JPH01228473A - 新規な組み換え体ｄｎａおよびグルタチオンの製造法 - Google Patents
新規な組み換え体ｄｎａおよびグルタチオンの製造法Info
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- JPH01228473A JPH01228473A JP63052659A JP5265988A JPH01228473A JP H01228473 A JPH01228473 A JP H01228473A JP 63052659 A JP63052659 A JP 63052659A JP 5265988 A JP5265988 A JP 5265988A JP H01228473 A JPH01228473 A JP H01228473A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野］
本発明は、新規な組み換え体ＤＮＡおよびグルタチオン
の製造法に関する。
の製造法に関する。
従来、グルタチオンは、有機合成、微生物（特に酵母）
菌体から抽出する方法および遺伝子組み換えにより、グ
ルタチオン合成に関する２種の酵素、γ−グルタミルー
し一システィン合成酵素（以下ＧＳＨ−１と略称する）
とグルタチオン合成酵素（以下ＧＳＨ−ＩＩと略称する
）活性が増強された大腸菌により製造する方法等で製造
されている。
菌体から抽出する方法および遺伝子組み換えにより、グ
ルタチオン合成に関する２種の酵素、γ−グルタミルー
し一システィン合成酵素（以下ＧＳＨ−１と略称する）
とグルタチオン合成酵素（以下ＧＳＨ−ＩＩと略称する
）活性が増強された大腸菌により製造する方法等で製造
されている。
グルタチオンは、グルタミン酸、システィン、グリシン
よりなるトリペプタイドであり、広範な肝疾患の治療薬
として、あるいは、生化学試薬として頻用される重要な
化合物である。
よりなるトリペプタイドであり、広範な肝疾患の治療薬
として、あるいは、生化学試薬として頻用される重要な
化合物である。
〔発明が解決しようとする課題］
しかしながら、前二者の方法は、反応工程の長さとその
複雑さにおいて、ま・た、煩雑な操作と菌体内低含量の
ために必ずしも有利な方法とは言えず、更に後者におい
てもＧＳＨ−１活性が低いことによりグルタチオン生産
が制限される等の問題があり、より効率の優れた生産方
法の開発が望まれている。
複雑さにおいて、ま・た、煩雑な操作と菌体内低含量の
ために必ずしも有利な方法とは言えず、更に後者におい
てもＧＳＨ−１活性が低いことによりグルタチオン生産
が制限される等の問題があり、より効率の優れた生産方
法の開発が望まれている。
〔課題を解決するための手段］
そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々
検討した結果、ＧＳＨ−１をコードする遺伝子（以下Ｇ
ＳＨ−１遺伝子と略称する）を含有するＤＮＡおよびＧ
ＳＨ−ＩＩをコードする遺伝子（以下ＧＳＨ−Ｉｆ遺伝
子と略称する）を含有するＤＮＡをバクテリオファージ
ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、この
組み換え体をエッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
）属に属する菌株に含ませたグルタチオン生産能を有す
る菌株を培地に培養し、培養物よりグルタチオンを採取
するか、もしくは、該微生物菌体および／または菌体処
理物をグルタミン酸、システィン、グリシン、アデノシ
ン−５′−３リン酸およびマグネシウムイオンと接触作
用させることにより従来法と比較して高収率にグルタチ
オンを生産できること等の知見を得、本発明を完成した
。
検討した結果、ＧＳＨ−１をコードする遺伝子（以下Ｇ
ＳＨ−１遺伝子と略称する）を含有するＤＮＡおよびＧ
ＳＨ−ＩＩをコードする遺伝子（以下ＧＳＨ−Ｉｆ遺伝
子と略称する）を含有するＤＮＡをバクテリオファージ
ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、この
組み換え体をエッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
）属に属する菌株に含ませたグルタチオン生産能を有す
る菌株を培地に培養し、培養物よりグルタチオンを採取
するか、もしくは、該微生物菌体および／または菌体処
理物をグルタミン酸、システィン、グリシン、アデノシ
ン−５′−３リン酸およびマグネシウムイオンと接触作
用させることにより従来法と比較して高収率にグルタチ
オンを生産できること等の知見を得、本発明を完成した
。
すなわち本発明は、Ｔ−グルタミル−Ｌ−システイン合
成酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡおよびグル
タチオン合成酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
をバクテリオファージベクターＤＮＡに挿入したことを
特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡであり、また本発明
は、Ｔ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵素をコード
する遺伝子を含有するＤＮＡおよびグルタチオン合成酵
素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡをバクテリオフ
ァージベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含
み、グルタチオン生産能を有するエッシェリシア属に属
する微生物を、培地に培養し、培養物よりグルクチオン
を採取するか、もしくは、該微生物菌体および／または
該微生物菌体処理物を、グルタミン酸、システィン、グ
リシン、アデノシン−５′−３リン酸およびマグネシウ
ムイオンと接触作用させてグルタチオンを生成させるこ
とを特徴とするグルタチオンの製造法である。
成酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡおよびグル
タチオン合成酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
をバクテリオファージベクターＤＮＡに挿入したことを
特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡであり、また本発明
は、Ｔ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵素をコード
する遺伝子を含有するＤＮＡおよびグルタチオン合成酵
素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡをバクテリオフ
ァージベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含
み、グルタチオン生産能を有するエッシェリシア属に属
する微生物を、培地に培養し、培養物よりグルクチオン
を採取するか、もしくは、該微生物菌体および／または
該微生物菌体処理物を、グルタミン酸、システィン、グ
リシン、アデノシン−５′−３リン酸およびマグネシウ
ムイオンと接触作用させてグルタチオンを生成させるこ
とを特徴とするグルタチオンの製造法である。
以下、本発明の詳細な説明する。
先ず、ＧＳＨ−ｎ遺伝子を含有するＤＮＡ、例えば、大
腸菌由来の前記ＤＮＡをバクテリオファージベクターＤ
ＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡの調製について述べる
。
腸菌由来の前記ＤＮＡをバクテリオファージベクターＤ
ＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡの調製について述べる
。
バクテリオファージベクターＤＮＡとしては、例えば、
λＣｌ１１５７１１２１Ｓ ＤＮＡ等が挙げられ、該Ｄ
ＮＡは、特開昭６１−１５２２８５号公報記載の方法と
全く同様にして得ることができる。
λＣｌ１１５７１１２１Ｓ ＤＮＡ等が挙げられ、該Ｄ
ＮＡは、特開昭６１−１５２２８５号公報記載の方法と
全く同様にして得ることができる。
一方、大腸菌由来のＧＳＨ−ＩＩｎ遺伝子含有するＤＮ
Ａは、例えば、特開昭６０−１８０５９２号公報記載の
方法と全く同様にして組み換え体プラスミドｐＢＲ３２
５−ｇｓｈ ＩＩ ｂ ＤＮＡとして得ることができる
。
Ａは、例えば、特開昭６０−１８０５９２号公報記載の
方法と全く同様にして組み換え体プラスミドｐＢＲ３２
５−ｇｓｈ ＩＩ ｂ ＤＮＡとして得ることができる
。
次いで、プラスミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ ＩＩ ｂ
ＤＮＡに、例えば、制限酵素」肥旧（ベーリンガー・マ
ンノ１イム・山之内・社・製）及びｔｌｉｎｄｌｌ （
ヘーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を、温度
３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度夫々１〜
１０ユニント／ｒａｌで２０分以上、好ましくは３０分
〜２時間作用させて消化し、ＤＮＡ消化物を得る。
ＤＮＡに、例えば、制限酵素」肥旧（ベーリンガー・マ
ンノ１イム・山之内・社・製）及びｔｌｉｎｄｌｌ （
ヘーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を、温度
３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度夫々１〜
１０ユニント／ｒａｌで２０分以上、好ましくは３０分
〜２時間作用させて消化し、ＤＮＡ消化物を得る。
このＤＮＡ消化物を、例えば、モレキュラー・クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、第１
１３〜１１４頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）記載の方法と同
様にして消化されたＤＮＡ末端を平滑末端にしたものと
ＥｃｏＲＩリンカ−（宝酒造・社・製）を混合し、これ
に、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハ
イム・山之内・社・製）等を温度４〜３７°Ｃ゛、好ま
しくは４〜１６°Ｃ１酵素濃度０．１〜１０ユニット／
ｍｌで２０分以上、好ましくは１２〜２４時間作用させ
てＧＳＨ−１１遺伝子の両性側にＥｃｏＲＩ切断部位を
有する組み換え体プラスミドを得る。
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、第１
１３〜１１４頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）記載の方法と同
様にして消化されたＤＮＡ末端を平滑末端にしたものと
ＥｃｏＲＩリンカ−（宝酒造・社・製）を混合し、これ
に、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハ
イム・山之内・社・製）等を温度４〜３７°Ｃ゛、好ま
しくは４〜１６°Ｃ１酵素濃度０．１〜１０ユニット／
ｍｌで２０分以上、好ましくは１２〜２４時間作用させ
てＧＳＨ−１１遺伝子の両性側にＥｃｏＲＩ切断部位を
有する組み換え体プラスミドを得る。
次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
及びバクテリオファージベクターλｃｌｓｓｔ１１２１
Ｓ ＤＮＡを混合し、これに例えば、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ （ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を
温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１〜
１０ユニット／−で２０分以上、好ましくは３０分〜２
時間作用させて消化したものに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（
ベーリンガー・マンハイム・山之内・社製）を温度４°
Ｃ以上、好ましくは１６°Ｃ１酵素濃度０．１〜５ユニ
ツ）／ｍで１時間以上、好ましくは１６〜２４時間作用
させて連結し、種々の組み換え体ＤＮＡを得る。
及びバクテリオファージベクターλｃｌｓｓｔ１１２１
Ｓ ＤＮＡを混合し、これに例えば、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ （ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を
温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１〜
１０ユニット／−で２０分以上、好ましくは３０分〜２
時間作用させて消化したものに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（
ベーリンガー・マンハイム・山之内・社製）を温度４°
Ｃ以上、好ましくは１６°Ｃ１酵素濃度０．１〜５ユニ
ツ）／ｍで１時間以上、好ましくは１６〜２４時間作用
させて連結し、種々の組み換え体ＤＮＡを得る。
このようにして得られた種々の組み換え体ＤＮＡの混合
物の中から目的とする組み換え体ＤＮＡを採取するには
次の方法による。
物の中から目的とする組み換え体ＤＮＡを採取するには
次の方法による。
まず、組み換え体ＤＮＡの作製に使用したファージと同
じ付着端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄｓ）及び同じ免疫
（ｉｍｍｕｎｉｔいをもつテンペレートファージをあら
かじめ溶原化した大腸菌に、同じ付着端及び同じ免疫を
もち、宿主染色体へのアタッチメントサイト（ａｔｔａ
ｃｈｍｅｎｔ ５ｉｔｅ、溶原化する際に宿主細菌の染
色体と組み換えを起す部位）をもたないテンペレートフ
ァージを大量に感染させた後に、組み換え体ＤＮＡを混
合し、温度２０〜４０″Ｃに保つことにより組み換え体
ＤＮＡを宿主細菌の菌体内にとり込ませることができる
（ヘルパー法）。
じ付着端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄｓ）及び同じ免疫
（ｉｍｍｕｎｉｔいをもつテンペレートファージをあら
かじめ溶原化した大腸菌に、同じ付着端及び同じ免疫を
もち、宿主染色体へのアタッチメントサイト（ａｔｔａ
ｃｈｍｅｎｔ ５ｉｔｅ、溶原化する際に宿主細菌の染
色体と組み換えを起す部位）をもたないテンペレートフ
ァージを大量に感染させた後に、組み換え体ＤＮＡを混
合し、温度２０〜４０″Ｃに保つことにより組み換え体
ＤＮＡを宿主細菌の菌体内にとり込ませることができる
（ヘルパー法）。
又上記ヘルパー法の他に塩化カルシウム法等によっても
同様に宿主細菌の菌体内に取り込ませることができる。
同様に宿主細菌の菌体内に取り込ませることができる。
更に、得られた種々の組み換え体ＤＮＡをイン・ビトロ
・パックケージング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇ
ｉｎｇ）法〔メソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第６８巻、第２
８１〜２９８頁、１９７９年、アカデミツク・プレス（
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に記載〕によりλバク
テリオファージの被膜蛋白質で包みバクテリオファージ
粒子を調製したのち、宿主細菌に感染させることにより
組み換え体ＤＮＡを宿主細菌の菌体内に取り込ませるこ
ともできる。
・パックケージング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇ
ｉｎｇ）法〔メソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第６８巻、第２
８１〜２９８頁、１９７９年、アカデミツク・プレス（
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に記載〕によりλバク
テリオファージの被膜蛋白質で包みバクテリオファージ
粒子を調製したのち、宿主細菌に感染させることにより
組み換え体ＤＮＡを宿主細菌の菌体内に取り込ませるこ
ともできる。
ここで用いられる宿主細菌は、−船釣なに１２株に含ま
れる大腸菌であれば、如何なるものでもよ（、例えば、
ＡＢ１１５７（Ｅ、ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏ
ｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ。
れる大腸菌であれば、如何なるものでもよ（、例えば、
ＡＢ１１５７（Ｅ、ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏ
ｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ。
Ｙａｌｅ大学、米国） 、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３
２５）、Ｗ３３５０ （ＡＴＣＣ２７０２０）、１１０
０（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓｌｌｏｏ（、西独）等
の大腸菌は、特に好適なものということが出来る。
２５）、Ｗ３３５０ （ＡＴＣＣ２７０２０）、１１０
０（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓｌｌｏｏ（、西独）等
の大腸菌は、特に好適なものということが出来る。
そして、上記菌株よりＧＳＨ−ｎ生産能を有する微生物
をスクリーニングすることによりＧ Ｓ Ｈ−■遺伝子
を含有するＤＮＡをバクテリオファージＤＮＡに挿入し
た組み換え体ＤＮＡを含み、ＧＳＨ−Ｉｔ生産能を有す
るエッシェリシア属に属する微生物を得ることができる
。
をスクリーニングすることによりＧ Ｓ Ｈ−■遺伝子
を含有するＤＮＡをバクテリオファージＤＮＡに挿入し
た組み換え体ＤＮＡを含み、ＧＳＨ−Ｉｔ生産能を有す
るエッシェリシア属に属する微生物を得ることができる
。
このようにして得られた微生物より純化された組み換え
体ＤＮＡを得るには、例えば、組み換え体ＤＮＡを保有
する溶源菌を、４０〜４５°Ｃ１好ましくは、４２〜４
３°Ｃで１０分以上、好ましくは、１５〜３０分で熱誘
導して培養したのち、例えば、クロロホルム等を添加し
て温度０〜４０°Ｃで１０分〜１時間振盪して宿主細菌
菌体を溶菌し、培地中にバクテリオファージを排出させ
たのち、この培養液を、７．０００〜２０．００Ｏｒ、
ｐ、ｍ、で１０〜３０分間遠心分離処理して菌数を除去
し、例えば、２０，０００〜４０．００Ｏｒ、ｐ。
体ＤＮＡを得るには、例えば、組み換え体ＤＮＡを保有
する溶源菌を、４０〜４５°Ｃ１好ましくは、４２〜４
３°Ｃで１０分以上、好ましくは、１５〜３０分で熱誘
導して培養したのち、例えば、クロロホルム等を添加し
て温度０〜４０°Ｃで１０分〜１時間振盪して宿主細菌
菌体を溶菌し、培地中にバクテリオファージを排出させ
たのち、この培養液を、７．０００〜２０．００Ｏｒ、
ｐ、ｍ、で１０〜３０分間遠心分離処理して菌数を除去
し、例えば、２０，０００〜４０．００Ｏｒ、ｐ。
１、で１〜３時間超遠心分離処理を行なってバクテリオ
ファージを精製し、更に、このようにして精製されたバ
クテリオファージより、例えば、モレキュラー０クロー
ニング（Ｍｏｒｅｃｕｌｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）、コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
