JPH04265859A

JPH04265859A - 酵素免疫測定法

Info

Publication number: JPH04265859A
Application number: JP3027588A
Authority: JP
Inventors: Akio Tsuji; 辻　章夫; Masako Maeda; 前田　昌子; Motoo Nakajima; 中島　基雄
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1991-02-21
Filing date: 1991-02-21
Publication date: 1992-09-22
Anticipated expiration: 2014-02-10
Also published as: US5246834A; JP2856339B2; EP0500099A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アデノシン三リン酸（
以下「ＡＴＰ」という）生成酵素を標識酵素として用い
る酵素免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体成分の微量分析法として化学発光や
生物発光を用いる分析法が行われており、特に生物の酵
素系を利用する発光反応の量子収率は高く極めて高感度
な分析法として種々応用されている。一方、発光反応の
酵素免疫測定法（以下「ＥＩＡ」という）への応用は化
学発光に偏っているが、生物発光に関してもＥＩＡにつ
いていくつかの試みがなされて来ている。例えば、還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドなどの発光反
応に関与する補酵素の生成酵素を標識し、生物発光の系
と接続することにより間接的にＥＩＡに導入する方法な
どである。この方法は標識酵素の増幅作用が加わり、極
めて高感度なＥＩＡとして有用である。例えば、グルコ
ース脱水素酵素を標識体とする１７−α−ヒドロキシプ
ロゲステロンのＥＩＡでは２．５　×１０−１２ｇの検
出が可能という報告がある（分析化学ｖｏｌ．３４（１
９８５）　１７７〜１８１）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、ＡＴＰ
を高感度に測定する手段としてホタルルシフェラーゼを
用いる生物発光に着目し、これをＥＩＡに応用すべく種
々検討した結果、本発明を完成した。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明のＥＩＡは、標識
酵素としてＡＴＰ生成酵素を用い、生成するＡＴＰをホ
タルルシフェラーゼを用いて生物発光させ、発光量を測
定することを特徴とするものである。以下、本発明を具
体的に説明する。本発明は、標識酵素としてＡＴＰ生成
酵素を用いるところに特徴があり、酵素免疫反応の手法
自体は、既知の方法を適用できる。例えば、測定対象物
質（抗原）を酵素で標識し、対応する抗体との反応を検
体中の抗原と競合させ、次に予め固相化された先の抗体
に対する第２抗体と反応させて固相上の酵素を定量する
方法（競合法）、測定対象とする抗原を、予め固相化さ
れた対応する抗体と反応させ、次いで酵素で標識された
抗原に対応する抗体と反応させて固相上の酵素を定量す
る方法（サンドイッチ法）などが挙げられるが、これら
以外の従来使用されている方法にも適用することができ
る。

【０００５】本発明で標識酵素として用いられるＡＴＰ
生成酵素は、基質アデノシン二リン酸（以下「ＡＤＰ」
という）をリン酸化してＡＴＰを生成する酵素であれば
如何なるものでもよく、その起源は問わない。そして、
その具体例としては酢酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ
等を挙げることができ、また酵素による標識は常法によ
って行われる〔酵素免疫測定法（昭和５７年医学書院発
行）等参照〕。次いで、基質としてＡＤＰを加え、固相
上のＡＴＰ生成酵素と反応させてＡＴＰを生成させ、こ
れをホタルルシフェラーゼを用いて発光させ、発光量を
測定する。

【０００６】ここで用いられるホタルルシフェラーゼと
しては、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系によるＡＴＰ
測定に用いられるルシフェラーゼであれば如何なるもの
でもよく、例えばゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリ
カボタル等由来のルシフェラーゼ、あるいはこれらのル
シフェラーゼを遺伝子組み換え法により製造したもの等
が挙げられる。

