JPH01230366A - 細胞侵入性医用材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は細胞侵入性医用材料に関する。

さらに詳しくは本発明は担体にヘリックス含量が０〜８
０％である変性コラーゲンを結合あるいは被覆した細胞
侵入性医用材料に関する。

本発明の医用月料は生体内に埋入されて生体組織と同化
され、あるいは創傷面に被覆されて真皮組織に変換され
るので医学および生物学の分野において人工皮膚、人工
血管等として利用される。

［従来の技術］ 生体組織に何らかの異常が生じた場合、自己の他部位の
組織あるいは、親族なと免疫原性の少ない個体からの同
種移植が好ましいがその様な供給か困難な場合には人工
物をもってそれに代替するという発想は古くから存在し
た。しかし、当然免疫拒絶反応の対象となるケースが多
く、そのため組織や免疫系細胞から不感作であるような
、いイっゆる組織反応か低い物質を求める努力か続けら
れている。ポリウレタンを代表とする合成高分子を、よ
り疎水化させる方向の研究なとはその一例である。また
、これとは全く正反対に、免疫反応を引き起こす前に速
やかに物質か組織と同化し７てしまうことにより器官と
しての機能をイ」与するという考え方がある。人工物と
（７ては生体由来材料であるコラーゲン等を選択し、線
維芽細胞等組織修復機能を持った細胞を早期に侵入させ
て、結合組織様の組織を構築さけて目的の組織をおおわ
せ免疫反応を免れる考え方で、後者の方がより理想に近
い形である。

コラーゲンを用いた人工材料は生体由来であるため、確
かに細胞組織に対する親和性は大きいと考えられるもの
の、生体内でコラゲナーゼにより容易に分解・吸収され
るものである。そこで使用するにあっては、何らかの手
段で架橋を導入し、物性面の強化をはかる必要かある。

架橋法としては加熱による脱水架橋、薬品を用いる化学
的架橋等を採用し得る。このうち熱脱水架橋は薬品処理
に比べ安全性が高いか、物性的にコラゲナーゼ酵素に対
する耐性が化学的架橋に対して低い。そこで、化学的架
橋を熱架橋と併用させたり、化学的架橋ｊ１ｉ独で用い
る手段か選択される。これを実施すると、物性面での性
質向上か著しい。例えば、１１０°Ｃの温度で真空下に
２４時時間−て熱的な架橋を導入した場合には、コラゲ
ナーゼ３　ｕ　ｎ　ｉ　ｔ　／　ｍｌ　＋：ｌ−＋に３
７℃下で静置すると１日以内に溶解するのに対し、イソ
シアネート系架橋のみを施した場合にはコラケナーセ゛
１ｏＯｕｎｉｔ／ｍｌ中に３７°Ｃで７日経過しても形
態に変化か見られない。ところが、かかる強固な架橋を
導入すると、導入前にコラーゲンか有していた細胞、組
織に対する親和性か大幅に低下し、細胞侵入か阻止され
る傾向が出現する。つまり物性面の強化と、細胞、組織
に対する親和性という生物学的性能の向上とは、両立が
困難な相反する事象であり、満足する材料は従来求め得
なかった。

［問題点を解決するための手段］ 本発明の目的は生体内に埋入または創傷面に被覆した際
に生体内の分解酵素に対して抵抗性を何し、一定期間必
要な機械的強度を保持し、かつ細胞、組織に対する親和
性が良好で増殖した細胞か容易にその内部に入り込みや
すい医用材料を提供することにある。

かかる本発明のｉ」的は以下の構成によって達成される
。

１）担体にヘリックス含量が０〜８０％である変性コラ
ーゲンを結合または被覆したことを特徴とする細胞侵入
性医用材料。

２）担体か生体吸収利料であるコ項の医用材料。

３）生体吸収旧材かコラーゲンである］または２項の医
用月利。

４）コラーゲンが熱脱水架橋あるいは化学架橋されてい
る１〜・３項のいずれかの項に記載の医用材料。

５）コラーゲンおよびヘリックス含量が０〜８０％であ
る変性コラーゲンを混合し、フィルムまたは多孔体を形
成させた後架橋されたことを特徴とする細胞侵入性医用
材料。