）、第７６〜８５頁（１９８２年）記載の方法等により
得ることができる。
ファージを精製し、更に、このようにして精製されたバ
クテリオファージより、例えば、モレキュラー０クロー
ニング（Ｍｏｒｅｃｕｌｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）、コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
）、第７６〜８５頁（１９８２年）記載の方法等により
得ることができる。
なお、バクテリオファージベクターＤＮＡに挿入するＣ
；５Ｈ−ＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡの数は、１個以上
、好ましくは、１〜２個である。
；５Ｈ−ＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡの数は、１個以上
、好ましくは、１〜２個である。
次に、ＧＳＨ−１遺伝子を含有するＤＮＡ、例えば大腸
菌由来の前記ＤＮＡをバクテリオファージベクターＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡの調製について述べる。
菌由来の前記ＤＮＡをバクテリオファージベクターＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡの調製について述べる。
バクテリオファージベクターＤＮＡとしては、被膜蛋白
質の遺伝情報部分のみにエンドヌクレアーゼ切断部位を
有するものであれば如何なるものでもよく、例えば、バ
クテリオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃ ＤＮＡ等が挙げ
られる。
質の遺伝情報部分のみにエンドヌクレアーゼ切断部位を
有するものであれば如何なるものでもよく、例えば、バ
クテリオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃ ＤＮＡ等が挙げ
られる。
上記バクテリオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃ ＤＮＡは
、以下の方法で調製することができ、まず、特開昭５８
−２１２７８１号公報記載の実施例と全く同様にしてバ
クテリオファージλＣＴｓ、ｔｌ１２１ ＤＮＡを得、
このバクテリオファージＤＮＡの分離を容易にするため
に、後期プロモーターより上流域又は、下流域にマーカ
ーを付与する。マーカーは如何なるものでも良く、例え
ば、薬剤耐性マーカーが挙げられる。
、以下の方法で調製することができ、まず、特開昭５８
−２１２７８１号公報記載の実施例と全く同様にしてバ
クテリオファージλＣＴｓ、ｔｌ１２１ ＤＮＡを得、
このバクテリオファージＤＮＡの分離を容易にするため
に、後期プロモーターより上流域又は、下流域にマーカ
ーを付与する。マーカーは如何なるものでも良く、例え
ば、薬剤耐性マーカーが挙げられる。
そして、薬剤耐性マーカーを付与する例としては、例え
ば、後期プロモーターより下流に唯一存在する制限酵素
ＥｃｏＲＩ切断部位に、テトラサイクリン耐性遺伝子（
Ｔｃ’と略称する。）を組み込めばよく、テトラサイク
リン耐性により容易にこのバクテリオファージＤＮＡを
分離することができる。
ば、後期プロモーターより下流に唯一存在する制限酵素
ＥｃｏＲＩ切断部位に、テトラサイクリン耐性遺伝子（
Ｔｃ’と略称する。）を組み込めばよく、テトラサイク
リン耐性により容易にこのバクテリオファージＤＮＡを
分離することができる。
そしてまた、テトラサイクリン耐性バクテリオ７７−ジ
ＤＮＡ、例えば、ＥＮ１１２１Ｔｃ／ｘｂは、下記のよ
うにして８周製できる。
ＤＮＡ、例えば、ＥＮ１１２１Ｔｃ／ｘｂは、下記のよ
うにして８周製できる。
プラスミドｐＫＮ２０６ ＤＮ＾〔ティー・マスダ（Ｔ
、Ｍａ−ｓｕｄａ）等、アプリ。パイオル、ケム、 （
Ａｇｒｉ、Ｂｉｏｌ。
、Ｍａ−ｓｕｄａ）等、アプリ。パイオル、ケム、 （
Ａｇｒｉ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、）、第５０巻、第２７１〜２７８頁（１９８
６）記載の方法により得たものである。〕に、例えば、
制限酵素ＰｖｕＩＩ（ベーリンガー・マンハイム・山之
内・社・製）を温度３０″Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ
１酵素濃度１−１０ユニット／ｍｌで、２０分以上、好
ましくは３０分〜２時間作用させて消化し、ＤＮＡ消化
物を得る。
６）記載の方法により得たものである。〕に、例えば、
制限酵素ＰｖｕＩＩ（ベーリンガー・マンハイム・山之
内・社・製）を温度３０″Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ
１酵素濃度１−１０ユニット／ｍｌで、２０分以上、好
ましくは３０分〜２時間作用させて消化し、ＤＮＡ消化
物を得る。
このＤＮＡ消化物にＥｃｏＲＩリンカ−（宝酒造社・製
）を混合したのち、Ｔ４バクテリオファージ由来のＤＮ
Ａリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・
製）を酵素濃度０．１〜１０ユニット／−添加し、温度
４〜３７°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃで２０分以上、
好ましくは６〜２４時間作用させて連結することにより
、ＥｃｏＲＩ切断部位を有する組み換え体プラスミドｐ
ＫＮ３０６ ＤＮＡを調製することができる。組み換え
体プラスミドｐＫＮ３０６ ＯＮＡによる形質転換は、
モレク・ジエン・ジエネント（Ｍｏｌｅｃ。
）を混合したのち、Ｔ４バクテリオファージ由来のＤＮ
Ａリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・
製）を酵素濃度０．１〜１０ユニット／−添加し、温度
４〜３７°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃで２０分以上、
好ましくは６〜２４時間作用させて連結することにより
、ＥｃｏＲＩ切断部位を有する組み換え体プラスミドｐ
ＫＮ３０６ ＤＮＡを調製することができる。組み換え
体プラスミドｐＫＮ３０６ ＯＮＡによる形質転換は、
モレク・ジエン・ジエネント（Ｍｏｌｅｃ。
ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、） 、第１２４巻、第１〜１０頁
（１９７３）記載の塩化カルシウム処理により行なうこ
とができる。
（１９７３）記載の塩化カルシウム処理により行なうこ
とができる。
また、ここで用いられる宿主菌としては、例えば、大腸
菌１１００ （Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
西独、ハイデルベルグより入手）等が挙げられる。
菌１１００ （Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
西独、ハイデルベルグより入手）等が挙げられる。
このようにして得られた形質転換株より、常法により、
例えば、塩化セシウム−エチジウムブロマイド密度勾配
超遠心分離処理により純化されたプラスミドＤＮＡ ｐ
ＫＮ３０６を得ることができ、このプラスミドｐＫＮ３
０６ ＯＮＡに、例えばＥｃｏＲＩ （ベーリンガー・
マイハイム・山之内・社・製）を酵素濃度１〜１０ユニ
ッＩ−／ｄ加え、温度４°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ
で、２０分以上、好ましくは３０分〜２時間作用させて
テトラサイクリン耐性遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得
、このＤＮＡ断片を例えば、メンズ・イン・エンザイモ
ロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
第６８巻、第１７６〜１８２頁（１９７９）に記載のア
ガロース電気泳動処理によって単離することができる。
例えば、塩化セシウム−エチジウムブロマイド密度勾配
超遠心分離処理により純化されたプラスミドＤＮＡ ｐ
ＫＮ３０６を得ることができ、このプラスミドｐＫＮ３
０６ ＯＮＡに、例えばＥｃｏＲＩ （ベーリンガー・
マイハイム・山之内・社・製）を酵素濃度１〜１０ユニ
ッＩ−／ｄ加え、温度４°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ
で、２０分以上、好ましくは３０分〜２時間作用させて
テトラサイクリン耐性遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得
、このＤＮＡ断片を例えば、メンズ・イン・エンザイモ
ロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
第６８巻、第１７６〜１８２頁（１９７９）に記載のア
ガロース電気泳動処理によって単離することができる。
上記ＤＮＡ断片に、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
したλｃｌａｓｔｌ１２１ ＤＮＡ と、例えばＸｂａ
Ｉを識別する部位を含む５ ’−ｐＡＡＴＴＧＴＣＴ
ＡＧＡリンカ−（ベックマン社製のｐｔ、ｕｓｔのＤＮ
Ａ合成機により合成したものである）を加え、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ヘーリンガー・マイハイム・山之内・社・
製）で処理して連結することにより、テトラサイクリン
耐性遺伝子を含有するバクテリオファージλｃｌｓｓ、
１１２１−Ｔｃ／ｘｂを育種することができる。
したλｃｌａｓｔｌ１２１ ＤＮＡ と、例えばＸｂａ
Ｉを識別する部位を含む５ ’−ｐＡＡＴＴＧＴＣＴ
ＡＧＡリンカ−（ベックマン社製のｐｔ、ｕｓｔのＤＮ
Ａ合成機により合成したものである）を加え、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ヘーリンガー・マイハイム・山之内・社・
製）で処理して連結することにより、テトラサイクリン
耐性遺伝子を含有するバクテリオファージλｃｌｓｓ、
１１２１−Ｔｃ／ｘｂを育種することができる。
次いで、このバクテリオファージλＣｌ８Ｓ？１１２１
−Ｔｃ／ｘｂから、ＤＮＡを、常法により、例えば、テ
ィー・マニアティス（ＴｏＭａｎｉａｔｉｓ）等の方法
（モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ＣＩｏ、ｎｉｎｇ）、第７６〜８５頁（１９８２年）〕
により精製する。
−Ｔｃ／ｘｂから、ＤＮＡを、常法により、例えば、テ
ィー・マニアティス（ＴｏＭａｎｉａｔｉｓ）等の方法
（モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ＣＩｏ、ｎｉｎｇ）、第７６〜８５頁（１９８２年）〕
により精製する。
また、更に、バクテリオファージＤＮＡの被膜蛋白質生
合成の遺伝情報の部分のみにエンドヌクレアー、ゼ切断
部位を有し、後期プロモーターより下流に薬剤耐性マー
カーが付与されたバクテリオファージＤＮＡの調製につ
いて述べる。
合成の遺伝情報の部分のみにエンドヌクレアー、ゼ切断
部位を有し、後期プロモーターより下流に薬剤耐性マー
カーが付与されたバクテリオファージＤＮＡの調製につ
いて述べる。
薬剤耐性マーカーは、如何なるものでもよいが、例えば
Ｔｃｒマーカーの付与されたバクテリオファージＤＮＡ
であり、更に、被膜蛋白質生合成の遺伝情報の部分のみ
を識別するエンドヌクレアーゼ切断部位も如何なるもの
でもよく、例えば、」匹１７１切断部位ｊＥＪ２ｕｌ切
断部位等が挙げられる。
Ｔｃｒマーカーの付与されたバクテリオファージＤＮＡ
であり、更に、被膜蛋白質生合成の遺伝情報の部分のみ
を識別するエンドヌクレアーゼ切断部位も如何なるもの
でもよく、例えば、」匹１７１切断部位ｊＥＪ２ｕｌ切
断部位等が挙げられる。
この被膜蛋白質生合成の遺伝情報の部分のみにエンドヌ
クレアーゼ切断部位を有するバクテリオファージＤＮＡ
は、特公昭６１−３７９１５号公報と全く同様にして得
ることができる。例えば、特開昭５８−２１２７８１号
公報実施例中項目（６）の方法と全く同様にして得られ
たバクテリオファージ１２−２ ＤＮＡと、バクテリオ
ファージλｇｔＷＥＳ 、 Ｂ ＤＮＡ （ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリイ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈａｂｏｒａｔｏｒｙ） ・社・製〕を制限酵
素、例えば、ＥｃｏＲｌ （ベーリンガー・マンハイム
・山之内・社・製）１〜５０ユニツト、好ましくは５〜
１０ユニツトで温度４〜３７°Ｃ１好ましくは、３７°
Ｃで２０分〜２４時間、好ましくは、３０分〜２時間反
応させて消化物を得、この消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて、温度４°Ｃ〜３７°Ｃ１好ましくは、４〜１
６°Ｃ１１〜２４時間、好ましくは、１６〜２４時間反
応させて、連結反応を行ない、このＤＮＡを用いて、大
腸菌、例えば、１１００に形質導入する。形質導入方法
は、例えば、デイ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎ）〔メンズ・イン・エンザイモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻
、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕記載の塩化カル
シウム処理法により形質導入できる。この方法により、
大腸菌、例えば、大腸菌１１００株上でプラークを形成
するバクテリオファージ１２−２ＷＥを得ることができ
る。このバクテリオファージ１２−２ＷＥおよび、バク
テリオファージφ８０〔特開昭５８−２１２７８１号公
報実施例中の項目（１）記載の方法により大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（φ８０） （ＡＴＣＣ３１２７
７）から得たものである。〕を 〕特開昭５８−２１２
７８１号公報実施例中項目２）記載の方法と全く同様に
して、大腸菌に感染させてプラークを形成するバクテリ
オファージ１２−２−３００ ＤＮＡを得ることができ
る。
クレアーゼ切断部位を有するバクテリオファージＤＮＡ
は、特公昭６１−３７９１５号公報と全く同様にして得
ることができる。例えば、特開昭５８−２１２７８１号
公報実施例中項目（６）の方法と全く同様にして得られ
たバクテリオファージ１２−２ ＤＮＡと、バクテリオ
ファージλｇｔＷＥＳ 、 Ｂ ＤＮＡ （ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリイ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈａｂｏｒａｔｏｒｙ） ・社・製〕を制限酵
素、例えば、ＥｃｏＲｌ （ベーリンガー・マンハイム
・山之内・社・製）１〜５０ユニツト、好ましくは５〜
１０ユニツトで温度４〜３７°Ｃ１好ましくは、３７°
Ｃで２０分〜２４時間、好ましくは、３０分〜２時間反
応させて消化物を得、この消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて、温度４°Ｃ〜３７°Ｃ１好ましくは、４〜１
６°Ｃ１１〜２４時間、好ましくは、１６〜２４時間反
応させて、連結反応を行ない、このＤＮＡを用いて、大
腸菌、例えば、１１００に形質導入する。形質導入方法
は、例えば、デイ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎ）〔メンズ・イン・エンザイモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻
、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕記載の塩化カル
シウム処理法により形質導入できる。この方法により、
大腸菌、例えば、大腸菌１１００株上でプラークを形成
するバクテリオファージ１２−２ＷＥを得ることができ
る。このバクテリオファージ１２−２ＷＥおよび、バク
テリオファージφ８０〔特開昭５８−２１２７８１号公
報実施例中の項目（１）記載の方法により大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（φ８０） （ＡＴＣＣ３１２７
７）から得たものである。〕を 〕特開昭５８−２１２
７８１号公報実施例中項目２）記載の方法と全く同様に
して、大腸菌に感染させてプラークを形成するバクテリ
オファージ１２−２−３００ ＤＮＡを得ることができ
る。
つぎに、被膜蛋白質の遺伝情報部分のみにエンドヌクレ
アーゼ切断部位を有する組み換えバクテリオファージＤ
ＮＡと、後期プロモーター下流域に薬剤耐性マーカーの
付与された、バクテリオファージＤＮＡとを例えば、Ｘ
ｈｏＩ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）
等を用い組み換えることにより被膜蛋白質の遺伝情報部
分のみにエンドヌクレアーゼ切断部位を有し、かつ後期
プロモーター下流域に薬剤耐性マーカーの付与されたバ
クテリオファージＤＮＡを育種することができる。
アーゼ切断部位を有する組み換えバクテリオファージＤ
ＮＡと、後期プロモーター下流域に薬剤耐性マーカーの
付与された、バクテリオファージＤＮＡとを例えば、Ｘ
ｈｏＩ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）
等を用い組み換えることにより被膜蛋白質の遺伝情報部
分のみにエンドヌクレアーゼ切断部位を有し、かつ後期
プロモーター下流域に薬剤耐性マーカーの付与されたバ
クテリオファージＤＮＡを育種することができる。
例えば、上記で得られたバクテリオファージ１２−２−
３００ ＤＮＡおよびλｃＴｅｓ７１１２１−Ｔｃ／ｘ
ｂを制限酵素ＸｈｏＩ（全酒造・社・製）１〜２０ユニ
ツトで、温度４〜３７°Ｃ１好ましくは、３７°Ｃで２
０分〜２４時間、好ましくは、３０分〜２時間反応させ
、消化物を常法により得、この消化物を７４ ＤＮＡリ
ガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）
を用いて、温度４〜３０°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃ
ｌ２Ｏ分〜４８時間、好ましくは、１６〜２４時間連続
反応を行なったのち、前記デイ−・エム・モーリソン（
Ｄ。
３００ ＤＮＡおよびλｃＴｅｓ７１１２１−Ｔｃ／ｘ
ｂを制限酵素ＸｈｏＩ（全酒造・社・製）１〜２０ユニ
ツトで、温度４〜３７°Ｃ１好ましくは、３７°Ｃで２
０分〜２４時間、好ましくは、３０分〜２時間反応させ
、消化物を常法により得、この消化物を７４ ＤＮＡリ
ガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）
を用いて、温度４〜３０°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃ
ｌ２Ｏ分〜４８時間、好ましくは、１６〜２４時間連続
反応を行なったのち、前記デイ−・エム・モーリソン（
Ｄ。
ｉ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法により塩化カルシウム処
理した大腸菌、例えば、大腸菌ＱＤ５００３株（凡用大
学より入手）を形質転換し、この菌株上でプラークを形
成するバクテリオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃを得るこ
とができる。
