JPH01228472A - 補酵素の固定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は補酵素の固定化法に関するものである。

さらに詳細に述べれば補酵素をフィブロイン膜にて包括
することを特徴とする補酵素の固定化法に関するもので
ある。

（従来の技術） ある種の酵素反応にはＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨ，ＮＡＤ，
ＮＡＤＰ，ＡＴＰなどの補酵素が必要である。これら補
酵素は高価であるため、回収再使用することが望ましい
が、補酵素はたんぱく質である酵素に比べて分子量が小
さく、包括法による固定化は困難であった。この点から
従来は補酵素を固定化する方法として、補酵素をポリエ
チレングリコールなどの高分子化合物で化学修飾し、高
分子化して固定化する方法が提案されている。この方法
は一部で実用化されているが、補酵素の化学修飾によっ
て酵素との親和性が低下し、酵素反応速度が低下するな
どの問題点が生じている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者は上記した従来の問題点を解決するために補酵
素の機能性、経済性に優れた固定化方法を提供しようと
していろいろと研究を重ねてきたが、フィブロイン膜が
補酵素の固定化に使えることを見い出し、ここに本発明
を完成するに至った。

（課題を解決するための手段） 即ち本発明は補酵素をフィブロイン膜にて包括すること
を特徴とする補酵素の固定化法である。

以下に本発明の詳細を説明する。

フィブロイン膜のフィブロインは絹糸虫のつくる繭から
採取される。フィブロイン膜はその製法には限定されず
、例えばフィブロイン水溶液を乾燥し、エタノールに浸
漬して不溶化処理したものや、フィブロイン水溶液にグ
リセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコー
ルなどのポリオール類を混合して乾燥し、不溶化処理し
て製造されたものが使用できる。

（実施例）と（作用） 以下に本発明の実施例と作用を説明する。

実施例１ 繭層４ｇを熱水中でよくほぐし、０．５％（ｗ／ｖ））
ブリジエー３５（ポリオキシエチレンラウリルアルコー
ルエーテル）水溶液２００ｍｌに浸した。これを沸騰水
中で湯せんにかけて４０分間撹拌した。解した繭層を新
しいブリジエー３５水溶液に入れ、同じ操作を繰り返し
た。その後３％炭酸ナトリウム、温水、水、蒸留水の順
で洗浄した。この結果、約３．５ｇの純フィブロインを
得た。

得られた純フィブロイン３．０ｇを２００ｍｌの９．３
Ｍ臭化リチウム水溶液に浸し、４０℃でインキュベート
した。１２時間後、フィブロインが完全に溶解したのを
確認した後、室温で４８時間蒸留水に対して透析した。

透析後、１８０００ｇで３０分間遠心し、沈殿を除去し
た上清を液状フィブロインとした。この液状フィブロイ
ンをガラス板に流し、４０℃で乾燥した。得られた膜を
９５％エタノールに４時間浸し、不溶化したフィブロイ
ン膜を得た。膜厚は乾燥状態で約７０μｍであった。

高さ４．５ｃｍ、直径３ｃｍのプラスチック製円筒容器
の底に直径２ｃｍの穴をあけ、ここにフィブロイン膜を
貼付した。漏水のないのを確認した後、第１表に示した
１ｍＭの各種補酵素を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７．２）５ｍｌを内部に入れた。次にこの容器
全体を２０ｍｌの純水を入れたビーカーに浮かべ、内液
と外液の液面の高さをあわせた。内液をスターラーで撹
拌しながら、１，２，３，４，５，６，２４時間毎に外
液中の補酵素濃度を測定した。

濃度の測定は２６０ｍｍにおける吸光度を測定すること
により行った。実験は２８℃で行った。第１表に結果を
表す。

単位はμＭ 漏出率＝外液の各補酵素のモル数／最初に内液を入れた
補酵素のモル数 第１表に示すように補酵素の漏出率は２４時間経過後で
３〜５％に留まり、本発明方法によって補酵素が固定化
されていることが示された。なおフィブロイン水溶液に
ポリオール類を混合して乾燥し調整したフィブロイン膜
を用いた結果も第１表と同様であり、この発明方法にお
いては適用されるフィブロイン膜はその製造方法に限定
されないことが明らかとなった。

実施例２ 補酵素と酵素をフィブロイン膜で同時固定化し、ピルビ
ン酸とアンモニアをアラニンに転換するバイオリアクタ
ーを作製した。実施例１で用いた器具の内側に３ｍＭ、
ＮＡＤＨ、シグマ社製アラニン脱水素酵素（Ａ−７６５
３，５８ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）０．１ｍｇ、シグマ社製ア
ルコール脱水素酵素（Ａ−７０１１，３００ｕｎｉｔｓ
／ｍｇ）１ｍｇ、ナトリウムアジド１ｍｇを含む０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）５ｍｌを入れた。こ
の容器を４ｍｇのナトリウムアジドを含む０．７Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２０ｍｌに浮かべ、内液と
外液の液面の高さをあらわせた。

２８℃で内液を撹拌しながら、１２時間ごとに０．５Ｍ
ピルビン酸カリウム、１Ｍ塩化アンモニウムを含む１Ｍ
トリズリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）２００μｌおよび９
８％エチルアルコール１６．６μｌを内液に加えた。ま
た１２時間ごとに外液を交換し、１２時間ごとのアラニ
ン量を島津ＬＣ−６Ａ高速液体クロマトグラフで定量し
た。この結果を第２表に示す。

アラニン量：その時間までに生成したアラニンの積算量 転換効果：アラニン量／その時間までに加えたピルビン
酸カリウム量の積算量 第２表に示すように、ピルビン酸からアラニンへの転換
効率は７２時間までにはほとんど変化しなかった。即ち
本発明のバイオリアクターへの応用において、反応効果
の低下を招くような酵素・補酵素の漏出は認められなか
った。

（発明の効果） 本発明は以上説明した通りの構成であり、フィブロイン
膜により補酵素を包括し、固定化するもので、補酵素自
体に修飾を行なわないため、補酵素の機能低下を伴わず
、簡便で経済性に優れている。

また、本発明は酵素反応のバイオリアクターへの応用に
おいて、反応効果の低下を招くような酵素・補酵素の漏
出は認められず好成績をあげることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）補酵素をフィブロイン膜にて包括することを特徴
   とする補酵素の固定化法。