JPH02460A - ポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はポリペプチドおよびその製造法に関する。さら
に詳しくは、本発明はプロティンジスルフィドイソメラ
ーゼ活性を存するポリペプチドおよびその製造法に関す
る。

従来技術および解決すべき課題 ジスルフィド結合の形成がタンパク質の立体構造の保持
やそれに伴う活性発現にきわめて重要であることは一般
的に知られている。真核細胞ではジスルフィド結合は小
胞体でタンパク質翻訳と同時にもしくは翻訳後直ちに形
成される［Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２５７．　８８４７（１９８２）］。この
ジスルフィド結合は植　口ｔｒｏ　　でも非酵素的に形
成されろか、ｉｎ　　ｖｉｖｏよりら反応速度がおそく
、しかも槙　憔皿　での条件が凰　畦咀を反映していな
いことから、Ａｎｒ　ｔｎｓｅｎ　　らはｉｎ　　ｖｌ
ｖ。

ではノスルフィドインターヂエンノプロテインというタ
ンパク質がジスルフィド結合の形成に機能していると行
えた［Ｊ、　　１ｌｉｏ１．　　Ｃｈｃｍ、、　２３８
６２８（１９６３）］、このち゛えは現在でも依然とし
て仮説であるが、　ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ　　において還
元■やスクランブル型のりボヌクレアーゼ（とらに不活
性型）に作用して正しいジスルフィド結合の形成を促進
し活性型とする酵次が種々の真核生物において発見され
精製されている［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

２０、６５９−１（１９８１）＋Ｂｉｏｃｈｃｍ、　Ｊ
、、２１３゜２２５（１９８３）；　Ｂｉｏｃｈｅａ、
Ｊ、、２１３．２４５（１９８３卸。スクランブル型リ
ボヌクレアーゼは走性条件）゛で還元再酸化処理を行い
調製したもので、活性型リボヌクレアーゼがａする４対
のンスル：フイト結合が自由に組み換えられて生成する
トＲ々の分子−Ｈの混合物である［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｊ、。

２１、’３．　２３５（１９８３）コ。不活性型リボヌ
クレアーゼを活性型とする酵素に対してはプロテインジ
スルフ、イドイソメラーゼ（ＰＤＩ、ＥＣ５゜３゜４．
１）という名称が与えられており、分子量５２０００〜
６２０００の同一なサブユニット２個からなる二１体で
等電点は４．０〜４．５であろ［Ｔｒ（！ｎｄｓ　　ｉ
ｎ　　ｆ３ｉｏｅｈｃｍ、　　Ｓｃｉ、、　　９．　４
３８（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　ｔシｎ
ｚｙｍｏ！、、　　Ｉ　　Ｏ７２８＋（＋９８４）］、
なお、既知のプロテインジスルフィドレダクターゼ（−
グルタチオンインンコＪ／トランスヒドロゲナーゼ、Ｙ
シＣ１，８，−４，２）はＰ　Ｉ）　Ｉと同一分子であ
ると考えられている（Ｉｉｕｒ。

Ｊ、　ｌｉｏｃｈｅｍ、、　３２．　２７（１９７３）
；ＢｉｏｃｈｅｆｆｉｉｓＬｒｙ、　　Ｉ　４　、２１
　＋　５（１９７５）］、。

１り８５ｑ：、ＥｄＩＩＩａｎらはラブ！・肝ＰＤＩの
相補Ｄ　Ｎ　Ａのクローニングに成功し、その全塩基配
列を明らかにした［Ｎａｔｕｒｅ、　３１７　、　２６
７（１９８５）１゜ラット叶ＰＤＩは４８９アミノ酸か
ら＄１′Ｉ４成され、さらにそのアミノ末端に１９アミ
ノ酸からなるシグナルベブヂドが付加されている。

さらに、リボヌクレオチドレダクターゼ反応なと種々の
酸化還元反応のコファクターとして知らイ１ている大腸
菌チオレドキノン［Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
。

６、．１７５（１９６８）；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７２．　２３０５（１９７５）；　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　１ｎＥｎｚｙ＋ｎ（＞１．．１０７，２９５（１
９８４）］と相同性のある領域をアミノ末端とカルホキ
ノル末端近傍の２箇所にら−）でいた６ｈ領域には２個
のＣｙＳを持−）た相同の配ダリ（Ｔ　ｒｐ−Ｃｙｓ　
−Ｇ　１ｙ−Ｃｙｓ■、ｙｓ）がｒｒ−在し、これがジ
スルフィドとスルフヒドリルの交換を通してＩ’ｌ）！
反応を触媒すると考えられている。なお、大腸菌チオレ
ドキンンが３尾型およびスクランブル型リボヌクレアー
ゼを括質としてＩ）Ｉ）　Ｉ活性を示すことら最近報告
されている　［Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　　Ａｃａｄ、
　　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８３゜７６４：３（１９８６）
コ。

ＰＤＩの利用価値としては大腸菌で生産される組換え型
タンパク質のリフォールディングへの適用かηえられろ
。近年の急速な遺伝子工学技術の進歩により真核生物の
タンパク質が大腸菌で大９生産されるようになったが、
この組換え型タンパク質はｌ″Ｅしいジスルフィド結合
を欠いていたり、誤−・たジスルフィド結合のかかり方
を６っていたり・李゛る［ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　
　４　、　７７５（１９８５）：　　ｉｎ　　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ　　Ｉシｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　　ｌ’ｏ１．。

４（Ｖｉｌｌｉａｍｓｏｎ、　Ｒ，、ｃｄ）　ｐｐ、　
　ｌ　２７（１９８３）］。

イ！ｔって、正しいジスルフィド結合を存する活性型の
Ｑｌｌ換え７ｊタンパク質を得るにはりフナールディノ
ゲの操作が必要である。この操作は現在レドックスバッ
フＹ−などを用いた酸化還元反応で化学的に行イつれて
いるが、　ｉｎ　　ｖｉｖｏで機能しているｉｉｌ能性
かあるＰ　Ｉ）　Ｉをｔｌ用した方が正しいジスルフィ
ド結合を特５ｖ的に形成できるであろう。特に多数のジ
スルフィド結合を仔するＭ１換え型タンパク質にはきわ
めてＹｊ°効であると考えられろ。また、Ｉ）ＤＩをコ
ードする遺伝ｒを組換え体大腸閑に導入して大腸菌内で
組換え型タンパク質に作用さけることら可能である。

従来法によるＩ）　Ｌ）　Ｉの製造法では材料の人手が
困難であり取得できるＰＤＩのｆａら限られているため
、純度の高いＰＤＩを大噴生産できる技術の開発か望ま
れている。ラットおよびランＩ）　Ｉ）　Ｉについては
既にその遺伝子がクローニングされている［Ｎａｔｕｒ
ｅ、　３１７．２６７（１９８５）］が、Ｐ　Ｉ）Ｉ遺
伝子を大腸菌なとて発現させ活性型のＰＤＩを精ツシ取
（’Ｊした例は今までのところ服告されていない。また
、上記以外の真核生物のＰＤＩをクローニングした例は
今までのところ全く知られていない。

本発明者らは、甲状腺ホルモンＴ３（３，３’、５−ト
リヨードチロニン（以下′ｒ３と略称する）と特異的に
結合するタンパク質（Ｔ　３　　ＢＩｎｄｊｎｇＰｒｏ
ｔｅｉｎ、以下Ｔ　３　［（Ｐと略称する）の生物学的
作用やタンパク化学的性質などについての研究を進めて
きた。Ｔ３８Ｐは哺乳動物細胞の細胞膜や細胞質に存在
し、またＴ３レセプターは細胞核に存在していることが
知られている。本発明者らの一部は、ウシ肝細胞膜から
精製取得したＴ３ＢＰに対する抗体の作成に成功し［Ｉ
Ｉｏｒｉｕｃｈｉ、　Ｒ，ａｎｄＹａｍａｕｃｈｉ、　
　Ｋ、　　ｉｎ　　Ｇｕｎｍａ　　Ｓｙｍｐｏｓｉａ　
　ｏｎＥｎｄｏｃｒ４ｎｏ１ｏｇＹ　２３ＣＣｅｎｔｅ
ｒ　　ｆｏｒ　　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎ　　Ｊａｐａｎ、　Ｔｏｋｙｏ：　ＶＮＵ　　５ｃ
ｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ、　ＢＹ、　ＵＬｒｅｃｈｔ）　
ｐｐＩ　４９−１６６（１９８６）］、遺遺伝子工学平
手を駆使してＴ３ＢＰタンパク質をコードする遺伝子を
クローン化する努力を重ねてきた。その過程の中で、上
記の抗’ｒ　３１１３　Ｐ抗体をプローブとして得られ
たウシ肝′ｒ３［３１）のｃＤＮＡが、ウンＰＤｒタン
パク質をコードしている事実を発見した［国際出願番号
：ＰＣＴ／Ｊｌ）８７１０００５８；国際出願日：１９
８７年１月２８０］。

一般に、ヒトにより近い動物の蛋白質はそのアミノ酸配
列においてヒトの蛋白質と非常に高い相同性があり、ア
ミノ酸の穴なっている部分らその大部分はコドンのｏｒ
＋ａ　　ｐｏｉｒ＋ｔ　　ｍｕｔａｔｉｏｎ　　によっ
て導びかれる乙のである。従って１ｊη記したウノ′ｒ
３１１３１）（ＦＤＰ）遺伝子ノＩ）　Ｎ　Ａ配列は、
ヒトＰＤＩ遺伝子のＤＮＡ配列に極めて良く似ているも
のと推定される。そこで本発明台らはウシＰＤＩ遺伝子
の一部をＤＮＡプローブとして用いて、ヒトＰＤ１．ｌ
１７（Ｂ子をヒト細胞よりクローニングし、該遺伝子を
含む組換えＤＮＡを構築し、該ＤＮＡで形質転換された
形質転換体を倍径すると、ヒトＰＤｒが生産されること
を見い出した。本発明者らはこれらの知見に基づき、さ
らに研究した結果、本発明を完成した。