理した大腸菌、例えば、大腸菌ＱＤ５００３株（凡用大
学より入手）を形質転換し、この菌株上でプラークを形
成するバクテリオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃを得るこ
とができる。
このようにして、目的とする被膜蛋白質の遺伝情報部分
のみにエンドヌクレアーゼ切断部位を有し、後期プロモ
ーター下流域に薬剤耐性マーカーの付与されたバクテリ
オファージＤＮＡを育種することができる。
のみにエンドヌクレアーゼ切断部位を有し、後期プロモ
ーター下流域に薬剤耐性マーカーの付与されたバクテリ
オファージＤＮＡを育種することができる。
一方、大腸菌由来のＧＳＨ−１遺伝子を含有するＤＮＡ
は、例えば、特開昭５９−１９２０８８号公報記載の方
法と全く同様にして組み換え体プラスミドｐＨＲ３２２
−ｇ５ｈｌ ＤＮＡ として得ることができる。
は、例えば、特開昭５９−１９２０８８号公報記載の方
法と全く同様にして組み換え体プラスミドｐＨＲ３２２
−ｇ５ｈｌ ＤＮＡ として得ることができる。
次いで、組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ
ｒＤＮＡに、例えば、制限酵素５ｔｕｌ（ベーリンガー
・マンハイム・山之内・社・製）を温度３０°Ｃ以上、
好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１〜１０ユニット／ｒｎ
ｌで２０分以上、好ましくは、３０分〜２時間作用させ
て消化し、ＤＮＡ消化物を得る。このＤＮＡ消化物と血
Ｉリンカ−（全酒造・社・製）を混合し、これに、例え
ば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム
・山之内・社・製）等を温度４〜３７°Ｃ１好ましくは
、４〜１６°Ｃ１酵素濃度０．１〜１０ユニット／ｍｌ
で、２０分以上、好ましくは、１２〜２４時間作用させ
て、組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈｌ Ｄ
ＮＡ上にｍｌ切断部位を有する組み換え体プラスミドを
得る。
ｒＤＮＡに、例えば、制限酵素５ｔｕｌ（ベーリンガー
・マンハイム・山之内・社・製）を温度３０°Ｃ以上、
好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１〜１０ユニット／ｒｎ
ｌで２０分以上、好ましくは、３０分〜２時間作用させ
て消化し、ＤＮＡ消化物を得る。このＤＮＡ消化物と血
Ｉリンカ−（全酒造・社・製）を混合し、これに、例え
ば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム
・山之内・社・製）等を温度４〜３７°Ｃ１好ましくは
、４〜１６°Ｃ１酵素濃度０．１〜１０ユニット／ｍｌ
で、２０分以上、好ましくは、１２〜２４時間作用させ
て、組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈｌ Ｄ
ＮＡ上にｍｌ切断部位を有する組み換え体プラスミドを
得る。
このようにして得られた組み換え体プラスミドを常法、
例えば、塩化カルシウム処理法等により大腸菌、例えば
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１００を形質転換して得た形
質転換株から常法、例えば、塩化セシウム密度勾配超遠
心法により純化された組み換え体プラスミドＤＮＡを得
る。
例えば、塩化カルシウム処理法等により大腸菌、例えば
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１００を形質転換して得た形
質転換株から常法、例えば、塩化セシウム密度勾配超遠
心法により純化された組み換え体プラスミドＤＮＡを得
る。
この純化された組み換え体プラスミドＤＮＡとプラスミ
ドベクター、例えば、ｐＵｃ１９ （宝酒造・社・製）
とを混合したものに、例えば、制限酵素Ｐｓｔｌ（宝酒
造・社・製）を温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ
１酵素濃度１〜１０ユニット／ｄで、２０分以上、好ま
しくは、３０分〜２時間作用させて、消化したのち、こ
のＤＮＡ消化物に、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベー
リンガー・マンハイム・山之内・社・製）等を温度４〜
３７°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃ１酵素濃度０．１〜
１０ユニット／−で２０分以上、好ましくは、１２〜２
４時間作用させＧＳＨ−■遺伝子の両外側に上１切断部
位を有する組み換え体プラスミドを得る。
ドベクター、例えば、ｐＵｃ１９ （宝酒造・社・製）
とを混合したものに、例えば、制限酵素Ｐｓｔｌ（宝酒
造・社・製）を温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ
１酵素濃度１〜１０ユニット／ｄで、２０分以上、好ま
しくは、３０分〜２時間作用させて、消化したのち、こ
のＤＮＡ消化物に、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベー
リンガー・マンハイム・山之内・社・製）等を温度４〜
３７°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃ１酵素濃度０．１〜
１０ユニット／−で２０分以上、好ましくは、１２〜２
４時間作用させＧＳＨ−■遺伝子の両外側に上１切断部
位を有する組み換え体プラスミドを得る。
次いで、ＧＳＨ−１遺伝子が複数個、組み込まれた組み
換え体プラスミドを作製する。
換え体プラスミドを作製する。
大腸菌由来のＧＳＨ−１遺伝子を２個含有するＤＮＡは
、例えば、特開昭６０−１８０５９２号公報記載の方法
と同様にして組み換え体プラスミドｐｌ’ｌＲ３２５−
ｇ５ｈｌ−Ｔ ＤＮＡとして得ることができる。
、例えば、特開昭６０−１８０５９２号公報記載の方法
と同様にして組み換え体プラスミドｐｌ’ｌＲ３２５−
ｇ５ｈｌ−Ｔ ＤＮＡとして得ることができる。
このようにして得られた組み換え体プラスミドｐＢＲ３
２５−ｇｓｈｌ−Ｉ ＤＮＡ と前述の如くしてＧＳＨ
−１遺伝子の両外側にＭｌ切断部位を有する組み換え体
プラスミドに、例えば、制限酵素ｌＩＪ （宝酒造・
社・製）を温度３０°Ｃ以上、好ましくは、３７°Ｃ１
酵素濃度１〜１０ユニット／ｍ！で２０分以上、好まし
くは、３０分〜２時間作用させて消化しＤＮＡ消化物を
得る。
２５−ｇｓｈｌ−Ｉ ＤＮＡ と前述の如くしてＧＳＨ
−１遺伝子の両外側にＭｌ切断部位を有する組み換え体
プラスミドに、例えば、制限酵素ｌＩＪ （宝酒造・
社・製）を温度３０°Ｃ以上、好ましくは、３７°Ｃ１
酵素濃度１〜１０ユニット／ｍ！で２０分以上、好まし
くは、３０分〜２時間作用させて消化しＤＮＡ消化物を
得る。
このＤＮＡ消化物に、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（
ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）等を温度
４〜３７°Ｃ１好ましくは、４〜１６°Ｃ１酵素濃度０
．１−１０ユニッ）／ｍ／で２０分以上、好ましくは、
６〜１２時間作用させてＧＳＨ−１遺伝子が複数個、例
えば２個およびその両外側に、」ＬＩ切断部位を有する
組み換え体プラスミドＤＮＡを得る。
ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）等を温度
４〜３７°Ｃ１好ましくは、４〜１６°Ｃ１酵素濃度０
．１−１０ユニッ）／ｍ／で２０分以上、好ましくは、
６〜１２時間作用させてＧＳＨ−１遺伝子が複数個、例
えば２個およびその両外側に、」ＬＩ切断部位を有する
組み換え体プラスミドＤＮＡを得る。
次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡおよび上記したバクテリオファージベクターＥＮ
５０１Ｓ Ｔｃ ＤＮＡを混合し、これに例えば、制限
酵素布Ｉ （ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・
製）を温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃
度１〜１０ユニット／ｍｌで２０分以上、好ましくは３
０分〜２時間作用させて消化したものに７４ＤＮＡリガ
ーゼ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を
温度４°Ｃ以上、好ましくは１６°Ｃ１酵素濃度０．１
〜５ユニット／−で１時間以上、好ましくは、１６〜２
４時間作用させて連結し、種々の組み換え体ＤＮＡを得
る。
ＤＮＡおよび上記したバクテリオファージベクターＥＮ
５０１Ｓ Ｔｃ ＤＮＡを混合し、これに例えば、制限
酵素布Ｉ （ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・
製）を温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃
度１〜１０ユニット／ｍｌで２０分以上、好ましくは３
０分〜２時間作用させて消化したものに７４ＤＮＡリガ
ーゼ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を
温度４°Ｃ以上、好ましくは１６°Ｃ１酵素濃度０．１
〜５ユニット／−で１時間以上、好ましくは、１６〜２
４時間作用させて連結し、種々の組み換え体ＤＮＡを得
る。
以下、前述した大腸菌由来のＧＳＨ−ｎ遺伝子を含有す
るＤＮＡをバクテリオファージベクターＤＮＡに挿入し
た組み換え体ＤＮＡの調製法と同様にしてＧＳＨ−１遺
伝子を含有するＤＮＡをバクテリオファージＤＮＡに挿
入した組み換え体ＤＮＡを含み、ＧＳＨ−１生産能を有
するエッシェリシア属に属する微生物を得ることができ
、また、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、第
２０２巻、第１２７９頁（１９７８年）記載の方法によ
り純化された組み換え体ＤＮＡを得ることができる。
るＤＮＡをバクテリオファージベクターＤＮＡに挿入し
た組み換え体ＤＮＡの調製法と同様にしてＧＳＨ−１遺
伝子を含有するＤＮＡをバクテリオファージＤＮＡに挿
入した組み換え体ＤＮＡを含み、ＧＳＨ−１生産能を有
するエッシェリシア属に属する微生物を得ることができ
、また、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、第
２０２巻、第１２７９頁（１９７８年）記載の方法によ
り純化された組み換え体ＤＮＡを得ることができる。
なお、バクテリオファージベクターＤＮＡに挿入するＧ
ＳＨＩ遺伝子を含有するＤＮＡの数は、１個以上、好ま
しくは、２〜８個である。
ＳＨＩ遺伝子を含有するＤＮＡの数は、１個以上、好ま
しくは、２〜８個である。
このようにして得たＧＳＨ−ｎ遺伝子を含有するＤＮＡ
をバクテリオファージベクターＤＮＡに挿入した組み換
え体ＤＮＡおよびＧＳＨ−ｎ遺伝子を含有するＤＮＡを
バクテリオファージベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを混合し、これに、例えば、制限酵素ＸｈｏＩ
（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を温度
３０°Ｃ以上、好ましくは、３７°Ｃ１酵素濃度１〜５
０ユニット／ｍＩで３０分以上、好ましくは３０分〜２
時間作用させて消化したものに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を温度
４°Ｃ以上、好ましくは４〜１６°Ｃ１酵素濃度０．１
〜１０ユニント／ｒｒｉで２０分以上、好ましくは１２
〜２４時間作用させて連結し、種々の組み換え体ＤＮＡ
を得る。
をバクテリオファージベクターＤＮＡに挿入した組み換
え体ＤＮＡおよびＧＳＨ−ｎ遺伝子を含有するＤＮＡを
バクテリオファージベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを混合し、これに、例えば、制限酵素ＸｈｏＩ
（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を温度
３０°Ｃ以上、好ましくは、３７°Ｃ１酵素濃度１〜５
０ユニット／ｍＩで３０分以上、好ましくは３０分〜２
時間作用させて消化したものに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を温度
４°Ｃ以上、好ましくは４〜１６°Ｃ１酵素濃度０．１
〜１０ユニント／ｒｒｉで２０分以上、好ましくは１２
〜２４時間作用させて連結し、種々の組み換え体ＤＮＡ
を得る。
以下、上記Ｃ，５Ｈ−ＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡをバ
クテリオファージベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを含み、Ｃ，５Ｈ−ｎ生産能を有するエッシェリ
シア属に属する微生物及び該組み換え体ＤＮＡの調製法
と同様にしてＧＳＨ−１遺伝子を含有するＤＮＡおよび
ＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡをバクテリオファ
ージベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み
、グルタチオン生産能を有するエッシェリシア属に属す
る微生物を得ることができる。また、例えば、上記ＧＳ
Ｈ−１ｉｌ伝子を含有するＤＮＡをバクテリオファージ
ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡの純化法と
同様にして純化された組み換え体ＤＮＡを得ることがで
きる。
クテリオファージベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを含み、Ｃ，５Ｈ−ｎ生産能を有するエッシェリ
シア属に属する微生物及び該組み換え体ＤＮＡの調製法
と同様にしてＧＳＨ−１遺伝子を含有するＤＮＡおよび
ＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡをバクテリオファ
ージベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み
、グルタチオン生産能を有するエッシェリシア属に属す
る微生物を得ることができる。また、例えば、上記ＧＳ
Ｈ−１ｉｌ伝子を含有するＤＮＡをバクテリオファージ
ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡの純化法と
同様にして純化された組み換え体ＤＮＡを得ることがで
きる。
次いで、ＧＳＨ−Ｉ遺伝子を含有するＤＮＡおよびＧＳ
Ｈ−Ｉｔ遺伝子を含有するＤＮＡをバクテリオファージ
ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、グ
ルタチオン生産能を有するエッシェリシア属に属する微
生物を、該組み換え体ＤＮＡの自己複製が誘発されない
条件下、例えば、温度３０〜３５°Ｃで２〜２４時間培
養する。
Ｈ−Ｉｔ遺伝子を含有するＤＮＡをバクテリオファージ
ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、グ
ルタチオン生産能を有するエッシェリシア属に属する微
生物を、該組み換え体ＤＮＡの自己複製が誘発されない
条件下、例えば、温度３０〜３５°Ｃで２〜２４時間培
養する。
このときの培地は、−船釣な細菌培養培地が用いられ、
例えばＴ−Ｙ培地が好ましい。
例えばＴ−Ｙ培地が好ましい。
次いで、例えば、ヒートインダクション（温度４０〜４
５°Ｃ） 、ＵＶ処理又はマイトマイシン添加等を行う
ことにより該組み換え体ＤＮＡの自己複製を誘発した後
、更に宿主菌の増殖できる温度で培養する。
５°Ｃ） 、ＵＶ処理又はマイトマイシン添加等を行う
ことにより該組み換え体ＤＮＡの自己複製を誘発した後
、更に宿主菌の増殖できる温度で培養する。
このときの温度は必ずしも該組み換え体ＤＮＡの自己複
製を誘発する温度を維持する必要はなく、宿主菌の増殖
できる範囲内の温度を適宜選択して採用することができ
る。
製を誘発する温度を維持する必要はなく、宿主菌の増殖
できる範囲内の温度を適宜選択して採用することができ
る。
このようにして新規な組み換え体ＤＮＡの自己複製を誘
発したのち、例えば、２〜６時間培養して培養物を得る
。
発したのち、例えば、２〜６時間培養して培養物を得る
。
次に、グルタチオンの製造について述べる。
このようにして培養物より菌体を集めて、−度０．８５
％の生理的食塩水で洗浄後、水懸濁液として、これを１
００°Ｃの沸とう水中で１〜１０分、好適には１分処理
することにより大腸菌菌体内のグルタチオンを抽出でき
る。また、上記培養後の菌体を集菌した後、該菌体を以
下に述べるような処理をし、これをグルタミン酸、シス
ティン、グリシン、マグネシウムイオン、ＡＴＰと好ま
しくは適当なＡＴＰ再生系存在下に反応せしめることに
より、グルタチオンを製造することができる。このよう
な菌体処理物としては、菌体の有機溶媒処理物、界面活
性剤処理物、菌体の音波破砕物、音波処理後に遠心で得
られる無細胞抽出液あるいは、適当な担体に固定した菌
体、あるいは酵素が挙げられる。
％の生理的食塩水で洗浄後、水懸濁液として、これを１
００°Ｃの沸とう水中で１〜１０分、好適には１分処理
することにより大腸菌菌体内のグルタチオンを抽出でき
る。また、上記培養後の菌体を集菌した後、該菌体を以
下に述べるような処理をし、これをグルタミン酸、シス
ティン、グリシン、マグネシウムイオン、ＡＴＰと好ま
しくは適当なＡＴＰ再生系存在下に反応せしめることに
より、グルタチオンを製造することができる。このよう
な菌体処理物としては、菌体の有機溶媒処理物、界面活
性剤処理物、菌体の音波破砕物、音波処理後に遠心で得
られる無細胞抽出液あるいは、適当な担体に固定した菌
体、あるいは酵素が挙げられる。
この場合、利用できる有機溶媒としては、アセトン、ト
ルエン、エーテルなど、界面活性剤としては、トリトン
ｘｉｏｏ、 ドデシル硫酸、セチルトリメチルアンモ
ニウムプロミドなどが利用される。
ルエン、エーテルなど、界面活性剤としては、トリトン
ｘｉｏｏ、 ドデシル硫酸、セチルトリメチルアンモ
ニウムプロミドなどが利用される。
また、菌体、あるいは酵素の固定化にはポリアクリルア
ミドゲル、アルギン酸ゲル、光硬化樹脂などの他ＤＥＡ
Ｅ−セルロース、ＤＥＡＥ−セフアゾ・ンクス等も担体
として用いることができる。またかかる反応に利用され
るＡＴＰ再生系としては、大腸菌のもつアセテートキナ
ーゼ反応、カルバメートキナーゼ反応、あるいは微生物
の解糖系が好適である。グルタチオン生成反応は酵素含
存物を５〜４０ｍＭノグルタミン酸（好適ニハ２０ｍＭ
）、５〜４０ｍＭノシステイン（好適には２０ｍＭ）
、５〜５０ｍＭのグリシン（好適には２０ｍＭ） １
〜３０ｍＭのマグネシウムイオン（好適に１０１０１１
Ｉ、１〜２０ｍＭのＡＴＰ （好適には１０ｍＭ）を含
む反応液で、２０°ｃ〜４０″Ｃ（好適には３７°Ｃ）
、また反応ｐＨは６〜９ （好適には７．５）で数時間
接触させることによって行える。本反応系において、ア
セテートキナーゼ反応をＡＴＰ再生系として用いる場合
には、アセチルリン酸５〜４０ｍＭ （好適には２０ｄ
）を添加すればよい。大腸菌は強いアセテートキナーゼ
活性をもっているので、アセテートキナーゼ源を添加す
る必要はない。
ミドゲル、アルギン酸ゲル、光硬化樹脂などの他ＤＥＡ
Ｅ−セルロース、ＤＥＡＥ−セフアゾ・ンクス等も担体
として用いることができる。またかかる反応に利用され
るＡＴＰ再生系としては、大腸菌のもつアセテートキナ
ーゼ反応、カルバメートキナーゼ反応、あるいは微生物
の解糖系が好適である。グルタチオン生成反応は酵素含
