JPH0669381B2 - カルニチンの製造法 - Google Patents
カルニチンの製造法Info
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- JPH0669381B2 JPH0669381B2 JP62305830A JP30583087A JPH0669381B2 JP H0669381 B2 JPH0669381 B2 JP H0669381B2 JP 62305830 A JP62305830 A JP 62305830A JP 30583087 A JP30583087 A JP 30583087A JP H0669381 B2 JPH0669381 B2 JP H0669381B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はカルニチンニトリルを加水分解してカルニチン
を製造する方法に関するものである。本発明により製造
されるカルニチンは脂肪酸代謝に関連する物質としてビ
タミンBTと呼ばれたことがあり、従来DL体が健胃剤など
に使用されてきたが、最近では特にＬ体が注目され、心
臓疾患や脂肪血症の治療剤として有用でありまた高カロ
リー輸液としても用いることができることが知られてい
る。
を製造する方法に関するものである。本発明により製造
されるカルニチンは脂肪酸代謝に関連する物質としてビ
タミンBTと呼ばれたことがあり、従来DL体が健胃剤など
に使用されてきたが、最近では特にＬ体が注目され、心
臓疾患や脂肪血症の治療剤として有用でありまた高カロ
リー輸液としても用いることができることが知られてい
る。
従来の技術 従来DL−カルニチンの製法としては、古くから合成法が
知られているが、合成法は、加熱、鉱酸、アルカリや有
害物質の使用などエネルギー的、公害的に不利であり、
また生成するカルニチンがDL体である欠点がある。最近
生化学的方法として4N−トリメチルアミノ酪酸の水酸化
反応（米国特許4,371,618）、３−デヒドロカルニチン
の還元反応（Appl.Environm.Microbiol.,39巻、329頁、
1980年）、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを
経由する方法（公開特公昭59−118093号）、クロトンベ
タインを基質とする方法（公開特公昭59−183694号、同
59−118093号）、DL−Ｏ−アシルカルニチンのエステラ
ーゼによる加水分解法（Biotechnol.Bioeng.,26巻、911
頁、1984年）が研究された。しかし、これらの方法は、
原料が高価であつたり、酵素が不安定であつたり、高価
な補酵素の補給を必要とするなど工業的に不満足なもの
といわざるをえない。カルニチンニトリルを鉱酸などの
使用により化学的に加水分解することは従来知られてい
たが、生化学的加水分解については全く知られていなか
つた。
知られているが、合成法は、加熱、鉱酸、アルカリや有
害物質の使用などエネルギー的、公害的に不利であり、
また生成するカルニチンがDL体である欠点がある。最近
生化学的方法として4N−トリメチルアミノ酪酸の水酸化
反応（米国特許4,371,618）、３−デヒドロカルニチン
の還元反応（Appl.Environm.Microbiol.,39巻、329頁、
1980年）、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを
経由する方法（公開特公昭59−118093号）、クロトンベ
タインを基質とする方法（公開特公昭59−183694号、同
59−118093号）、DL−Ｏ−アシルカルニチンのエステラ
ーゼによる加水分解法（Biotechnol.Bioeng.,26巻、911
頁、1984年）が研究された。しかし、これらの方法は、
原料が高価であつたり、酵素が不安定であつたり、高価
な補酵素の補給を必要とするなど工業的に不満足なもの
といわざるをえない。カルニチンニトリルを鉱酸などの
使用により化学的に加水分解することは従来知られてい
たが、生化学的加水分解については全く知られていなか
つた。
