JPS5950312B2 - 酵素もしくは微生物菌体の固定化法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素または微生物菌体の固定化方法に関する
。

詳しくは、活性度の大幅な低下を招かずに、酵素または
微生物菌体を固形有機重合体中に固定化する方法に関す
る。

従来、酵素または微生物菌体の固定化方法として、たと
えばポリアクリルアミド等の親水性有機重合体を水溶液
の状態でゲル化せしめ、その際に酵素等を添加しておく
ことにより包括する方法がとられていた。

このような包括法は、酵素等を担体と化学的に結合せし
めるいわゆる担体結合法とは異なり、それら自身が直接
に化学的変化をおこすことがないため、担体結合法と比
較して活性の低下をきたすことの少ないすぐれた固定化
方法ではあるが、親水性を機重合体をゲル状態に硬化さ
せるためのエネルギー源として電離放射線を用いたり、
硬化速度を増大するための種々の触媒などの試薬類を添
加したりするため、さらに親水性有機重合体のゲル化時
に発熱がおこるために、酵素等が失活せしめられるおそ
れもあり、ゲル形成の条件の選択には細心の注意を払う
必要があった。

また、水溶液状態から親水性有機重合体をゲル化させた
膜は、空隙が小さいため、酵素もしくは微生物菌体に必
要な水分の透過性に問題があった。

一方、溶質、溶剤、非溶剤及び酵素の混合液又は分散液
を薄層状にして溶剤、非溶剤を揮発乾燥させて、微孔膜
中に酵素を固定化する方法が特開昭５１−１１５９９０
号公報に示されているが、この方法によっても酵素活性
を充分に発揮することができなかった。

本発明者らは、従来の酵素等の固定化方法における上記
のような難点を解消し、酵素等を失活させることなしに
、固形有機重合体に容易に固定化する新規な方法を提供
するため、種々検討を重ねた結果、本発明を完成するこ
とができた。

すなわち本発明は、連続水相中に酵素または微生物菌体
を含有する有機重合体の水性分散液を基体に塗布または
含浸せしめたのち、分散媒である水を揮散させて有機重
合体を固定化せしめることを特徴とする酵素もしくは微
生物菌体の固定化法である。

本発明の固定化法において、固定化は水が揮散して有機
重合体粒子が融着する際に生ずる空隙部で行なわれるた
めに、その過程で酵素等自身が、担体結合法によるよう
な直接化学変化を生ぜしめられないことはもちろん、固
定化には電子線エネルギーや触媒などの試薬を用いる必
要がない。

また、水が揮散し、分散粒子が互いに融着し、乾燥する
際、発熱のおそれがないため、酵素もしくは微生物菌体
の失活のおそれがきわめて少ない。

しかも酵素もしくは微生物菌体が有機重合体の分散粒子
の連接によって生ずる網目状構造中に強固に包括される
ので、固定化酵素等の安定性は、従来の担体結合法など
と新較していささかの途色も認められない。

さらに、水が揮散し、乾燥した塗膜は、有機重合体の分
散粒子が融着した形となっているだめ多くの空隙を有し
、透水性が優れており、また強固であるため、酵素もし
くは微生物菌体の担体としては理想的なものである。

本発明の適用を受ける酵素まだは微生物菌体の種類とし
ては、水に溶解もしくは分散せしめることができ、しか
も種々の基質に対して有用な化学的もしくは生物学的作
用を及ぼし得る活性を有するもので、有機重合体を著し
ぐ変質せしめるおそれのないものでさえあれば除外され
ることはない。

それらのうちの代表的なものを例示するならば、たとえ
ば下記のようなものがある。

すなわち、酵素としては、アミラーゼ、ウレアーゼ、グ
ルコースオキシターゼ、グルコアミラーゼ、グルコース
イソメラーゼ、カタラーゼ、インベルターゼ、ラクター
ゼ、Ｌ−アミイ酸オキシターゼ、Ｄ−アミノ酸オキシタ
ーゼ、α−ガラクトシターゼ、アミノアシラーゼ、アス
パルターゼ、ペニシリナーゼ、ヘニシリンアミターゼ、
トリプシン、パパイン、ポリフェノールオキシターゼ、
ナリンギナーゼ、アスパラギナーゼ、フマラーゼ、メリ
ピアーゼ、ムタロターゼ、パーオキシターゼ、アルコー
ルオキシターゼ、β−グルコシターゼ、乳酸デヒドロゲ
ナーゼ、プロテアーゼおよびチロシン・フェノール・リ
アーゼなどがあり、微生物菌体としては、ラクトバチル
ス・ブルガリス、アエロバクターアエロゲネス、バチル
スズブチリス、アゾトパクターピネランデイ、プロテウ
ス・ブルガリスおよびクロエラケラなどを挙げることが
できる。