存物を５〜４０ｍＭノグルタミン酸（好適ニハ２０ｍＭ
）、５〜４０ｍＭノシステイン（好適には２０ｍＭ）
、５〜５０ｍＭのグリシン（好適には２０ｍＭ） １
〜３０ｍＭのマグネシウムイオン（好適に１０１０１１
Ｉ、１〜２０ｍＭのＡＴＰ （好適には１０ｍＭ）を含
む反応液で、２０°ｃ〜４０″Ｃ（好適には３７°Ｃ）
、また反応ｐＨは６〜９ （好適には７．５）で数時間
接触させることによって行える。本反応系において、ア
セテートキナーゼ反応をＡＴＰ再生系として用いる場合
には、アセチルリン酸５〜４０ｍＭ （好適には２０ｄ
）を添加すればよい。大腸菌は強いアセテートキナーゼ
活性をもっているので、アセテートキナーゼ源を添加す
る必要はない。
上記の様にして、抽出あるいは反応液中に生成したグル
クチオンは、通常のイオン交換樹脂のカラムで容易に単
離される。まず抽出液あるいは反応液のｐＨを硫酸で３
．０に合わせた後、これをカチオン交換樹脂、例えばダ
イアイオンＰＫ−２２８１１”に導通し、０．５Ｍの水
酸化アンモニウムで溶出する。溶出液のｐＨを硫酸で４
．５に合わせた後、ア −ニオン交換樹脂、例えばデオ
ライ） Ａ２（ＣＩｌ、ＣＯＯ−型）に導通ずる。吸着
したグルタチオンを０．５Ｍ硫酸で溶出後、エタノール
を５０％になるように添加することによって結晶グルタ
チオンを単離取得できる。
クチオンは、通常のイオン交換樹脂のカラムで容易に単
離される。まず抽出液あるいは反応液のｐＨを硫酸で３
．０に合わせた後、これをカチオン交換樹脂、例えばダ
イアイオンＰＫ−２２８１１”に導通し、０．５Ｍの水
酸化アンモニウムで溶出する。溶出液のｐＨを硫酸で４
．５に合わせた後、ア −ニオン交換樹脂、例えばデオ
ライ） Ａ２（ＣＩｌ、ＣＯＯ−型）に導通ずる。吸着
したグルタチオンを０．５Ｍ硫酸で溶出後、エタノール
を５０％になるように添加することによって結晶グルタ
チオンを単離取得できる。
以上の如く本発明によれば、ＧＳＨ−１遺伝子を含有す
るＤＮＡおよびＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡを
バタテリオファージベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシェリシア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する菌株に含ませたグルタ
チオン生産能を有する菌株を培地に培養し、培養物より
グルタチオンを採取するか、′もしくは、該微生物菌体
および／または菌体処理物をグルタミン酸、シメテイン
、グリシン、アデノシン−５−３リン酸およびマグネシ
ウムイオンと接触作用させることにより従来法と比較し
て高収率にグルタチオンを生産できることができるので
本発明は極めて有用である。
るＤＮＡおよびＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡを
バタテリオファージベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシェリシア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する菌株に含ませたグルタ
チオン生産能を有する菌株を培地に培養し、培養物より
グルタチオンを採取するか、′もしくは、該微生物菌体
および／または菌体処理物をグルタミン酸、シメテイン
、グリシン、アデノシン−５−３リン酸およびマグネシ
ウムイオンと接触作用させることにより従来法と比較し
て高収率にグルタチオンを生産できることができるので
本発明は極めて有用である。
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
［１］組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２ｇｓｈ Ｉ［
ｅ ＤＮＡの８周製 （１）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００ （ｐＢＲ３２
２−ｇｓｈＩＩｂｈ）の調製 組み換え体プラスミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ Ｕ ｂ
ＤＮＡを保持するエッシェリシア・コリ Ｃ６Ｃ６００
ｒ−（Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００ｒ −ｍ−）（微工研菌寄
第７４７１号）より組み換え体プラスミドｐＢＲ３２５
−ｇｓｈ ＩＩ ｂ ＤＮＡ（特開昭６０−１８０５９
２号公報記Ｒ）を、ティー・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎ
ｉ−ａｔｉｓ）等の方法〔モレキュラー・クローニング
（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ）
、第８６〜９６頁（１９８２年）〕記載の方法により精
製単離し、組み換え体プラスミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ
Ｉ［ｂ ＤＮＡ １ｍｇを得た。
ｅ ＤＮＡの８周製 （１）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００ （ｐＢＲ３２
２−ｇｓｈＩＩｂｈ）の調製 組み換え体プラスミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ Ｕ ｂ
ＤＮＡを保持するエッシェリシア・コリ Ｃ６Ｃ６００
ｒ−（Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００ｒ −ｍ−）（微工研菌寄
第７４７１号）より組み換え体プラスミドｐＢＲ３２５
−ｇｓｈ ＩＩ ｂ ＤＮＡ（特開昭６０−１８０５９
２号公報記Ｒ）を、ティー・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎ
ｉ−ａｔｉｓ）等の方法〔モレキュラー・クローニング
（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ）
、第８６〜９６頁（１９８２年）〕記載の方法により精
製単離し、組み換え体プラスミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ
Ｉ［ｂ ＤＮＡ １ｍｇを得た。
この組み換え体プラスミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ ｎ
ｂ ＤＮＡ２μｇ、Ｂａｍ旧（ベーリンガー・マンハイ
ム・山之内・社・製）１ユニツト及びｔｌｉｎｄｌｌｌ
（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）ｌユ
ニットを、５０ｍＭ ）リス−〇ＣＩ （ｐ’Ｈ７，
５） ／ １０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ／ １ｍ門ジチオスレ
イトール／１００ｍＭ ＮａＣ１を含有する溶液２０μ
！中で、温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、常法に
よりアガロースゲル電気泳動処理を行なってＤＮＡ断片
を分離し、該ＤＮＡ断片を含有するゲルを切り出したも
のを、透析チューブに詰め、再度電気泳動処理を行ない
、ゲル中に存在するＤＮＡ断片をゲル外に出し、ＧＳＨ
−Ｉｔ遺伝子を含有するＤＮＡ断片ｇｓｈ Ｕ ｂｈ
Ｏ，６μｇを得た。
ｂ ＤＮＡ２μｇ、Ｂａｍ旧（ベーリンガー・マンハイ
ム・山之内・社・製）１ユニツト及びｔｌｉｎｄｌｌｌ
（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）ｌユ
ニットを、５０ｍＭ ）リス−〇ＣＩ （ｐ’Ｈ７，
５） ／ １０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ／ １ｍ門ジチオスレ
イトール／１００ｍＭ ＮａＣ１を含有する溶液２０μ
！中で、温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、常法に
よりアガロースゲル電気泳動処理を行なってＤＮＡ断片
を分離し、該ＤＮＡ断片を含有するゲルを切り出したも
のを、透析チューブに詰め、再度電気泳動処理を行ない
、ゲル中に存在するＤＮＡ断片をゲル外に出し、ＧＳＨ
−Ｉｔ遺伝子を含有するＤＮＡ断片ｇｓｈ Ｕ ｂｈ
Ｏ，６μｇを得た。
次いで、プラスミドｐＲＲ３２２（ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ・社・製）０．５μ
ｇ、Ｂａｍ旧１ユニント及びＨｉｎｄｎ［１ユニツトを
、５０ｍＭ ）リス−ＩＣＩ （ｐ Ｈ７，５）／
１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ／ １ｍＭジチオスレイトール／
１００ｍＭＮａＣ１を含有する溶液２０μ！中で温度３
７°Ｃで１時間反応させたものに、上述の如くして得ら
れたＤＮＡ断片ｇｓｈ ＩＩ ｂｈ Ｏ，５ＩＩ ｇ及
びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・
山之内・社・製）ｌユニットを夫々添加し、温度１６°
Ｃで１２時間作用させ組み換え体プラスミドｐＢＲ３２
２−ｇｓｈ Ｕ ｂｈ ＤＮＡを含有する種々の組み換
え体プラスミドＤ Ｎ Ａ ０．８μｇを得た。
・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ・社・製）０．５μ
ｇ、Ｂａｍ旧１ユニント及びＨｉｎｄｎ［１ユニツトを
、５０ｍＭ ）リス−ＩＣＩ （ｐ Ｈ７，５）／
１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ／ １ｍＭジチオスレイトール／
１００ｍＭＮａＣ１を含有する溶液２０μ！中で温度３
７°Ｃで１時間反応させたものに、上述の如くして得ら
れたＤＮＡ断片ｇｓｈ ＩＩ ｂｈ Ｏ，５ＩＩ ｇ及
びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・
山之内・社・製）ｌユニットを夫々添加し、温度１６°
Ｃで１２時間作用させ組み換え体プラスミドｐＢＲ３２
２−ｇｓｈ Ｕ ｂｈ ＤＮＡを含有する種々の組み換
え体プラスミドＤ Ｎ Ａ ０．８μｇを得た。
次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ Ｉｔ ｂｈ ＤＮＡを用い、塩
化カルシウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００
（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ西独、ハ
イデルベルクより入手）を、ジェイ・バクチリオル、（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） 、第１１９巻、第１０７
２〜１０７４頁（１９７４年）に記載の方法により形質
転換し、２０μｇ／ｍｌのアンピシリン（以下、Ａｐと
略称する。）を含有する’ｒ −ｙ培地上で生育し、か
つ、テトラサイクリン（以下、Ｔｃと略称する。）２０
μｇ／−を含有するＴ−Ｙ培地上で未生育の形質・転換
株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ）１１００ （ｐＢＲ３２２
−ｇｓｈ Ｕ ｂｈ）を得た。
ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ Ｉｔ ｂｈ ＤＮＡを用い、塩
化カルシウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００
（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ西独、ハ
イデルベルクより入手）を、ジェイ・バクチリオル、（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） 、第１１９巻、第１０７
２〜１０７４頁（１９７４年）に記載の方法により形質
転換し、２０μｇ／ｍｌのアンピシリン（以下、Ａｐと
略称する。）を含有する’ｒ −ｙ培地上で生育し、か
つ、テトラサイクリン（以下、Ｔｃと略称する。）２０
μｇ／−を含有するＴ−Ｙ培地上で未生育の形質・転換
株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ）１１００ （ｐＢＲ３２２
−ｇｓｈ Ｕ ｂｈ）を得た。
（２）組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ Ｉ
Ｉ ｅ ＤＮ＾の調製 次いで、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） １１０ｌ１００（ｐ
ＢＲ３２２−ＩＩ ｂｈ）から項目［１］ （１）に記
載の方法により組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇ
ｓｈ ＩＩ ｂｈ ＤＮＡを精製単離してＤＮＡ１ｍｇ
を得た。
Ｉ ｅ ＤＮ＾の調製 次いで、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） １１０ｌ１００（ｐ
ＢＲ３２２−ＩＩ ｂｈ）から項目［１］ （１）に記
載の方法により組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇ
ｓｈ ＩＩ ｂｈ ＤＮＡを精製単離してＤＮＡ１ｍｇ
を得た。
このｐＢＲ３２２−ｇｓｈ ＩＩ ｂｈ ＤＮＡ ５
ｕ ｇを、前述の如くしてＢｓｍＨＩ ５ユニツトで処
理したのち、常法通り、フェノール処理及びエタノール
沈澱を行ない、得られた沈澱物を２０μｌの水に溶解し
、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、第１１３〜１１４ 頁、コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
（１９８２）記載の方法に従い、Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡ
ポリメレースＩのフレノウ・フラグメント （Ｋｌｅｎ
ｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔｏｆ Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｌ） （全酒造・社・製）を用い
て処理し、更に、」匹石リンカ−１０ｕｇを加え、前述
の如くしてＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ユニツトで処理し、
プラスミドｐＢＲ３２２上に、ＧＳＨ−■の遺伝子の両
性側にＥｃｏＲＩ切断部位を有する組み換え体プラスミ
ドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ ｎ ｅ ＤＮ＾４ｕｇを得た
。
ｕ ｇを、前述の如くしてＢｓｍＨＩ ５ユニツトで処
理したのち、常法通り、フェノール処理及びエタノール
沈澱を行ない、得られた沈澱物を２０μｌの水に溶解し
、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、第１１３〜１１４ 頁、コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
（１９８２）記載の方法に従い、Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡ
ポリメレースＩのフレノウ・フラグメント （Ｋｌｅｎ
ｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔｏｆ Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｌ） （全酒造・社・製）を用い
て処理し、更に、」匹石リンカ−１０ｕｇを加え、前述
の如くしてＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ユニツトで処理し、
プラスミドｐＢＲ３２２上に、ＧＳＨ−■の遺伝子の両
性側にＥｃｏＲＩ切断部位を有する組み換え体プラスミ
ドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ ｎ ｅ ＤＮ＾４ｕｇを得た
。
［２コバクテリオフアージλｃＴａｓ７１１２１ｓの育
種（］）バクテリオファージλＣｌｌｌ５？１１２１の
育種特開昭５８−２１２７８１号公報、実施例に記載の
方法と全く同様にしてバクテリオファージλｃｌａｓｔ
ｌ１２１を育種した。
種（］）バクテリオファージλＣｌｌｌ５？１１２１の
育種特開昭５８−２１２７８１号公報、実施例に記載の
方法と全く同様にしてバクテリオファージλｃｌａｓｔ
ｌ１２１を育種した。
なお、λＣＩａｓ７１１２１バクテリオファージは、該
ファージを常法により大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００
（ＭａｘＰＩａｎｋ４ｎｓｔｆｔｕｔ西独、ハイデル
ベルグより入手、以下、同株使用）に溶原化して得られ
た溶原菌、すなわちＥ、ｃｏｌｔ １１００（λＣｌ８
５？１１２１） （微工研菌寄第１３３号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１３３） ］として工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。
ファージを常法により大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００
（ＭａｘＰＩａｎｋ４ｎｓｔｆｔｕｔ西独、ハイデル
ベルグより入手、以下、同株使用）に溶原化して得られ
た溶原菌、すなわちＥ、ｃｏｌｔ １１００（λＣｌ８
５？１１２１） （微工研菌寄第１３３号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１３３） ］として工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。
（２）バクテリオファージλｃＩ ５ｓｙｌ１２１ｓの
育種項目［２］ Ｑ）で得られたバクテリオファージλ
ｃｌｓｓｔｌ１２１から常法によりＤＮＡを抽出し、こ
のＤＮＡ２．１μｇを」二Ｒ１（ベーリンガー・マンハ
イム・山之内・社・製）１０ユニツトで切断して得たＤ
ＮＡの断片に、λｃＩｓｓ７ Ｓａｍ７ ＤＮＡ （米
国ワシントン社より入手）を予め上記ＥｃｏＲＩ １ユ
ニ・ントで切断して得たＤＮＡ断片０．４μｇを添加し
たのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ユニットを添加し、温度
７°Ｃで４８時間保持して組み換え体ＤＮＡの混合物を
得、更に該ＤＮＡ混合物を、イン・ビトロ・パッケージ
ング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）法〔メ
ソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙ−Ｈｏｌｏｇｙ）第６８巻、第２８１〜２９
８頁、１９７９年、アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に記載〕によりバクテリオファージ
の被膜蛋白質で包みバクテリオファージ粒子を得た。
育種項目［２］ Ｑ）で得られたバクテリオファージλ
ｃｌｓｓｔｌ１２１から常法によりＤＮＡを抽出し、こ
のＤＮＡ２．１μｇを」二Ｒ１（ベーリンガー・マンハ
イム・山之内・社・製）１０ユニツトで切断して得たＤ
ＮＡの断片に、λｃＩｓｓ７ Ｓａｍ７ ＤＮＡ （米
国ワシントン社より入手）を予め上記ＥｃｏＲＩ １ユ