発明が解決しようとする問題点と問題点を解決するため
の手段 本発明者らは、カルニチンの有用性、特にその光学活性
体の有用性に着目し、エネルギー的、及び公害的に有利
な生化学的加水分解法が、カルニチン合成の中間体であ
るカルニチンニトリルに対して適用できれば、工業的に
有利なカルニチンの製法となりうると考え、その可能性
を、保存微生物、広く自然界から分離した微生物の検討
によつて追求した結果、本発明を完成するに至つた。
の手段 本発明者らは、カルニチンの有用性、特にその光学活性
体の有用性に着目し、エネルギー的、及び公害的に有利
な生化学的加水分解法が、カルニチン合成の中間体であ
るカルニチンニトリルに対して適用できれば、工業的に
有利なカルニチンの製法となりうると考え、その可能性
を、保存微生物、広く自然界から分離した微生物の検討
によつて追求した結果、本発明を完成するに至つた。
作 用 本発明は、安価に簡単に合成しうるカルニチンニトリル
に、これを加水分解してカルニチンを生成せしめる酵素
（ニトリラーゼの１種）もしくは該酵素を含有する製
剤、生体標品（微生物、細胞）、固定化酵素、固定化菌
体を作用せしめてカルニチンを製造する方法である。勿
論、生化学的方法の常としてカルニチンニトリルはその
非毒性の塩、例えばクロライドの形でも使用でき、カル
ニチンも塩の形でも製造しうる。本発明方法によれば、
常温かつ中性附近という温和な条件で反応を行うことが
できるので、エネルギー的、公害抑制の面からも従来法
に比して有利であり、従来の生化学的方法のようなカル
ニチンから誘導した化合物を原料とするのではなく、カ
ルニチン合成の中間体であり光学不活性（DL体）のカル
ニチンニトリルから光学活性のカルニチンをえることは
本発明の方法によつて始めて可能となつた。
に、これを加水分解してカルニチンを生成せしめる酵素
（ニトリラーゼの１種）もしくは該酵素を含有する製
剤、生体標品（微生物、細胞）、固定化酵素、固定化菌
体を作用せしめてカルニチンを製造する方法である。勿
論、生化学的方法の常としてカルニチンニトリルはその
非毒性の塩、例えばクロライドの形でも使用でき、カル
ニチンも塩の形でも製造しうる。本発明方法によれば、
常温かつ中性附近という温和な条件で反応を行うことが
できるので、エネルギー的、公害抑制の面からも従来法
に比して有利であり、従来の生化学的方法のようなカル
ニチンから誘導した化合物を原料とするのではなく、カ
ルニチン合成の中間体であり光学不活性（DL体）のカル
ニチンニトリルから光学活性のカルニチンをえることは
本発明の方法によつて始めて可能となつた。
本発明に使用する酵素は、一般名でニトリラーゼと呼ば
れ、国際的な酵素分類の命名記号によると、加水分解酵
素の中で鎖状アミド結合に作用するもの（分類3.5.5）
に属するものである。トリメチルアミノ基を構造に有す
るカルニチンニトリルのような化合物に作用するニトリ
ラーゼの存在については従来全く知見がなく、本発明の
研究で始めて見出されたものである。
れ、国際的な酵素分類の命名記号によると、加水分解酵
素の中で鎖状アミド結合に作用するもの（分類3.5.5）
に属するものである。トリメチルアミノ基を構造に有す
るカルニチンニトリルのような化合物に作用するニトリ
ラーゼの存在については従来全く知見がなく、本発明の
研究で始めて見出されたものである。
カルニチンニトリルをカルニチンに変換する酵素を生産
する微生物は、自然界より、カルニチンニトリルからカ
ルニチンを生成する能力に基いて選択分離することがで
きる。具体的には本発明者らが分離した菌株である細胞
菌株6N−23,11N−26,6N−29,6N−49をあげることができ
る。これらの菌株は本発明者らが分離し、本発明に使用
しうるものの代表株として微生物工業技術研究所に寄託
したものであり、その分類学的性質は次のとおりであ
る。
する微生物は、自然界より、カルニチンニトリルからカ
ルニチンを生成する能力に基いて選択分離することがで
きる。具体的には本発明者らが分離した菌株である細胞
菌株6N−23,11N−26,6N−29,6N−49をあげることができ
る。これらの菌株は本発明者らが分離し、本発明に使用
しうるものの代表株として微生物工業技術研究所に寄託
