JPH0123061B2 - - Google Patents
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- JPH0123061B2 JPH0123061B2 JP57022907A JP2290782A JPH0123061B2 JP H0123061 B2 JPH0123061 B2 JP H0123061B2 JP 57022907 A JP57022907 A JP 57022907A JP 2290782 A JP2290782 A JP 2290782A JP H0123061 B2 JPH0123061 B2 JP H0123061B2
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- C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
- C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
- C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
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- C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
- C07D311/82—Xanthenes
-
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- C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
- C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
- C07D473/04—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two oxygen atoms
- C07D473/06—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two oxygen atoms with radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached in position 1 or 3
- C07D473/08—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two oxygen atoms with radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached in position 1 or 3 with methyl radicals in positions 1 and 3, e.g. theophylline
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
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Description
本発明は生物学的液体例えば血清、血漿、脊髄
液、羊水および尿中のリガンドを測定する方法お
よび試薬に関する。特に、本発明は螢光偏光免疫
定量法操作およびこの操作に試薬として使用され
るトレーサーに関する。本発明の螢光偏光免疫定
量法操作は免疫定量法の特異性と螢光偏光技術の
速度および便利さを組合せて試料中に存在する特
異的リガンドの量を測定する手段を提供するもの
である。 リガンドを測定するための競争結合免疫定量法
は供試試料中のリガンドとトレーサーと称される
標識試薬との間でのリガンドおよびトレーサーに
特異的な抗体上の限られた数のレセプター結合部
位についての競争を基とするものである。 一般に、螢光偏光技術は、螢光性の標識化合物
が直線状に偏光された光で励起されるとその回転
速度と逆の関係にある偏光の度合を有する螢光を
発するという原理に基くものである。従つて、分
子例えば螢光性標識を有するトレーサー―抗体接
合体が直線状に偏光された光で励起されると、発