ニ・ントで切断して得たＤＮＡ断片０．４μｇを添加し
たのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ユニットを添加し、温度
７°Ｃで４８時間保持して組み換え体ＤＮＡの混合物を
得、更に該ＤＮＡ混合物を、イン・ビトロ・パッケージ
ング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）法〔メ
ソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙ−Ｈｏｌｏｇｙ）第６８巻、第２８１〜２９
８頁、１９７９年、アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に記載〕によりバクテリオファージ
の被膜蛋白質で包みバクテリオファージ粒子を得た。
次いで、このようにして得たバクテリオファージ粒子を
大腸菌ＱＤ５００３（凡用大学より入手、以下、同株使
用）を指示菌としてトリプトン寒天培地上に撒き、温度
３７°Ｃで１６時間培養したのち、生じたプラーク中よ
り、項目［２］ （１）記載の大腸菌１１００を指示菌
として用いた場合、プラークを形成せず、前記大腸菌口
Ｄ５００３を指示菌として用いた場合、プラークを形成
する性質を有し、かつ後期プロモーターＰ’ｒ部位より
下流域で、その付着末端に至るＤＮＡ部分にのみＥｃｏ
ＲＩによる切断部位が１箇所存在し、かつまた、溶菌に
関与するＳ遺伝子が該遺伝子が変異したＤＮＡ断片（λ
ｃＩ□７Ｓａｍ？ＤＮＡ由来）に組み換えられたために
、宿主細菌を溶解する能力を火山したバクテリオファー
ジλＣＩａｓｙｌ１２１Ｓを分離して得た。
大腸菌ＱＤ５００３（凡用大学より入手、以下、同株使
用）を指示菌としてトリプトン寒天培地上に撒き、温度
３７°Ｃで１６時間培養したのち、生じたプラーク中よ
り、項目［２］ （１）記載の大腸菌１１００を指示菌
として用いた場合、プラークを形成せず、前記大腸菌口
Ｄ５００３を指示菌として用いた場合、プラークを形成
する性質を有し、かつ後期プロモーターＰ’ｒ部位より
下流域で、その付着末端に至るＤＮＡ部分にのみＥｃｏ
ＲＩによる切断部位が１箇所存在し、かつまた、溶菌に
関与するＳ遺伝子が該遺伝子が変異したＤＮＡ断片（λ
ｃＩ□７Ｓａｍ？ＤＮＡ由来）に組み換えられたために
、宿主細菌を溶解する能力を火山したバクテリオファー
ジλＣＩａｓｙｌ１２１Ｓを分離して得た。
［３］λｃＩａｓｙｌ１２１ｓの後期プロモーターより
下流域でその付着末端に至るＤＮＡ部分に存在するエン
ドヌクレアーゼ切断部位にＧＳＨ−ＩＩ遺伝子断片を翻
訳に必要なりＮＡ配列の制御下に挿入した組み換え体バ
クテリオファージλＥＮ１１２１Ｓ−Ｇ ＩＩの調製 項目［２］ （２）で得られたバクテリオファージλｃ
ｌｓｓｔｌ１２１ｓ ＤＮＡ １０ ＩＩ ｇおよび、
項目［１］ （２）で得られた組み換え体プラスミドｐ
ＢＲ３２２−ｇｓｈ Ｉｆ ｅＤＮＡ ３μｇを混合し
、これを、５０酵トリス−０Ｃｔ（ｐＨ７，４）／１０
０ｍＭ ＮａＣ１／１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，の組成の溶液
５０μ！に添加し、更に５０ユニツトのＥｃｏＲＩを添
加し、温度３７”Ｃで２時間作用させたのち、常法によ
りフェノール抽出およびエタノール沈澱処理を行ない沈
澱物を得、これを、５０１ＴＩＭトリスー１１ｃＩ（ｐ
Ｈ７，４）／１０ｍＭジチオスレイトール／ １０ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ１０．１ｍＭＡＴＰの組成溶液８μｌに添
加し、温度４°Ｃで１８時間作用させて連結反応を行な
った。
下流域でその付着末端に至るＤＮＡ部分に存在するエン
ドヌクレアーゼ切断部位にＧＳＨ−ＩＩ遺伝子断片を翻
訳に必要なりＮＡ配列の制御下に挿入した組み換え体バ
クテリオファージλＥＮ１１２１Ｓ−Ｇ ＩＩの調製 項目［２］ （２）で得られたバクテリオファージλｃ
ｌｓｓｔｌ１２１ｓ ＤＮＡ １０ ＩＩ ｇおよび、
項目［１］ （２）で得られた組み換え体プラスミドｐ
ＢＲ３２２−ｇｓｈ Ｉｆ ｅＤＮＡ ３μｇを混合し
、これを、５０酵トリス−０Ｃｔ（ｐＨ７，４）／１０
０ｍＭ ＮａＣ１／１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，の組成の溶液
５０μ！に添加し、更に５０ユニツトのＥｃｏＲＩを添
加し、温度３７”Ｃで２時間作用させたのち、常法によ
りフェノール抽出およびエタノール沈澱処理を行ない沈
澱物を得、これを、５０１ＴＩＭトリスー１１ｃＩ（ｐ
Ｈ７，４）／１０ｍＭジチオスレイトール／ １０ｍＭ
ＭｇＣ１ｚ１０．１ｍＭＡＴＰの組成溶液８μｌに添
加し、温度４°Ｃで１８時間作用させて連結反応を行な
った。
得られたＤＮＡｌ０μｇをインビトロ・パッケージング
法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）により、
λバクテリオファージの被膜蛋白質で包みバクテリオフ
ァージ粒子を調製し、このファージ粒子溶液５０μｌに
、大腸菌１１００（１０９個／ｒｎｌ、 ０．５ ｕ
４２）を加え、温度３０″Ｃで３０分間卿装したもの
に、更に、バクテリオファージλｃｂ２ （１０１０
個／ｍ、０．１ｒｎｌ）を加え、温度３０°Ｃで３０分
間卿装しくこの操作により非溶原菌は死滅する）、これ
をＴ−Ｙ寒天培地上に撒き、温度３２°Ｃで１６時間培
養した。
法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）により、
λバクテリオファージの被膜蛋白質で包みバクテリオフ
ァージ粒子を調製し、このファージ粒子溶液５０μｌに
、大腸菌１１００（１０９個／ｒｎｌ、 ０．５ ｕ
４２）を加え、温度３０″Ｃで３０分間卿装したもの
に、更に、バクテリオファージλｃｂ２ （１０１０
個／ｍ、０．１ｒｎｌ）を加え、温度３０°Ｃで３０分
間卿装しくこの操作により非溶原菌は死滅する）、これ
をＴ−Ｙ寒天培地上に撒き、温度３２°Ｃで１６時間培
養した。
なお、バクテリオファージλｃｂ２は、大腸菌に−１２
（λ） （ＡＴＣＣ１２４３５）より、エイ・デイ−カ
イザー（Ａ、Ｄ、Ｋａｉｓｅｒ）、パイロロジー（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ）、第３巻、第２４頁（１９５７）および
ジー・ケレンバーガー（Ｇ。
（λ） （ＡＴＣＣ１２４３５）より、エイ・デイ−カ
イザー（Ａ、Ｄ、Ｋａｉｓｅｒ）、パイロロジー（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ）、第３巻、第２４頁（１９５７）および
ジー・ケレンバーガー（Ｇ。
Ｋｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ）等、ジェイ・モル・パイオ
ル（Ｊ。
ル（Ｊ。
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、第３巻、第３９９〜４０８頁（
１９６１）記載の方法により調製したものである。
１９６１）記載の方法により調製したものである。
以上の如くして培養し、生育してきた菌株のうち、λｃ
ｌｅｓｔｌ１２１ｓ ＤＮＡ上にＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を
保持する組み換え体バクテリオファージＤＮＡによる溶
源菌を以下の方法で検索し、数菌株のバクテリオファー
ジＤＮＡ上にＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を有する溶源菌を得た
。
ｌｅｓｔｌ１２１ｓ ＤＮＡ上にＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を
保持する組み換え体バクテリオファージＤＮＡによる溶
源菌を以下の方法で検索し、数菌株のバクテリオファー
ジＤＮＡ上にＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を有する溶源菌を得た
。
上記により得られた溶源菌、すなわち、λｃｂ２耐性か
つ温度感受性菌を夫々Ｔ−Ｙ培地を用いて温度３２°Ｃ
で１６時間振盪培養して得た培養液０．５ ｍｌを１５
０ ｍｌ容の三角フラスコ中の１０−のＴ−Ｙ培地に接
種し、クレット・ユニッツ（Ｋｌｅｔｔ ｕｎｉｔｓ）
が約１００になったところで温度を４３°Ｃに上昇させ
て２５分間振盪したのち再び温度を３２°Ｃに降下させ
て約３時間振盪を続けた。
つ温度感受性菌を夫々Ｔ−Ｙ培地を用いて温度３２°Ｃ
で１６時間振盪培養して得た培養液０．５ ｍｌを１５
０ ｍｌ容の三角フラスコ中の１０−のＴ−Ｙ培地に接
種し、クレット・ユニッツ（Ｋｌｅｔｔ ｕｎｉｔｓ）
が約１００になったところで温度を４３°Ｃに上昇させ
て２５分間振盪したのち再び温度を３２°Ｃに降下させ
て約３時間振盪を続けた。
このようにして得た培養液のうち１ｍｌを超音波破砕処
理したものを細胞抽出液とし、ジャーナル・オブ・ジェ
ネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ。
理したものを細胞抽出液とし、ジャーナル・オブ・ジェ
ネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ。
Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、） 、第１２８巻、第１
０４７〜１０５２頁（１９８２）記載の方法に従いＧＳ
Ｈ−ＩＩの酵素活性を測定し、活性の高い菌株を選択し
た。この活性の高い溶源菌を、１０ｍＺのＴ−Ｙ培地を
用い温度３２°Ｃにてクレット・ユニッツ（Ｋｌｅｔｔ
ｕｎｉｔｓ）が約１００になるまで振盪培養したのち
、温度４３°Ｃで２０分間加温し、更に温度３７°Ｃで
３時間振盪培養して培養液を得、該培養液よりそれと等
容量のフェノール／クロロホルム混合溶媒を用いてＤＮ
Ａを抽出し、得られたＤＮＡをエタノール沈澱させてＤ
ＮＡを得た。
０４７〜１０５２頁（１９８２）記載の方法に従いＧＳ
Ｈ−ＩＩの酵素活性を測定し、活性の高い菌株を選択し
た。この活性の高い溶源菌を、１０ｍＺのＴ−Ｙ培地を
用い温度３２°Ｃにてクレット・ユニッツ（Ｋｌｅｔｔ
ｕｎｉｔｓ）が約１００になるまで振盪培養したのち
、温度４３°Ｃで２０分間加温し、更に温度３７°Ｃで
３時間振盪培養して培養液を得、該培養液よりそれと等
容量のフェノール／クロロホルム混合溶媒を用いてＤＮ
Ａを抽出し、得られたＤＮＡをエタノール沈澱させてＤ
ＮＡを得た。
このようにして得られたＤＮＡをトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７，５）／ １ ｍＭ ＥＤＴＡ組成の溶液１＋ｎｌに
溶解し、Ｊ亥溶液４ｕｆを、１０ｍＭ ）リス−ｎｃＩ
（ｐＨ７，４）／１００ｍＭ ＮａＣ＋ ／１０ｍＭ
Ｍｇ５Ｏｎ／１ｍＭジチオスレイトールの組成の溶液
３０μｌに添加したものに、更に、５０ユニツト（７）
ＥｃｏＲＴおよび２０μｇのＲＮａｓｅＡ （シグマ・
社・製）を添加し、温度３７°Ｃで１時間作用させて消
化し、これをアガロースゲル電気泳動処理し、ＤＮＡ断
片の大きさを分析した。
７，５）／ １ ｍＭ ＥＤＴＡ組成の溶液１＋ｎｌに
溶解し、Ｊ亥溶液４ｕｆを、１０ｍＭ ）リス−ｎｃＩ
（ｐＨ７，４）／１００ｍＭ ＮａＣ＋ ／１０ｍＭ
Ｍｇ５Ｏｎ／１ｍＭジチオスレイトールの組成の溶液
３０μｌに添加したものに、更に、５０ユニツト（７）
ＥｃｏＲＴおよび２０μｇのＲＮａｓｅＡ （シグマ・
社・製）を添加し、温度３７°Ｃで１時間作用させて消
化し、これをアガロースゲル電気泳動処理し、ＤＮＡ断
片の大きさを分析した。
その結果、ＧＳＨ−ｎ高活性の溶源菌すべてに、約１．
６ Ｋｂｐの組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓ
ｈ ｎ ｅＤＮＡ由来のＤＮＡ断片が検出された。
６ Ｋｂｐの組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓ
ｈ ｎ ｅＤＮＡ由来のＤＮＡ断片が検出された。
以上の如くして大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） １１００（Ｅ
Ｎ１１２１Ｓ−Ｇ■）を分離し、所期の組換え体バクテ
リオファージλＥＮ１１２１Ｓ−Ｇ ＩＩ ＤＮへの調
製を行った。
Ｎ１１２１Ｓ−Ｇ■）を分離し、所期の組換え体バクテ
リオファージλＥＮ１１２１Ｓ−Ｇ ＩＩ ＤＮへの調
製を行った。
［４１組み換え体プラスミドｐＵｃ１９−ｇｓｈ Ｕ
ｋｋ ＤＮＡの単離 （１）大腸菌（Ｌｃｏｌｉ） １１００（ｐｌｌｏｏ（
ｐＢＲ３２２−の調製組み換え体プラスミドｐＢＲ３２
２−ｇｓｈ Ｉ ＤＮＡを保持する大腸’ＣＩｆＲＣ９
１２（Ｅ、ｃｏｌｉ ＲＣ９１２） （微工研菌寄第６
７３１号）より組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇ
ｓｈＩＤＮＡ （特開昭５９−１９２０８８号公報記載
）を項目［１１（１）記載の方法により精製単離し、Ｄ
ＮＡＩｍｇを得た。
ｋｋ ＤＮＡの単離 （１）大腸菌（Ｌｃｏｌｉ） １１００（ｐｌｌｏｏ（
ｐＢＲ３２２−の調製組み換え体プラスミドｐＢＲ３２
２−ｇｓｈ Ｉ ＤＮＡを保持する大腸’ＣＩｆＲＣ９
１２（Ｅ、ｃｏｌｉ ＲＣ９１２） （微工研菌寄第６
７３１号）より組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇ
ｓｈＩＤＮＡ （特開昭５９−１９２０８８号公報記載
）を項目［１１（１）記載の方法により精製単離し、Ｄ
ＮＡＩｍｇを得た。
この組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ Ｉ
ＤＮＡ ５μｇ ヲＳｔｕ Ｉ （ヘーリンガー・マ
ンハイム・山之内・社・製）５ユニツトと混合し、温度
３７“Ｃで１時間消化したのち、常法によりフ・エノー
ル処理およびエタノール沈澱処理を行って得た沈澱物を
２０μ！の水に溶解し、これを、モレキュラー・クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、第
１１３〜１１４頁、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）記載の方法に
従って大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ・フラグ
メント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｅ、
ｃｏｌｉＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔ ）を用い
て処理し、更に血■リンカ−ＩＯμｇを添加し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ１ユニツトを温度１６°Ｃで１６時間作
用させて組み換え体Ｄ Ｎ ＡｐＢＲ３２２−ｇｓｈ
Ｉ上に血Ｉ切断部位を有する組み換え体プラスミドｐＢ
Ｒ３２２−ｇｓｈ Ｉ ｋ ＤＮＡを得た。
ＤＮＡ ５μｇ ヲＳｔｕ Ｉ （ヘーリンガー・マ
ンハイム・山之内・社・製）５ユニツトと混合し、温度
３７“Ｃで１時間消化したのち、常法によりフ・エノー
ル処理およびエタノール沈澱処理を行って得た沈澱物を
２０μ！の水に溶解し、これを、モレキュラー・クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、第
１１３〜１１４頁、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）記載の方法に
従って大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ・フラグ
メント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｅ、
ｃｏｌｉＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔ ）を用い
て処理し、更に血■リンカ−ＩＯμｇを添加し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ１ユニツトを温度１６°Ｃで１６時間作
用させて組み換え体Ｄ Ｎ ＡｐＢＲ３２２−ｇｓｈ
Ｉ上に血Ｉ切断部位を有する組み換え体プラスミドｐＢ
Ｒ３２２−ｇｓｈ Ｉ ｋ ＤＮＡを得た。
この組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ Ｉ
ｋ ＤＮＡを用い塩化カルシウム処理した前記大腸菌１
１００を、項目［１］ （１）記載の方法により形質転
換し、２０Ｍ／ｄのＡｐを含むＴ−Ｙ培地上で生育する
が、Ｔｃを２０ｕｇ／ｒｄ含むＴ−Ｙ培地上では生育で
きない形質転換株、すなわち、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
１１０ｌ１００（ｐＢＲ３２２−Ｉ ｋ）を得た。
ｋ ＤＮＡを用い塩化カルシウム処理した前記大腸菌１
１００を、項目［１］ （１）記載の方法により形質転
換し、２０Ｍ／ｄのＡｐを含むＴ−Ｙ培地上で生育する
が、Ｔｃを２０ｕｇ／ｒｄ含むＴ−Ｙ培地上では生育で
きない形質転換株、すなわち、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
１１０ｌ１００（ｐＢＲ３２２−Ｉ ｋ）を得た。
（２）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭｌｏｌ （ｐＵｃ１
９−ｇｓｈ Ｉｋｐ）の調製 次いで、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００ （ｐＢＲ３
２２−ｇｓｈ １ ｋ）から組み換え体プラスミドｐＢ
Ｒ３２２−ｇｓｈ ｒ ｋ ＤＮＡを項目［１］ （１
）記載の方法により精製単離し、ＤＮＡ １ ｍｇを得
た。
９−ｇｓｈ Ｉｋｐ）の調製 次いで、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００ （ｐＢＲ３
２２−ｇｓｈ １ ｋ）から組み換え体プラスミドｐＢ
Ｒ３２２−ｇｓｈ ｒ ｋ ＤＮＡを項目［１］ （１
）記載の方法により精製単離し、ＤＮＡ １ ｍｇを得
た。
このようにして得た組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２
−ｇｓｈ Ｉｋ ＤＮＡ ５ ｕｇをユｓｔｌ （
ヘーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）５ユニツ
トと混合し、これを温度３７°Ｃで１時間消化したもの
を、常法によりアガロースゲル電気泳動処理し、ＤＮＡ
断片を得た。
−ｇｓｈ Ｉｋ ＤＮＡ ５ ｕｇをユｓｔｌ （
ヘーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）５ユニツ
トと混合し、これを温度３７°Ｃで１時間消化したもの
を、常法によりアガロースゲル電気泳動処理し、ＤＮＡ
断片を得た。
このＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、これを透析チュ
ーブに詰め、再度電気泳動処理し、ゲル中に存在するＤ
ＮＡ断片をゲル外に出し、２μｇのＧＳＨ−Ｉ遺伝子を
含むＤＮＡ断片ｇｓｈ Ｉ ｋｐを得た。
ーブに詰め、再度電気泳動処理し、ゲル中に存在するＤ
ＮＡ断片をゲル外に出し、２μｇのＧＳＨ−Ｉ遺伝子を
含むＤＮＡ断片ｇｓｈ Ｉ ｋｐを得た。
次いで、プラスミドｐＨｃ１９（全酒造・社・製）ｌμ
ｇをＰｓｔｌ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社
・製）５ユニツトと混合して温度３７°Ｃで１時間消化
したものに、上述の如くして得られたＤＮＡ断片ｇｓｈ
