JPH01228499A - 酵素サイクリング法を用いたｎａｄｈの超高感度化学発光測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、ＮＡＤＨを極めて感度良く定量する新規な方
法に関するものであり、生体内の各臓器の様子について
の検査にたいしても有効であり、例えば医療の分野にお
いて広く利用することが出来る。

［従来の技術］ 従来化学発光法を利用したＮＡＤＨの測定方法としては
１本発明者等が以前に発表した１−ＭＰＭＳ及びＩＬ−
ｍ−ＰＯＤを使用する方法〔分析化学３６巻８２頁（１
９８７年）〕が知られているにすぎない。

［発明が解決しようとする問題点］ 近時、分析化学の一つの命題である微量の試料を精度高
く測定する方法の開発が著しく盛んになってきており、
生体内酵素反応に広く関与するＮＡＤＨの超微量の定量
についてもその測定法の開発が望まれていた。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者は、ＮＡＩ）Ｈの化学発光法による測定の感度
を高める方法につき鋭意検討を重ねていたところ、ＮＡ
ＤＨを特定の酵素系に組込んで該酵素系をサイクルさせ
、実際の測定対象とする物質を増強してから測定するこ
とによって、測定精度を高めることに成功して本発明を
なした。

即ち本発明の方法は、基質としてオキザレート及びエタ
ノールを使用し酵素としてマレイン酸デヒドロゲナーゼ
（ＭＤＨ）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）
を使用する酵素サイクリング法によって増幅されたＮＡ
ＤＨを化学発光系に導いて測定する方法である。

上記本発明の方法に使用される化学発光系としては、従
来知られている方法例えば１−ＭＰＭＳ及びＩＬ−ｍ−
ＰＯＤを使用することが出来る。

本発明は、次のようにして容易に実施することが出来る
。

ＮＡＤＨの標準溶液又はＮ　Ａ　Ｄ　Ｈを含む試料溶液
に、酵１ＡＤＨ及びＭＤＨｌ及び基質オキザレート及び
エタノールを加えて適当時間反応させ、酵素を失活せし
めたのち過剰のＮＡＤ、ＭＤＨ、グルタミン酸−オキザ
ロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタメートを
加えて先の反応によって得ら九だマレートに相当するＮ
ＡＤＨを生ぜしめて、この溶液に１−ＭＰＳＭ及びｍ　
−Ｐ　ＯＤの溶液を加えて発光させる。

［実施例］ 次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが本
発明はこれによって限定されるものではない６ 実施例 種々の濃度のＮＡＤＨＡＤＨ溶液１Ｍ　リン酸緩衝液、
ｐＨ７，５）　２μｍを、ＡＤＨ溶液（２０Ｕ／ｍ１．
０．０４Ｍ　ピロリン酸緩衝液、ｐＨ８，８）１０μｌ
、ＭＤＨ溶液（３０Ｕ／ｍ１．０．１Ｍリン酸緩衝液。

ＰＨ７，５）　１０μｍ、及びオキザロ酢酸：エタノー
ル＝　２ｍＭ　：　１．２Ｍの溶液２０μｌからなる混
合液に加え、４℃に一夜放置した後、１００℃で３分間
加熱した。

得られた反応液に、ＮＡＤ７ｓ液（５ｍＭ、　０．１、
呵リン酸緩衝液、ＰＨ７，５）、ＭＤＨ溶液（１２Ｕ　
／ｍｌ、前記緩衝液）、グルタミン酸水溶液（５ｄ）、
ＧＯＴ溶液（Ｉ　Ｕ／＋ａ１．　Ｏ，１Ｍ　リン酸緩衝
液、　ｐＨ７，５）、及び２−アミノ−２−メチルプロ
パツール緩衝液の等景況合液２００μｌヲ加工、２５℃
で１０分間放置した。

上記反応液４０μｍを採取し５ｏｏμｍの１−ＭＰＭＳ
水溶液（５Ｘ　１０−’Ｍ）及びＩＬ−ｍ−Ｐ○Ｄ水溶
液（２，４Ｘ１０−’Ｍ／ｌＸｌ０−’Ｍ）ｔｉ分注し
て発光させた。

この方法によりＮＡＤＨは３ｏｆＩＩＩ０１〜６ｐｍｏ
ｌ／ａｓｓａｙの検量域で測定された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＮＡＤＨの化学発光法による検量線を示した
ものであり、縦軸は発光強度（カウント／６秒）を示し
、横軸は検体試料中に含まれたＮＡＤＨ野料を示す。図
中（）内の数字は、ｃｖ％（ｎ＝４）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、基質としてオキザレート及びエタノールを使用し酵
   素としてマレイン酸デヒドロゲナーゼ及びアルコールデ
   ヒドロゲナーゼを使用する酵素サイクリング法によって
   増幅されたＮＡＤＨを化学発光系に導き測定することを
   特徴とするＮＡＤＨの定量法。 ２、化学発光系が１−メトキシフェナジンメトサルフェ
   ート（１−ＭＰＭＳ）及びイソルミノール（ＩＬ）−マ
   イクロペルオキシダーゼ（ｍ−ＰＯＤ）を使用する系で
   ある請求項１の方法。