したものであり、その分類学的性質は次のとおりであ
る。
これらの分類菌は、何れも好気性で、グラム陽性であ
り、胞子をつくらぬコリネ形の細菌であり、バーゼーズ
・マニユアル・オブ・システマチツク・バクテリオロジ
ー（Bergey′ｓ Manual of Systematic Bacteriolo
gy）第２巻（1986年）に従うと、分類セクシヨン15の、
異常、非胞子形成、グラム陽性桿菌に属する。さらに何
れの菌も細胞壁中にメソ−ジアミノピメリン酸を有し、
またマイコール酸をふくむのでコリネバクテリウム（Co
rynebacterium）属に属するものと考えられる。
り、胞子をつくらぬコリネ形の細菌であり、バーゼーズ
・マニユアル・オブ・システマチツク・バクテリオロジ
ー（Bergey′ｓ Manual of Systematic Bacteriolo
gy）第２巻（1986年）に従うと、分類セクシヨン15の、
異常、非胞子形成、グラム陽性桿菌に属する。さらに何
れの菌も細胞壁中にメソ−ジアミノピメリン酸を有し、
またマイコール酸をふくむのでコリネバクテリウム（Co
rynebacterium）属に属するものと考えられる。
従来コネリ形細菌の分類の困難性が指摘されてきたが上
記した新しい分類書では化学的分類をとり入れた結果、
比較的明確な区別が属の間ではできるようになつてい
る。しかしなお困難な点があることを述べておきたい。
化学的分類に従うと、上の分離菌は、メソ−ジアミノピ
メリン酸を細胞壁に有することと、マイコール酸の比較
的短鎖のもの（クロマトグラフイーから判断）を含むこ
とからコリネバクテリウム属、カセオバクター（Casecb
acter）属およびロドコツカス（Rhodococcus）属が分類
の候補となる。事実、上記分類書にもこれら３属の間の
区別の困難なことが述べられている。本発明者らは、ロ
ドコツカス属は、ノカルジア形を示すと記載されている
が、上の分類菌ではコリネ形は通常みられるがノカルジ
ア形はみられないので区別されると判定した。また、カ
セオバクター属は１菌種のみ記載されており、絶対好気
性とされ、分類源がチーズであることが記載されてい
る。一方コリネバクテリウム属菌は通気嫌気性のものが
大部分であるが絶対好気性の菌もふくみ、また土から分
離された菌が含まれている。このようなことから本発明
者らは上の分離菌をコリネバクテリウム属の菌と固定し
た。
記した新しい分類書では化学的分類をとり入れた結果、
比較的明確な区別が属の間ではできるようになつてい
る。しかしなお困難な点があることを述べておきたい。
化学的分類に従うと、上の分離菌は、メソ−ジアミノピ
メリン酸を細胞壁に有することと、マイコール酸の比較
的短鎖のもの（クロマトグラフイーから判断）を含むこ
とからコリネバクテリウム属、カセオバクター（Casecb
acter）属およびロドコツカス（Rhodococcus）属が分類
の候補となる。事実、上記分類書にもこれら３属の間の
区別の困難なことが述べられている。本発明者らは、ロ
ドコツカス属は、ノカルジア形を示すと記載されている
が、上の分類菌ではコリネ形は通常みられるがノカルジ
ア形はみられないので区別されると判定した。また、カ
セオバクター属は１菌種のみ記載されており、絶対好気
性とされ、分類源がチーズであることが記載されてい
る。一方コリネバクテリウム属菌は通気嫌気性のものが
大部分であるが絶対好気性の菌もふくみ、また土から分
離された菌が含まれている。このようなことから本発明
者らは上の分離菌をコリネバクテリウム属の菌と固定し
た。
以下、分離株の性質の共通性に基いて、若干のグループ
に分けて分類学的性質を記載する。先ず全分離株に共通
する性質を述べると、上記したとおり、何れもグラム陽
性、好気性のコリネ形の桿菌であり、胞子をつくらず、
抗酸性も運動性もない。肉汁寒天培養でコロニーは小さ
く、周縁は全淵、隆起は半レンズ〜凸状、表面は平滑で
光沢は半透明で拡散性の色素はつくらない。肉汁液体培
養で、表面に環状に生育し、中等度に濁つた生育をす
る。ゼラチンを液化せず、VPテスト、インドールの生
成、でん粉の加水分解は何れも陰性である。無機窒素源
（硝酸塩およびアンモニウム塩）の利用はグルコース培
