JPH01228469A - グルコース・イソメラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）株またはその変異株を培養することによりグル
コース・イソメラーゼを製造する方法に関する。

甘いシロップは例えば製パン、菓子及び飲料工業に広く
使用されている。これらのシロップは一般に主な甘味剤
として澱粉を加水分解して得られるシュークロース（蔗
糖）またはデキストロースを含む生成物から成っている
。シュークロースから得られるものよりも甘いシロップ
が必要とされる場合には、転化糖のシロップが用いられ
る。これはシュークロースを酸で加水分解して約５０％
のグルコース（テキストロース）と約５０％のフルクト
ース（レヴユロース）の混合物をつくることにより得ら
れる。グルコースはシュークロースよりも幾分甘味が少
ないが、フルクトースはシュークロースよりもかなり甘
いので、全体としての甘さはシュークロースに比べて増
加する。

デキストロースはアルカリ性の条件下においてはフルク
トースに変化し得ることは公知である。

この変化は甘いシロップを製造する上で大きな潜在的価
値をもっている。しかしアルカリによる変化は、アルカ
リ反応によって製品のシロップの中の灰分濃度が望まし
くないほど高くなり、これを除去するのは不経済である
ために、工業的にはこれまで成功していない。灰分を除
去しなければシロップは商品として受入れられない。ア
ルカリによる異性化及びそれに伴なう問題については米
国特許第３，３８３，２４５号で論じられている。

従って従来法においてはグルコースを酵素によってフル
クトースに変える方法が行われている。例えばズソイド
モナス・ヒドロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｈｙｄ
ｒｏｐｈｉｌａ）、ストレプトマイセス◆フラヴオヴイ
レンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｌａｖｏｖｉｒ
ｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アクロモゲヌスＣ５ｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｕｓ）、
ストレプトマイセス・エキナツール（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　ｅｃｈｉｎａｔｕｒ）、ストレプトマイセス
０アルプス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｓ）
、ストレプトマイセス・オリバケウス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、バチルス・コアグ
ランス（Ｂａｃｊｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、ミ
クロバクテリウム・アルポレッセンス（Ｍｉｃｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）　［以前は
フラヴオバクテリウム・アルポレンセンス（Ｆｌａｖｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｒｂｏｒｓｓｃｅｎｓ）として
分類されていた］及びバチルス・リケニフオルミス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種は適
当な栄養媒質中で生育し、グルコース・イソメラーゼの
性質をもった酵素を生産し得ることが見出だされている
。例えば米国特許第２，９５０，２２８号、同第３，６
１６，２２１号、同第３，６２５．８２８号、同第３，
９７９．２６１号、同第４．０６１，５３９号及び同第
４．３４８，４８０号参照。グルコース・イソメラーゼ
を生産する多くのバクテリア株のスクリーニングはエム
・シ工力不（Ｍ、　５ｕｅｋａｎｅ）等のツァイトシュ
リフッ・フユール・アルゲマイ不・ミクロビオロギ−（
Ｚ、　Ａｌｇｅｍｅｉｎｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉ
ｅ）誌、２１巻、４５７頁（１９８１）の論文に報告さ
れている。ミクロバクテリウム・ラクティクム（Ｍ、　
ｌａｃｔｉｃｕｍ）及びプレグイバクテリウム０インペ
リアレ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ　ｉｍｐｅｒ
ｉａｌｅ）（ミクロバクテリウム・インペリアレとして
再分類）はキシロース上では生育せずグルコース・イソ
メラーゼを生産しないことをシェカネ等は報告している
。ミクロバクテリウム・ラエヴアニ７才ルメンス（Ｍ、
　ｌａｅｖａｎｉｆｏｒｍｅｎｓ）は以前はコライネバ
クテリウム・ラエヴアニフォルメンス（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｅｖａｎｉｆｏｒｍｅｎｓ）と
して分類されていたものである。シエカネ等は数種のコ
ライネバクテリウムを試験し、これらの種はいずれもグ
ルコース・イソメラーゼを生産しないと報告している。

従って従来法においてはいずれもミクロバクテリウム・
インペリアレ、ミクロバクテリウム・ラクティクム、ミ
クロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍ、　ａｍｍ
ｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）またはミクロバクテリウム・ラ
エヴアニ７オルマンス種の株を使用してグルコース・イ
ソメラーゼを製造することは示唆されていない。