課題を解決するための手段 本発明は、（１）第３図のアミノ酸配列をコードする塩
基配列（１）を含有する組み換えＤＮＡ、（２）塩基配
列（１）を含有するベクターで形質転換された形質転換
体、（３）第３図のアミノ酸配列を含Ｈするポリペプチ
ドし以下、ヒトＰＤＩまたはヒトｐＤｒ（Ｉｆ）と略称
する］、および（４）塩基配列（＋）を含有するベクタ
ーで形質転換された形質転換体を培養し、培養物中にヒ
トＰＤＩを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とするヒトＰＤｆの製造法を提供するものである。

塩基配列（１）としては、第３図のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列であればいかなる乙のであってもよいが
、第５図下段の塩基配列１０４（アミノ酸配列＋ＩのＡ
ｌａをコードするコドンの第１塩基Ｇ）〜１５７３（ア
ミノ酸配列＋４９０のＬｅｕをコードするコドンの第３
塩基Ｇ）であることが好ましい。また、第５図下段の塩
基配列１０４〜■５７３の５′上流に翻訳開始コドンＡ
ＴＧあるいは第５図下段の塩基配列５０（アミノ酸配列
１８のＭｅｔをコードするコドンの第１塩Ｌ＜−Ａ　）
〜１０３（アミノ酸量クリ−１のＡｓｐをコードずろコ
ドンの第３塩基Ｃ）が付加された塩基配列ら好ましい。

さらに、第５図下段の塩基配列１０４〜１５７３の５゛
上流にＧＡＣあるいはＡＴＧＧＡＣが付加された塩基配
列、第５図下段の塩基配列１０７〜＋５７３．および第
５図下段の塩基配列１０７〜ｌ５７３の５°１−流にＡ
ＴＧが付加された塩基配列もあげられる。

ヒトＰＣＩ（ＩＩ）としては、第３図のアミノ酸配列で
示されるポリペプチド、第３図のアミノ酸配列で示され
るポリペプチドのＮ末端にＭｅｔあるいは第５図上段ア
ミノ酸配列−１８〜−１で示されろペプチドが付加され
たポリベブヂド、第３図のアミノ酸配列で示されるポリ
ペプチドのＮ末端にＡｓｐあるいはＭｅｔ−Ａｓｐが付
加されたポリペプチド。第５図上段アミノ酸配列＋Ｉの
Ａｌａが除去されたポリペプチド、第５図上段アミノ酸
配列＋１のΔｌａ／＋＜Ｍｅｔに置換されたポリペプチ
ドがあげられる。これらのペプチドは糖が配位した糖蛋
白であ−・てらよく、また他のポリペプチドとの融合蛋
白であ−）でらよい。

ド発明におけるヒトＰＣＩのポリペプチドをコードｒる
塩基配列を有するＩ）　Ｎ　Ａを含ｅＴする発現ｇベク
ターは、たとえば、（１）ヒト■フＤ＋をコードＣ７Ｉ
ｔｎＲＮＡを分離し、（１１）該ＲＮＡから単鎖の相ｈ
ｉＤＮＡ（Ｃ１）ＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成
１５、（…）Ｘ！ｉ、相補ＤＮＡをファージまたはプラ
スミドに組み色み、（ｉｖ）ｉＶられた組み換えファー
ジまたはプラスミドで宿主を杉質転換し、（ｖ）ｉ罎ら
ｔまた形質転換体を培養後、形質転換体から適ちなり法
、たとえば抗Ｔ　３Ｂ　Ｉ）抗体を用いたイムノア・・
ｌセ仁枚射性同位元素で標識されたプローブを用いるプ
ラーク・ハイブリダイゼーションやコ「に−ハｒブリダ
イゼーンヨンにより目的とするＤ　Ｎ　Ａ　＋含Ｔｉす
るファージまたはプラスミドを１１１１１し、（ｖｌ）
そのファージまたはプラスミドから目的とするクローン
化ＤＮＡを切り出し、（ｖＩ＋）該クローン化Ｄ　Ｎ　
Ａをビークル中のプロモーターのＦ流に述結する、こと
により製造することができヒトＩ）　Ｉ）　Ｉをコード
するｍＲＮＡは、種々のヒ１−１’　Ｄ　ｌ産生細胞、
例えばヒト肝細胞、胎盤細胞などから得ることができる
。

ヒＩ−Ｐ　Ｄ　ｌ産生細胞からＩ（Ｎ　Ａを調製する方
法としては、グアニジンチオノアネ−１・法［Ｃｈｉｒ
ｇｖｉｎ、　Ｊ、　Ｍ、　　ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、　　Ｉ　８　。

５２９・１（＋９７９）］などが挙げられる。

このようにして得られたＥＩ　Ｎ　Ａを鋳型とし、逆転
写酵素を用いて、たとえば　Ｏｋａｙａｍａ、　ｌｉ　
　らの方法［Ｍｏ１．　　Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、、
　２．１６１（＋９８２）および同誌、３．　２８０（
１９８３）］やＧｕｂｌｅｒ、　　Ｕ、とｌｌｏ「「ｍ
ａｎ、　Ｂ、　Ｊ、の方法［Ｇｃｎｅ。

２５．２６３（１９８３）］に従いＣＩ）　Ｎ　Ａを合
成し、１すられたＣ　Ｄ　Ｎ　／’Ｌをプラスミドやフ
ァージに組み込む、。

ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば太陽
菌由来のｐｒ３Ｒ３２２［Ｇｅｎｅ、　２　、　９５（
１９７７）］、ｐＢＲ３２５［Ｇｅｎｅ、　４．　　＋
　２１（１９７８）］、ｐＵＣｌ　２［Ｇｅｎｅ、　　
１９．　２５９（１９８２））、ｐＵＣＩ　３ＣＧｅｎ
ｅ、　　Ｉ　　９．　２５９（１９８２）１．枯草菌由
来のｐＵ　１１１１０　［Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　ＣｏｌＣｏ１１ｌ、
、　　Ｉ　　Ｉ　　２　、　　６７８（＋９８３）］な
とが挙げられるが、その他のらのであ−てし、宿主内で
複製保持される乙のであれば、い４５れをら用いること
ができる。また、ｃＤＮ、八を１１１み込むフ７−ジヘ
クターとしては、たとえばλｇｉ　　Ｉ　Ｉ［Ｙｏｕｎ
ｇ、　　Ｒ，、ａｎｄ　　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　Ｕ
ＳＡ、　　８０．　　Ｉ　Ｉ　９４（１９８３）］など
が襞げられろが、その他のらのであっても、宿１ミ内で
増殖できるしのであればよい。

プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、たとえ
ば１１ａｎｉａＬｉｓ、　　Ｔ、ら、　％Ｉｏｌｃｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ｌ１ａｒｂｏｒ　　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、　　ｐ、　２３９（１９８２）に記
載の方法などが挙げられる。また、ファージ・ベクター
にＣＩ）　Ｎ　Ａを組み込む方法としては、たとえばｌ
１ｙｕｎｈ、　Ｔ、　Ｖ、らの方法［ＤＮＡｃｌｏｎｉ
ｎｇ、ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　ａｐｐｒｏａｃｈ、
　　Ｉ　、　　４９（１９８５）１などが挙げられる。

このようにしてｉりられたプラスミドやファージ・ベク
ターは、適当な宿主たとえば大腸菌、枯草菌などに導入
する。

上記大腸菌の例としてはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｅ
ｏｌｉＫ　ｌ　２　１ＮＩ　Ｉ　　［ｔ’ｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　［ｌＳＡ。

６０、　　Ｉ　６０（１９６８）１．ＪＭＩ　０３［Ｎ
ｕｅｌＡｃｉｄｓ、　Ｒｃｓ、、９．３０９（１９８１
）１．Ｊ　Ａ２２１［」、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　Ｉ
　２０．　５１７（１９７８）］。

ＩＩ　ｎ　Ｉ　０１　［Ｊ、Ｍｏ１．１３ｉｏ１．、−
１１　、　・１５９（１９６９月、Ｃ６００［Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ、　３９　、　４４０（１９５４）］などが挙
げられる。

」二記情り菌としては、たとえばＢａｃｉｌｌｕｓｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ　　　ｈ１目　　　Ｉ　　１４［Ｇｃｎｅ
、　　２４．　２５５（１９８３）１．２０７−２１　
［Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ、　　９５゜８７（１９８４月
などか挙げられろ。

プラスミドで宿主を彩質転換する方法としては、たとえ
ばｌ１ａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　　ら、　１ｌｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　　ＣｌｏｎｉｎｇＣｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ
　　ｌ１ａｒｂｏｒ　　Ｉ、ａｂｏｒａＬｏｒｙ、　Ｉ
）、　２４９（＋９８２）に記載のカルシウムクロライ
ド法あるいはカルノウムク〔１ライド／′ルビジウムク
ｖノライト法などかヤげらイｚる。また、ファージ・ヘ
クタ−はたとえば、増殖させた大腸菌にインビトロパブ
ケージング法を用いて導入することができる。

このようにして得られた形質転換体中から自体公知の方
法、たとえばコロニー・／”％イブリダイゼーンヨン法
［Ｇｅｎｅ、　　Ｉ　Ｏ、６３（１９８０）］、プラー
ク・ハイブリダイゼーション法［５ｃｉｅｎｃｅ。