これらの酵素または微生物菌体の担体となる有機重合体
の水性分散液には種々のものがある。

たとえば乳化重合体エマルションすなわちポリビニルエ
ステルエマルション（ポリ酢酸ヒニルエマルション、ホ
リフロビオン酸ビニルエマルションなト）、エチレン・
酸ビニル共重合体エマルション、ポリ塩化ビニルエマ
ルション、アクリル樹脂（アクリル酸エステルまたはメ
タクリル酸エステルをモノマーの主要部とする共重合体
〕エマルション、ポリスチレンエマルション、スチレン
・フタジエン共重合体エマルション、フッ素樹脂エマル
ション等の付加重合体系合成樹脂エマルション、酸性基
を有する有機縮重合物の塩の水性分微液、すなわちカル
ボ十シル基、リン酸基、スルホン基等の酸性基を有し、
それ自身では水分散性を有しない有機縮重合物だとえは
ポリエステル（アルキド樹脂）、変性エポキシ樹脂、ア
クリル樹脂等の酸性基の全部もしくは一部を塩基物質で
中和し造塩して水分散化したエマルション、天然ゴムラ
テックス等の天然有機重合体の水分散液などが挙げられ
る。

それらの有機重合体の平均分子量については、特に制限
はないが、分散粒子の平均粒径は０，０１〜５ミクロン
、とくに０，０２〜１ミクロンのものが好ましい。

平均粒径が０，０１ミクロン未満であると、それらの粒
子が連接し部分的に融合して生ずる網状構造の空隙部は
極めて微細となるため酵素分子または微生物菌体を収容
し包括することができないため、酵素等に対する固定化
効果が充分ではない。

また平均粒径が５ミクロンをとれる場合には、生成する
網状構造の空隙が粗大であり、−たん包括した酵素等が
基質との作用時に容易に溶離するため、得られた成形物
を永続的に繰返し使用するには不適当である。

これらの有機重合体分散液には、界面活性剤、可塑剤、
少量の有機溶剤、顔料、その他の添加剤等の成分が添加
されていてもよい。

有機重合体の水性分散液に対する酵素等の添加割合は、
通常有機重合体に対し固形分比で０，０１〜１５０重量
％、好ましくは０，１〜１００重量％の範囲である。

０．０１重量％未満では塗布および／’ｔたは含浸後、
分散媒を揮散させて得られる成形物中における酵素等が
極端な低濃度のため、使用時に基質に対する作用が微弱
であり、１５０重量％をこえる量添加しても、完全に包
括されず、溶脱しやすい部分が増大するため経済的に不
利である。

酵素等の添加方法についてはとくに制限はなく、固体の
ｉｔ得られるものであっても水に溶解まだは分散しやす
いものならばそのまま直接に添加してよく、水けん濁液
または水溶液としたものならばもちろんそのまま混合で
きる。

塗布または含浸される基体の形状は、分散媒を揮散させ
るについての支障さえなければとくに限定されないが、
通常種々の吸収性を有するものや有しないものが基体（
支持体）として用いられる。

支持体とされる物体は、その材質として金属、ガラス、
プラスチックス、ゴム、セロファン、セラミック材料、
木材管種々のものがあり、それらの板状体、膜状体、線
状体、管状体、塊状体などが用いられる。

吸収性を有する基体としては、繊維状物（有機質もしく
は無機質）の集積物、紡績物もしくは編織物、発泡プラ
スチック等の多孔物質、有機質もしくは無機質の粉粒状
物を使用することができる。

本発明において基体に塗布する場合、１回塗りでも数回
塗り重ねでもよく、１ｍをこえる厚さに塗布しても、効
果がそれ以上あがらず、また乾燥されにくくなるので、
通常、乾燥膜厚が１ｍｍ以下となるように塗布する。

連続水相中に酵素等を添加された有機重合体の：水性分
散液を基体に塗布または含浸させた後、水を揮散させる
には、通常室温以下の温度で空気中に放置するが、酵素
等を著しく失活させない範囲内（通常６０℃以下）で加
熱してもよく、また送風、減圧などの操作によって揮散
を促進することができる。

基体に塗布した場合、必要に応じ、分散媒の揮散後には
がし取って、支持体のない膜状物として用いてもよい。

本発明方法、および本発明方法によって得られる活性有
機重合体は、前記の特長のほかに次のような長所を有し
ている。

すなわち、本発明における有機重合体として、塗料用、
接着剤用など容易に入手し得る有機重合体の水性分散液
をそのまま利用することもできるので、きわめて簡便に
、ｈつ低コストで製造することができる。

しかも、本発明方法によって得られる、酵素等を含有す
る、乾燥した活性有機重合体は、酵素等を多量に包括す
ることができ、使用中における、酵素または微生物菌体
の溶離による損失がきわめて少なく、かつ基質に対する
接触も能率的に行なえる。

さらに得られた機械的強度が大きく、膨しゅん、変形の
おそれがほとんどないので、広範囲の使用条件に適応で
きる。

したがって、添加される酵素等の種類に応じ、各種の用
途−た７とえば食品、医薬品等の製造、もしくは加工、
センサーとしての用途などに用いてきわめて有利な結果
が得られる。