光された光は極めて偏光されたままである。それ
は螢光団が光が吸収される時点と発光される時点
との間で回転することから拘束されるからであ
る。「遊離」（free）のトレーサー化合物（すなわ
ち、抗体に結合されていない）が直線状に偏光さ
れた光によつて励起された場合、その回転は相当
するトレーサー―抗体接合体よりも一層速くな
り、それ故に分子が一層ランダム配列され、従つ
て発光された光が減偏光される。すなわち、螢光
偏光により、競争結合免疫定量法で生成されるト
レーサー―抗体接合体の量を測定する定量的手段
が提供される。 種々の螢光性標識化合物が技術分野で知られて
いる。米国特許第3998943号には螢光性標識とし
てフルオレセインイソチオシアネート（FITC）
を用いる螢光標識されたインシユリン誘導体およ
び螢光性標識として４―アミノフルオレセイン塩
酸塩を用いる螢光標識されたモルフイン誘導体の
製造が記載されている。カルボキシフルオレセイ
ンもまた分折測定に使用されている。アナル・レ
ト（Anal.Lett）、第10巻、第787頁（1977年）に
R.F.チエン（Chen）がホスホリパーゼの活性を
指示するのにカルボキシフルオレセインを使用す
ることを報告している。しかしながら、カルボキ
シフルオレセインは本発明によれば接合しない。
このものはレシチンリポソームに包接され、レシ
チンの加水分解により遊離された場合のみに螢光
を生じる。 本発明は、試料を式 （式中Ｒはカルボキシフルオレセインのカルボ
ニル炭素に結合している単独の反応性第一または
第二アミノ基を有する分子量50〜4000のリガンド
―類似体であり、而してこのリガンド―類似体は
該リガンドと少くとも１種の共通エピトープを有
して共通抗体により特異的に認識されるようにさ
れている）を有するトレーサーの生物学的に許容
し得る塩および前記リガンドおよび前記トレーサ
ーを特異的に認識し得る抗体と混合し、そして次
に試料中の前記リガンドの濃度の標準として螢光
偏光技術によりトレーサー抗体接合体の量を測定
することを特徴とする試料中のリガンドを測定す
る方法を提供するものである。 更に、本発明は上記の方法での試薬に有用なあ
る種の新規なトレーサーおよびその生物学的に許
容し得る塩に関する。本発明の方法およびトレー
サーは血清および血漿中の治療薬物の濃度を定量
的にモニターするのに特に有用である。 本文で使用される「リガンド」（ligand）なる
用語は、レセプター、通常抗体、が得られるかま
たは形成され得る単独反応性アミノ基を有する分
子、特に低分子量ハプテンを称するものである。
このようなハプテンは一般には低分子量の蛋白質
を含まない母体（動物に注射すると抗体形成を誘
起しないが抗体に対して反応性である）である。
ハプテンに対する抗体は一般にはまずハプテンを
蛋白質に接合させそして接合体生成物を動物に注
射することにより生産される。得られた抗体を通
常の抗体単離技術で単離する。 本発明の方法により測定し得るリガンドは広範
囲な分子量範囲にわたつて変化する。高分子量の
リガンドも測定し得るが、最良の結果を得るには
本発明の方法を低分子量一般に50〜4000の範囲の
リガンドを測定するのに使用するのが一般には好
適である。100〜2000の範囲の分子量を有するリ
ガンドを測定するのが一層好ましい。 本発明の新規なトレーサーは、Ｒで示されるリ
ガンド―類似体が50〜4000の範囲内の分子量を有
する式（）の化合物を包含している。好ましい
新規なトレーサーは、Ｒで示されるリガンド―類
似体が100〜2000の範囲内の分子量を有する基を
包含する式（）の化合物を包含している。 本発明の方法によつて測定可能な単独反応性ア
ミノ基を有するリガンドの代表例にはステロイド
例えばエステロン、エストラジオール、コルチゾ
ル、テストエストロン、プロゲステロン、ヘノデ
オキシコール酸、ジゴキシン、コール酸、ジギト
キシン、デオキシコール酸、リトコール酸ならび
にこれらのエステルおよびアミド誘導体；ビタミ
ン例えばＢ―12、葉酸；チロキシン、トリヨード
チロキシン、ヒスタミン、セロトニン、プロスタ
グランデイン例えばPGE、PGF、PGA；抗喘息
剤例えばテオフイリン、制ガン剤例えばドキソル
ビシンおよびメソトレキセート、抗不整脈剤例え
ばジイソピラミド、リドカイン、プロカインアミ
