
ラス瓶にて１０Ｍ１のＰＢＳ／ツイーン（実施例４に記
りに添加した。

同様にして未標識の分析ブランクを両物質につき作成し
た。これらの瓶を１晩転勤させて、ＰＢＡをＰＢＳ／ツ
イーン中に抽出した。遠心分離により未溶解の物質を分
離した後、上澄溶液２５０μ２づつの試料を２５０μｉ
のＰＢＡ特異性抗体に添加し、かつ実施例４に記載した
と同様な分析キットを用いて分析した。

第３表に示した結果から、標識された医薬品は未標識の
医薬品から明らかに区別しうることが示された。

（以下余白） 】−」Ｌ−表 １遁　　　　　　未１はトエ　　１ｎＬ　　Ｅ）バラセ
タモール　　４００　　　２８８　　７２平均比＝７４
　３．Ｄ、＝４．２　　Ｃ，Ｖ、＝５．７ｍナプロキセ
ン　　　５１７　　　３５０　　６８平均比＝７１　３
．Ｄ、＝５．７　　Ｃ，Ｖ、−８，ＯＸ率示した数値は
、実施例４に記載したチューブルミノメータから読取っ
た。

１土■１ 狸Ｊｌｌｂ鉱た近 ２０ｐｐ−のＰＢＡを含有する「オーデコロン」の試料
を作成した。この標識物質２！１１と未標識２ｄとを小
型のガラス試験管に入れ、かつ緩和な空気流の下で蒸発
乾固させた。２ＮｉのＰＢＳ／ツイーン（実施例４に記
載）を油性残留物に添加しかつチューブの内容物を渦流
混合により激しく混合した。水より重い不溶性の油を次
いで遠心分離によって分離し、かつ各試料の上澄液を実
施例６に記載したように分析した。第３表に示した結果
から、標識香料は未標識香料から明らかに区別しうろこ
とが示された。

平均比＝７１　　Ｓ、Ｄ、＝５．７−Ｃ，Ｖ、＝８．０
χ本示した数値は、実施例４に記載したチューブルミノ
メータか′ら読取った。

代案の方法として標識オーデコロンと未標識オ−デコロ
ンとをＰＢＡ／ツイーンで１０倍希釈し、かつ実施例６
に説明したように直接分析した。その結果を第５表に示
し、これはこの代案方法も未標識香料と標識香料との間
の明確な区別を可能にすることを示している。

第２５表 平均比＝６５．４　３．Ｄ、＝４．２　　Ｃ，Ｖ、＝６
．４！２ｏｐｐｍのＰＢＡを含有するブレンドウィスキ
ーの試料を作成した。標識ウィスキーと未標識ウィスキ
ーの対応試料とをＰＢＳ／ツイーンで４倍希釈し、かつ
各試料（２５０μりを実施例６に記載した方法により分
析した。第６表に示した結果は、標識ウィスキーが未標
識ウィスキーから明らかに区別されうることを示してい
る。

玉−互−表 飲料　　　　　　末盪瓜Ｌ　　盗塁Ｌ　　止］）ウィス
キー　　　　３７５　　　１１９　　３１平均比＝２８
．４　５．Ｄ、＝６．９　　Ｃ，Ｖ、＝２４Ｘ＊示した
数値は実施例４に記載したチューブルミノメータから得
られた。この実施例においては発生した信号を処理する
のに約２０分間を要すすることが認められた。

代理人の氏名　　　川原１）−穂

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）製品に関連した肉眼上検出しえない実質的に水溶
   性の標識化合物の存在を検出するに際し、前記標識化合
   物の試料を水性媒体中に加えかつ試料中の標記化合物を
   この標識化合物に対し特異的な免疫分析により同定する
   ことを特徴とする検出方法。
2. （２）標識化合物を製品と混合する請求項１記載の方法
   。
3. （３）製品が油系製品、医薬品、農薬、香料または飲料
   である請求項１または２記載の方法。
4. （４）製品が液体の油系製品である請求項２記載の方法
   。
5. （５）製品が潤滑油である請求項４記載の方法。
6. （６）標記化合物を芳香族カルボン酸；フェノール；多
   価アルコールおよびフェノールのエーテル；アミノ酸；
   ペプチド；蛋白質；脂質；炭水化物；核酸およびポリ核
   酸から選択する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方
   法。
7. （７）標識化合物がｍ−フェノキシ安息香酸である請求
   項６記載の方法。
8. （８）標識化合物を、水および／または水混和性の有機
   溶剤からなる溶剤を用いて製品から抽出する請求項１〜
   ７のいずれか一項に記載の方法。
9. （９）標識化合物の同定を競合性の酵素結合免疫吸着分
   析によって行なう請求項１〜８のいずれか一項に記載の
   方法。
10. （１０）製品に関連した肉眼上検出しえない実質的に水
    溶性の標識化合物の存在を検出するための分析キットに
    おいて、前記標識化合物の試料を水性媒体中に加える手
    段と、標識化合物に対し特異性の抗体を含む免疫分析手
    段と、免疫分析を監視する検出手段と、分析の結果を真
    正製品から期待される結果と比較する手段とからなるこ
    とを特徴とする分析キット。
11. （１１）標識化合物の試料を水性媒体中に加える手段が
    、標識化合物を水溶液中に導入する溶剤手段からなる請
    求項１０記載の分析キット。
12. （１２）標識混合物を水溶液中に導入する溶剤手段が水
    および／または水混和性の有機剤からなる請求項１１記
    載の分析キット。
13. （１３）免疫分析の結果を真正製品から期待される結果
    と比較する手段が、真正製品から期待される結果を記載
    した説明書からなる請求項１０〜１２のいずれか一項に
    記載の分析キット。
14. （１４）免疫分析の結果を真正製品から期待される結果
    と比較する手段が、標識された真正製品と同一である標
    識物質の試料からなる請求項１０〜１２のいずれか一項
    に記載の分析キット。
15. （１５）抗体がｍ−フェノキシ安息香酸に対し特異性の
    モノクローナル抗体である請求項１０〜１４のいずれか
    一項に記載の分析キット。
16. （１６）ｍ−フェノキシ安息香酸の蛋白結合体に対し特
    異性のモノクローナル抗体。
17. （１７）−２．５〜５．０の範囲のｌｏｇＰを有する１
    ｐｐｂ〜２５ｐｐｍの肉眼上検出しえない実質的に水溶
    性の標識化合物を含む油系製品。