ｌｋｌ）１μｇを添加し、更に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）ｌユニ
ットを添加し、温度１６゛Ｃで１２分間反応させて連結
し、プラスミドｐＵｃ１９ ＤＮＡ上にＧＳＨ−１遺伝
子の両性側にＭｌ切断部位を保持する組み換え体プラス
ミドＩ）ＵＣｌ３−ｇｓｈ Ｉ ｋｐＤＮＡを得た。
ｇをＰｓｔｌ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社
・製）５ユニツトと混合して温度３７°Ｃで１時間消化
したものに、上述の如くして得られたＤＮＡ断片ｇｓｈ
ｌｋｌ）１μｇを添加し、更に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）ｌユニ
ットを添加し、温度１６゛Ｃで１２分間反応させて連結
し、プラスミドｐＵｃ１９ ＤＮＡ上にＧＳＨ−１遺伝
子の両性側にＭｌ切断部位を保持する組み換え体プラス
ミドＩ）ＵＣｌ３−ｇｓｈ Ｉ ｋｐＤＮＡを得た。
次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ｐＨｃ１９−ｇｓｈ Ｉ ｋｐ ＤＮＡを用い、塩化カ
ルシウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ
（全酒造■より購入〕を前記項目［１］ （１）記載
の方法により形質転換し、２０ｕｇ／−のＡｐを含むＴ
−Ｙ 培地上で生育し、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイドおよびイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイドを含有
するＴ−Ｙ培地上で白いコロニーをつくる形質転換株、
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＪＭＩＯＩ （ｐＵｃ１９−
ｇｓｈ Ｔ ｋｐ）を得た。
ｐＨｃ１９−ｇｓｈ Ｉ ｋｐ ＤＮＡを用い、塩化カ
ルシウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ
（全酒造■より購入〕を前記項目［１］ （１）記載
の方法により形質転換し、２０ｕｇ／−のＡｐを含むＴ
−Ｙ 培地上で生育し、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイドおよびイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイドを含有
するＴ−Ｙ培地上で白いコロニーをつくる形質転換株、
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＪＭＩＯＩ （ｐＵｃ１９−
ｇｓｈ Ｔ ｋｐ）を得た。
（３）組み換え体プラスミドｐＵｃ１９−ｇｓｈ Ｕ
ｋｋ ＤＮＡの調製 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ （ｐＵｃ１９−ｇ
ｓｈ Ｉ ｋｐ）から項目［１］ （１）記載の方法に
より組み換え体ＤＮＡｐＵｃ１９−ｇｓｈ Ｉ ｋｐ
ＤＮＡを精製単離し、ＤＮＡ１ｍｇを得た。
ｋｋ ＤＮＡの調製 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ （ｐＵｃ１９−ｇ
ｓｈ Ｉ ｋｐ）から項目［１］ （１）記載の方法に
より組み換え体ＤＮＡｐＵｃ１９−ｇｓｈ Ｉ ｋｐ
ＤＮＡを精製単離し、ＤＮＡ１ｍｇを得た。
また、組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ Ｉ
ＤＮＡから特開昭６０−１８０５９２号公報実施例記
載の方法に従い、ＧＳＨ−１遺伝子を２個組み込んだ組
み換え体プラスミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ１．Ｉ ＤＮ
Ａを調製し、この組み換え体プラスミドＤＮＡを用いて
塩化カルシウム処理した前記大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
１１００を項目［１］ （１）記載の方法により形質転
換し、Ａｐを２０ｕｇ／ｍｌを含むＴ−Ｙ培地では生育
できず、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍ！を含むＴ
−Ｙ培地では生育する形質転換株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ） １１００ｌ１００（ｐＢＲ３２５−、Ｉ）を得た
。
ＤＮＡから特開昭６０−１８０５９２号公報実施例記
載の方法に従い、ＧＳＨ−１遺伝子を２個組み込んだ組
み換え体プラスミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ１．Ｉ ＤＮ
Ａを調製し、この組み換え体プラスミドＤＮＡを用いて
塩化カルシウム処理した前記大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
１１００を項目［１］ （１）記載の方法により形質転
換し、Ａｐを２０ｕｇ／ｍｌを含むＴ−Ｙ培地では生育
できず、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍ！を含むＴ
−Ｙ培地では生育する形質転換株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ） １１００ｌ１００（ｐＢＲ３２５−、Ｉ）を得た
。
このようにして得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００
（ｐＢＲ３２５−ｇｓｈｌ Ｉ）から組み換え体プラス
ミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ１．Ｉ ＤＮＡを、項目［１
］ （１）記載の方法により精製単離し、ＤＮＡ１■を
得た。
（ｐＢＲ３２５−ｇｓｈｌ Ｉ）から組み換え体プラス
ミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ１．Ｉ ＤＮＡを、項目［１
］ （１）記載の方法により精製単離し、ＤＮＡ１■を
得た。
次いで、組み換え体Ｄ Ｎ ＡｐＢＲ３２５−ｇｓｈ
ｎ ＤＮＡ ５μｇおよび」しＩＩ （ベーリンガー
・マンハイム・山之内・社・製）５ユニツトを混合した
ものを温度３７°Ｃで１時間消化し、常法によりアガロ
ースゲル電気泳動処理してＤＮＡ断片を分離し、該ＤＮ
Ａ断片を含有するゲルを切り出したものを、透析チュー
ブに詰め、再度電気泳動処理を行ないゲル中に存在する
ＤＮＡ断片をゲル外に出し、ＧＳＨ−Ｉ遺伝子の一部を
含むＤＮＡ断片ｇｓｈ１．Ｉ ｂｇ２μｇを得た。
ｎ ＤＮＡ ５μｇおよび」しＩＩ （ベーリンガー
・マンハイム・山之内・社・製）５ユニツトを混合した
ものを温度３７°Ｃで１時間消化し、常法によりアガロ
ースゲル電気泳動処理してＤＮＡ断片を分離し、該ＤＮ
Ａ断片を含有するゲルを切り出したものを、透析チュー
ブに詰め、再度電気泳動処理を行ないゲル中に存在する
ＤＮＡ断片をゲル外に出し、ＧＳＨ−Ｉ遺伝子の一部を
含むＤＮＡ断片ｇｓｈ１．Ｉ ｂｇ２μｇを得た。
上述の如くして精製した組み換え体プラスミドｐＵｃ１
９−ｇｓｈ Ｉ ｋｐ ｌ ｕ ｇおよびＩＩＩ （
ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）５ユニツ
トを混合し、温度３７°Ｃで１時間消化したものに、上
記ＤＮＡ断片ｇｓｈ１．Ｉ ｂｇ １ ｔｌｇを添加し
、更にＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム
・山之内・社・製）■ユニットを加え、温度１６°Ｃで
１２時間反応させて連結し、この連結したＤＮＡを用い
塩化カルシウム処理した前記大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１
１００を項目［１］ （１）記載の方法により形質転換
し、Ａｐ２０μｇ／−を含有するＴ−Ｙ培地で生育する
形質転換株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐＵｃ
１９−ｇｓｈｌ、１ｋｋ）を分離した。
９−ｇｓｈ Ｉ ｋｐ ｌ ｕ ｇおよびＩＩＩ （
ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）５ユニツ
トを混合し、温度３７°Ｃで１時間消化したものに、上
記ＤＮＡ断片ｇｓｈ１．Ｉ ｂｇ １ ｔｌｇを添加し
、更にＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム
・山之内・社・製）■ユニットを加え、温度１６°Ｃで
１２時間反応させて連結し、この連結したＤＮＡを用い
塩化カルシウム処理した前記大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１
１００を項目［１］ （１）記載の方法により形質転換
し、Ａｐ２０μｇ／−を含有するＴ−Ｙ培地で生育する
形質転換株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐＵｃ
１９−ｇｓｈｌ、１ｋｋ）を分離した。
このようにして得た形質転換株より組み換え体プラスミ
ドＤＮＡを、ニュークリック・アシッズ・リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、第７
巻、第１５１３〜１５２３頁に記載のアルカリ抽出法に
よって単離して、アガロース電気泳動で検出し、検出さ
れるＸ且み換えプラスミドＤＮＡのうち、ＧＳＨ−■遺
伝子が２個組み込まれた組み換え体プラスミドは、Ｇ
Ｓ Ｈ−１遺伝子が１個組み込まれた組み換え体プラス
ミドＤＮＡより大きい組み換え体プラスミドＤＮＡとし
て検出される。すなわち、アガロース電気泳動において
泳動単離の短い組み換え体プラスミドＤＮＡとして検出
される。このようにしてＧＳＨ−ｆｉｆｆ伝子を２個含
む組み換え体プラスミドｐＵｃ１９−ｇｓｈ１．Ｉ ｋ
ｋ ＤＮＡを得た。
ドＤＮＡを、ニュークリック・アシッズ・リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、第７
巻、第１５１３〜１５２３頁に記載のアルカリ抽出法に
よって単離して、アガロース電気泳動で検出し、検出さ
れるＸ且み換えプラスミドＤＮＡのうち、ＧＳＨ−■遺
伝子が２個組み込まれた組み換え体プラスミドは、Ｇ
Ｓ Ｈ−１遺伝子が１個組み込まれた組み換え体プラス
ミドＤＮＡより大きい組み換え体プラスミドＤＮＡとし
て検出される。すなわち、アガロース電気泳動において
泳動単離の短い組み換え体プラスミドＤＮＡとして検出
される。このようにしてＧＳＨ−ｆｉｆｆ伝子を２個含
む組み換え体プラスミドｐＵｃ１９−ｇｓｈ１．Ｉ ｋ
ｋ ＤＮＡを得た。
（４）組み換え体プラスミドｐＵｃ１９−ｇｓｈ１．Ｉ
ｋｋ Ｉ〕ＮＡの単離 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐＵｃ１９−ｇｓｈ
ｌ、Ｉ ｋｋ）から項目［１］ （＋）記載の方法によ
り組み換え体プラスミドｐＵＣ１９−ｇｓｈ１．Ｉ ｋ
ｋ ＤＮＡ １ ｍｇを得た。
ｋｋ Ｉ〕ＮＡの単離 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐＵｃ１９−ｇｓｈ
ｌ、Ｉ ｋｋ）から項目［１］ （＋）記載の方法によ
り組み換え体プラスミドｐＵＣ１９−ｇｓｈ１．Ｉ ｋ
ｋ ＤＮＡ １ ｍｇを得た。
［５１バクテリオフアージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃの育種（
１）バクテリオファージλＣｌ８Ｓ７１１２１の育種特
開昭５８−２１２７８１号公報記載の実施例と全く同様
にしてバクテリオファージλＣｌＢ５７１１２１ ［
このファージは、このファージを常法により大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）１１００ （Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ西独、ハイデルベルグより入手）に溶原化
して得られる溶原菌、すなわち、Ｅ、ｃｏｌｉ １１０
０（λＣｌｌｌ５？１１２１） （微工研条寄第１３３
号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３３） ）として工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。］を調製し、こ
のバクテリオファージλＣＩａｓ、１１２１から、ティ
ー・マニアテス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法〔モ
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１
ｏ−ｎ＋ｎｇ） 、第７６〜８５頁（１９８２年）〕の
方法により、バクテリオファージλＣｌ１ｌＳ？１１２
１のＤＮＡを得た。
１）バクテリオファージλＣｌ８Ｓ７１１２１の育種特
開昭５８−２１２７８１号公報記載の実施例と全く同様
にしてバクテリオファージλＣｌＢ５７１１２１ ［
このファージは、このファージを常法により大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）１１００ （Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ西独、ハイデルベルグより入手）に溶原化
して得られる溶原菌、すなわち、Ｅ、ｃｏｌｉ １１０
０（λＣｌｌｌ５？１１２１） （微工研条寄第１３３
号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３３） ）として工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。］を調製し、こ
のバクテリオファージλＣＩａｓ、１１２１から、ティ
ー・マニアテス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法〔モ
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１
ｏ−ｎ＋ｎｇ） 、第７６〜８５頁（１９８２年）〕の
方法により、バクテリオファージλＣｌ１ｌＳ？１１２
１のＤＮＡを得た。
（２）バクテリオファージλｃＩｅｓｔｌ１２１−Ｔｃ
／ｘｂの育種 次いで、このようにして得たバクテリオファージλｃＩ
ｓｓｔｌ１２１のＤＮＡ１μｇ及び１０ユニツトのＥｃ
ｏＲＩ （宝酒造・社・製）を５０ｍＭト’Ｊスー塩酸
緩衝？＆（１００ｍＭ ＮａＣ１及び１０ｍＭ Ｍｇ５
Ｏ＜含有、ｐＨ７，４）中で温度３７°Ｃで１時間反応
させたのち、常法によりフェノール抽出及びエタノール
沈澱を行ないバクテリオファージλｃｌａｓ、１１２１
ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物０．８μｇを得た。
／ｘｂの育種 次いで、このようにして得たバクテリオファージλｃＩ
ｓｓｔｌ１２１のＤＮＡ１μｇ及び１０ユニツトのＥｃ
ｏＲＩ （宝酒造・社・製）を５０ｍＭト’Ｊスー塩酸
緩衝？＆（１００ｍＭ ＮａＣ１及び１０ｍＭ Ｍｇ５
Ｏ＜含有、ｐＨ７，４）中で温度３７°Ｃで１時間反応
させたのち、常法によりフェノール抽出及びエタノール
沈澱を行ないバクテリオファージλｃｌａｓ、１１２１
ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物０．８μｇを得た。
一方、プラスミドｐＫＮ２０６ ＤＮＡ （ティー・マ
スダ（ＴｏＭａｓｕｄａ）等、アグリ・パイオル・ケム
、 （Ａｇｒｉ。
スダ（ＴｏＭａｓｕｄａ）等、アグリ・パイオル・ケム
、 （Ａｇｒｉ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） 、第５０巻、第２７１〜２７
８頁（１９８６）記載の方法により得たものである。〕
１１８ｇびＰｖｕＩＩ （宝酒造・社・製）１０ユニ
ツトを、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝ａ、（５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４及び１ｍＭジチオスレ
イトール含有、ｐＨ７，４）中で、温度３７°Ｃで２時
間反応させたのち、常法によりフェノール抽出及びエタ
ノール沈澱を行ないプラスミドｐＫＮ２０６ ＯＮへの
血■消化物０．８μｇ得た。
８頁（１９８６）記載の方法により得たものである。〕
１１８ｇびＰｖｕＩＩ （宝酒造・社・製）１０ユニ
ツトを、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝ａ、（５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４及び１ｍＭジチオスレ
イトール含有、ｐＨ７，４）中で、温度３７°Ｃで２時
間反応させたのち、常法によりフェノール抽出及びエタ
ノール沈澱を行ないプラスミドｐＫＮ２０６ ＯＮへの
血■消化物０．８μｇ得た。
次いで、プラスミドｐＫＮ２０６ ＤＮＡのＰｖｕ Ｉ
Ｉ消化物０．８μｇ、５′末端をリン酸化したＥｃｏＲ
Ｉリンカ−〔ニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎ
ｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ） ・社・製）１
８ｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイ
ム・山之内・社・製）１ユニツトを、６６ｍＭ ｌ−
リス−塩酸緩衝液（６，６ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ
ジチオスレイトール及び１０ｍＭＡＴＰ含有、ｐＨ７，
５）中で、温度４ ’Ｃで２００時間反応せてプラスミ
ドｐＫＮ３０６ ＯＮ八へ、８μｇを得た。
Ｉ消化物０．８μｇ、５′末端をリン酸化したＥｃｏＲ
Ｉリンカ−〔ニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎ
ｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ） ・社・製）１
８ｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイ
ム・山之内・社・製）１ユニツトを、６６ｍＭ ｌ−
リス−塩酸緩衝液（６，６ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ
ジチオスレイトール及び１０ｍＭＡＴＰ含有、ｐＨ７，
５）中で、温度４ ’Ｃで２００時間反応せてプラスミ
ドｐＫＮ３０６ ＯＮ八へ、８μｇを得た。
このようにして得たプラスミドｐＮＫ３０６ ＤＮＡで
デイ−・エム・モーリソン（ＤｏＭ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
）の方法〔メンズ・イソ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第３
２６〜３３１頁（１９７９年）］により塩化カルシウム
処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＨｌ （ＡＴＣＣ３
３８４９）株を形質転換し、大腸菌ＤＩ＋ １ （ｐＫ
Ｎ３０６）を得た。
デイ−・エム・モーリソン（ＤｏＭ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
）の方法〔メンズ・イソ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第３