本発明は回収可能な量の酵素を生成するのに十分な時間
の間、適当な栄養剤を含む媒質中において、ミクロバク
テリウム・ラクティクム、ミクロバクテリウム・インペ
リアレ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム、及
びミクロバクテリウム・ラエヴアニ７才ルマンス、及び
それらの変異株から成る群から選ばれたミクロバクテリ
ウム種の培地を生育させることを特徴とするグルコース
・イソメラーゼの製造法に関する。適当なミクロバクテ
リウム株にはミクロバクテリウム・インペリアレ、ミク
ロバクテリウム・ラクティクム、ミクロバクテリウム・
アンモニアフィルムまたはミクロバクテリウム・ラエヴ
アニ７オＪレマンス株まｌこはそれらの変異株が含まれ
る。

本発明においてはグルコース・イソメラーゼを製造する
ためにミクロバクテリウム株またはその変異株を使用す
る。或種の株はグルコース・イソメラーゼをかなりの置
土産し得ることが見出された。これらの株は通常の誘起
剤のキシロースが存在しなくても実質的な水準の本質的
な酵素活性を示す。例えばこれらのミクロバクテリウム
種はラクトースを含む栄養媒質上で生育させるとグルコ
ース・イソメラーゼを生産するが、ミクロバクテリウム
・アルポレッセンスはこれらの条件ではグルコース・イ
ソメラーゼを生産しない。グルコース・イソメラーゼを
生産する適当なミクロバクテリウム種にはミクロバクテ
リウム・インペリアレ、ミクロバクテリウム・ラクティ
クム、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルムまたは
ミクロバクテリウム・ラエヴアニ７オルマンス株または
それらの変異株が含まれる。これらのミクロバクテリウ
ム種の株は現在では米国メリーランド州ロックヴイル（
Ｒｏｃｋｖ　ｉ　Ｉ　Ｉｅ）のアメリカン・タイプ・カ
ルチャー１コレクシヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から同定番号
ＡＴＣＣ８３６５、ＡＴＣＣ８１８０、ＡＴＣＣ１５３
５４及びＡＴＣＣ１５９５３として入手できる。

グルコース・イソメラーゼを生産し得るミクロバクテリ
ウム種の変異株は公知方法でつくることができる。例え
ば突然変異により変異が起ることができる。またメタン
スルフォン酸エチル、ニュータレオチドー塩基同族列、
重亜硫酸ナトリウム等によって誘起される化学的な変異
誘発、熱、γ線、紫外線等によって誘発される物理的な
変異誘発、オリゴニュークレオチドによる変異誘発、Ｄ
ＮＡ欠失、ＤＮＡ挿入等による変異誘発等を含むいくつ
かの方法により起ることができる。最後に（ａ）グルコ
ース・イソメラーゼの生産を増加させ、（ｂ）微生物等
の生育特性を改善する公知遺伝子工学的方法により変異
株をつくることができる。上記ミクロバクテリウムの変
異株は米国特許第４．３５５．１０３号記載のように２
−デオキシグルコース耐性ヲモつものを選択するか、及
び／又はスクリーニングする。

ミクロバクテリウム種は寒天の斜面培養器、好ましくは
栄養寒天［米国、ミシガン州、デトロイト（Ｄｅｔｒｏ
ｉｔ）のデイフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製］の上に保持され、適当
な栄養剤を含む種々の媒質で培養される。好ましくはこ
の媒質は炭素源、窒素源及び無機塩源を含んでいる。代
表的な窒素源は製パン用イースト抽出物、加水分解した
動物蛋白質等である。代表的な無機塩には硫酸アンモニ
ウム、燐酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガ
ン等が含まれる。好適な媒質は加水分解した動物蛋白質
、トウモロコシの浸漬液、製パン用イースト抽出物、緩
衝剤（無機質）の塩及び炭水化物を含んでいる。適当な
炭水化物にはキシロース、ラクトース、重合体の加水分
解生成物等が含まれる。

この微生物は温度約３０〜３５°Ｃにおいて好気性培養
条件で生育する。好適な生育温度は３３℃である。

生育媒質のｐｕは約６．５〜約７．５の範囲に保たなけ
ればならない。好適なｐＨは７．０である。生育媒質の
初期ｐＨは約７，０であることが好ましい。最高のグル
コース・イソメラーゼ活性は一般に約４８〜約７２時間
で得られる。