本発明によって得られる活性有機重合体は、従来の親水
性有機重合体から得られるものと比較して、強度、酵素
などの捕捉力、酵素などの活性度透水性、膨潤のおそれ
のないことなど、酵素もしくは微生物菌体を含有する重
合体として極めて優れたものである。

次に、実施例をあげて本発明を説明する。

実施例 １ アクロナールＨ８−１９０エマルシヨン（商品名、油化
パーディツシュ（株）製造品、スチレン−アクリル系共
重合体 加熱残分５０重量％、平均粒径０，０４ミクロ
ン）１０部（重量部、以下同じ）グルコースオキシター
ゼ（カタラーゼを含む）０．５重量％を含む０．ＩＭＩ
Ｊン酸緩衝液５部および活性白土１部を混合しかきまぜ
て均一にしたのち、５００ミクロンのドクターブレード
を用いてガラス板上に塗布した。

２５℃で１０時間乾燥させたのち、ガラス板からはがし
取ることによって、可撓性の良好な乳白色の膜が得られ
た。

この膜から５部ＭｒＬ×５ｒＩｒｒｒＬの小片を１０枚
切りとり、１重量％グルコース水溶液２０ｍ１を基質と
して、４０℃で１０分間かきまぜながら反応させ、生成
したグルコン酸を０．ＩＮのＫＯＨで中和滴定を行なっ
た結果、固定化しない酵素と比較して７０％の活性を有
することが認められた。

実施例 ２ ＥＸ−１００４エマルシヨン（商品名、三菱レイヨン（
来製造品、メチルメタクリレート／ｎ−ブチルメタクリ
レート／酸の共重合体 加熱残分３５重量％、平均粒径
０，０３ミクロン）１０部と０．１％ウレアーゼ緩衝液
５部とからなる混合液に、厚さ１００ミクロンのポリエ
ステルフィルムを浸漬して引き上げ、つり下げて３０℃
で１５時間風乾シた。

このエマルション被覆フィルムの厚さは、その上端部を
除くと約２１０ミクロンであった。

このエマルション被覆フィルムから切り出した５ｍｍＸ
５ｍの小片１０枚を、基質としてのウレア０．０１モル
／ｌを含む３０℃の０．０１ Ｍｏ ｆ−リン酸緩衝液
２０ｍＡに浸漬した。

３０分後に反応液５ｍｌをとり、０．ＩＮ塩酸５ｍｔを
加えたのち、０．ＩＮのＮａ ＯＨで逆滴定した結果、
上記被覆フィルム中のウレアーゼが固定化しないウレア
ーゼに対して５０％の活性を有することが認められた。

実施例 ３ ＶｎｎｃｏａｔＧ−１３３ニーｑルション（商品名、大
日本インキ化学工業（ａ）製造品、アクＩＪ ｆｉｙ系
エマルション 加熱残分４５重量％、平均粒径０，１１
ミクロン）１０部およびインベルターゼを１重量％にな
るように溶解させた０、ＩＭ＝酢酸緩衝液（ｐＨ５，０
）５部とから得られる混合液をナイロンネットに含浸さ
せ、２３℃で２０時間風乾して厚さ約０，２闘の網入り
樹脂膜を作成した。

この網入り樹脂膜から切り出した１ ０ｒｒｒｍＸ １
０ｒｒｖｎの小片１０枚を、４０℃の５０ｍＭショ糖水
浴液２０ｍ１に浸漬し、１０分間かきまぜを続けて反応
させた。

反応液についてグルコスタット（藤沢メディカルサプラ
イ （株）製造品〕液を用いて生成ブドウ糖の定量を行
なった結果、固定化しないインベルターゼに対して５２
％の活性を有することが認められた。

実施例 ４ Ｔｃｃｒｙｌ ＢＣＸ−４３４９エマルション（商品名
、東洋インキ製造（株）製造品、アクリル系エマルショ
ン、加熱残分４０重量％、平均粒径０，０４ミクロン）
１０部と、クロエラケラ種酵母を含有量約３０重量％に
なるようにけん濁させた０、 Ｉ Ｍｏ１−リン酸緩衝
液（ｐＨ７，２）１０部とからなる混合液を、水平に配
置されたポリプロピレンシート上に置かれた厚さ０．３
ｍのスペーサー枠内に流しこみ、３０℃、１０時間の風
乾後剥離することによって乳白色の菌体膜が得られた。

この菌体膜から切り出した１０ｍＸ１０咽の小片１０枚
を、０、ｌＭｏ１−リン酸緩衝液中の２０ｍＭｏｌ−Ｈ
２０２溶液に３０℃で浸漬し、かき捷ぜながら反応させ
た。

５分後の２４０ｎｍの紫外吸光度の変化から、上記菌体
膜が、カタラーゼ活性を顕著に有することが認められた
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 連続水相に酵素もしくは微生物菌体を含有せしめた
   有機重合体の水性分散液を、基体に塗布または含浸せし
   めた後、水を揮散させて有機重合体を固形化せしめるこ
   とを特徴とする酵素もしくは微生物菌体の固定化法。