ド、プロパノロール、キニジン、Ｎ―アセチル―
プロカインアミド；抗けいれん剤例えばフエノバ
ルビタール、フエニトイン、ピリミドン、バルプ
ロン酸、カルバムアゼピン、およびエトスクシイ
ミド；抗生物質例えばペニシリン、セフアロスポ
リンおよびバンコマイシン；抗関節剤例えばサリ
シレート；三環系を包含する抗うつ剤例えばノル
トリプチリン、アミノトリプチリン、イミプラミ
ンおよびデシプラミン等ならびにこれらの代謝産
物が包含される。本発明の方法により測定し得る
その他のリガンドには濫用性薬物例えばモルヒ
ネ、ヘロイン、ヒドロモルホン、オキシモルホ
ン、メタポン、コデイン、ヒドロコドン、ジヒド
ロコデイン、ジヒドロヒドロキシコデイン、ホル
コデイン、デキストロメトルフアン、フエナゾシ
ンおよびデオニンならびにこれらの代謝産物が包
含される。 本発明のトレーサーは一般にはその酸とイオン
化された状態との間の平衡で存在し、そしてイオ
ン化された状態で本発明の方法において有効であ
る。従つて、本発明は酸またはイオン化された状
態のトレーサーを包含し、そして便宜上、本発明
のトレーサーは本文中においてそれらの酸形態で
構造上表わされる。本発明のトレーサーがそのイ
オン化された状態で存在する場合、トレーサーは
生物学的に許容し得る塩の形態で存在する。本文
で使用される「生物学的に許容し得る塩」なる用
語は塩例えばナトリウム、カリウム、アンモニウ
ムおよび本発明の方法に使用する場合に本発明の
トレーサーをそのイオン化された状態で存在させ
得る類似物を称する。一般には、本発明のトレー
サーは溶液中で塩として存在し、特定の塩は使用
した緩衝剤から生じる。すなわち、りん酸ナトリ
ウム緩衝剤の存在下では本発明のトレーサーは一
般にはナトリウム塩としてそのイオン化された状
態で存在する。 本発明のトレーサーは次の式のカルボキシフル
オレセインに結合したＲで表わされるリガンド―
類似体を包含している。 本文で使用される「リガンド―類似体」なる用
語は、その実質的な割合がレゼプターの結合部位
についてリガンドと競争し得る決定基またはエピ
トープ部位を１個またはそれ以上を定めるのにリ
ガンドと同一の空間および極性機構を有する一価
または多価の基を称する。このリガンド―類似体
の特徴は、それがリガンドについての抗体により
認識されるように問題のリガンドと十分な構造類
似性を有することである。たいていの場合、リガ
ンド―類似体は、分子表面の重要な部分について
問題のリガンドと同一または実質的に同一の構造
および電荷分布（空間および極性機構）を有して
いる。往々にしてハプテンのための結合部位はリ
ガンドに結合するのに使用するものと抗体生産の
ための抗原の調製において同じであるので、抗体
のための鋳型を提供するリガンド―類似体の同一
部分がトレーサー中のリガンド―類似体により曝
される。 一般に、Ｒで示されるリガンド―類似体の組は
相当するリガンドから反応性水素原子、すなわち
反応性アミン（第一または第二）に結合している
水素原子の除去により、またはカルボキシフルオ
レセイン部分に結合する部位においてイミノ基
液、羊水および尿中のリガンドを測定する方法お
よび試薬に関する。特に、本発明は螢光偏光免疫
定量法操作およびこの操作に試薬として使用され
るトレーサーに関する。本発明の螢光偏光免疫定
量法操作は免疫定量法の特異性と螢光偏光技術の
速度および便利さを組合せて試料中に存在する特
異的リガンドの量を測定する手段を提供するもの
である。 リガンドを測定するための競争結合免疫定量法
は供試試料中のリガンドとトレーサーと称される
標識試薬との間でのリガンドおよびトレーサーに
特異的な抗体上の限られた数のレセプター結合部
位についての競争を基とするものである。 一般に、螢光偏光技術は、螢光性の標識化合物
が直線状に偏光された光で励起されるとその回転
速度と逆の関係にある偏光の度合を有する螢光を
発するという原理に基くものである。従つて、分
子例えば螢光性標識を有するトレーサー―抗体接
合体が直線状に偏光された光で励起されると、発
光された光は極めて偏光されたままである。それ
は螢光団が光が吸収される時点と発光される時点
との間で回転することから拘束されるからであ
る。「遊離」（free）のトレーサー化合物（すなわ