地で何れも陽性である。カタラーゼ、脱窒反応、ウレア
ーゼはともに陽性であり、オキシダーゼは陰性である。
Ｏ−ＦテストはHugh Leifson法で酸の生成から発酵性
と判定されるが、ガスの生成は認めない。クエン酸の利
用はKoserの培地で何れも陽性である。リトマスミルク
の反応の変化はほとんどなく、還元、凝固、液化はな
い。糖からの酸生成は第１表に示した以外に、何れも、
Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、イノシトール、Ｄ
−マニトール、グリセリンに対して陽性であり、Ｄ−ガ
ラクトース、シユクロース、ラクトース、マルトース、
でん粉に対して陰性である。ガスの発生は認められな
い。26〜40℃で生育し、20℃では生育しないか、極めて
僅かな生育しかしない。何れも細胞壁中にメソ−ジアミ
ノピメリン酸を有し、また細胞中に比較的短鎖のマイコ
ール酸をふくむ。
に分けて分類学的性質を記載する。先ず全分離株に共通
する性質を述べると、上記したとおり、何れもグラム陽
性、好気性のコリネ形の桿菌であり、胞子をつくらず、
抗酸性も運動性もない。肉汁寒天培養でコロニーは小さ
く、周縁は全淵、隆起は半レンズ〜凸状、表面は平滑で
光沢は半透明で拡散性の色素はつくらない。肉汁液体培
養で、表面に環状に生育し、中等度に濁つた生育をす
る。ゼラチンを液化せず、VPテスト、インドールの生
成、でん粉の加水分解は何れも陰性である。無機窒素源
（硝酸塩およびアンモニウム塩）の利用はグルコース培
地で何れも陽性である。カタラーゼ、脱窒反応、ウレア
ーゼはともに陽性であり、オキシダーゼは陰性である。
Ｏ−ＦテストはHugh Leifson法で酸の生成から発酵性
と判定されるが、ガスの生成は認めない。クエン酸の利
用はKoserの培地で何れも陽性である。リトマスミルク
の反応の変化はほとんどなく、還元、凝固、液化はな
い。糖からの酸生成は第１表に示した以外に、何れも、
Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、イノシトール、Ｄ
−マニトール、グリセリンに対して陽性であり、Ｄ−ガ
ラクトース、シユクロース、ラクトース、マルトース、
でん粉に対して陰性である。ガスの発生は認められな
い。26〜40℃で生育し、20℃では生育しないか、極めて
僅かな生育しかしない。何れも細胞壁中にメソ−ジアミ
ノピメリン酸を有し、また細胞中に比較的短鎖のマイコ
ール酸をふくむ。
以下分離株の性質から更に共通の性質をもつものを群別
して、I,II,III,IVの群に分けて、以上に述べた以外の
分類的性質を第１表に記載する。
して、I,II,III,IVの群に分けて、以上に述べた以外の
分類的性質を第１表に記載する。
以上のような性質を有する菌は夫々の群について数株づ
つ分離された。これらの菌の性質を前記した分類書の記
載と比較するとコリネバクテリウム属として記載されて
いる何れの菌種とも一致するものはなかつた。そこでこ
れらの菌をコリネバクテリウム属菌種（Corynebacteriu
m sp.）と同定して第Ｉ群の代表株6N−23、第II群の代
表株11N−26、第III群の代表株6N−29、第IV群の代表株
6N−49を微生物工業技術研究所（以下微工研と省略す）
に寄託した。
つ分離された。これらの菌の性質を前記した分類書の記
載と比較するとコリネバクテリウム属として記載されて
いる何れの菌種とも一致するものはなかつた。そこでこ
れらの菌をコリネバクテリウム属菌種（Corynebacteriu
m sp.）と同定して第Ｉ群の代表株6N−23、第II群の代
表株11N−26、第III群の代表株6N−29、第IV群の代表株
6N−49を微生物工業技術研究所（以下微工研と省略す）
に寄託した。
微工研に寄託した菌株名と微工研の寄託番号を対応して
示すと次のとおりである。
示すと次のとおりである。
6N−23 ・・・微工研菌寄第9712号 11N−26・・・微工研菌寄第9731号 6N−29 ・・・微工研菌寄第9729号 6N−49 ・・・微工研菌寄第9730号 これらの微生物は、野生株、変異株の何れも使用でき、