−り− ６）架橋されたコラーゲンフィルムあるいは多孔体をヘ
リックス含量０〜８０％である変性コラーゲン溶液で被
覆したことを特徴とする細胞侵入性医用材料。

本発明のへソックス含量０〜８０％の変性コラーゲンは
、牛真皮由来のコラーゲンを酸またはアルカリ処理し、
得られた三重鎖へソックスを有するコラーゲンを水の存
在下で５０〜１２５℃好ましくは９０〜１２１℃で２０
分〜２４時間加熱することによって得られる。ヘリック
ス含量とはコラーゲン特有の三重鎖へソックスの含量を
意味し、変性コラーゲンてはこのへソックスがランダム
コイル化しているためへソックス含量が変性度に対応す
る。このヘリックス含量は円偏光２色性分光計（ＣＤ）
や赤外分光光度計（ＩＲ）で測定することができる［：
Ｐ、　Ｌ、　Ｇｏｒｄｅｎ　ｅｔａｌ、　Ｍａｃｒｏｍ
ｏｌｅｃｕｌｅｓ、　１（Ｂ）　９５４　（１，９７４
））　。

本発明の変性コラーゲンのへソックス含量は０〜８０％
であり、より好ましくは０〜５０％である。

原料コラーゲンは酸またはアルカリ処理したコラーゲン
をさらにプロクターゼまたはペプシンによりその分子末
端のテロペプチドを消化除去し、抗原性を無くしたもの
が望ましい。

」二記変性コラーゲンが結合または被覆される担体は、
生体内の分解酵素によって分解されず一定の期間、機械
的強度を有し、生体に受容されるものか使用される。こ
のような担体の例としてポリエステル、ポリウレタン、
塩化ビニルのような合成樹脂をあげることができるが好
適には、コラーゲン、フィブロイン、ポリ乳酸のような
生体吸収旧材か使用される。

最も好ましくは、コラーゲンを加熱処理または架橋剤で
処理した架橋コラーゲンが使用される。

コラ−ケンの架橋は常法に従ってコラーゲンを加熱処理
するか架橋剤で処理することによって実施される。

加熱処理による場合は、コラーゲンを真空下で１１．０
℃に２時間以上保持して脱水するのが望ましい。

架橋剤で処理する場合は架橋剤には特に制限はなく、グ
ルタルアルデヒドのようなアルデヒド系架橋剤、ヘキザ
メチレンジイソシアネートのようなイソシアネート系架
橋剤、１　エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド塩酸塩のようなカルボシト系架橋剤等
が使用される。

架橋度か低すぎると医用材料と（２ての十分な物理的強
度が得られず、逆に高ずぎるとコラーゲンの１１４造、
性質か損われるので避けるべきである。

０．０１〜５％（ｗ／ｖ）　、好ましくは１〜３％（Ｗ
／の架橋剤濃度で架橋させると適当な架橋度のコラーゲ
ンか得られる。

架橋が導入されるべきコラーゲンは二重鎖へリックスを
有する分散状の水溶性のものでは架橋しても物性があま
り向上［７ないので分散状コラーゲンを３７℃でりん酸
系の緩衝液を用い゛Ｃ中和処理し、生体内にあるような
周期性線維構造をもつ再構成された線維コラーゲンの形
にすることか好ましい。これにより架橋処理との相乗効
果て物性が飛躍的に向上する。

本発明において担体としてコラーゲンを使用する場合細
胞侵入性医用材料は次の方法によって作製される。

１）コラーゲン水溶液を調製し、これを２分して一方は
そのまま放置し他方はこのコラーゲン水溶液を加熱処理
して変性させることにより変性コラーゲンとする。両溶
液を混合した後、ソルベントキャスティング法によりフ
ィルムを、凍結乾燥法により多孔性スポンジをそれぞれ
作製した後、該フィルムあるいは該多孔性スポンジに熱
架橋あるいは化学架橋を形成させることにより本発明の
医用材料を作製する。

２）コラーゲン水溶液を作製した後、ソルベントキャス
ティング法によりフィルムあるいは凍結乾燥法により多
孔性スポンジを作製する。その後、熱架橋反応あるいは
化学架橋反応を行なう。

一方、変性コラーゲンはコラーゲン水溶液を加熱処理に
よって変性させることにより別途作製する。該架橋コラ
ーゲンフィルムあるいは多孔体スポンジを該変性コラー
ゲン溶液に浸漬した後、取り出し自然あるいは真空ある
いは凍結乾燥することにより本発明の医用材料を作製す
る。