ち、抗体に結合されていない）が直線状に偏光さ
れた光によつて励起された場合、その回転は相当
するトレーサー―抗体接合体よりも一層速くな
り、それ故に分子が一層ランダム配列され、従つ
て発光された光が減偏光される。すなわち、螢光
偏光により、競争結合免疫定量法で生成されるト
レーサー―抗体接合体の量を測定する定量的手段
が提供される。 種々の螢光性標識化合物が技術分野で知られて
いる。米国特許第3998943号には螢光性標識とし
てフルオレセインイソチオシアネート（FITC）
を用いる螢光標識されたインシユリン誘導体およ
び螢光性標識として４―アミノフルオレセイン塩
酸塩を用いる螢光標識されたモルフイン誘導体の
製造が記載されている。カルボキシフルオレセイ
ンもまた分折測定に使用されている。アナル・レ
ト（Anal.Lett）、第10巻、第787頁（1977年）に
R.F.チエン（Chen）がホスホリパーゼの活性を
指示するのにカルボキシフルオレセインを使用す
ることを報告している。しかしながら、カルボキ
シフルオレセインは本発明によれば接合しない。
このものはレシチンリポソームに包接され、レシ
チンの加水分解により遊離された場合のみに螢光
を生じる。 本発明は、試料を式 （式中Ｒはカルボキシフルオレセインのカルボ
ニル炭素に結合している単独の反応性第一または
第二アミノ基を有する分子量50〜4000のリガンド
―類似体であり、而してこのリガンド―類似体は
該リガンドと少くとも１種の共通エピトープを有
して共通抗体により特異的に認識されるようにさ
れている）を有するトレーサーの生物学的に許容
し得る塩および前記リガンドおよび前記トレーサ
ーを特異的に認識し得る抗体と混合し、そして次
に試料中の前記リガンドの濃度の標準として螢光
偏光技術によりトレーサー抗体接合体の量を測定
することを特徴とする試料中のリガンドを測定す
る方法を提供するものである。 更に、本発明は上記の方法での試薬に有用なあ
る種の新規なトレーサーおよびその生物学的に許
容し得る塩に関する。本発明の方法およびトレー
サーは血清および血漿中の治療薬物の濃度を定量
的にモニターするのに特に有用である。 本文で使用される「リガンド」（ligand）なる
用語は、レセプター、通常抗体、が得られるかま
たは形成され得る単独反応性アミノ基を有する分
子、特に低分子量ハプテンを称するものである。
このようなハプテンは一般には低分子量の蛋白質
を含まない母体（動物に注射すると抗体形成を誘
起しないが抗体に対して反応性である）である。
ハプテンに対する抗体は一般にはまずハプテンを
蛋白質に接合させそして接合体生成物を動物に注
射することにより生産される。得られた抗体を通
常の抗体単離技術で単離する。 本発明の方法により測定し得るリガンドは広範
囲な分子量範囲にわたつて変化する。高分子量の
リガンドも測定し得るが、最良の結果を得るには
本発明の方法を低分子量一般に50〜4000の範囲の
リガンドを測定するのに使用するのが一般には好
適である。100〜2000の範囲の分子量を有するリ
ガンドを測定するのが一層好ましい。 本発明の新規なトレーサーは、Ｒで示されるリ
ガンド―類似体が50〜4000の範囲内の分子量を有
する式（）の化合物を包含している。好ましい
新規なトレーサーは、Ｒで示されるリガンド―類
似体が100〜2000の範囲内の分子量を有する基を
包含する式（）の化合物を包含している。 本発明の方法によつて測定可能な単独反応性ア
ミノ基を有するリガンドの代表例にはステロイド
例えばエステロン、エストラジオール、コルチゾ
ル、テストエストロン、プロゲステロン、ヘノデ
オキシコール酸、ジゴキシン、コール酸、ジギト
キシン、デオキシコール酸、リトコール酸ならび
にこれらのエステルおよびアミド誘導体；ビタミ
ン例えばＢ―12、葉酸；チロキシン、トリヨード
チロキシン、ヒスタミン、セロトニン、プロスタ
グランデイン例えばPGE、PGF、PGA；抗喘息
剤例えばテオフイリン、制ガン剤例えばドキソル
ビシンおよびメソトレキセート、抗不整脈剤例え
ばジイソピラミド、リドカイン、プロカインアミ
ド、プロパノロール、キニジン、Ｎ―アセチル―
プロカインアミド；抗けいれん剤例えばフエノバ
ルビタール、フエニトイン、ピリミドン、バルプ
ロン酸、カルバムアゼピン、およびエトスクシイ