微生物またはその培養液から抽出した酵素も本発明に使
用できる。さらに、この酵素活性を有する固定化酵素、
固定化微生物も勿論使用できる。
微生物またはその培養液から抽出した酵素も本発明に使
用できる。さらに、この酵素活性を有する固定化酵素、
固定化微生物も勿論使用できる。
これらの微生物を培養して必要なニトリラーゼ活性をふ
くむ標品をえるには、通常の培養法によればよく、特に
説明を要しないが、基質として用いるカルニチンニトリ
ルを含有する培地に生育せしめた場合にニトリラーゼ活
性の高い培養物をえることができる。また固形培地、液
体培地の何れも使用可能である。
くむ標品をえるには、通常の培養法によればよく、特に
説明を要しないが、基質として用いるカルニチンニトリ
ルを含有する培地に生育せしめた場合にニトリラーゼ活
性の高い培養物をえることができる。また固形培地、液
体培地の何れも使用可能である。
上記のようにしてつくつたニトリラーゼ活性を含む微生
物またはそれによりつくつた酵素標品をカルニチンニト
リルに作用せしめる方法は、基質をふくむ溶液に酵素標
品を加えて反応が進行するまで培養すればよいが、微生
物を酵素標品とする培養は微生物の培養液に基質を加え
て反応せしめてもよく、また、微生物の培養液から分離
した酵素標品、菌体、洗浄菌、凍結乾燥菌体、アセトン
乾燥菌体など物理化学的、生化学的に処理した菌体、抽
出液、精製物、固定化処理標品などの形でも基質と接触
せしめることができる。
物またはそれによりつくつた酵素標品をカルニチンニト
リルに作用せしめる方法は、基質をふくむ溶液に酵素標
品を加えて反応が進行するまで培養すればよいが、微生
物を酵素標品とする培養は微生物の培養液に基質を加え
て反応せしめてもよく、また、微生物の培養液から分離
した酵素標品、菌体、洗浄菌、凍結乾燥菌体、アセトン
乾燥菌体など物理化学的、生化学的に処理した菌体、抽
出液、精製物、固定化処理標品などの形でも基質と接触
せしめることができる。
基質濃度は、バツチ式、連続式の何れによるかによつて
も異るが、バツチ式では一般に媒質中0.1〜30％、好ま
しくは0.5〜10％程度で、連続式ではこれよりやゝ濃度
を低下させた方がよい。
も異るが、バツチ式では一般に媒質中0.1〜30％、好ま
しくは0.5〜10％程度で、連続式ではこれよりやゝ濃度
を低下させた方がよい。
反応は、普通５〜60℃、好ましくは25〜50℃附近、pH4
〜10附近で行われる。反応時間は、静置、撹拌、流下等
の手段、あるいは酵素標品の形態、力価によつて異つて
くるので一様ではないが、バツチ法では通常１〜150時
間程度である。
〜10附近で行われる。反応時間は、静置、撹拌、流下等
の手段、あるいは酵素標品の形態、力価によつて異つて
くるので一様ではないが、バツチ法では通常１〜150時
間程度である。
反応の進行は、薄層クロマトグラフイーによりカルニチ
ンの生成を追跡して、あるいはベアソンらの酵素法によ
るＬ−カルニチンの分析により行なう。総カルニチン中
に占めるＬ体のＤ体と比率あるいは光学純度は、反応液
からシリカゲルのクロマトグラフイーによりカルニチン
を分離し、Ｌ−フエニルアラニンのカルニチンアミドに
変換した後、高速液体クロマトグラフイーでＬ−フエニ
ルアラニンのＬ−カルニチンアミドとＬ−フエニルアラ
ニンのＤ−カルニチンアミドの両者の面積比で決定する
ことができる。反応終了後、反応液をイオン交換樹脂の
カラムにかけ、稀塩酸で溶出、濃縮することによりＬ−
カルニチンクロライドとして回収される。
ンの生成を追跡して、あるいはベアソンらの酵素法によ
るＬ−カルニチンの分析により行なう。総カルニチン中
に占めるＬ体のＤ体と比率あるいは光学純度は、反応液
からシリカゲルのクロマトグラフイーによりカルニチン
を分離し、Ｌ−フエニルアラニンのカルニチンアミドに
変換した後、高速液体クロマトグラフイーでＬ−フエニ
ルアラニンのＬ−カルニチンアミドとＬ−フエニルアラ
ニンのＤ−カルニチンアミドの両者の面積比で決定する
ことができる。反応終了後、反応液をイオン交換樹脂の
カラムにかけ、稀塩酸で溶出、濃縮することによりＬ−