本発明のグルコース・イソメラーゼはそれが生産される
際に生育するバクテリアの細胞の内部で生成する。細胞
は公知方法、例えば濾過または遠心分離により発酵液か
ら分離され、直接グルコース・イソメラーゼ源として使
用される。このような細胞は公知方法、例えば米国特許
第３．７７９，８６８号記載のグルタルアルデヒド処理
によって凝集させ酵素活性を不動化させることができる
。別法として細胞を機械的方法、自己分解作用または酵
素を使う他の方法によって破り、細胞の破片から可溶性
の酵素を分離することができる。可溶性の酵素は直接使
用するか、または公知方法により適当な坦体の上に不動
化することができる。

下記の実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例 ミクロバクテリウムの培地の一部を栄養寒天培養器から
、１％の加水分解し・Ｉこ動物蛋白質［デイフコ・ラボ
ラトリーズ製バクト・トリプトン（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙ
ｐｔｏｎｅ）］　、１％のトウモロコシ浸漬液の乾燥物
［ロケット・フレール（Ｒｏｑｕｅｔｔｅｓ　ｆｒｅｒ
ｅｓ）社］、１％のイースト抽出物（ディフィ：Ｉ）、
１％の燐酸−水素カリウム、０．５％の燐酸二水素カリ
ウム、及び２％のキシロースまたはラクトースから成る
水性媒質５０ｍ　ｌを含む２５０ｍ１の邪魔板付きフラ
スコに移す。媒質の初期ｐＨは約７．０である。

次にフラスコを２５０ｒｐｍで回転する回転振盪機上で
３３°Ｃにおいて７２時間培養する。培養後米国特許第
４．３４８，４８０号記載の方法によりグルコース・イ
ソメラーゼ活性を試験した。結果を下記表に示す。

グルコース・イソメラーゼ活性は試験条件下で１分間に
生成したフルクトースのマイクロモル数に等しい単位（
ＧＩＵ）で表わされる。

Ｇ［Ｕ／Ｑ ラフティクム　　　　　　　５１　　　　３０３ミクロ
バクテリウム・ インペリアレ　　　　　　９０７　　　１２．６８７ミ
クロバクテリウム・ アンモニアフィルム　　　７０５　　　　３０３ミクロ
バクテリウム・ ラエヴアニ７才ルマンス　２５３　　　　３０３７ラヴ
オバクテリウム・ アルポレッセンス木　　　　　０本本　　３，３０３木
本本ミクロバクテリウム・アルボレッセンスとして再分
類されるもの。

＊＊米国特許第４，０６１，５３９号から採ったデータ
をＧＩＵ／ｉ２単位に換算した値。

本発明の主な特徴及び態様は次の通りである。

１、回収可能な量の酵素を生成するのに十分な時間の間
、適当な栄養剤を含む媒質中において、ミクロバクテリ
ウム・ラクティクム、ミクロバクテリウム・インペリア
レ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム、及びミ
クロバクテリウム・ラエヴァニフォルマンス、及びそれ
らの変異株から成る群から選ばれたミクロバクテリウム
種の培地を生育させるグルコース・インメラーゼの製造
法。

２、生育は好気的に行われる上記第１項記載の方法。

３、核種はミクロバクテリウム・ラクティクムである上
記第１項記載の方法。

４、核種はミクロバクテリウム・インペリアレである上
記第１項記載の方法。

５、核種はミクロバクテリウム・アンモニアフィルムで
ある上記第１項記載の方法。

６、核種はミクロバクテリウム・ラエヴアニフオルマン
スである上記第１項記載の方法。

７、核種はミクロバクテリウム・ラクティクムの変異株
である上記第１項記載の方法。

８、核種はミクロバクテリウム・インペリアレの変異株
である上記第１項記載の方法。

９、核種はミクロバクテリウム・アンモニアフィルムの
変異株である上記第１項記載の方法。

１０、核種はミクロバクテリウム・ラエヴアニ７才ルマ
ンスの変異株である上記第１項記載の方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、回収可能な量の酵素を生成するのに十分な時間の間
   、適当な栄養剤を含む媒質中において、ミクロバクテリ
   ウム・ラクティクム、ミクロバクテリウム・インペリア
   レ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム、及びミ
   クロバクテリウム・ラエヴァニフォルマンス、及びそれ
   らの変異株から成る群から選ばれたミクロバクテリウム
   種の培地を生育させることを特徴とするグルコース・イ
   ソメラーゼの製造法。