ミド；抗生物質例えばペニシリン、セフアロスポ
リンおよびバンコマイシン；抗関節剤例えばサリ
シレート；三環系を包含する抗うつ剤例えばノル
トリプチリン、アミノトリプチリン、イミプラミ
ンおよびデシプラミン等ならびにこれらの代謝産
物が包含される。本発明の方法により測定し得る
その他のリガンドには濫用性薬物例えばモルヒ
ネ、ヘロイン、ヒドロモルホン、オキシモルホ
ン、メタポン、コデイン、ヒドロコドン、ジヒド
ロコデイン、ジヒドロヒドロキシコデイン、ホル
コデイン、デキストロメトルフアン、フエナゾシ
ンおよびデオニンならびにこれらの代謝産物が包
含される。 本発明のトレーサーは一般にはその酸とイオン
化された状態との間の平衡で存在し、そしてイオ
ン化された状態で本発明の方法において有効であ
る。従つて、本発明は酸またはイオン化された状
態のトレーサーを包含し、そして便宜上、本発明
のトレーサーは本文中においてそれらの酸形態で
構造上表わされる。本発明のトレーサーがそのイ
オン化された状態で存在する場合、トレーサーは
生物学的に許容し得る塩の形態で存在する。本文
で使用される「生物学的に許容し得る塩」なる用
語は塩例えばナトリウム、カリウム、アンモニウ
ムおよび本発明の方法に使用する場合に本発明の
トレーサーをそのイオン化された状態で存在させ
得る類似物を称する。一般には、本発明のトレー
サーは溶液中で塩として存在し、特定の塩は使用
した緩衝剤から生じる。すなわち、りん酸ナトリ
ウム緩衝剤の存在下では本発明のトレーサーは一
般にはナトリウム塩としてそのイオン化された状
態で存在する。 本発明のトレーサーは次の式のカルボキシフル
オレセインに結合したＲで表わされるリガンド―
類似体を包含している。 本文で使用される「リガンド―類似体」なる用
語は、その実質的な割合がレゼプターの結合部位
についてリガンドと競争し得る決定基またはエピ
トープ部位を１個またはそれ以上を定めるのにリ
ガンドと同一の空間および極性機構を有する一価
または多価の基を称する。このリガンド―類似体
の特徴は、それがリガンドについての抗体により
認識されるように問題のリガンドと十分な構造類
似性を有することである。たいていの場合、リガ
ンド―類似体は、分子表面の重要な部分について
問題のリガンドと同一または実質的に同一の構造
および電荷分布（空間および極性機構）を有して
いる。往々にしてハプテンのための結合部位はリ
ガンドに結合するのに使用するものと抗体生産の
ための抗原の調製において同じであるので、抗体
のための鋳型を提供するリガンド―類似体の同一
部分がトレーサー中のリガンド―類似体により曝
される。 一般に、Ｒで示されるリガンド―類似体の組は
相当するリガンドから反応性水素原子、すなわち
反応性アミン（第一または第二）に結合している
水素原子の除去により、またはカルボキシフルオ
レセイン部分に結合する部位においてイミノ基
【式】がリガンド中に当初存在する１個またはそ
れ以上の原子を置換しているリガンドのアミノ誘
導体を形成させることにより誘導される。反応性
水素の除去によりＲで表わされるリガンド―類似
体を形成し得るリガンドの具体例には例えばプロ
カインアミド、チロキシンおよびキニジンが包含
される。アミノ誘導体がリガンド―類似体として
有用であるリガンドの具体例にはテオフイリン、
バルプロン酸、フエノバルビタール、フエニトイ
ン、プリミドン、ジイソピラミド、ジゴキシン、
クロラムフエニコール、サリシレート、アセトア
ミノフエノン、カルバムアゼピン、デシプラミン
およびノルトリプチリンが包含される。更に、リ
ガンドは、抗体と結合するために必要なエピトー
プ部位を保持しながら、官能基の１個またはそれ
以上の付加または除去により構造上変形してリガ
ンド―類似体を形成させることもできる。しか
し、このような変形されたリガンド―類似体はイ
ミノ基を経てカルボキシフルオレセインに結合さ
れる。 本発明のトレーサーは一般には既知の技術に従
つて製造される。例えば、式 Ｒ―Ｘ （） （式中Ｒは先の定義のとおりであり、そしてＸ
は反応性水素である）を有する化合物を式 （式中Ｚは水酸基または活性エステルであり、
そしてカルボキシ基が好ましくは安息香酸環の４
―または５―位に結合している）を有する化合物
で不活性溶媒の存在下に処理して式（）の化合