２６〜３３１頁（１９７９年）］により塩化カルシウム
処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＨｌ （ＡＴＣＣ３
３８４９）株を形質転換し、大腸菌ＤＩ＋ １ （ｐＫ
Ｎ３０６）を得た。
前記項目［１］ （１）と全く同様にしてプラスミドｐ
ＫＮ３０６ ＤＮＡ １２００μｇを得、このＤＮＡ断
片３ｇ及びＥｃｏＲＩ （全酒造・社・製）５０ユニツ
トを、５０ｍＭ１−リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ Ｎ
ａＣ１及び１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ。
ＫＮ３０６ ＤＮＡ １２００μｇを得、このＤＮＡ断
片３ｇ及びＥｃｏＲＩ （全酒造・社・製）５０ユニツ
トを、５０ｍＭ１−リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ Ｎ
ａＣ１及び１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ。
含有、ｐＨ７，４）中で温度３７°Ｃで２時間反応させ
たのち、アール・シー・エイ・ヤング（ＲｏＣ，Ａ、Ｙ
ａｎｇ）等の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジ−（
Ｍｅ−ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第
６８巻、第１７６〜１８２頁（１９７９年）］により、
テトラサイクリン耐性遺伝子を含有する２、３ＫｂのＤ
ＮＡ断片３．５μｇを分取した。
たのち、アール・シー・エイ・ヤング（ＲｏＣ，Ａ、Ｙ
ａｎｇ）等の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジ−（
Ｍｅ−ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第
６８巻、第１７６〜１８２頁（１９７９年）］により、
テトラサイクリン耐性遺伝子を含有する２、３ＫｂのＤ
ＮＡ断片３．５μｇを分取した。
上記２．３ＫｂのＤＮＡ断片１μｇ、合成した５′−ｐ
ＡＡＴＴＧＴＣＴＡＧ リンカ−（ベックマン・社・製
のＰＬＵＳＩＤＮＡ合成機により合成したものである。
ＡＡＴＴＧＴＣＴＡＧ リンカ−（ベックマン・社・製
のＰＬＵＳＩＤＮＡ合成機により合成したものである。
）１μｇ、ＥｃｏＲＩで切断したバクテリオファージλ
ｃｌｓ５ｔｌ１２１ ＤＮＡ １ ｔｌ ｇ及びＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ヘーリンガー・マンハイム・山之内・
社・製）１２ユニツトを、６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（６，６ｍＭＭｇＳＯ４，１０ｍＭジチオスレイトール
及び１０ｍＭ ＡＴＰ含有、ｐＨ７，５）中で温度４°
Ｃで２００時間反応せ、得られたＤＮＡで、塩化カルシ
ウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００を、前記
デイ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
）の方法により形質転換して、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
１１００ （λｃｌｅｓ、１１２１−Ｔｃ／ｘｂ）を得
た。
ｃｌｓ５ｔｌ１２１ ＤＮＡ １ ｔｌ ｇ及びＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ヘーリンガー・マンハイム・山之内・
社・製）１２ユニツトを、６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（６，６ｍＭＭｇＳＯ４，１０ｍＭジチオスレイトール
及び１０ｍＭ ＡＴＰ含有、ｐＨ７，５）中で温度４°
Ｃで２００時間反応せ、得られたＤＮＡで、塩化カルシ
ウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００を、前記
デイ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
）の方法により形質転換して、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）
１１００ （λｃｌｅｓ、１１２１−Ｔｃ／ｘｂ）を得
た。
（３）バクテリオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃの育種大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００ （λｃｌｅｓ７１１２
１−Ｔｃ／ｘｂ）から、ティー・マニアナイス（Ｔ、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）等の方法〔モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第７６〜
８５頁（１９８２年）〕により得られたバクテリオファ
ージλＣＩａｓ７１１２１−Ｔｃ／ｘｂ ＤＮＡ ２
μｇ及び西１ （全酒造・株・製）１０ユニツトを５０
ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣ＋及び
１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，含有、ｐＨ７，４）中で混合し、
温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、常法によりフェ
ノール抽出及びエタノール沈澱を行い、バクテリオファ
ージλＣｌ１ｌＳ７１１２１−Ｔｃ／ｘｂ ＤＮＡのＸ
ｈｏ Ｉ消化物１．６μｇを得た。
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００ （λｃｌｅｓ７１１２
１−Ｔｃ／ｘｂ）から、ティー・マニアナイス（Ｔ、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）等の方法〔モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第７６〜
８５頁（１９８２年）〕により得られたバクテリオファ
ージλＣＩａｓ７１１２１−Ｔｃ／ｘｂ ＤＮＡ ２
μｇ及び西１ （全酒造・株・製）１０ユニツトを５０
ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣ＋及び
１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ，含有、ｐＨ７，４）中で混合し、
温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、常法によりフェ
ノール抽出及びエタノール沈澱を行い、バクテリオファ
ージλＣｌ１ｌＳ７１１２１−Ｔｃ／ｘｂ ＤＮＡのＸ
ｈｏ Ｉ消化物１．６μｇを得た。
一方、特開昭５８−２１２７８１号公報記載の実施例中
項目（６）の方法と全く同様にして得られたバクテリオ
ファージ１２−２ ＤＮＡ ｌμｇ、バクテリオファー
ジλｇｔ ＷＥＳ・λＢ ＤＮＡ 〔ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） ０社・製〕１μｇ及び
ＥｃｏＲＩ （全酒造・株・製）１０ユニットを５０ｍ
Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣ１及び
１０ｍＭ ＭｇＳＯ４含有、ｐＨ７，４）中で、温度３
７°Ｃで１時間反応させたのち、常法によりフェノール
抽出エタノール沈澱を行ない消化物１６６μｇを得た。
項目（６）の方法と全く同様にして得られたバクテリオ
ファージ１２−２ ＤＮＡ ｌμｇ、バクテリオファー
ジλｇｔ ＷＥＳ・λＢ ＤＮＡ 〔ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） ０社・製〕１μｇ及び
ＥｃｏＲＩ （全酒造・株・製）１０ユニットを５０ｍ
Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣ１及び
１０ｍＭ ＭｇＳＯ４含有、ｐＨ７，４）中で、温度３
７°Ｃで１時間反応させたのち、常法によりフェノール
抽出エタノール沈澱を行ない消化物１６６μｇを得た。
このようにして得た消化物１．６μｇ及びＴ４ ＤＮＡ
リガーゼｌユニットを６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（６
，６ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭジチオスレイトール及
び１０ｍＭＡＴＰ含有、ｐＨ７，５）中で温度４°Ｃで
１６時間反応させ、得られたＤＮＡで、塩化カルシウム
処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） １１００を、前記デ
イ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）
の方法により形質転換し、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１
００上でプラークを形成するバクテリオファージ１２−
２ＷＥを得た。
リガーゼｌユニットを６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（６
，６ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭジチオスレイトール及
び１０ｍＭＡＴＰ含有、ｐＨ７，５）中で温度４°Ｃで
１６時間反応させ、得られたＤＮＡで、塩化カルシウム
処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） １１００を、前記デ
イ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）
の方法により形質転換し、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１
００上でプラークを形成するバクテリオファージ１２−
２ＷＥを得た。
上述の如くして得られたバクテリオファージ１２−２Ｗ
Ｅ及びバクテリオファージφ８０〔特開昭５８−２１２
７８１号公報実施例中の項目（１）記載の方法により大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（φ８０） （ＡＴＣ
Ｃ３１２７７）から得た〕を特開昭５８−２１２７８１
号公報実施例中項目（２）記載の方法により大腸菌１１
００に感染させて溶菌液を得、この溶菌液を、溶源菌で
ある大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（φ８０） （
ＡＴＣＣ３１２７７）に感染させ、プラークを形成する
バクテリオファージ１２−２−３００を得た。
Ｅ及びバクテリオファージφ８０〔特開昭５８−２１２
７８１号公報実施例中の項目（１）記載の方法により大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（φ８０） （ＡＴＣ
Ｃ３１２７７）から得た〕を特開昭５８−２１２７８１
号公報実施例中項目（２）記載の方法により大腸菌１１
００に感染させて溶菌液を得、この溶菌液を、溶源菌で
ある大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（φ８０） （
ＡＴＣＣ３１２７７）に感染させ、プラークを形成する
バクテリオファージ１２−２−３００を得た。
次いで、バクテリオファージ１２−２−３００から、前
述したティー・マニアナイス（Ｔ、Ｍｏｎ１ａｔｉｓ）
等の方法により調製したバクテリオファージ１２−２−
３００ＤＮＡ２μｇ及び−Ｘｈｏ Ｉ ２０ユニツトを
、５０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ Ｎａ
Ｃ１及び１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏａ含有、ｐＨ７，４）中で
温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、常法によりフェ
ノール抽出及びエタノール沈澱を行ない消化物１．６μ
ｇを得た。
述したティー・マニアナイス（Ｔ、Ｍｏｎ１ａｔｉｓ）
等の方法により調製したバクテリオファージ１２−２−
３００ＤＮＡ２μｇ及び−Ｘｈｏ Ｉ ２０ユニツトを
、５０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ Ｎａ
Ｃ１及び１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏａ含有、ｐＨ７，４）中で
温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、常法によりフェ
ノール抽出及びエタノール沈澱を行ない消化物１．６μ
ｇを得た。
前記したバクテリオファージ１２−２−３００ ＤＮＡ
のＸｈｏ Ｉ消化物１μｇ、上述したバクテリオファー
ジλｃｌｓｓ、１１２１−Ｔｃ／ｘｂ ＤＮＡのＸｈｏ
Ｉ消化物ｌａｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニットを
６６ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（６，６ｍＭ ＭｇＣ１
ｚ、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭＡＴＰ含
有、ｐＨ７，５）中で温度１６゛Ｃで１６時間反応させ
たのち、得られたＤＮＡで前記デイ−・エム・モーリソ
ン（Ｄ、Ｍ、ｍｏｒｒｉ−ｓｏｎ）の方法により塩化カ
ルシウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＱＤ５００３
（凡用大学より入手）を形質転換し、大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）ＱＤ５００３株上でプラークを形成するバクテ
リオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃを得た。
のＸｈｏ Ｉ消化物１μｇ、上述したバクテリオファー
ジλｃｌｓｓ、１１２１−Ｔｃ／ｘｂ ＤＮＡのＸｈｏ
Ｉ消化物ｌａｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニットを
６６ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（６，６ｍＭ ＭｇＣ１
ｚ、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭＡＴＰ含
有、ｐＨ７，５）中で温度１６゛Ｃで１６時間反応させ
たのち、得られたＤＮＡで前記デイ−・エム・モーリソ
ン（Ｄ、Ｍ、ｍｏｒｒｉ−ｓｏｎ）の方法により塩化カ
ルシウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＱＤ５００３
（凡用大学より入手）を形質転換し、大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）ＱＤ５００３株上でプラークを形成するバクテ
リオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃを得た。
［６］バタテリオフアージＦＮ５０１Ｓ−Ｔｃのコート
蛋白質製造の遺伝子情報部分に存在するエンドヌクレア
ーゼ切断部位にＧＳＨ−１遺伝予断片を翻訳に必要なり
ＮＡ配列の制御下に挿入した組み換え体バクテリオファ
ージλＥＮ５０１Ｓ−ＧＩ２の作製項目［５］ （３）
で得られたバクテリオファージＥＮ５０１ＳＴｃ ＤＮ
Ａ １０８ｇおよび項目［４］ （４）で得られた組み
換え体プラスミドＩ）ＬｉＣｌ２−ｇｓｈｌ、Ｉ ｋｋ
ＤＮＡ３ｕｇを混合し、これをｌＱｍＭ トリス−
１１ｃＩ （ｐ Ｈ７，５）／ １０ｍＭ ＭｇＣｌ□
／１酵ジチオスレイトールの組成の溶液５０μｐに添加
し、更に、５０ユニツトの」匹Ｉ（ベーリンガー・マン
ハイム・山之内・社・製）を添加し、温度３７°Ｃで２
時間作用させたのち、常法によりフェノール抽出および
エタノール沈澱して沈澱物を得、これを５０１１ＩＭト
リス４１ｃＩ （ｐ Ｈ７，４）／ １０ｍＭＭｇＣ１
ｚ／］ＯｍＭジチオスレイトール１０，１ｍＭ ＡＴＰ
の組成の溶液８μ℃に添加し、更に、２ユニントのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・
社・製）を添加し、温度４ ”Ｃで１８時間作用させて
連結反応を行なった。
蛋白質製造の遺伝子情報部分に存在するエンドヌクレア
ーゼ切断部位にＧＳＨ−１遺伝予断片を翻訳に必要なり
ＮＡ配列の制御下に挿入した組み換え体バクテリオファ
ージλＥＮ５０１Ｓ−ＧＩ２の作製項目［５］ （３）
で得られたバクテリオファージＥＮ５０１ＳＴｃ ＤＮ
Ａ １０８ｇおよび項目［４］ （４）で得られた組み
換え体プラスミドＩ）ＬｉＣｌ２−ｇｓｈｌ、Ｉ ｋｋ
ＤＮＡ３ｕｇを混合し、これをｌＱｍＭ トリス−
１１ｃＩ （ｐ Ｈ７，５）／ １０ｍＭ ＭｇＣｌ□
／１酵ジチオスレイトールの組成の溶液５０μｐに添加
し、更に、５０ユニツトの」匹Ｉ（ベーリンガー・マン
ハイム・山之内・社・製）を添加し、温度３７°Ｃで２
時間作用させたのち、常法によりフェノール抽出および
エタノール沈澱して沈澱物を得、これを５０１１ＩＭト
リス４１ｃＩ （ｐ Ｈ７，４）／ １０ｍＭＭｇＣ１
ｚ／］ＯｍＭジチオスレイトール１０，１ｍＭ ＡＴＰ
の組成の溶液８μ℃に添加し、更に、２ユニントのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・
社・製）を添加し、温度４ ”Ｃで１８時間作用させて
連結反応を行なった。
得られたＤＮＡｌ０μｇをイン・ビトロ・パッケージン
グ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋｅｇｉｎｇ）法により
、λバクテリオファージの被覆蛋白質で包み、バクテリ
オファージ粒子を調製し、このファージ粒子溶液５０μ
ｌに、前記大腸菌１ｌＯＯｃｌＯ９／ｒｎｌ、 ０．５
μＡ ）を加え、温度３０°Ｃで３時間装置したもの
に、更に、項目［３］記載の方法と同様にしてバクテリ
オファージλｃｂ２で処理し、更に、Ｔｃ耐性の菌株を
選択することにより溶源菌を得た。
グ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋｅｇｉｎｇ）法により
、λバクテリオファージの被覆蛋白質で包み、バクテリ
オファージ粒子を調製し、このファージ粒子溶液５０μ
ｌに、前記大腸菌１ｌＯＯｃｌＯ９／ｒｎｌ、 ０．５
μＡ ）を加え、温度３０°Ｃで３時間装置したもの
に、更に、項目［３］記載の方法と同様にしてバクテリ
オファージλｃｂ２で処理し、更に、Ｔｃ耐性の菌株を
選択することにより溶源菌を得た。
この溶源菌を夫々Ｔ−Ｙ培地を用いて温度３２°Ｃで１
６時間振盪培養し、培養液０．５ ｍ／を１５０ ｍ容
三角フラスコ中の１０−のＴ−Ｙ培地に接種し、タレン
ト・ユニッツ（Ｋｌｅｔｔ ｕｎｉｔｓ）が約１００に
なったところで温度を４３°Ｃに上昇させて２５分間振
盪したのち、再度温度を３２°Ｃに降下させて約３時間
振盪を続けた。
６時間振盪培養し、培養液０．５ ｍ／を１５０ ｍ容
三角フラスコ中の１０−のＴ−Ｙ培地に接種し、タレン
ト・ユニッツ（Ｋｌｅｔｔ ｕｎｉｔｓ）が約１００に
なったところで温度を４３°Ｃに上昇させて２５分間振
盪したのち、再度温度を３２°Ｃに降下させて約３時間
振盪を続けた。