【０００７】

【発明の効果】本発明は、ホタルルシフェラーゼを用い
る生物発光を利用するＥＩＡを提供するものであり、種
々の測定対象物質を高感度に測定することができる。

【０００８】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をより具体的に
説明する。

【０００９】

【実施例１】酢酸キナーゼ（以下「ＡＫ」という）を標
識酵素とした１７−α−ヒドロキシプロゲステロン（以
下「１７−ＯＨＰ」という）の競合免疫測定法１．１７
−ＯＨＰ−ＡＫ複合体の調製（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ニ）を調製した。試薬（イ）：１７−ＯＨＰ−３ＣＭＯ溶液１７α−ヒド
ロキシプロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）
オキシム（シグマ社製）をジオキサンに０．１　Ｍとな
るように溶解し、１７−ＯＨＰ−３ＣＭＯ溶液を調製し
た。試薬（ロ）：Ｎ−ヒドロキシサクシニミド溶液Ｎ−ヒド
ロキシサクシニミドをジオキサンに０．１４Ｍとなるよ
うに溶解し、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド溶液を調製し
た。試薬（ハ）：ＤＣＣ溶液ジシクロヘキシルカルボジイミドをジオキサンに、０．
１４Ｍとなるように溶解し、ＤＣＣ溶液を調製した。試薬（ニ）：ＡＫ溶液酢酸キナーゼ（ユニチカ（株）製）を５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．４　）に１ｍｌ当たり１．１６　ｍ
ｇ　となるように溶解し、ＡＫ溶液を調製した。（２）標識反応試薬（イ）、（ロ）および（ハ）をそれぞれ１ｍｌ、０
．５　ｍｌおよび０．５　ｍｌ混合し、室温にて３時間
反応させた。不溶物を遠心除去し、試薬（ニ）０．２５
　ｍｌ　に添加し、４℃にて一晩反応させた。５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４　）に対して透析した後
、遠心（２５００ｒｐｍ，１０分）上澄をトヨパールＨ
Ｗ−５５（東ソー製）を用いたゲル濾過により精製し、
１７−ＯＨＰ−ＡＫ複合体を調製した。２．１７−ＯＨＰの測定（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ヘ）を調製した。試薬（イ）：抗１７−ＯＨＰ抗血清１７α−ヒドロキシプロゲステロン−３−（Ｏ−カルボ
キシメチル）オキシム−ＢＳＡ（シグマ社製）を抗原と
して常法によりウサギに免疫し調製した。（用時適宜希
釈して使用する。）試薬（ロ）：１７−ＯＨＰ−ＡＫ複合体溶液前項１．に
より調製した１７−ＯＨＰ−ＡＫ複合体を５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４　）５０μｌで２００　倍に
希釈し、１７−ＯＨＰ−ＡＫ複合体溶液を調製した。試薬（ハ）：１７−ＯＨＰ溶液１７α−ヒドロキシプロゲステロン（シグマ社製）０．
１　〜２００ｐｇ　を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４　）５０μｌに溶解し、１７−ＯＨＰ溶液を調製
した。試薬（ニ）：基質溶液５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４　）にＡＤＰ、
アセチルリン酸及び酢酸マグネシウムをそれぞれ１０μ
Ｍ、１ｍＭ、３０ｍＭとなるように溶解し、基質溶液を
調製した。試薬（ホ）：測定用緩衝液５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４　）に酢酸マグ
ネシウム、ブロックエース（大日本製薬社製）をそれぞ
れ３０ｍＭ、１０％となるように溶解し、測定用緩衝液
を調製した。試薬（ヘ）：発光試薬溶液ＡＴＰ測定用キット（キッコーマン（株）製ルシフェー
ル−ＬＵ）の発光試薬１ビンを発光試薬溶解用液１ビン
に溶解し、発光試薬溶液を調製した。（２）測定常法により作製したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化試験
管に試薬（イ）を５０μｌ、試薬（ロ）を５０μｌ、更
に試薬（ハ）を５０μｌ添加し、４℃にて一晩反応させ
た。５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４　）を用い
て３回洗滌し、洗滌液を除去した後、試薬（ニ）を５０
μｌ、試薬（ホ）を１００　μｌ添加し、３７℃にて１
時間反応させた。これに試薬（ヘ）１００　μｌを添加
し、生じる発光を発光検出器（アロカ社製ルミネッセン
スリーダーＢＬＲ−２０１　）により１５秒間積算した
。その結果を図１に示す。図１から０．５　×１０−１
２ｇの１７−ＯＨＰまで検出できることがわかる。