１９６．１８０（１９７７）］およびＤＮＡ塩基配列決
定法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ、７４５６０　　（１９７７）：　Ｎｕｃｌ、＾
ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　９゜３０９　　（１９８１月
を用い、求めるクローンを選出ずろ。

このようにして、クローン化されたヒトＰＣＩをコード
する塩基配列を含有するＤＮＡを有するベクターを保持
する微生物が得られる。

後述の実施例１で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉＫＩ２ＤＨ５α／ｐ７３８Ｐ−３が保持するプラ
スミドｐＴ　３　Ｂ　Ｐ　−３は、ヒトＰＤＩをコード
する塩基配列を含有するＤＮＡを有する。該ＤＮＡの制
限酵素切断位置を第４図に示す。第４図に示すように該
ＤＮＡは全長的２．４Ｋｂｐであり、制限酵素Ｂａｍ１
ｌ　Ｉ　、ＥｃｏＲＩ　、　Ｃ１ａｌ　、　Ｈｉｎｄ［
ＩＩ。

Ｐｓｔｌにより断片に切断される。

次に、該微生物からプラスミドやファージ・ベクターを
単離する。

該＋１１離法としては、アルカリ抽出法［Ｂｉｒｍｂｏ
ｉｍｌｌ、Ｃ，ら、　Ｎｕｃｌ、、＾ｃｉｄｓ　　Ｒｅ
ｓ、、　　Ｉ　、　　Ｉ　５１３（１９７９月などが挙
げられる。

、に記りローン化されヒトＰＤＩをコードする塩Ｊ、（
配列を含有するＤＮＡを存するプラスミドまたはファー
ジ・ベクターは目的によりそのまま、または所望により
制限酵素で消化して使用することができる。

り［１−ン化された遺伝子は、発現に適したビークル（
ベクター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベ
クターを得ることができる。

ベクターとしては、上記大腸菌由来のプラスミド（例、
ｐ［３Ｒ３２２，ｐＩＨ１３２５，ｐＵＣＩ　２．ｐＵ
ＣＩ　３　、ｐｔｒｐ７８１　）、枯草菌由来プラスミ
ド（例、ｐＵＢＩ　１０．ｐＴＭ５．ｐｃＩ９４）、酵
母由来プラスミド（例、ｐｓＨＩ　９．ｐＳＩ−（１５
，ｐＧＬＤ９０６゜ｐＧＬＤ９０６−１．ｐＣＤＸ、ｐ
ＫＳＶ−１０）、あるいはλファージなどのバクテリオ
ファージおよびレトロウィルス、ワタソニアウイルスな
どの動物ウィルスなどが挙げられる。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終始コドンとしてのＴ
　Ａ　Ａ　、　Ｔ　Ｇ　ＡまたはＴＡＧを存していてら
よい。さらに該遺伝子を発現さけるにはその上流にプロ
モーターを接続する。本発明で用いられるプロモーター
としては、遺伝子の発現に用いろ宿主に対応して適切な
プロモーターであればいかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主が大腸菌である場合は、ｔ
ｒｐプロモーター、Ｉａｃプロモーターｒｅｃプロモー
ター、λＰＬプロモーター、　ｌｐｐプロモーターなど
が、宿主が枯草菌である場合は、５Ｐ０１プロモーター
、ＳＰ　　０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターな
ど、宿主が酵母である場合は、ＰＩ−１０５プロモータ
ー　ＰＧＫプロモーター、ＧΔＰ（Ｇｌ、Ｄ）プロモー
ター、　Ａ　Ｄ　Ｉ−１プロモーターなどが好ましい。

とりわけ宿主が大腸菌でプロモーターがｔｒｐプロモー
ターまたは　λ■フ１．プロモーターであることが好ま
しい。

宿主が動物細胞である場合には、Ｓ　Ｖ　＝１０由来の
プロモーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙
げられ、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好まし
い。

このようにして作製された塩基配列（１）を含むＤＮＡ
を含有するベクターを用いて、形質転換体を製造する。

宿主としては、大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核生物
や酵母、カビ、動物細胞などの真核生物か挙げられる。

を記大腸菌、枯草菌の具体例としては、面記したものと
同様のものが挙げられる。

上記酵母の具体例としては、たとえば Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　　ＡＩｒ２２．ＡＩ［２２Ｒ−ＮＡ８７　１１Ａ、Ｄ
ＫＤ−５Ｄなどが挙げられる。

上記動物細胞の具体例としては、たとえば、すル’ａＷ
、Ａｃ　ＯＳ　−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスタ
ー細胞Ｃ１１０，マウス１、細胞なとが半げられる。

−■−１足大腸菌を形質転換するには、たとえばｆ’ｒ
ｏｃ。

Ｎａ１１．　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳ、ｌ、
　６９．２１１０ＣＩ９７２）やＧｅｎｅ、　　ｌ　７
．　　ｌ　０７（１９８２）などに記載の方法に従って
行われる。

枯Ｑ菌を形質転換Ｃるには、たとえばＭＯｌｅｃ。

Ｇｅｎ、　　　Ｇｅｎｃｔ、、　　　１　６　８．　　
　　ｌ　　Ｉ　　ＩＣＩ　　９　７　９）などに記載の
方法に従って行われる。

酵１；１を形質転換するには、たとえばＰｒｏｃＮａｔ
ｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＬＩＳＡ、　　７
５．　１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行わ
れる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばＶｉｒｏｌｏｇ
ｙ、　　５２．　４５６（１９７３）に記、ｌ＆の方法
に従って行われる。

このようにして、塩基配列（１）を含（−ｒするベクタ
ーで形質転換された形質転換体が得られる。

宿主が大陽画、枯信菌、放線菌、酵母、カビである形質
転換体を培養する際、培養に使用される培地と１、では
液体培地か適当であり、その中には該形質転換体の成育
に必要な炭素源、窒素源、無機物その他か含ａせしめら
れる。炭Ｘ源としては、たとえばグルコース、デキスト
リン、可溶性澱粉、ショ糖なと、窒素源としては、たと
えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンステイープ・
リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレ
イショ抽出液などの無機または６機物質、無機物として
は塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム７塩化マグ
ネノウムなどが挙げられる。

培地のｐＨは約５〜８か望ましい。

宿ノーが大陽画の場合、用いる培地は、たとえばグルコ
ース、カザミノ酸を含むＭ９培地「ＭｉｌｌｅｒＪ、　
Ｅｘｐ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、、　ｐ、４　：３１
　、　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、　　Ｉ　
９７２　］が好ましい。培養は通常的１４〜・１３℃で
約３〜２・１時間行い、必要により、通気や攪拌を加え
ることらできる。

宿主か枯草菌の場合、培養は通常的３０〜４０℃で約６
〜２４時間行い、必要により通気や攪拌を加えることら
できる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ　　最小培地［（３
ｃｉｓｔｉａｎ、に、　Ｌ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、７７．４５０５
（１９８０）］あるいはそれを改変した低Ｐ　ｉ培地［
Ｂｉｏｃｈｅｍ　　旧ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏ１ｆｆ１ｕｎ、、１３８，２６８（１９８６））な
どが挙げられる。培地のＩ）Ｈは約５〜８に調整するの
が好ましい。培養は通常的２０℃〜３５℃で約２４〜７
２時間行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地［５ｃｉｅｎｃｅ、　　１２２　、　５０１（１
９５２）］、１）ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　８
゜３９６（１９５９）］、ＲＰＭ　Ｉ　Ｉ　６４０培地
［Ｊ、　Ａｓ。

Ｖｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、、　　Ｉ　９９．　５１９（１
９６７）］。

＋９９培地［Ｐｒｏｃ、　ＳＯＣ，ＥＸＰ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｗｅｄ、、　７３　。

１（１９５０）］などが挙げられる。ｐＨは約６〜８で
あるのが好ましい。培養は通常的３０℃〜４０℃で約１
５〜６０時間行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。

本発明のヒトｆ）　Ｉ）　Ｉタノバク質は細胞内または
細胞外に生成、蓄積する。細胞内ＰＤＩを培養物から抽
出するに際しては、培毘後公知の方法で細胞を集め、塩
酸グアニジンや尿素などの蛋白変性剤を含む緩衝液やト
ライトン−１００などの界面活性剤を含む緩衝液中に細
胞を懸濁させたのち、遠心分離によりヒｌ−Ｐ　Ｄ　Ｉ
を含む上澄液を得る方法、あるいはガラスピーズによる
破砕、超音波処理、リゾチームなどの酵素処理や凍結融
解法によって細胞を破壊したのち、遠心分離によりヒト
ＰＤ１を含む上澄液を得る方法などをノ♂官用い得る。

これらのＬ澄液や細胞外に生成、蓄積したヒトＰＤＩを
分離、精製するには自体公知の分離、精製法を適切に組
み合わせて実施すればよい。これらの公知の分離、精製
法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度の差を同相
する方法、透析法、限外ろ適法、ゲルろ適法および５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として
分子−量の差をトリ用する方法、イオン交換クロマトゲ
ラフィーなとの荷電の差をｐ１用する方法、アフィニテ
ィークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する
方法、逆用高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の
差をＩＩＩ用する方法１等電点電気泳動法などの等電点
の差を利用する方法、ヒドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィーなどの特異的吸着性を利用する方法などが挙げ
られる。特にヒトＰＤＩタンパク質は酸性タンパク質で
あると考えられるため、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡ
Ｅ）セルロース、ＤＥＡＥ）ヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌ）、カルボキシメチル（ＣＭ）セルロース、ＣＭ　
トヨパールなどのイオン交換クロマトグラフィーが該蛋
白質の精製に有効である。