物を生成させる。 本文で使用される「活性エステル」なる用語
は、カツプリング剤の存在下にカルボキシ炭素か
ら容易に「除去される」部分を称する。このよう
なカルボキシフルオレセインの「活性エステル」
は当業者により容易に確かめられ、カルボキシフ
ルオレセインと化合物例えばＮ―ヒドロキシ―ス
クシンイミド、１―ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル・水和物またはｐ―ニトロフエノールとをカツ
プリング剤例えばジシクロヘキシルカルボジイミ
ドおよび溶媒の存在下で反応させることによつて
製造される。このようにして得られたカルボキシ
フルオレセインの活性エステルを次に式（）の
化合物と反応させて式（）のトレーサーを得
る。 式（）の化合物が水溶性であるときは、反応
メカニズムは水溶液中でカルボキシフルオレセイ
ンと式（）の化合物とのカツプリング剤として
水溶性カルボジイミド例えば１―エチル―３―
（3′―ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
の存在下での直接反応により進行する。 本発明のトレーサーの製造方法が進行する温度
は限定がない。温度は反応を開始し、維持するの
に十分なものでなければならない。一般に、便宜
上また経済上、室温で十分である。本発明のトレ
ーサーを製造するに当り、反応剤の比は厳密には
臨界的ではない。式（）の化合物の各モルにつ
き、式（）の化合物１モルを用いて妥当な収率
が得られる筈である。反応の容易さおよび反応生
成物の採取のためには式（）の化合物を過剰に
用いるのが好ましい。 生成物の取扱いおよび採取を容易ならしめるた
めに、本発明のトレーサーの製造方法を不活性溶
媒の存在下に実施する。適当な不活性溶媒には出
発物質と反応することなく、また出発物質を溶解
するのに十分な溶媒が包含され、例えば水（式
（）の化合物が水溶性である場合）、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキサイド等が包含さ
れる。式（）の化合物が反応性アミン塩である
場合、適当な塩基を反応混合物に加えて反応性ア
ミンの遊離塩基を形成させる。適当な塩基には例
えばトリエチルアミンが包含される。式（）の
反応生成物は一般には本発明の方法に適用する前
に薄層もしくはカラムクロマトグラフイーを用い
て精製する。 本発明の方法によれば、測定すべきリガンドを
含む試料を式（）のトレーサーの生物学的に許
容し得る塩およびリガンドとトレーサーに対して
特異的である抗体と混合する。試料中に存在する
リガンドおよびトレーサーが抗体部位を限定する
べく競争し、結果としてリガンド―抗体およびト
レーサー―抗体複合体が生じる。トレーサーおよ
び抗体の濃度を一定に保つことにより、形成され
るリガンド―抗体複合体対トレーサー―抗体複合
体の比は試料中に存在するリガンドの量に正比例
する。従つて、混合物を偏光で励起し、トレーサ
ーおよびトレーサー―抗体複合体により発光され
る螢光の偏光を測定することにより、試料中のリ
ガンドの量を定量的に測定することが可能であ
る。 理論では、抗体に複合されていないトレーサー
の螢光偏光は低く、零に近い。特異的な抗体と複
合すると、このようにして形成されたトレーサー
―抗体複合体は、比較的小さいトレーサー分子よ
りも遅い抗体分子の回転をとり、それにより観察
される偏光を増大する。従つて、リガンドが抗体
部位についてトレーサーと競争すると、トレーサ
ー―抗体複合体の螢光の観察される偏光はトレー
サーの偏光とトレーサー―抗体複合体の偏光との
間のどこかの値となる。試料がリガンドを高濃度
で含有しているときは、観察される偏光値は遊離
リガンドの値により接近、すなわち低くなる。供
試試料がリガンドを低濃度で含有しているとき
は、偏光値は結合リガンドの値により接近、すな
わち高くなる。免疫定量法の反応混合物を垂直次
いで水平に偏光された光で順次励起し、そして発
光された光の垂直成分のみを解折することによ
り、反応混合物中の螢光の偏光を正確に測定する
ことができる。偏光と測定すべきリガンドの濃度
との正確な関係は既知の濃度をもつキヤリブレー
ターの偏光値を測定することによつて確定され