コラーゲン以外の担体を使用する場合にも」二記と同様
の方法により変性コラーゲンの水溶液に浸漬して担体に
変性コラーゲンを被覆または結合させる。

担体に対する変性コラーゲンの組成はおよそ５〜８０％
（ｗ／ｗ）であり、より好ましくは１０〜５０％（ｗ／
ｗ）である。

次に実施例および試験例を示して本発明をさらに具体的
に説明する。

実施例　］　　］アテロコラーゲンー変性アテロコラー
ゲンマトリックの調製 アテロコラーゲン（ＡＣ）　　ｉ、ＯｇをｐＨ３，０の
希塩酸に溶解させた。

この溶液を６０℃の恒温槽て３０分間保持したのち、室
温下で２時間放置して変性アテロコラーゲン（ＨＡＣ）
の溶ン夜を得た。このよう１こして得られた変性アテロ
コラ−ケンのへリックス含量は約４０％であ−〕だ。Ｄ
、３ｖ／ｖ％アテロコラーゲンー　］〇　− （ｐＨ３，０）溶液を撹拌しなから、０．３ｗ／ｖ％変
性アテロコラーゲン溶液を添加し混合した。この溶液を
ステンレスバットに注入し、そのまま−３０°Ｃに急速
凍結し、十分凍結した後、−４０°Ｃ１０，１トール未
満の真空下で凍結乾燥した。さらに生成物を５０ミリト
ール未昼の真空下１１０°Ｃ１２４時間処理して熱脱水
架橋した。

比較例　１　　アテロコラーゲンマトリックスの調製 アテロコラーゲン（ＡＣ）１．０　ｇを０．３ｗ／ｖ％
の濃度になるようにｐＨ３，０の希塩酸に溶解させた。

この溶液を上記の方法で凍結乾燥し、さらに熱脱水架橋
した。

試験例１　　アテロコラーゲン−変性アテロコラーゲン
マトリックスのｉｎ　ｖｔｔｒ。

細胞侵入性試験 上記実施例１、および比較例１て得られたマトリックス
について、ラットの皮膚線維芽細胞を用いてｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏで培養実験を行ない細胞侵入性の評価を行なった
。

一］］− ６０ｍｌ１１滅菌シヤーレ〔テルモ（製）〕に直径３５
ｃｍ　Ｊｇのコラーゲンスポンジを置き、線維芽細胞を
ｌＸｌ０”個／ｍｌの濃度で１ｍｌ、スポンジ上に滴下
し、２４４時間３フ 含むＤＭＥ培地を３ｍｌ入れ、３７°Ｃドで６日間培養
した。

１０％中性緩衝ホルマリン液で固定後染色を施し、光学
顕微鏡で観察［７評価した。評価の結果を表−１に示し
た。

（以下余白） 表　　　−　　　１ コラーゲンマトリックスへの ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞侵入性試験 注）細　胞　侵入　性　　スポンジの形態保持性−　全
く　なし　消失（溶解） ±　軽微に侵入　はとんど溶解 ＋　小規模に侵入　　検体は残存しているが著しい形態
変化 廿　中程度に侵入　　小規模の収縮・溶解帯顕著に侵入
　形態不変 表−１から、ＡＣ単独のマトリックスに対し、ＨＡＣを
混合したマトリックスでは、大幅に細胞の侵入性が向上
することか判った。但し、スポンジの形状維持の観点か
らは、ＨＡＣの重量％か８０％未満であることが好まし
いといえる。

比較例　２　　線維化アテロコラーゲンの調製アテロコ
ラーゲン１．０ｇをｐ＋＋３．ｏの希塩酸に溶解して０
．３ｗ／ｖ％にした。この溶液を４℃の恒温槽に入れ撹
拌しなから、りん酸緩衝液を加え、終濃度が０，１％（
ｗ／ｖ）アテロコラーゲン、３０ｍ　Ｍりん酸−２−す
トリウム、　１００ｍＭ　　ＮａＣｆ１であるコラーゲ
ン溶液を調製した。ついて３７℃の恒温槽に１日浸漬し
、線維化コラ−ケン（Ｆ　Ｃ）液を得た。この液を遠心
分離（５０００ｒ．ｐ．ｍ．、　１．０分）して、濃縮
し、０．３％（Ｗ／Ｖ）線維化アテロコラーゲン（Ｆ　
Ｃ）溶液を調製した。この溶液を一３０°Ｃで急速凍結
した後、凍結乾燥を行ないスポンジを作製した。その後
このスポンジを真空下１１０℃、２時間処理し熱脱水架
橋した。

実施例　２　　線維化アテロコラーゲン−変性アテロコ
ラーゲンマトリックスの 調製 上記で調製した０．３％（ｗ／ｖ）線維化アテロコラー
ゲン（Ｆ　Ｃ）と１％（ｗ／ｖ）変性アテロコラ−ケン
（ＨＡＣ）を３７℃で混合し、１時間撹拌した。