上記で得られるヒトＰＤＩ蛋白質の活性（ＰＤ■活性）
は、基質として還元型およびスクランブル型リボヌクレ
アーゼを用いて活性型リボヌクレアーゼに変換する速度
を測定することにより求められる［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｊ、、　　１５９，３７７（１９７６）：Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８３．７
６４３（１９８６）；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、　　１０７　。

２８１（１９８４）；　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ
ｌ、、　２３４゜１５＋２（１９５９）］。

作用および効果 本発明のヒトＰＤＩタンパク質は、任欲の目的タンパク
質中に存在するスルフヒドリルおよびジスルフィド間の
交換反応を触媒して最ら安定性が高い天然型のジスルフ
ィド結合を形成する。さらに詳しくは、該タンパク質は
溶存酸素や酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）−還元型グ
ルタチオン（ＧＳｌｌ）混合物やジチオスレイトール（
Ｄ　′ｒ　Ｔ　）、　２メルカプトエタノール、アスコ
ルビン酸などの還元剤の存在下で、還元タンパク質に作
用して天然型のジスルフィド結合を形成する反応を触媒
したり、既にジスルフィド結合とりわけ非天然型のジス
ルフィド結合を有する酸化型タンパク質に作用して天然
型のジスルフィド結合を再形成する反応を触媒する。

従って、分子中にジスルフィド結合を存するタンパク質
を遺伝子組換え技術を用いて製造するに際して、とりわ
け組み換えＤＮＡの宿主が大腸菌。

＋古草菌やバチルス・プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂ
ｒｅｖｉｓ）などの原核細胞である場合に、そのタンパ
ク分子中に天然型ジスルフィド結合を効率よく形成する
目的でヒトＰＤＩタンパク質を使用し得る。上記タンパ
ク質としては、インターフェロン−α、インターフェロ
ンーβ、インターフェロン−γ、イオンーロイキンー１
．インターロイキン−２，Ｂ細胞増殖因子（ＢＧＦ）、
Ｂ細胞分化因子（Ｉ３ＤＦ）、マクロファージ活性化因
子（ＭＡＦ’）、リンホトキシン（ＬＴ）、腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）などのサイト力インや、　トランスホーミ
ンググロースファクタ−（ＴＧＦ）、エリスロボエチン
、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、フィブロブラスト増殖
因子（ＦＧＦ）。

インスリン、ヒト成長ホルモンなどのペプチドタンパク
ホルモンや、Ｂ型肝炎ウィルス抗原などの病原微生物抗
原タンパク質や、ペプチダーゼやリゾチームなどの酵素
や、ヒト血清アルブミン、免疫グロブリンなどの血中タ
ンパク成分が挙げられる。

ここで用いられる該ＰＤＩタンパク質は、精製タンパク
質でも部分精製タンパク質でらよく、細胞内や細胞外に
生成、蓄積する上記の目的タンパク質やその精製標品に
該ＰＤｆタンパク質を直接作用させればよい。該ＰＤＩ
タンパク質をコードする組換えＤＮＡを含有する宿主に
、上記の目的タンパク質をコードする組み換えＤＮＡを
二重に感染させた形質転換体を用いて反応させろことら
できろ。

明細吉および図面で用いる記号の意義は第１表に示すと
おりである。

第１表 ニリン酸緩衝食塩液 ：デオキシリボ核酸 ：相補的デオキシリボ核酸 ：アデニン ：ヂミン ：グアニン シトシン ：リボ核酸 ：メッセンジャーＲＮＡ ：デオキシアデノシン三リン酸 ＢＳ 　Ｎ　Ａ ＤＮＡ ＲＮＡ ＲＮＡ ＡＴＰ ｄＴ　Ｔ　ｒ’ ｄＧ　”ｒ　Ｉ’ ＣＴＰ 　Ｔ　Ｐ ＤＴＡ 　Ｄ　Ｓ ｉｙ ｌａ ａｌ ｅｕ ＋１ｅ ｅｒ ｈｒ ｙｓ ｅｔ ｌｕ ｓｐ ｙｓ ｒｇ ｒｉｓ ：デオキンチミジン三リン酸 、デオキングアノンン三リン酸 ：デオキシシチジン三リン酸 ：アデノシン三リン酸 ：エヂレンジアミン四酢酸 ニドデシル硫酸ナトリウム ニブリシン ：アラニン ：バリン ：ロイシン ：イソロイシン ：セリン ：スレオニン ：ンステイン ：メチオニン ：グルタミン酸 ：アスパラギン酸 一ノジン ：アルギニン ：ヒスチジン １”ｈｅ ’ｌ’ｙｒ ’ｒｒｐ ｆ’ｒ。

ｓｎ ｌｎ ：フェニルアラニン ：チロシン コトリプトファン ：プロリン ：アスパラギン ：グルタミン なよｊ、本発明のＩ）ＤＩタンｌくり質におし）て（よ
、そのアミノ酸配列の一部（５％程度まで）ｈ＜修“（
イー１加、除去、その他のアミノ酸への置換など）さＩ
ｔていてもよい。

及顛 以下に参考例および実施例を示して本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれら１こ目退定されるべきも
のではない。

参考例１　ウシ肝臓ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリ
ーの作製 ラン肝臓よりＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート法
［Ｃｈｉｒｇｖｉｎ、　Ｊ、　Ｍ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ。

＋８．　５２９４（１９７９）］を用いて抽出１７た。

このＲＮ　Ａよりポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴｄＴセルロ
ースカラムクロマトグラフィーにより精製した［Ａｖｉ
ｖとＬｅｄｅｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

６９．１４０８（１９７２）ｌ。

このポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡをＧｕｂｌ
ｅｒ　　Ｕとｌ１ｏｆｆａａｎ、　Ｂ、　Ｊ、の方法［
Ｇｅｎｅ、　２５　。

２６３（１９８３）］で調製し、次に１ｌｕｙｎｈ、　
Ｔ、　Ｖ。

らの方法［ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　Ｉ　、　ａ　
ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏｃｈ、　　Ｉ　、　４９
（１９８５）］に従って上記ｃＤＮ　ＡにＥｃｏｌｌｌ
リンカ−を付加したのち、λｇｔ１１のＥｃｏＲ１部位
にクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

参考例２　ウシＰＤＩｃＤＮＡを含むプラスミドの単離
とその塩基配列の決定 大腸菌ＹＩ０９６に葉考例Ｉで得たλｇｔｌｌのＣＩ）
　Ｎ　Ａライブラリーを感染させたのち、Ｌブロスの軟
寒天プレートにまいた。プラークが出現しはじめた時に
、Ｉ　Ｐ　Ｔ　Ｇ　（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏｇａ
ｌａｃｔｏｓｉｄｃ）を含むニトロセルロース膜をプレ
ートの上にのせ、３時間インキュベーションした。次に
、ニトロセルロース膜をはずし、ＴＢＳＩ衝液（５（ｌ
ａＭＴｒｉｓ、Ｐｌｌ　７．９．　１５０　ｇ＋Ｍ　　
Ｎ　ａＣＩ）で洗浄し、つづいて３％ゼラチン溶液につ
けた。

このように処理したニトロセルロース膜ヲＴ３結合蛋白
質に対する抗体（ａｎｔｉ　−Ｂ　Ｌ　Ｔ　ｓＲ）溶液
［Ｈｏｒｉｕｃｈｉ、　　Ｒ，ａｎｄ　　Ｙａｍａｕｃ
ｈｉ、　Ｋ、、　Ｇｕｒ＋ｍａＳｙｍｐｏｓｉａ　　　
ｏｎ　　　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　　　２　３
　　、　　ｐ、１　４　９（＋９８６）］に浸し、抗原
抗体反応させた。次ｊこ、謹慎を蒸留水とＴ　Ｂ　Ｓ緩
衝液で洗浄した後、２次抗体と反応させ、発色する陽性
クローンλｇｔｌｌ’ｒ　３　［３Ｉ）　−１を選択し
た。λｇｉｌｌ　　Ｔ３Ｉ３Ｐｌ中のｃＤＮＡをＥｃｏ
Ｒｌで切り出し、ブラスミ　ドｐＵｃ　ｌ　９［Ｇｅｎ
ｅ、　　３３．　　ｌ　Ｏ３（Ｉ　９８５）］のＥｃｏ
ｌ１１部位にリクローニングし、プラスミドｐ’［’　
３　＋３１’　−１を作製した。該プラスミドに含まれ
るｃＩ）ＮＡ部分のうち、制限酵素ＥｃｏＲＩ−ｐｖｕ
［Ｉ断片をｐ　Ｎ　Ａプローブに用いて、５Ｘ１０５個
の実施例１に記載のＣＤＮＡライブラリーを再度スクリ
ーニングして、陽性のクローンを選択　し　）こ。

このようにして得られたクローンの一つであるλｇｔｌ
ｌ　　Ｔ３ＢＰ−２からＳａｃ［−ＫｐｎｌでＣＤＮＡ
を切り出し、プラスミドｐＵｃＩ９の５ａｃ１−Ｋｐｎ
１部位にリクローニングし、プラスミドｐ’ｒ　３　Ｂ
　Ｐ　−２を作製した。（なお、λｇｔｌｌＴ３８Ｐ−
２にクローニングされたｃＤＮＡの５′末端側ＥｃｏＲ
Ｉ認識部位はＦＩＪｌ、壊されていた）Ｅ、　　ｃｏｌ
ｉ　　ＫＩ２　　ＤＨ５αをプラスミドｐＴ３３Ｐ−２
で形質転換させ、得られた組み換え体Ｅ、ｃｏｌｉＫ１
２　　ＤＩ−１５α／ｐＴ　３８　Ｐ　−２よりプラス
ミドｐＴ　３　Ｂ　Ｐ　−２をアルカリ法［Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ。