る。リガンドの濃度はこのようにして作製された
標準曲線から外挿することができる。 本発明の方法を実施するPHは式（）のトレー
サーをそのイオン化された状態で存在させるのに
十分なものでなければならない。PHは約３〜12の
範囲、更に通常では約５〜10の範囲、最も好まし
くは約６〜９であり得る。種々の緩衝剤を分折操
作中PHを達成し、維持するのに使用し得る。使用
される代表的な緩衝剤にはホウ酸塩、りん酸塩、
炭酸塩、トリス、バルビタール等が包含される。
使用される特別な緩衝剤は本発明にとつて限定的
なものではないが、個々の分折において使用され
る抗体および測定すべきリガンドに鑑み特別な緩
衝剤が好ましいこともある。緩衝剤の陽イオン部
分は一般に溶液中のトレーサー塩の陽イオン部分
を定める。 本発明の方法は適度の温度、好ましくは一定の
温度で実施される。温度は通常約０〜50℃、更に
普通には約15〜40℃の範囲にある。 分折し得るリガンドの濃度は一般に約10-2〜
10-13M、更に普通には約10-4〜10-10Mに変り得
る。より高い濃度のリガンドは当初の試料を希釈
して分折することができる。 問題のリガンドの濃度範囲に加えて、例えば分
折が定性的、半定量的または定量的であるか否
か、使用する装置、ならびにトレーサーおよび抗
体の特徴を考慮して使用すべきトレーサーおよび
抗体の濃度を普通定める。試料中のリガンドの濃
度は他の試薬、すなわちトレーサーおよび抗体の
濃度範囲を定めて普通分折の感度を最適とする
が、個々の試薬濃度は経験則で定められる。トレ
ーサーおよび抗体の濃度は当業者により容易に確
かめられる。 前述の如く、本発明の好ましいトレーサーは５
―カルボキシフルオレセインもしくは４―カルボ
キシフルオレセインまたはこれらの混合物から製
造され、次の式で表わされる。 以下の例示的で限定を企図しない実施例は本発
明の範囲内の特別のトレーサーを製造し得る方法
を当業者に更に例示するのに役立つものである。
以下の実施例で製造される化合物を具体的に示す
構造式に出てくる記号〔CF〕は次の式の部分を
示す。 （式中、出発物質として４―および５―カルボ
キシフルオレセインの混合物が使用される事実に
鑑み、カルボニル炭素は上記式中４―または５―
位に結合している）。 実施例 ｍ―またはｐ―アミノフエノバルビタール（５
mg）およびカルボキシフルオレセイン（５mg）を
ピリジン0.5mlに溶解した。混合物にＮ，N′―ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（15mg）を加え
た。反応を室温で２時間進行させ、その後反応生
成物を展開溶媒としてクロロホルム：メタノール
（２：１）混合物を用いてシリカゲル薄層クロマ
トグラフイーにより２回精製すると次の式を有す
るアミノフエノバルビタール―カルボキシフルオ
レセイン接合体が得られた。 実施例 100％エタノール100ml中の水酸化ナトリウム
（1.0ｇ）、フエニトイン（2.5ｇ）および２―ブロ
モメチルアミン臭化水素酸塩（2.0ｇ）を含む溶
液を２時間還流させ、次に減圧下に蒸発乾涸させ
た。残渣を水50mlに懸濁させ、そして6N水酸化
ナトリウムを加えてPHをPH11に調節して未反応の
フエニトインを溶解した。残留沈殿、２―β―ア
ミノエチルフエニトインを過し、水で十分に洗
滌し、そして乾燥した。 カルボキシフルオレセインの活性エステルを、
ピリジン0.5ml中にＮ―ヒドロキシスクシンイミ
ド（５mg）、カルボキシフルオレセイン（7.5mg）
およびＮ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（20mg）を溶解することにより製造した。反応
を室温で２時間進行させ、その後２―β―アミノ
エチルフエニトイン（10mg）を反応混合物に溶解
した。得られた混合物を室温、暗所で一夜反応さ
せ、その後反応生成物を展開溶媒としてクロロホ
ルム：メタノール（３：１）混合物を用いるシリ
カゲル薄層クロマトグラフイーにより２回精製す
ると次の式を有する２―β―アミノエチルフエニ
トイン―カルボキシフルオレセイン接合体が得ら
れた。 実施例 乾燥ジメチルスルホキサイド６ml中の２―カル
ボキシメチルフエニトイン（620mg）、Ｎ―ヒドロ