カルニチンクロライドとして回収される。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１ グルコース0.5％、ペプトン0.25％、肉エキス0.15％、
酵母エキス0.15％、NaCl0.125％、DL−カルニチンニト
リル・クロライド1.0％の組成の培地（pH7.2）を30ml入
れた300mlの三角フラスコに第２表に示した菌株を植菌
して26℃で72時間培養したものを遠心分離して菌体をえ
る。これを水にけん濁して遠心分離した後、DL−カルニ
チンニトリル・クロライドをふくむ100mMりん酸ナトリ
ウム−水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.0）に加えてもと
の生育培養の濃度とし、同時にDL−カルニチンニトリル
・クロライドの濃度は５％としたものを調製する。この
液50mlをふくむ300ml三角フラスコを26℃で72時間静置
反応させたとき反応液中には左旋性の光学活性カルニチ
ンが生成していた。酵素法による分析結果は第２表に示
したＬ−カルニチン濃度であり、生成カルニチン中のＬ
−カルニチンの含量（Ｌ体の比率は第２表に示したとお
りであつた。
酵母エキス0.15％、NaCl0.125％、DL−カルニチンニト
リル・クロライド1.0％の組成の培地（pH7.2）を30ml入
れた300mlの三角フラスコに第２表に示した菌株を植菌
して26℃で72時間培養したものを遠心分離して菌体をえ
る。これを水にけん濁して遠心分離した後、DL−カルニ
チンニトリル・クロライドをふくむ100mMりん酸ナトリ
ウム−水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.0）に加えてもと
の生育培養の濃度とし、同時にDL−カルニチンニトリル
・クロライドの濃度は５％としたものを調製する。この
液50mlをふくむ300ml三角フラスコを26℃で72時間静置
反応させたとき反応液中には左旋性の光学活性カルニチ
ンが生成していた。酵素法による分析結果は第２表に示
したＬ−カルニチン濃度であり、生成カルニチン中のＬ
−カルニチンの含量（Ｌ体の比率は第２表に示したとお
りであつた。
実施例２ 菌株として6N−49を用い、生育培養の培地として、グル
コース１％、NH4Cl 0.1％、ペプトン0.5％、NaCl 0.5
％、K2HPO4 0.75％、KH2PO4 0.25％、MgSO4・7H2O
0.05％、FeSO4・7H2O 0.01％、DLカルニチンニトリル
・クロライド１％の組成の培地（pH7.2）を用いる他は
実施例１と同様に実施した。反応72時間で反応液中に左
旋性のカルニチンが生成し、Ｌ−カルニチンの濃度は1
8.1mg／ml、カルニチン中のＬ−カルニチンの率は60.5
％であつた。反応120時間ではＬ−カルニチンの生成量
は22.17mg／mlであつた。
コース１％、NH4Cl 0.1％、ペプトン0.5％、NaCl 0.5
％、K2HPO4 0.75％、KH2PO4 0.25％、MgSO4・7H2O
0.05％、FeSO4・7H2O 0.01％、DLカルニチンニトリル
・クロライド１％の組成の培地（pH7.2）を用いる他は
実施例１と同様に実施した。反応72時間で反応液中に左
旋性のカルニチンが生成し、Ｌ−カルニチンの濃度は1
8.1mg／ml、カルニチン中のＬ−カルニチンの率は60.5
％であつた。反応120時間ではＬ−カルニチンの生成量
は22.17mg／mlであつた。
反応120時間の反応液を強酸性陽イオン交換樹脂（ナト
リウム型）カラムに通して、カルニチンとカルニチンニ
トリルを吸着させ、ついで酢酸アンモニウムの稀薄溶液
を流してカルニチンをカルニチンニトリルより分けてカ
ルニチン分画を濃縮し、アルコール添加冷却することに
より、左旋性カルニチンを回収した。
リウム型）カラムに通して、カルニチンとカルニチンニ
トリルを吸着させ、ついで酢酸アンモニウムの稀薄溶液
を流してカルニチンをカルニチンニトリルより分けてカ
ルニチン分画を濃縮し、アルコール添加冷却することに
より、左旋性カルニチンを回収した。
実施例３ 使用菌株として6N−49を用い、生育培地としてグリセリ
ン３％、ペプトン0.5％、肉エキス0.3％、酵母エキス0.