Ｉｌ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、、　Ｎｕｃｌ、
＾ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　　１１　。

＋５１３（１９７９）］によって抽出請製した。このプ
ラスミドに含まれるｃＤＮＡ部位は全長的２．８Ｋｂｐ
であり、その簡単な制限酵素地図を第１図に示した。

このｃＤＮＡ部分の塩基配列をジデオキシヌクレオチド
合成鎖停止法［Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、ら、　Ｎｕｃｌ
。

Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　　９．　３０９（１９８１
）］によって決定した。決定された塩基配列より推測さ
れるアミノ酸配列を第２図に示した。

該ポリペプチドのアミノ酸配列は、ラットＰＤＩのそれ
と９０％以上の相同性を有しているが、甲状腺ホルモン
結合能を有するヂロキシン結合グロブリン（ＴＩ３に）
、チロキンン結合プレアルブミン（’Ｉ″ｌ３ＰＡ）や
Ｃ−ｅｒｂＡ蛋白質のアミノ酸配列との相同性は認めら
れなかった。

プラスミドＩ）Ｔ３ＢＰ−２を保持するＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　ＫＩ２　　ＤＩ（５α／ｐＴ
３ＢＰ−２）は財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番
号ＩＦＯ１４５６３として寄託され、また、通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲｌ）に受託番号
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１５９５として寄託されている。

なお、Ｉ）Ｔ３ＢＰ−１に含まれるｃＤＮＡのＥｃ。

Ｒ［−Ｐｖｕｌｌ断片はｐ’ｒ　３　Ｂ　Ｐ　−２をＫ
ｐｎｌおよび５ａｃｌ処理した後、ＥｃｏＲＩおよびＰ
ｖｕｌｌ処理することにより得ることもできる。

実施例１　ヒトＰＤＩ　　ｃＤＮＡを含むプラスミドの
単離とその塩基配列の決定 ヒト胎盤ｌＲＮＡをもとに作製されたλｇ目星のｃＤＮ
Ａライブラリー（Ｔｏｙｏｂｏ　　Ｃｏ、、　　Ｌｔｄ
。

Ｊａｐａｎより購入）を、大腸菌ＹＩ０９６を宿主とし
て、軟寒天プレート上に約ｌＸｌ０’クローンずつ４枚
まき、これをニトロセルロースフィルター（ミリポア社
、ＨＡＴＦフィルター）上に移した後、０．５Ｎ　　Ｎ
ａＯＨ溶液に溶解し露出変性したファージＤＮＡをフィ
ルター上に乾燥固定した（Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ら、「
モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　
Ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｊ　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　１
ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｐ、　３２０　
、　１９８２　）。一方、参考例２に記載のプラスミド
ｆ）７３１３Ｐ−１に含まれるｃＤＮＡ部分のうち、制
限酵素ＥｃｏＲ［およびＰｖｕＵで切断して得られるＤ
ＮＡ断片をニックトランスレーション法（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、同上　ｐ。

１０９）により３！Ｐ漂識しプローブとした。

標識したプローブと、ＤＮＡを固定したフィルターを、
標識プローブを含む、５ｘＳＳＰＥ（０，９Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１，５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）
、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ）、５０％ホルムアミド、　５　
ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ
／−変性サケ精子ＤＮＡ溶液１０−中で４２℃、１６時
間、会合反応を行い、反応後、フィルターを２ｘＳＳＣ
（Ｉ　ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ。

０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶
液中で室温で３０分ずつ２回、ｌＸ５ＳＣ。

０．１％ＳＤＳ溶液中で６８℃で３０分ずつ２回洗浄し
た。洗浄したフィルターを乾燥させた後、ラジオオート
グラムをとり、プローブと反応するクローンを検索した
。この方法により得られたクローンλｇａｌｌ　　７３
ＢＰ−３よりＤａｖｉｓらの方法（Ｄａｖｉｓら、［ア
ドバンスト・バクチリアル・ノエネティクス（＾ｄｖａ
ｎｃｅｄ　　８ａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
ＪＣｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ｌ１ａｒｂｏｒ　　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｉ　９８０）によりファージＤ
ＮＡを抽出した。次にλｇｔｌｌＴ３［３Ｐ−３からＥ
ｃｏＲｌでｃＤＮＡを切り出し、プラスミドｐ［Ａｃ１
９のＥＣｏＲｌ部位にリクローニングし、　プラスミド
ｐ’ｒ　３１３　Ｐ　−３を作製した。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＫＩ２　　ＤＨ５αをプラスミドｐ’ｒ
３Ｂ１）　−３で形質転換させ、得られた組換え体Ｅ。

ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＤＨ５α／ｐＴ　３１１　Ｐ　
−３よりプラスミドｐＴ３ＢＰ−３をアルカリ法［Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ。

Ｉｌ、　Ｃ，ａｎｄ　　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、、　Ｎｕｃｌ
、　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｃｓ、、　１１１５＋３（１９７
９）］によって抽出精製した。このプラスミドに含まれ
ろｃＤＮＡ部分は全長的２．４Ｋｂｐであり、その簡単
なお１限酵木地図を第４図に示した。

このｃＤＮＡ部分の塩基配列をジブオキソヌクレオチド
合成鎖停止法［Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ。ら、　Ｎｕｃ　
１Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　　９．　３０９（１９８
１）コによって決定した。決定された塩基配列より推測
されるアミノ酸配列を第５図に示した。

該ポリペプチドのアミノ酸配列は、ラットＰ　Ｉ）■の
それと９０％以上の相同性を存しているが、甲状腺ホル
モン結合能をａするチロキシン結合グロブリン（Ｔ　Ｂ
　Ｇ　）、チロキノン結合プレアルブミン（ＴＢＰＡ）
やＣ−ｅｒｂＡ蛋白質のアミノ酸配列との相同性は認め
られなかった。

プラスミドｐ’ｒ　３　Ｂ　Ｐ　−３を保持するＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　Ｋ　１２　　Ｄ　Ｈ
５ａ（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　ＫＩ２
　　ＤＩＩ５α／ｐＴ３Ｂ１）　−３）はＩＦＯに受託
番号ＩＦＯ１４６１０として寄託され、またＦＲＩに受
託番号ＰＥＲＭＩＭＰ−１８４１（ＦＥＲＭ　　Ｉン−
９３８６より移行）として寄託されている。

実施例２　動物細胞用発現プラスミドの構築ニブラスミ
ドｐＴ３８Ｐ−３ＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ１１１テ分解
し、第４図に示した２、４ＫｂｐのｃＤＮＡを分離した
。このＤＮＡを、特開昭６１６３２８２号公報に記載の
プラスミドｐＴＢＩ０６のインターロイキン−２遺伝子
領域の５′末端側のＰｓｔｌ切断部位及び３′末端側の
Ｂａｌ＋１ｌ（Ｉ切断部位をＥｃｏＲｌに変換しインタ
ーロイキン−２遺伝Ｐ領域を除去したプラスミドｐＴＢ
３８９を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し５′末端のリン酸
基をアルカリ性ホスファターゼ処理により除去したしの
と混合し、Ｔ　４Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを作用させて、プ
ラスミドｐ′ｒＢ７４５を構築した（第６図）。

実施例３　ヒトＰＤｒをコードする遺伝子の動物細胞に
おける発現： サルＣ０９−７細胞を１０％胎児牛血清を含むＤ　Ｍ　
Ｅ　Ｍ培地で弔層培養した後、同培地で培地交換した。

交換の４時間後に公知の方法［Ｇｒａｈａｍら。

ＶｌｒｏｌｏｇＹ、　　５２．　４５６（１９７３）コ
に従いプラスミドｐＴＢ７４５のＤＮＡ　　１０μｇを
含むカルノウムホスフェートゲルを調製Ｉ２細胞に添加
し、ｐＴＢ７４５感染ＣＯ８〜７細胞を得た。さらにそ
の４時ＩＲＪ後グリセロール処理して０．５％胎児牛血
清を含む培地でＪ二記ｐＴＢ７４５．感染Ｃ０Ｓ７細胞
の培養を続けた。

４８時間後に、１）ＴＢ７４５感染ＣＯ５−７細胞を３
．５％ホルマリンを含むＰＢＳで室温で１５分間固定し
た。その後０．１％サポニンを含むＰＢＳで室温で１０
分間処理した後、前記した抗つシＴ３ＢＰウサギ抗体を
４℃で２時間反応させた。Ｐ　Ｂ　Ｓで未反応抗体をよ
く洗い落した後、ＦＩＴＣラベル抗ウサギつｇＧヒツジ
抗体を一晩反応させ、蛍光顕微鏡で観察した。結果を第
７図に示したが、対照のＣＯＳ細胞に比べ、ヒトＩ）Ｄ
Ｉ遺伝子を導入した細胞では明らかに強い蛍光が観察さ
れ、ＣＯ８細鉋中でヒトＰＤＩ蛋白が合成されているこ
とが判明した。