このようにして得た培養液のうち１−を超音波破砕処理
したものを細胞抽出液とし、ジャーナル・オプ・ジェネ
ラル、マイクロバイオロジー（Ｊ。
したものを細胞抽出液とし、ジャーナル・オプ・ジェネ
ラル、マイクロバイオロジー（Ｊ。
Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、） 、第１２８巻、第１
０４７〜１０５２頁（１９８２年）記載の方法に従い、
ｃ ｓ、 ｔｌ−ｒの酵素活性を測定し、活性の高い株
を選択した。この活性の高い溶源菌より項目［３１で記
載の方法と同様にして、ＤＮＡを抽出し、１０ユニツト
の」肌■（ヘーリンガー・マンハイム・山之内・社・製
）で温度３７°Ｃで２時間消化し、アガロース電気泳動
処理し、ＤＮＡ断片の大きさを分断した。
０４７〜１０５２頁（１９８２年）記載の方法に従い、
ｃ ｓ、 ｔｌ−ｒの酵素活性を測定し、活性の高い株
を選択した。この活性の高い溶源菌より項目［３１で記
載の方法と同様にして、ＤＮＡを抽出し、１０ユニツト
の」肌■（ヘーリンガー・マンハイム・山之内・社・製
）で温度３７°Ｃで２時間消化し、アガロース電気泳動
処理し、ＤＮＡ断片の大きさを分断した。
その結果、ＧＳＨ−Ｉ高活性の溶源菌は、約４にｂｐの
ｐＵｃ１９−ｇｓｈｌ、Ｉ ｋｋ由来のＤＮＡ断片を保
持していた。
ｐＵｃ１９−ｇｓｈｌ、Ｉ ｋｋ由来のＤＮＡ断片を保
持していた。
以上の如くして大腸菌（Ｂ、ｃｏｌｉ）１１００（ＥＮ
５０１ＳＧ Ｉ２）を分離し、所期の組み換え体バクテ
リオファージλＥＮ５０１Ｓ−ＧＩ２の作製をおこなっ
た。
５０１ＳＧ Ｉ２）を分離し、所期の組み換え体バクテ
リオファージλＥＮ５０１Ｓ−ＧＩ２の作製をおこなっ
た。
［７１同−ハタテリオフアージＤＮＡ上にＧ Ｓ Ｈ−
１およびＧ Ｓ Ｈ−ＩＩ ａ伝子を保持するバクテリ
オファージ５０１Ｇｒ２ ｘ Ｇ１１ｌの作製（１）
大腸菌１１００ （５０１Ｇ １２ ｘ ＧＩＩＩ）
の調製項目「３って得られたバクテリオファージＥＮＩ
Ｉ２１ＳｆｄｌＤＮＡ ｌｏｕｇおよび、項目［６１で
得られたバクテリオファージＥＮ５０１ＳＧ １２ Ｄ
ＮＡ １０μｇを混合し、これを５０ｍＭ ）リス−
ＨＣＩ（ｐＨ７，５） ／１０ｍＭＭｇＣ１ｚ／１ｍＭ
ジチオスレイトール／１００ｍＭ ＮａＣｌの組成の溶
液５０μ℃に添加し、更に５０ユニツトのＸｈｏｌ（ベ
ーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を添加し、
温度３７°Ｃで２時間作用させたのち、常法によりフェ
ノール抽出およびエタノール沈澱して、沈澱物を得、こ
れを５０ｍＭ トリス−１１ｃＩ（ｐＨ７，４）／１
０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ／１０ｍＭジチオスレイトール１０
、１ｍＭ Ａ Ｔ Ｐの組成の溶液８μｌに添加し、更
に、２ユニツトのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー
・マンハイム・山之内・社・製）を添加し、温度４°Ｃ
で１８時間作用させて、連結反応を行なった。
１およびＧ Ｓ Ｈ−ＩＩ ａ伝子を保持するバクテリ
オファージ５０１Ｇｒ２ ｘ Ｇ１１ｌの作製（１）
大腸菌１１００ （５０１Ｇ １２ ｘ ＧＩＩＩ）
の調製項目「３って得られたバクテリオファージＥＮＩ
Ｉ２１ＳｆｄｌＤＮＡ ｌｏｕｇおよび、項目［６１で
得られたバクテリオファージＥＮ５０１ＳＧ １２ Ｄ
ＮＡ １０μｇを混合し、これを５０ｍＭ ）リス−
ＨＣＩ（ｐＨ７，５） ／１０ｍＭＭｇＣ１ｚ／１ｍＭ
ジチオスレイトール／１００ｍＭ ＮａＣｌの組成の溶
液５０μ℃に添加し、更に５０ユニツトのＸｈｏｌ（ベ
ーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）を添加し、
温度３７°Ｃで２時間作用させたのち、常法によりフェ
ノール抽出およびエタノール沈澱して、沈澱物を得、こ
れを５０ｍＭ トリス−１１ｃＩ（ｐＨ７，４）／１
０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ／１０ｍＭジチオスレイトール１０
、１ｍＭ Ａ Ｔ Ｐの組成の溶液８μｌに添加し、更
に、２ユニツトのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー
・マンハイム・山之内・社・製）を添加し、温度４°Ｃ
で１８時間作用させて、連結反応を行なった。
得られたＤＮＡｌ０μｇをイン・ビトロ・パッケージン
グ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）法により
λバクテリオファージの被覆蛋白質で包み、バクテリオ
ファージ粒子を調製し、このファージ粒子溶液５０μｌ
に大腸菌１１００ （Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ４ｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ西独、ハイデルベルグより人手） （１０’／ｍ
／、０．５μりを加え、温度３０°Ｃで、２時間装置し
たものに、更に項目［３１に記載の方法と同様にλｃｂ
２で処理したのち、溶源菌を得た。
グ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）法により
λバクテリオファージの被覆蛋白質で包み、バクテリオ
ファージ粒子を調製し、このファージ粒子溶液５０μｌ
に大腸菌１１００ （Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ４ｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ西独、ハイデルベルグより人手） （１０’／ｍ
／、０．５μりを加え、温度３０°Ｃで、２時間装置し
たものに、更に項目［３１に記載の方法と同様にλｃｂ
２で処理したのち、溶源菌を得た。
組み換え体ＤＮＡを含有する溶源菌は、１．５μｇ／ｍ
／のＴｃを含有する培地で生育せず、プラーク形成能を
欠失している株として選択する。この選択された組み換
え体ＤＮＡを含有する菌株より組み換え体ＤＮＡを検出
する方法を以下に示した。
／のＴｃを含有する培地で生育せず、プラーク形成能を
欠失している株として選択する。この選択された組み換
え体ＤＮＡを含有する菌株より組み換え体ＤＮＡを検出
する方法を以下に示した。
選択された組み換え体ＤＮＡを含有する溶原菌ヲＴ −
Ｙ培地ｒ ａｔに接種して、クレット・ユニッッが約１
００になったところで温度を４３°Ｃに上昇させて２５
分間振盪したのち再び、温度を３２°ｃに降下させて約
３時間振盪を続けた。
Ｙ培地ｒ ａｔに接種して、クレット・ユニッッが約１
００になったところで温度を４３°Ｃに上昇させて２５
分間振盪したのち再び、温度を３２°ｃに降下させて約
３時間振盪を続けた。
このようにして得られた培養液にクロロボルム５０μｌ
を添加し、更に温度３２°Ｃで２０分間振盪を続け（こ
の操作により溶関する。）、常法によりフェノール抽出
及びエタノール沈澱を行ないＤＮＡを抽出した。
を添加し、更に温度３２°Ｃで２０分間振盪を続け（こ
の操作により溶関する。）、常法によりフェノール抽出
及びエタノール沈澱を行ないＤＮＡを抽出した。
このようにして得られたＤＮＡを、前記の如くしてＥｃ
ｏＲＩおよびｈｒで処理し、アガロース電気泳動にかけ
ＤＮＡ断片の大きさを分析した結果、選択された溶源菌
の保持する組み換え体ＤＮＡは、Ｇ Ｓ Ｈ−１遺伝子
を２個含むｐＵｃ１９−ｇｓｈｌ、Ｉ ｋｋおよびＧＳ
Ｈ−Ｕ遺伝子を含むｐＢＲ３２２−ｇｓｈ ＩＩ ｅ由
来のＤＮＡ断片を保持することが判明した。
ｏＲＩおよびｈｒで処理し、アガロース電気泳動にかけ
ＤＮＡ断片の大きさを分析した結果、選択された溶源菌
の保持する組み換え体ＤＮＡは、Ｇ Ｓ Ｈ−１遺伝子
を２個含むｐＵｃ１９−ｇｓｈｌ、Ｉ ｋｋおよびＧＳ
Ｈ−Ｕ遺伝子を含むｐＢＲ３２２−ｇｓｈ ＩＩ ｅ由
来のＤＮＡ断片を保持することが判明した。
以上の如くして大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００ （５
０１Ｇ Ｉ ２ｘＧＩ１１）を分離した。
０１Ｇ Ｉ ２ｘＧＩ１１）を分離した。
なお、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００ （５０１ＧＩ
２ Ｘ Ｇ１１ｌ）は、工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第９９０３号（ＦＥＲＭ Ｐ−９９０
３）として寄託されている。
２ Ｘ Ｇ１１ｌ）は、工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第９９０３号（ＦＥＲＭ Ｐ−９９０
３）として寄託されている。
（２）組み換え体バクテリオファージ５０１ＧＩ２ＸＧ
ｎＩＤＮＡの単離 上記で得られた溶源菌、即ち大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｈ
ｏｏ （５０１ｃ１２ Ｘ ＧＩＩＩ）を、Ｔ−Ｙ培地
３ｍｆに接種し、温度３２°Ｃで１６時間振盪培養して
得た培養液５００μ！を、Ｔ−Ｙ培地３０ｍＺを含む５
０〇−容三角フラスコに加え、温度３２°Ｃでクレット
・ユニッッ（Ｋｌｅｔｔ ｕｎｉｔｓ）が約１００にな
るまで振盪培養を行ない、温度４２°Ｃで１５分間熱誘
発を行なったのち、温度３７°Ｃで２時間振盪培養を行
ない培養液を得た。
ｎＩＤＮＡの単離 上記で得られた溶源菌、即ち大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｈ
ｏｏ （５０１ｃ１２ Ｘ ＧＩＩＩ）を、Ｔ−Ｙ培地
３ｍｆに接種し、温度３２°Ｃで１６時間振盪培養して
得た培養液５００μ！を、Ｔ−Ｙ培地３０ｍＺを含む５
０〇−容三角フラスコに加え、温度３２°Ｃでクレット
・ユニッッ（Ｋｌｅｔｔ ｕｎｉｔｓ）が約１００にな
るまで振盪培養を行ない、温度４２°Ｃで１５分間熱誘
発を行なったのち、温度３７°Ｃで２時間振盪培養を行
ない培養液を得た。
この培養液に５００μｌのクロロホルムを添加しくこの
操作で溶菌される。）、溶菌液を得、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ） 、第２０２巻、第１２７９頁（１９７８
）記載の方法と同様にして、この溶菌液２Ｉ１１／に、
０．２５ＭＥＤＴＡ／ ０．５ Ｍ ｌ−リス−）Ｉ
Ｃ１（ｐ Ｈ９，０） ／ ２．５％ドデシル硫酸ナト
リウムを含む溶液４００μ℃を添加し、温度７０°Ｃで
３０分間加熱したのち、これに８Ｍ酢酸カリウム溶液を
５００ｕｆｆｉ添加し、氷上で１５分間放置したのち、
１２０００ｇで２０分間遠心分離処理を行なって、上清
をとり、この上清に、２倍量のエタノールを添加し、２
７０００ｇで３０分間遠心分離処理を行ない、得られた
沈澱を常法で乾燥することにより純化された組み換え体
バクテリオファージ５０１Ｇ Ｉ２ Ｘ ＧＩＩＩ Ｄ
ＮＡ ５００ μｇを得た。
操作で溶菌される。）、溶菌液を得、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ） 、第２０２巻、第１２７９頁（１９７８
）記載の方法と同様にして、この溶菌液２Ｉ１１／に、
０．２５ＭＥＤＴＡ／ ０．５ Ｍ ｌ−リス−）Ｉ
Ｃ１（ｐ Ｈ９，０） ／ ２．５％ドデシル硫酸ナト
リウムを含む溶液４００μ℃を添加し、温度７０°Ｃで
３０分間加熱したのち、これに８Ｍ酢酸カリウム溶液を
５００ｕｆｆｉ添加し、氷上で１５分間放置したのち、
１２０００ｇで２０分間遠心分離処理を行なって、上清
をとり、この上清に、２倍量のエタノールを添加し、２
７０００ｇで３０分間遠心分離処理を行ない、得られた
沈澱を常法で乾燥することにより純化された組み換え体
バクテリオファージ５０１Ｇ Ｉ２ Ｘ ＧＩＩＩ Ｄ
ＮＡ ５００ μｇを得た。
（３）組み換え体バクテリオファージＥＮ１１２１ＳＧ
ｎＤＮＡ、バクテリオファージＥＮ５０１ＳＧ Ｉ
２ ＤＮＡおよびバクテリオファージ５０１ＧＩ２ ｘ
ＧＩＩＩ ＤＮ八にょる溶源菌を培養して得られた菌
体のＧＳＨ−ＩおよびＧＳＨ−１１活性 かくして得られた溶源菌、すなわち、大腸菌１１００
（ＥＮ１１２１ＳＧＩＩ） 、大腸菌１１００（ＥＮ５
０１ＳＧ Ｉ ２）および大腸菌１１００ （５０１Ｇ
Ｉ２ ｘ Ｇ１１ｌ）ｃ７）保有するａＳＨｉおよびＧ
ＳＨ−ＩＩ活性を第１表に示した。
ｎＤＮＡ、バクテリオファージＥＮ５０１ＳＧ Ｉ
２ ＤＮＡおよびバクテリオファージ５０１ＧＩ２ ｘ
ＧＩＩＩ ＤＮ八にょる溶源菌を培養して得られた菌
体のＧＳＨ−ＩおよびＧＳＨ−１１活性 かくして得られた溶源菌、すなわち、大腸菌１１００
（ＥＮ１１２１ＳＧＩＩ） 、大腸菌１１００（ＥＮ５
０１ＳＧ Ｉ ２）および大腸菌１１００ （５０１Ｇ
Ｉ２ ｘ Ｇ１１ｌ）ｃ７）保有するａＳＨｉおよびＧ
ＳＨ−ＩＩ活性を第１表に示した。
なお、各酵素活性は、Ｔ−Ｙ培地で前記項目［６］に記
載の方法に従い培養した菌体より調製した菌体抽出液を
用いて行なった。
載の方法に従い培養した菌体より調製した菌体抽出液を
用いて行なった。
また、酵素活性は、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マ
イクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） 、第１２８巻、１
０４７〜１０５２頁（１９８２）記載の方法で行なった
。
イクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） 、第１２８巻、１
０４７〜１０５２頁（１９８２）記載の方法で行なった
。
第 １ 表
実施例２ グルタチオン生成活性
溶原菌、大腸菌１１００ （ｓｏｌＧＩ２ｘ ＧＩＩＩ
）は、Ｔ−Ｙ培地を用い前記項目［６１に記載の方法に
従い培養し、大腸菌１１００および大腸菌１１００／
ｐＢＲ３２２−ｇｓｈＬＩ−ＩＩ ｂは、Ｔ−Ｙ培地で
温度３７°Ｃで２０時間振盪培養し、このようにして得
られた菌体を夫々集菌し、０．８５％（Ｗ／Ｖ）の生理
食塩水で１回洗浄して得た菌体１ｇを夫々２ｍｌの０．
５ｍＭのし一システィンを含む５ｍＭのトリス−１１ｃ
Ｉ（ｐＨ７，０）緩衝液に懸濁し、更に、常法により超
音波破砕処理し、８０ｍＭＬ−グルタミン酸、２０ｍ門
Ｌ−しスティン、２０ｍＮグリシン、２５ｍＭ塩化マグ
ネシウム、２０ｍＭＡＴＰ、 ２０ｍＭアセチルリン
酸および２５ ＋１１Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７，２
）緩衝液を含む反応液７９−を加え、温度３７°Ｃで２
時間振盪培養を行ない、かくして反応液中に生成したグ
ルタチオン量より算出したグルタチオン生成活性を第２
表に示した。
）は、Ｔ−Ｙ培地を用い前記項目［６１に記載の方法に
従い培養し、大腸菌１１００および大腸菌１１００／
ｐＢＲ３２２−ｇｓｈＬＩ−ＩＩ ｂは、Ｔ−Ｙ培地で
温度３７°Ｃで２０時間振盪培養し、このようにして得
られた菌体を夫々集菌し、０．８５％（Ｗ／Ｖ）の生理
食塩水で１回洗浄して得た菌体１ｇを夫々２ｍｌの０．
５ｍＭのし一システィンを含む５ｍＭのトリス−１１ｃ
Ｉ（ｐＨ７，０）緩衝液に懸濁し、更に、常法により超
音波破砕処理し、８０ｍＭＬ−グルタミン酸、２０ｍ門
Ｌ−しスティン、２０ｍＮグリシン、２５ｍＭ塩化マグ
ネシウム、２０ｍＭＡＴＰ、 ２０ｍＭアセチルリン
酸および２５ ＋１１Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ７，２
）緩衝液を含む反応液７９−を加え、温度３７°Ｃで２
時間振盪培養を行ない、かくして反応液中に生成したグ
ルタチオン量より算出したグルタチオン生成活性を第２
表に示した。
（本頁以下余白）
Claims (2)
- （１）γ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵素をコー
ドする遺伝子を含有するＤＮＡおよびグルタチオン合成
酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡをバクテリオ
ファージベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新
規な組み換え体ＤＮＡ。 - （２）γ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵素をコー
ドする遺伝子を含有するＤＮＡおよびグルタチオン合成
酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡをバクテリオ
ファージベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを
含み、グルタチオン生産能を有するエッシェリシア属に
属する微生物を、培地に培養し、培養物よりグルタチオ
ンを採取するか、該微生物菌体および／または該微生物
菌体処理物を、グルタミン酸、システイン、グリシン、
アデノシン−５′−３リン酸およびマグネシウムイオン
と接触作用させてグルタチオンを生成させることを特徴
とするグルタチオンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63052659A JPH01228473A (ja) | 1988-03-08 | 1988-03-08 | 新規な組み換え体ｄｎａおよびグルタチオンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63052659A JPH01228473A (ja) | 1988-03-08 | 1988-03-08 | 新規な組み換え体ｄｎａおよびグルタチオンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01228473A true JPH01228473A (ja) | 1989-09-12 |
Family
ID=12920991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63052659A Pending JPH01228473A (ja) | 1988-03-08 | 1988-03-08 | 新規な組み換え体ｄｎａおよびグルタチオンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01228473A (ja) |
Cited By (12)
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| EP2143804A4 (en) * | 2007-04-06 | 2010-05-12 | Kyowa Hakko Bio Co Ltd | PROCESS FOR THE PREPARATION OF GLUTATHION OR GAMMA GLUTAMYLCYSTEIN |
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| US9688977B2 (en) | 2013-08-05 | 2017-06-27 | Greenlight Biosciences, Inc. | Engineered phosphoglucose isomerase proteins with a protease cleavage site |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59192088A (ja) * | 1982-09-29 | 1984-10-31 | Hikari Kimura | 遺伝子組換えで造成されるプラスミド |
-
1988
- 1988-03-08 JP JP63052659A patent/JPH01228473A/ja active Pending
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