3％、NaCl 0.25％の組成の培地（pH7.2）を用いる他
は、実施例１と同様に実施した場合、反応48時間のＬ−
カルニチン生成量は24.4mg／mlであつた。
ン３％、ペプトン0.5％、肉エキス0.3％、酵母エキス0.
3％、NaCl 0.25％の組成の培地（pH7.2）を用いる他
は、実施例１と同様に実施した場合、反応48時間のＬ−
カルニチン生成量は24.4mg／mlであつた。
実施例４ 実施例１の如く培養してえた菌株6N−49の菌体を200mg
／mlの濃度になるよう生理食塩水に懸濁した液10mlに４
％アルギン酸ナトリウム液10mlを加え混合した後、15％
の塩化カルシウム溶液にこの混合液を徐々に滴下して、
粒状の固定化菌体をえた。この固定化菌体全量をDL−カ
ルニチンニトリル・クロライド１％をふくむpH7.0の燐
酸緩衝液20mlに加え、30℃で16時間反応させたところ、
Ｌ−カルニチン（塩酸塩）が1.6mg／mlの濃度に生成し
ていた。
／mlの濃度になるよう生理食塩水に懸濁した液10mlに４
％アルギン酸ナトリウム液10mlを加え混合した後、15％
の塩化カルシウム溶液にこの混合液を徐々に滴下して、
粒状の固定化菌体をえた。この固定化菌体全量をDL−カ
ルニチンニトリル・クロライド１％をふくむpH7.0の燐
酸緩衝液20mlに加え、30℃で16時間反応させたところ、
Ｌ−カルニチン（塩酸塩）が1.6mg／mlの濃度に生成し
ていた。
発明の効果 本発明は上述したようにカルニチン合成の中間体で安価
に合成されるDL−カルニチンニトリルに微生物またはそ
の生産する酵素を作用させて、カルニチン、特に光学活
性のＬ−カルニチンを収率よく生成せしめるもので、工
業的な光学活性カルニチンの製法を提供するものであ
る。
に合成されるDL−カルニチンニトリルに微生物またはそ
の生産する酵素を作用させて、カルニチン、特に光学活
性のＬ−カルニチンを収率よく生成せしめるもので、工
業的な光学活性カルニチンの製法を提供するものであ
る。
Claims (3)
- 【請求項１】カルニチンニトリルを加水分解してカルニ
チンを生成せしめる能力を有するコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属する微生物もしくは、
該微生物またはその培養液から得られるニトリラーゼを
カルニチンニトリルに作用せしめてカルニチンを生成せ
しめることを特徴とするカルニチンの製造法。 - 【請求項２】生成するカルニチンが光学活性体である特
許請求の範囲第１項記載の製造法。 - 【請求項３】使用する微生物が菌株6N−23（微工研菌寄
第9712号）、11N−26（微工研菌寄第9731号）、6N−29
（微工研菌寄第9729号）または6N−49（微工研菌寄第97
30号）である特許請求の範囲第１項記載の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62305830A JPH0669381B2 (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | カルニチンの製造法 |
| US07/279,004 US5041375A (en) | 1987-12-04 | 1988-12-02 | Method of producing carnitine |
| KR1019880016137A KR890010206A (ko) | 1987-12-04 | 1988-12-03 | 카르니틴의 제조방법 |
| DE8888311489T DE3878421T2 (de) | 1987-12-04 | 1988-12-05 | Verfahren zur herstellung von carnitin. |
| EP88311489A EP0319344B1 (en) | 1987-12-04 | 1988-12-05 | Method of producing carnitine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62305830A JPH0669381B2 (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | カルニチンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01148192A JPH01148192A (ja) | 1989-06-09 |
| JPH0669381B2 true JPH0669381B2 (ja) | 1994-09-07 |
Family
ID=17949887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62305830A Expired - Lifetime JPH0669381B2 (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | カルニチンの製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
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| EP (1) | EP0319344B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0669381B2 (ja) |
| KR (1) | KR890010206A (ja) |
| DE (1) | DE3878421T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5210031A (en) * | 1989-07-20 | 1993-05-11 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Process for the production of R(-)-4-halo-3-hydroxybutyronitrile |