実施例・１　ヒｌ−Ｐ　ＣＩ遺伝子の大腸菌用発現プラ
スミドの構築： 前記実施例１で得られたヒトＰＤＩｅＤＮＡを含むプラ
スミドｐ’ｒ　３　Ｂ　Ｐ　−３を制限酵素Ａｖａｌで
切断し、ヒｌ−Ｐ　Ｄ　［をコードずろ領域の前トを含
む０．８５Ｋｂｐ　ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片
を用イテ、ｄＡＴＰ、ｄｃ′ｒＰ、ｄＧＴＰおよびｄ’
ｆ”ＴＰのｌｉ−在ＦにＩ）　Ｎ　Ａポリメラーゼ（Ｋ
ｌｅｎｏｗフラグメント）反応を行い、Ａｖａｌ切断部
位をｆ滑化した。このＤＮＡＩこリン酸化反応後の合成
オリゴヌクレオチド ”　ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧＣＧＣ”および”ＧＣＧＣＣ
ＡＴＡＧ”を Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼにより結合させ、ＥｃｏＲ
ＩおよびＣ１ａｌで切断して０．４９Ｋｂｐ　ＤＮＡ断
片を分離精製した。また別にプラスミドｐＴ　３　ＢＦ
２をＣ１ａｌおよびＰｓｔｌで切断し、ＰＣＩをコード
する領域の後半を含むｌ　、４７　Ｋｂｐ　ＤＮＡ断片
をｙ！ｌ製した。一方、ｔｒｐ　　プロモーターを有す
るプラスミドｐｔｒｐ　７８１　［Ｋｕｒｏｋａｖａ、
　Ｔ、ら　Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　
　Ｉ　Ｉ：　　３０７７−３０８５（１９８３）］ＤＮ
ＡをＥＣ０ＲＩおよびＰｓｔｌで切断し、ｔｒｐプロモ
ーター、テトラサイクリン耐性遺伝子およびプラスミド
複製開始部位を含む約３．２ＫｂｐＤＮＡを分離した。

ヒトＰＤＩをコードする遺伝子を含む前記０．４９　Ｋ
ｂｐＥｃｏＲＩＣ１ａｌ　　ＤＮＡ断片および１．４７
Ｋｂｐ　　Ｃ１ａｌ　−ＰｓｔｌＤＮＡ断片と、この３
，２Ｋｂｐ　　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｒ　　ＤＮＡ断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応により結合させ、ヒトＦＤ１発
現プラスミドｐＴ８７６６を構築した（第８図）。この
プラスミドを用いて大腸菌ＫＩ２ＤＨＩ株およびＭＭ２
９４株を形質転換させることによりプラスミドｐＴＢ７
６６を含む菌株　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ
ｉ　　Ｋ１２　　ＤＨＩ／Ｉ）ＴＢ　　７６６およびＭ
Ｍ２９４／ｐＴＢ７６６を得た。

プラスミドｐＴＢ７６６を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ　　Ｋ　Ｉ　２　　ＭＭ　２９４　（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉＭＭ２９ｉ／ｐ’ｒＩ
３７６６）はＩＦＯに受託番号ＩＦ’０　１４６１１と
して寄託され、またＦＲＩに受託番号Ｆ’ＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−１８４２（ＦＥＲＭＰ−９３９１より移管）として
寄託されている。

また、プラスミドｐｔｒｐ７８１を保持するＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　Ｋ　Ｉ　２　　Ｄ　ＨＩ
　　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　　Ｄ　Ｈｌ　
／ｐｔｒｐ７８１　）はｆＦ’ｏに受託番号ＩＦＯ１４
５４６として、またＰＲＩに受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−１５９１（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９０５５より移管）とし
て寄託されている。

実施例５ 大腸菌の３″Ｓ−メチオニンラベルと免疫沈降反応 発現プラスミドｐＴＢ７６６を含む大腸菌ＭＭ２９４あ
るいはＤ　Ｉ−１１を８μｇ／−テトラサイクリン、０
．２％カザミノ酸、１％グルコースを含むＭ９培地で３
７℃で培養し、Ｋ　ＩｅｔＬ値が２００のとき、ＩＡＡ
（３β−インドリルアクリル酸）を２５μｇ／−になる
ように添加した。添加２時間後、３５Ｓ−メチオニンを
１５μＣｉ　／　ｍＱとなるように加え、３０分間合成
される蛋白質をラベルした。

ラベル後、菌体を集め、０．１５Ｍ　　ＮａＣ１溶液で
洗い、培養液の１１５量のＩ　Ｏ＋＋＋Ｍ　Ｔｒｊｓ−
ＨＣＩｐＨ８，０，１０％蔗糖溶液に菌体を＠澗し、フ
ェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）。

ＮａＣＩ、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａをそれぞれ１ｍＭ、　０．２
Ｍ、　ｌ　ＯｍＭとなるように添加し、さらにリゾチー
ムを１５０量ｇ／ｌｎ１に加えて０℃、１時間作用さけ
た。

この懸濁液を３１’Ｃで２分間処理したのち、軽く（約
１０秒間）超音波処理を行い、遠心して菌体抽出液を得
た。この抽出液に抗つシＴ３ＢＰウサギ抗体［１１ｏｒ
ｉｕｃｈｉ、　Ｒ，ａｎｄ　　Ｙａｍａｕｃｈｉ、　Ｋ
、、　ＧｕｎｍａＳｙｍｐｏｓｉａ　　ｏｎ　　Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　２３　、　　Ｉ　４９（１９
８６月を加えて４℃−晩反応させ、さらに５Ｌａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃａｌ　　菌体（プロティンＡ）を加え、０
℃、３時間、抗原・抗体結合物を菌体に結合させた。菌
体を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，４，５ｍＭＥ
ＤＴＡ、１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、０．０５％　ノ二デ
ットＰ−４０（シェル石油）、Ｉｍｇ／！オボアルブミ
ン溶液を用いて遠心洗浄をくり返したのち、電気泳動用
試料溶液（０，０６２５Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−１−ＩＣＩ
、Ｉ）Ｈ６，８，２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタ
ノール０．００１％ブロモフェノールプルｌＯ％グリセ
ロール）中で１００℃、５分間処理して、結合物を溶出
した。得られた免疫沈降物を１０〜２０％グラジェント
のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて解析
した。泳動後、ゲルを５０％トリクロロ酢酸溶液で固定
し、フルオログラフィー法を用いてラジオオートグラム
をとった。第９図に示された結果から、発現プラスミド
を存する２揮の菌株、ＤＩ−１１／ｐＴＢ７６６゜ＭＭ
２９４／ｐ’ｒＢ７６６のいずれにおイテも予想される
大きさ（約６０ＫＤａ）のＰＤＩが産生されていること
が明らかになった。

実施例６　ヒトＰＤＩ遺伝子の酵母発現用プラスミドの
構築： 前記実施例１で得られたヒトＰＤＩｃＤＮＡを含むプラ
スミドｐＴ　３　Ｂ　Ｐ　−３を制限酵素Ｓ　ａｃ　Ｉ
で消化した後、Ｔ４ポリメラーゼ反応により平滑末端に
してＧ　Ｇ　Ｔ　ＣＧ　Ａ　ＣＣの配列をもツｓａｌｌ
リンカ−を結合し、さらに制限酵素５ａｌｔとＣ１ａｒ
で消化して０．６５ＫｂρのＤＮＡ断片を調製１、た、
まノ；、実施例２に記載のプラスミドｐＴＢ７４５のＤ
ＮＡを制限酵素Ｓ　ｃａ　ＩとＣ１ａｌで消化して３．
８ＫｂｐのＤＮＡ断片を分離した。さらにプラスミドＩ
ＩＩＧ　Ｌ　Ｄ　９０６−１　［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　　Ｃｏｓｍｕｎ、、　　　ｌ　　３　８，２
　６　８（１９８６）コのＤＮＡを制限酵素５ａｉｌと
５ｃａｌで消化して調製した６、２ＫｂｐのＤＮＡ断片
と上記の２．ｔのＤ　Ｎ　Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて結合し、酵母発現用プラスミドｐ’ｒＨ７６７
を構築した（第１０図）。このプラスミドを用いてＡ　
Ｊ−１２２Ｒ″″株を形Ｍ転換させることによりプラス
ミドｐＴＢ７６７を含む酵母株ＳａｃＣｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｌ１２　Ｒ−／ｐ’
ｒＢ７６７を得た。

プラスミドｐＴＢ７６７を保持する ５ａｃｃｈａｒｏｓ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　Ａ　Ｈ２２Ｒ−（Ｓａｃｃｈａｒｏａｙｃｅｓ　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａ　Ｈ２２Ｅじン’ｐＴ　Ｂ７６７
）はＩＦＯに受託番号ＩＦＯ１０４２５として寄託され
、またＦＲｌに受託番号Ｆ　Ｅ　ＲＭ［）−１８４３（
ＦＥ尺〜Ｉ　　Ｐ−９６０３より移管）として寄託され
ている。

実施例７　酵母の３５Ｓ−メチオニンラベルと免疫沈降
反応 発現プラスミドｐ′ｒＩ３７６７を含む酵母Ａｌ１２２
　ｎ−を低Ｐ　ｉ培地［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　ＲｅｓＣｏｍｍｕｎ、、　　Ｉ　３８．２６８
（１９８６月を用いて３７℃で一晩培徨ｊ７た後、″Ｓ
−メメチオニン２０μＣｉ　／　ｒｄとなるように加え
、合成される蛋白質をラベルした。ラベル後閑体を集め
、０．＋５Ｍ　　ＮａＣｌ溶液て洗い、培養液の１７５
量の７Ｍグアニノン塩酸を加えた。０℃で１時間おいて
菌体をとかした後、Ｉ　Ｏ，０００ｒｐｍ　Ｉ　０分間
遠心１、た。上清をｌ　ＯｍＭ　　’ｒ’ｒｉｓ−ｆ（
Ｃ１（ｐＨ８，０）。