この溶液を一３０℃で急速凍結した後、凍結乾燥を行な
いスポンジを作製した。その後、このスポンジを真空下
１１０°Ｃ，２時間処理し、熱脱水架橋した。

試験例　２　　線維化アテロコラーゲン−変性アテロコ
ラーゲンマトリックスの ｉｎ　ｖｔｔｒｏ細胞侵入性試験 上記実施例２、および比較例２で得られたマトリックス
について、試験例１と同様の操作でラットの線維芽細胞
を用いてｉｎ　ｖ＋ｔｒｏで培養実験を行ない、細胞侵
入性を評価した。

評価の結果を表−２に示した。

（以下余白） 表　　　−２ コラーゲンマトリックスへの ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞侵入性試験 表−２から、ＦＣを基材とするマトリックスは、全てス
ポンジの形態維持が良く、安定性に優れていた。細胞の
侵入では、ＦＣ単独でも若干の偏在的細胞侵入が見られ
たものの、ＨＡＣ添加系では非常に多くの細胞が、しか
も均一に分散して侵入しており、スポンジの形状もｉｎ
　ｖｉｔｒｏ培養実験系でありながらｉｎ　ｖｉｖｏの
生体組織に近い様相を呈していた。

試験例　３　　線維化アテロコラーゲン−変性アテロコ
ラーゲンマトリックスの ｉｎ　ｖｉｖｏ皮下埋入試験 実施例２、および比較例２で作製したマトリツクスをラ
ット皮下に埋入し、病理学的に組織像を検索する。

皮下埋植（埋入）には、約２００ｇのＷｉＳｔａｒ　−
ＫＹ系、雌性ラットを用いる。埋入前に、５倍希釈ネン
ブタールで麻酔後ラットの背面を手術用のイソジン液（
明治製菓■製）で漏らし、毛刈り用カミソリで毛の刈り
残しがないように、背面を注意深く剃毛する。その後、
剃られた背面をイソジンとエタノールで消毒する。各々
の切り込みから、ラットの皮部下の疎性結合鉱内に空隙
を作るように切り込みを広げる（ただし、隣接する切り
込み同志は連絡しないように配慮する。）。この空隙に
検体をさし込み、検体全体か平らに横たわるようにする
。角針付六イロン糸で切り口を縫合する。

切り口は３針縫う。同じ検体を別のラットにも同様にし
て埋入する。

埋入後３，２８日目に動物をエーテルあるいは２倍希釈
ネンブタールを用いて殺す。埋入検体が組織中に留まっ
ているようにして、ラットの背筋」二の皮膚組織を８　
ｃｍ　Ｘ　１２ｃｍあるいはそれ以上の太きさに切り取
る。この組織を１０％中性緩衝ホルマリン溶液中に置き
、−昼夜放置し固定後、病理組織検索を施す。

病理組織検索は組織からの検体の切り出しに始まる。検
体が確実に含まれるように、組織を０，５ｃｍＸ２．５
ｃｍ程度のたんさく状に切り出す。これをエタノール、
次にキンレンで透徹し、最後にパラフィンに置換する。

置換後、固型パラフィンの加熱溶解液に、検体を含む組
織を置き、急冷してパラフィン包埋を完了する。包埋さ
れた組織は、ヤマト■製回転式ミクロトームにて薄切を
行ない、厚さ４μｍのパラフィン切片とする。これを脱
パラフィンした後、任意の染色法で病理組織染色を行な
い、プレパラートを完成する。病理組織染色として、ヘ
マトキシリン−エオシン（Ｈ−Ｅ）染色、アサン染色、
レゾルシン−フクンン染色等を採用できる。結果を表−
３に示した。

（以下余白） 表　　　−３ 皮下埋入試験の病理組織変化 ＦＣだけでは、３日日においては好中球浸潤が強くかつ
線維芽細胞の侵入は中）度であり、２８［］目において
は、出来上かった肉芽組織が萎縮している。それに対し
、ＨＡＣが１０ないし２０重量％はいる事により３日日
における好中球浸潤は弱く、逆に線維等細胞侵入は、−
層良好となる。さらに２８日日日おける肉芽組織の萎縮
も著しく緩和される事が明らかである。