| JP2684238B2 (ja) * | 1990-10-09 | 1997-12-03 | 旭化成工業株式会社 | アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法 |
| US6060265A (en) * | 1996-12-18 | 2000-05-09 | Cytec Technology Corporation | Methods for the detoxification of nitrile and/or amide compounds |
| US5863750A (en) * | 1996-12-18 | 1999-01-26 | Cytec Tech Corp | Methods for the detoxification of nitrile and/or amide compounds |
| US6368804B1 (en) * | 1999-07-12 | 2002-04-09 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells |
| US20240228429A1 (en) * | 2023-01-04 | 2024-07-11 | Hubei Xujie Pharmaceutical Co., Ltd | Process for producing l-carnitine |
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|---|---|---|---|---|
| FR2294999A1 (fr) * | 1974-12-18 | 1976-07-16 | Anvar | Procede de preparation d'amides par hydrolyse biologique |
| IT1142201B (it) * | 1980-06-24 | 1986-10-08 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Procedimento per la produzione enzimatica di l-carnitina |
| US4366250A (en) * | 1980-09-24 | 1982-12-28 | Anvar | Preparation process of optically active α-aminated acids by biological hydrolysis of nitriles |
| US4642290A (en) * | 1982-12-06 | 1987-02-10 | Sih Charles J | Process for preparing a compound for use in the production of L-carnitine |
| JPS59183694A (ja) * | 1983-04-05 | 1984-10-18 | Hamari Yakuhin Kogyo Kk | 光学活性なカルニチンの生化学的製造法 |
| ZA852808B (en) * | 1984-04-20 | 1985-11-27 | Wisconsin Alumni Res Found | Process for preparing l-carnitine |
| DK261685A (da) * | 1985-06-11 | 1986-12-12 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af optisk aktive, organiske forbindelser |
| GB2195630B (en) * | 1986-08-26 | 1990-07-18 | Chuo Kaseihin Co Inc | Method for producing carnitine, l-carnitineamide hydrolase and method for producing same |
-
1987
- 1987-12-04 JP JP62305830A patent/JPH0669381B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-12-02 US US07/279,004 patent/US5041375A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-03 KR KR1019880016137A patent/KR890010206A/ko not_active Ceased
- 1988-12-05 DE DE8888311489T patent/DE3878421T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-05 EP EP88311489A patent/EP0319344B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3878421D1 (de) | 1993-03-25 |
| US5041375A (en) | 1991-08-20 |
| EP0319344A2 (en) | 1989-06-07 |
| EP0319344A3 (en) | 1990-05-30 |
| KR890010206A (ko) | 1989-08-07 |
| EP0319344B1 (en) | 1993-02-10 |
| DE3878421T2 (de) | 1993-06-03 |
| JPH01148192A (ja) | 1989-06-09 |
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