ＩｍＭ　　ＥＤＴＡ　　２００＋Ｍ　　ＮａＣ１および
ＩｍＭＰ〜ＩＳＦを含む液に対し透析して、菌体抽出液
を得た。この抽出液に抗つシＴ３１３Ｐウサギ抗体（実
施例５に記載）を加え、実施例５に記載の方法に従い免
疫沈降物を得て、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動およびラジオオートグラムにより解析した。その結果
、発現プラスミドをａする酵母Ａｆ４２２　Ｒ−、’ｐ
ＴＢ　７６７に特異的なポリペプチドの合成が認められ
、ヒトＩ’ＤＩが産生されていることが明らかになった
。

なお、使用した低Ｐ１培地の組成は以下のとおりであっ
た。

低［）ｉ培地［１−当たりｊ Ｋ　ＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　　１．５ｇグ
ルコース　　　　　　　　　　　　　２０ｇアスパラギ
ン　　　　　　　　　　　　２ｇＬ−ヒスデシン　　　
　　　　　　　！ＯＯｍｇＫ　ｆ　（１＊ｇ／ｄ）　　
　　　　　　　　　Ｉ００μｆｆＭｇ５Ｏ，・７ｆ（、
Ｏ（５００ｍｇ／１Ｏｄ）　　　１ｏｄＣａＣＩｓ　・
２　Ｈｔｏ　（３３０ｍｇ／　１０縁）　　　１０＞ｕ
微囁元素溶液（ａ　）　　　　　　　　　　　Ｉ　ｈｒ
ｌ。

ビタミン溶液（ｂ）１旋 微肴元素溶液（ａ：ＢＪＮ当たりコ ＣｕＳ　Ｏａ　・　５　ＨｔＯ ０ｍｇ Ｆｅ５　Ｏ，・　７　ＨｔＯ ２５０１１１ｇ ＭｎＳＯ−・　４１１ｔＯ ０ｍｇ （Ｎ　Ｉｒ４）＊Ｐ　ｏ４１　１２　ＭＯＯｓ　’　Ｊ
　ＩＩｔＯ２０＋！Ｉｇ７、ｎＳＯ，・　７　Ｈｔｏ １０Ｂ ビタミン溶液（ｂ）［＋＆当たり１ イノ／トール　　　　　　　　　　　　　　Ｉ（１ｇチ
アミン　　　　　　　　　　　　　２００ｔａｇピリド
キシン　　　　　　　　　　　　２００量ｍｇパットテ
ン酸カルシウム　　　　　　２００１ｇニアンン　　　
　　　　　　　　　　２００１ｇピすチン　　　　　　
　　　　　　　　２ｍｇ実施例８　大腸菌ＭＭ２９４／
Ｉ）’ｒＢ７６６山来Ｉ）ＤＩの精製 ′Ｍ犠例１で得られたヒトＩ）ｒ）１発現プラスミドル
Ｔ　［（７６６を含む大腸菌〜（Ｍ２９４を５１１ｇ／
＋２ノテトラサヂクリン、ｌｏｇ／＆のバクト・トリプ
トン５ｇ／”’（！のバクトイ−ストエキスおよび５ｇ
／（！の食塩からなろ１１！の培地で３７℃で１１時間
培箋した。二の培養液はさら１こ、２ｍｇ／（ｌのビタ
ミンＢ、。

１０ｇ／′ｆ！のグルコース、ＩＯｇ／Ｑのカザミ、ノ
酸を含むＭ−９培地２０ｅに移しさらに３７℃で９時間
通気Ｍ１拌培養した。培養液を遠心し、菌体３８５ｇを
得た。

菌体３０ｇを０．１５Ｍ　　ＮａＣＱ−１０ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ−１ｍＭ　　ＰＭＳＦ−０，１ｍＭ（ｐ−アミジノ
フェニル）メタンスルボニルフルオライド塩酸塩（ＡＰ
ＭＳＦ）−２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ＆（ｐＨ７，４）
１５０−に均一に懸濁し、０℃で超音波処理（１分１川
を４回）を行い、遠心して菌体抽出液１５６−を得た。

抽出液を０．１５Ｍ　　ＮａＣＱ−１ｍＭ　　ＣａＣ（
！ｚ−０，１＋Ｍ　　ＡＰＭＳＦ−１０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６，８）で平衡化したセルロファイ
ンＧＣＬ−２０００−８ｒ（生化学工業株式会社）カラ
ム（６ｘ　Ｉ　０２ｃｍ、２８８０ｄ）に負荷し、同一
緩衝液で溶出して、ヒトＰＤＩ画分３２５滅を集めた。

次に上記溶出画分を０．１５Ｍ　　ＮａＣ（ｌ　−ＩＢ
ＭＣａＣ＋！ｔ−０，ＩｍＭ　　ＡＰＭＳＦ−１０ｔａ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）で平衡化した
ハイトロキシルアパタイト（バイオ・ラット社、アメリ
カ）カラム（１，５Ｘ　Ｉ　４ｃｍ、２５ｄ）に通して
、ヒトＰＤＩを吸着させ、カラムを上記平衡化緩衝液で
洗浄した。次いでｌ０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｉ−１６，８）２００１ｎ１．と３００ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（１）Ｈ６，８）２００１ｎ１とによる直
線濃度勾配溶出法によりヒトＰＤＩを溶出した。

溶出液をＯ，ＩｔａＭ　　ＡＰＭＳＦ−１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）に対して一夜透析し、
上記緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー
）カラム（１，５ｘ　Ｉ　５ｃｍ、２６．５ｍ）に通し
て、ヒトＰＤｒを吸着させ、カラムを上記緩衝液で洗浄
した。次いで、０．１ｍＭ　　ＡＰＭＳＦ１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ−Ｉ６．８）２００ｄと０．
５ＭＮａＣｆｆ−０，ＩＩｌ＋ＭＡｒフＭＳＦ−１０＋
ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液（１）Ｉ−１６，８）２０
０１１ｒｌとによる直線濃度勾配溶出法によりヒトＰＣ
Ｉを溶出した。

ヒトＰＤＩ画分を０．１ｍＭ　　ＡＰＭＳＦ−１０１１
ＩＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）に対して一
夜透析し、０．０９Ｍ　　ＮａＣＱ−１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６，８）で平衡化したＤＥＡＥ−
ＮＰＲＨＰＬＣ用カラム（東ソー、０．４６ｘ３　、５
　ｃｏ＋）に吸着させ、３０分間でＮａ（Ｊ！Ａ度を０
゜３９Ｍまで上昇させることに“よりヒトＰＤＩを溶出
した。ヒトＰＤＩ画分を分取し、除菌ろ過して、蛋白濃
度１０６μｇ／ＩＩＦＮのヒトＰＤＩ精製標品液１７．
１１ｄ、を得た（蛋白ｆＪ　１　、８　ｍｇ）。得られ
た精製標品は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で単一バンドを示した（第１１図）。

実施例９　大腸菌ＭＭ２９４／ｐＴＢ７６６由来ＰＤＩ
の精製 実施例８で得られた菌体３０ｇを０．１５ＭＮａＣ（１
−１０ｍＭ　ＥＤＴＡ−１ｍＭ　ＰＭＳＦ−０，１ａ＋
Ｍ　　ＡＰＭＳＦ−２０ｍＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣ＆（＋）
Ｉ−１７゜４）１６０ｄに均一に懸濁し、直径０．２５
〜０゜５０ｕ＋のガラスピーズの入ったビード・ビータ
−（バイオスペックプロダクト社、アメリカ）で０℃に
て３０分間処理をした。この処理液を遠心して抽出液８
４−を得た。

抽出液を実施例８と同一の操作によりヒトＰＤＩを精製
し、蛋白濃度１１１　ｕｇ／ｌｄｌのヒトＰＤ■精製標
品液９滅を得た（蛋白量１　、　ＯＢ）。

実施例１０ＰＤＩの蛋白化学的性質 実施例８で得られたヒトＰＤＩについて以下の蛋白化学
的性質を調べた。

（１）分子ｍ 還元条件下で５ＯＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電
気泳動を行った［Ｎａｔｕｒｅ、　２２７　、６８０（
１９７０月あと、コマジーブリリアントブルーＲ−２５
０染色した結果、ヒトＰＤｆ蛋白質は分子量約５５００
０ダルトンにバンドを示した（第１Ｉ図）。

（２）アミノ酸組成： ヒトＰＤＩ蛋白質を４％ヂオグリコール酸を含む６Ｎ塩
酸中１１０℃で２４．４８および７２時間加水分解した
のち日立８３５型アミノ酸分析計を用い、ニンヒドリン
法によりアミノ酸組成を分析した。なお、セリンおよび
スレオニンは加水分解の０時間に外挿して求めた。さら
にシステインは過ギ酸酸化したのち６Ｎ塩酸で加水分解
し、アミノ酸分析計によりシスティン酸として定！通し
た。

得られたアミノ酸組成値を第２表に示す。

２　ｌ、８ ２１．２ ７０．７ ２０．５ ２９．５ ４６．６ ５．５ ３１．１ ４．５ ２　Ｉ、５ ４１．５ １１．９ ３４．０ ４６．６ １１．７ １３．６ ４．５ （３）アミノ末端アミノ酸配列分析 ヒトＰＤＩ蛋白質１０２　μｇ（１，８５ＩＩＩＩｌｌ
ｏｌｅ）に気相プロテインシークエネーター（アプライ
ド・バイオシステムズ社製、４７０Ａ型、アメリカ）を
用いる自動エドマン分解法を適用して、Ｎ末端アミノ酸
配列を分析した。フェニルチオヒダントインアミノ酸（
ＰＴＩＩ−アミノ酸）はミクロパックＳ１）　−ＯＤ　
Ｓカラム（バリアン社、アメリカ）を用いる１１１’　
Ｌ　Ｃにより同定した。谷ステップで検出されたｆ）　
Ｔ　Ｈ−アミノ酸を第３表に示す。