実施例　３　　変性コラーゲンを被覆した架橋コラーゲ
ンの調製 比較例２で得た線維化アテロコラーゲン（ＦＣ）凍結乾
燥スポンジを０．０１％および１％へキサメチレンージ
ーイソシアネート（ＨＤＩ）＝エタノール溶液に一昼夜
浸漬し、化学架橋を導入した。それぞれのスポンジに実
施例コ−で得られた変性コラーゲン（ＨＡＣ）水溶液を
３０ｍ１添加し、十分浸漬後再び凍結乾燥してスポンジ
化１７、それぞれを真空下、１１０℃で２時間加熱処理
、および２４時間加熱処理を施し、熱脱水架橋を導入し
た。こうして、変性コラーゲン（ＨＡＣ）を被覆したコ
ラーゲンマトリックスを得た。最終的な組成化はＨＡＣ
が１０重量％となるようにした。

比較例　３　　架橋コラーゲンの調製 実施例３のうぢ、変性コラーゲン（ＨＡＣ）水溶液の添
加の過程を省いた、単独の線維化アテロコラーゲン（Ｆ
　Ｃ）のみの凍結乾燥スポンジ（架橋の導入は実施例３
と同一）を比較例３として用意した。

試験例　４　　変性コラ−ケン被覆架橋コラーゲンマト
リックスのｉｎνｉｖｏ皮下 埋入試験 実施例３および比較例３で作製したマトリックスを、試
験例３の手法に準じてラット皮下に埋入し、病理・組織
学的検索に付す。但し、試料は７日後、１４日後に取り
出した。結果を表−４に示した。

（以下余白） それぞれ比較例として置いたＦＣは、一部好中球等の浸
潤もあるものの、細胞成分自体の浸潤が、炎症性および
網内系細胞も含め、極めて悪い。それに比し２て、それ
ぞれＨＡ　Ｃを被覆したＦＣは、細胞成分の浸潤が甚だ
良好で、それに伴って一部自己組織化も行な４つねてお
り、中には異物反応がやや強いものもあるものの、特に
ＨＡＣ被覆ＦＣＯ旧％ＨＤＩ架橋」−熱架橋２時間の試
料に至っては好中球浸潤すら既に少ない極めて真皮に近
い構造を試料の部位に再構築しており、当発明の１」的
等を考えても最も理想に近いマトリックスであると言え
る。

実施例　４　　シリコーン膜含有コラーゲンスポンジの
調製 テフロン上に５０％５ｉｌａｓｔｉｃシリコ一ン接着剤
型Ａ　（Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のヘキサン溶液
を精密被覆用具（アプリケーター）を用いて塗布し製膜
した。塗布した直後に実施例３によって製造したスポン
ジをのせ、室温で１ｏ分程放置した後、Ｂ　Ｏ’Ｃで少
なくとも１時間オーブンで硬化させた。

試験例　５　　皮膚欠損創−・の移植試験実施例４によ
り製造したスポンジを使用して、ラットの皮膚欠損創へ
の移植試験を行なった。

ラット背部皮膚に皮下筋膜を創面とする全創皮膚欠損創
（２ｃｍＸ２ｃｍ）を作製し、シリコーン膜を表層に（
＝Ｊ与した検体を結紮縫合した。動物は移植後４週「ｊ
に殺し、移植物と傷床を切り取り、病理検索を施した。

４週１」では創収縮はあまり見られず、良好な肉芽組織
が形成［７、表皮再生が見られた。

［発明の効果］ 本発明の医用材料は、担体にヘリックス含量が０〜８０
％である変性コラーゲンを結合または被覆したものから
なるため、４１；体内に埋入あるいは創傷面に被覆され
た際にコラゲナーゼに対して抵抗性を有し、一定期間必
要とされる機械的強度を保持することかできるとともに
、生体適合性に優れ、その内部に増殖した細胞か容易に
入り込むことができる。アテロコラーゲンを原料として
得られる医用材料は抗原性を有しないので特に望ましい
。

従って本発明の医用材料は埋入型人工臓器例えば生体内
留置人工心臓、人工血管等や深度熱傷時の人工被覆材と
して利用される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）担体にヘリックス含量が０〜８０％である変性コラ
   ーゲンを結合または被覆したことを特徴とする細胞侵入
   性医用材料。 ２）担体が生体吸収材料である請求項１の医用材料。 ３）生体吸収材料がコラーゲンである請求項１または２
   の医用材料。 ４）コラーゲンが熱脱水架橋あるいは化学架橋されてい
   る請求項１〜３のいずれかの項に記載の医用材料。 ５）コラーゲンおよびヘリックス含量が０〜８０％であ
   る変性コラーゲンを混合し、フィルムまたは多孔体を形
   成させた後架橋されたことを特徴とする細胞侵入性医用
   材料。 ６）架橋されたコラーゲンフィルムあるいは多孔体をヘ
   リックス含量０〜８０％である変性コラーゲン溶液で被
   覆したことを特徴とする細胞侵入性医用材料。