【００１０】

【実施例２】ＡＫを標識酵素とした免疫グロブリンＧ（
ＩｇＧ）のサンドイッチ免疫測定法１．ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡＫ複合体（ＡＫ標識Ｆａｂ
’　）の調製（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ホ）を調製した。試薬（イ）：ＡＢＳ０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５　）に塩化ナトリウ
ムを０．９　％となるように溶解し、ＡＢＳを調製した
。試薬（ロ）：ＰＢＳ−ＢＳＡ１００　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０　）に塩化ナト
リウムおよび子牛血清アルブミンをそれぞれ０．９　％
、０．１　％となるように溶解し、ＰＢＳ−ＢＳＡを調
製した。試薬（ハ）：還元反応用試薬溶液試薬（ロ）に２−メルカプトエタノールおよびＥＤＴＡ
をそれぞれ０．１Ｍ、５ｍＭとなるように溶解し、還元
反応用試薬溶液を調製した。試薬（ニ）：ＡＫ溶液ＡＫ（ユニチカ（株）製）０．６６ｍｇを試薬（ロ）１
ｍｌに溶解し、ＡＫ溶液を調製した。試薬（ホ）：マレイミド化試薬溶液Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシル）サクシニミ
ド（同人化学社製）５ｍｇをジメチルホルムアミド１ｍ
ｌに溶解し、マレイミド化試薬溶液を調製した。（２）標識反応ヤギ抗ウサギＩｇＧ（生化学工業社製）（７ｍｇ／ｍｌ
）２ｍｌを試薬（イ）に対し一晩透析した後、膜濃縮し
た。これに０．２８ｍｇのペプシンを添加し、３７℃に
て一晩反応させた後、ゲル濾過によりＦ（ａｂ’）２を
分離した。これを濃縮し、試薬（ハ）５０μｌと混合し
て３７℃にて９０分間反応させた後、ゲル濾過によりＦ
ａｂ’　を分離した。　　一方、試薬（ニ）１ｍｌに試
薬（ホ）１ｍｌを８．４　μｌ加え、３７℃にて９０分
間反応させた後、ゲル濾過法により、反応生成物（マレ
イミド化ＡＫ）を分取した。これと、上記にて得られた
Ｆａｂ’とを混合し、３０℃にて２時間反応させた後、
ゲル濾過法により、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡＫ複合体（
ＡＫ標識Ｆａｂ’　）を得た。２．ウサギＩｇＧの定量（１）試薬の調製以下の試薬（イ）〜（ヘ）を調製した。試薬（イ）：ＰＢＳ−ＢＳＡ１００　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０　）に塩化ナト
リウムおよび子牛血清アルブミンをそれぞれ０．９　％
、０．１　％となるように溶解し、ＰＢＳ−ＢＳＡを調
製した。試薬（ロ）：ウサギＩｇＧ溶液ウサギＩｇＧ（生化学工業社製）を試薬（イ）を用いて
希釈し、０．２５〜２５０ｎｇ／ｍｌの濃度のウサギＩ
ｇＧ溶液を調製した。試薬（ハ）：測定用緩衝液５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４　）に酢酸マグ
ネシウムおよびブロックエース（大日本製薬社製）をそ
れぞれ３０ｍＭ、１０％となるように溶解し、測定用緩
衝液を調製した。試薬（ニ）：ＡＫ標識Ｆａｂ’　溶液前項１．で調製したヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡＫ複合体（
ＡＫ標識Ｆａｂ’　）をで１０００倍に希釈し、ＡＫ標
識Ｆａｂ’　溶液を調製した。試薬（ホ）：基質溶液５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４　）にＡＤＰ、
アセチルリン酸をそれぞれ１０μＭ　、１ｍＭとなるよ
うに溶解し、基質溶液を調製した。試薬（ヘ）：発光試薬溶液ＡＴＰ測定用キット（キッコーマン（株）製ルシフェー
ル−ＬＵ）の発光試薬１ビンを発光試薬溶解用液１ビン
に溶解し、発光試薬溶液を調製した。（２）測定常法により作製したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化試験
管に試薬（ロ）を１００　μｌ添加し、３７℃にて１時
間反応させた。試薬（ハ）を用いて３回洗滌し、液を除
去した後、試薬（ニ）を１００　μｌ添加し、３７℃に
て１時間反応させた。試薬（ハ）を用いて３回洗滌し、
液を除去した後、試薬（ハ）および試薬（ホ）をそれぞ
れ５０μｌずつ添加し、３７℃にて１時間反応させた。これに試薬（ヘ）１００　μｌを添加し、生じる発光を
発光検出器（アロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ
−２０１　）により１５秒間積算した。その結果を図２
に示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】１７−ＯＨＰの検量線を示す図である。

【図２】ウサギＩｇＧの検量線を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　標識酵素としてアデノシン三リン酸生
成酵素を用い、生成するアデノシン三リン酸をホタルル
シフェラーゼを用いて生物発光させ、発光量を測定する
ことを特徴とする酵素免疫測定法。