（以下余白） Ｃｙｓ　　： ハーフシスチン 未同定 （４）カルボキン末端アミノ酸分析 ヒトＰＤＩ蛋白質１５１μｇ（２、７５ｍ１Ｉｌｏｌｅ
）をヒドラジン分解法［Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５
９　、　Ｉ　７０（１９６６月により分析した。その結
果、カルボキシ末端アミノ酸はロイシンであった（回収
率：４６％）。

（５）紫外線吸収スペクトル 第１２図に示す如く、本物質は１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６，８）中で２８０ｎｍ付近に吠収極大
をもち、２５Ｏｎｍ付近に吸収極小をもつ典型的な蛋白
質の吸収スペクトルを示している。

実権例１１　　ＰＤＩによるスクランブル型リボヌクレ
アーゼのりフォールディング 実施例８で得たヒトＰＣＩについて、スクランブル型リ
ボヌクレアーゼのりフォールディング作用を准１定した
。

（１）材料 スクランブル型リボヌクレアーゼ（Ｓ　ＲＮａｓｅ）は
１ｌｉｌｌｓｏｎらの方法ｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

１０７．２８１−２９４（１９８４）］に従ってウシ膵
臓リボヌクレアーゼを用いて調製した。

（２）リボヌクレアーゼ（ＲＮ　ａｓｅ）活性の測定Ｒ
Ｎａｓｅの活性は酵母１）ＯＩＹＲＮＡを基質とするＫ
ａｌｎｉｓｋｙらの方法［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩ
ｌ、、　２３４　、１５１２−１５＋６（１９５９）］
に従って測定した。

（３）緩衝液 （ａ）Ｉ　ＯｍＭ　ＥＤＴＡを含む１００＋＋Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７、８）。

（ｂ）　０　、２　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，
０）。

（ｃ）０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）。

（４）測定法 試験管内にヒトＰＤＩ溶液１０μｆｆ（ＩＩＩμｇヒト
Ｐ　Ｄ　Ｉ　＃り、緩衝液（ａ）１６８μ＆およびＩｍ
Ｍ　　ＤＴＴ２μＣを混合し、３０℃の水浴上で５分間
予備加温したのち、０．５ｏ＋ｇ／蔵の５ＲＮａｓｅを
２０ｐＱ添加し、３０℃で６０分間加温した。緩衝液（
ｂ）を８００μｅ添加し、反応をストップさせた。

この反応液中のＲＮ　ａｓｅの活性は以下のようにして
測定した。すなわち、上記反応液２００μｅを遠心デユ
ープに入れ、３７℃で５分間予備加温した。１％になる
ように酵母ｐｏｌｙ　　ＲＮ　Ａを緩衝液（Ｃ）に溶解
した基質溶液も３７℃で５分間予備加温した。予備加温
後、反応液に２００μｅの基質溶液を加え、３７℃で４
分間反応させたのち、０．７５％酢酸ウラニウムを含む
２５％過塩素酸溶液２００μａを添加した。添加後、遠
心チューブを５分間水冷し、Ｉ　６０００　ｒｐｔａで
５分間遠心したのち、その上清を蒸留水で３０倍に希釈
して、波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。

以上の方法で、実施例８で得られたヒトＰＤＩの活性を
測定した結果、第４表に示すとおりヒトＰＤＩは活性の
認められなかった５ＲＮａｓｅを１０−５Ｍのジチオス
レイトール（ＤＴＴ）存在下で明らかに活性を持ったＲ
Ｎａｓｅに変換することが確認された。

第４表 ｏｎｅ ＤＩ ＤＴＴ ０．９ ０．９ ４．４ 実施例１２ＰＤＩによるスクランブル型組み換えインタ
ーロイキン−２のリフォールディング 実施例８で得たヒトＰＤＩについてスクランブル型組み
換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）のりフォール
ディング作用について測定した。

（１）材料 スクランブル型ｒｌＬ−２はＪ、　Ｌ、　Ｂｒａｗｎｉ
ｎｇらの方法［Ａｎａｌ、　ＢｉｏｃｈｅＩｍ、、　　
１５５，１２３−１２８（１９８６）コに従ってｒ　Ｉ
　Ｌ　−２［ＢｉｏｃｈｅＩＩｌ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、Ｉ　３０，６９２−６９９
（１９８５）］を用いて調製した。

（２）ＩＬ−２活性の測定 多山らによって改良されたマウスＮ　Ｋ　Ｃ３細胞を用
いるＭＴＴ変法［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ、　９３　。

１５７−１６５（１９８６）］により測定した。

（３）緩衝液 ３０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ９、０）（４
）測定法 試験管内にヒトＰＤＴ溶液（Ｉ１１μｇ／ｄ）を２０〜
Ｉ００μ１２．緩衝液をｌ０００μ＆、ＩｍＭＤ　’ｒ
　Ｔを３０μａ加え、液量が２８５０μσになるように
蒸留水で希釈したのち、スクランブル型ｒｌＬ−２（２
００ｕｇ／−）を１５０ｕ（ｌ添加し、３０℃で１８時
間反応させた。各試験管についてＩＬ−２活性をＭＴＴ
変法により測定した。

その結果、第５表に示すとおりヒトＰＤＩｉａ度に依存
してスクランブル型ｒｌＬ−２が活性型ｒｌＬ−２に変
換することが確認された。

０．７４ １．８５ ２．３７ ２．７７

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例２で得られたｐＴ３ＢＩ’−１およびｐ
Ｔ　３　Ｂ　Ｐ　−２中にクローニングされたｃＤＮＡ
の簡単な制限酵素地図を示す。図中、（１）はｐＴ３８
Ｐ−１にクローニングされたｃＤＮＡを、（２）はｐ７
３３Ｐ−２にりａ−ニングされたｃＤＮＡを示す。略号
Ａ　、　Ｅ　、　Ｉ（、ＰおよびＳはそれぞれＡａｔｌ
ｌ　、ＥｃｏＲＩ　、Ｈｉｎｃｌｌ　、Ｐｖｕ［Ｉおよ
び５ｓｐｌを示し、■は精製Ｔ３ＢＰタンパク質のトリ
ブテブク・ペプチド・マツピングにより得られたアミノ
酸配列と一致する部分を示す。 第２図は参考例２で得られたｐＴ　３　Ｂ　Ｐ　−２中
にクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列およびその配
列より推測されるアミノ酸配列を示す。 第３図はヒトＰＩ）Ｉのアミノ酸配列を示し、第４図は
実施例１で得られた［）Ｔ　３　Ｂ　Ｐ　−３中にクロ
ーニングされたＣ　Ｄ　Ｎ　Ａの簡単な制限酵素地図を
示−４゛。第４図中、略号Ｂ、Ｃ，Ｅ、ＨおよびＰはそ
れぞれ１３ａｍ）Ｉ　Ｉ　、Ｃ１ａｌ　、ＥｃｏＲＩ　
、Ｈｉｎｄ！ＩＩＩおよびＰｓｔｌを示す。 第５図は実施例１で得られたｐ’ｒ　３　Ｂ　Ｐ　−３
中にクローニングされたｃＤＮＡ塩基配列およびその配
列より推測されるアミノ酸配列を示す。 第６図はヒトＰＤ■遺伝子の動物細胞発現用プラスミド
の構築を示す。 第７図はヒトＰＤＩ遺伝子を導入した〇〇Ｓ〜７細胞で
合成されたヒトＰＤＩを蛍光抗体法で検出した結果（蛍
光顕微鏡写＊）を示す。（１）はＰＤ■遺伝子導入細胞
（生物）の形態を示す蛍光顕微鏡写真を示し、（２）は
対照とした遺伝子非導入細胞（生物）の形態、を示す蛍
光顕微鏡写真を示す。 第８図はヒ）ＰＤＩ遺伝子の大腸菌発現プラスミドの構
築を示す。 第９図は大腸菌で産生されたヒトＰＤｆの免疫沈降法に
よる検出を示す。レーンＢおよびＤはそれぞれＤＨＩ／
ｐＴＢ　７６６およびＭ　Ｍ　２９４　／　ＰＴＩ３７
６６を、レーンＡおよびＣはそれぞれＤＨｌ　／ｐｔｒ
ｐ７８１およびＭＭ　２９４　／ｐｔｒｐ７８１を示す
。 第１０図はヒトＰＤ　Ｉｌｌ伝子の酵母発現用プラスミ
ドのＮＩｔ築を示す。 第１［図はＰＤｆの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を示し、レーン！は精［ＰＤｒを、レーン２はマ
ーカー蛋白を示す。 第１２図は精製ＰＤＩの紫外線吸収スペクトルを示す。 代理人　　弁理士　　岩　１）　　弘 茅 図 ε Ｃ ＰＢ ε α（」　　αト　　コｃ　　Ｑリ　　コＱ　　コロ　　
αト　　句ハ・２ ｒツ′＋１ ９２．５− ４６．０− ３０．０− １４．３− 竿 図 竿 図 製表 （ｎｍ）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）第３図のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
   有する組み換えＤＮＡ。
2. （２）第３図のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
   有するベクターで形質転換された形質転換体。
3. （３）第３図のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
4. （４）第３図のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
   有するベクターで形質転換された形質転換体を培養し、
   培養物中に該アミノ酸配列を含有するポリペプチドを生
   成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該ポリ
   ペプチドの製造法。
5. （５）原核細胞で生産された真核生物のタンパク質に第
   ３図のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを反応させ
   ることを特徴とする、分子内に天然型ジスルフィド結合
   を有する真核生物のタンパク質の製造方法。