キシスクシンイミド（248mg）およびＮ，N′―ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（453mg）を含む
溶液を一夜室温で放置した。混合物を過し、ヒ
ドロジン（95％）0.7mlを液4.5に加えた。室温
で４時間後に水40mlおよび10％水酸化ナトリウム
0.5mlを反応混合物に加えた。沈殿２―カルボキ
シメチルフエニトインヒドラジドを過し、水で
洗滌し、乾燥しそして更に精製することなく使用
した。 Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド
（15mg）をピリジン0.5ml中の２―カルボキシメチ
ルフエニトインヒドラジン（５mg）およびカルボ
キシフルオレセイン（５mg）の溶液に加えた。反
応を室温で２時間進行させ、そして次に反応生成
物を展開溶媒としてクロロホルム：アセトン
（１：１）混合物を用いるシリカゲル薄層クロマ
トグラフイーにより２回精製して次の式を有する
２―カルボキシメチルフエニトインヒドラジド―
カルボキシフルオレセイン接合体を得た。 実施例 Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド
（15mg）をピリジン0.5ml中の８―β―アミノエチ
ルチオフイリン（５mg）およびカルボキシフルオ
レセイン（５mg）の溶液に加えた。反応を室温で
２時間進行させ、そして反応生成物を展開溶媒と
してクロロホルム：メタノール（２：１）混合物
を用いるシリカゲル薄層クロマトグラフイーによ
り２回精製して次の式を有する８―β―アミノエ
チルテオフイリン―カルボキシフルオレセイン接
合体を得た。 実施例 ８―β―アミノエチルテオフイリンの代りに８
―アミノメチルテオフイリンを用いて実施例の
操作を使用すると次の式を有する８―アミノメチ
ルテオフイリン―カルボキシフルオレセイン接合
体が得られた。 実施例 δ―バレロラクタム（7.5ｇ）を乾燥窒素雰囲
気下に乾燥テトラヒドロフラン60mlに溶解し、そ
してヘキサン中のｎ―ブチルリチウム（1.6M、
90ml）を反応フラスコに滴加し、乾燥氷―アセト
ン浴で冷却した。ｎ―ブチルリチウムの添加完了
後、反応混合物を１時間室温でかくはんし、30分
間還流させ、そして乾燥窒素雰囲気下に室温に冷
却した。１―ブロモエタン（8.0ｇ）をフラスコ
を氷浴で冷却しながら反応フラスコにゆつくり加
えた。得られた混合物を次に室温で16時間かくは
んし、その後水100mlをゆつくり加えた。得られ
た混合物を室温で30分間かくはんし、有機層を分
離した。水層をジエチルエーテル50mlで抽出し、
そして有機層を合し、硫酸ナトリウムで乾燥し
た。溶媒を蒸発させると暗色の油が得られ、この
ものは放置すると結晶化した。結晶性残渣を石油
エーテルから再結晶すると残渣3.8ｇが得られた。
残渣（2.8ｇ）を６時間6N塩酸25ml中で還流し
た。水を混合物から蒸発させると暗色の濃厚な油
―２―エチル―５―アミノペンタン酸―が得ら
れ、このものを更に精製することなく使用した。 カルボキシフルオレセインの活性エステルをピ
リジン0.5mlにＮ―ヒドロキシスクシンイミド
（５mg）、カルボキシフルオレセイン（7.5mg）お
よびＮ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド
（20mg）に溶解することにより製造した。反応を
室温で２時間進行させ、その後２―エチル―５―
アミノペンタン酸（20mg）を反応混合物に溶解し
た。得られた混合物を室温、暗所で一夜反応さ
せ、そして反応生成物を展開溶媒としてクロロホ
ルム：メタノール（３：１）混合物を用いるシリ
カゲル薄層クロマトグラフイーにより２回精製す
ると次の式を有する２―エチル―５―アミノペン
タン酸―カルボキシフルオレセイン接合体が得ら
れた。 実施例 カルボキシフルオロセインの活性エステルをピ
リジン0.5mlにＮ―ヒドロキシスクシンイミド
（５mg）、カルボキシフルオロセイン（7.5mg）お
よびＮ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド
（20mg）を溶解することにより製造した。反応を
室温で２時間進行させ、その後５―（γ―アミノ
プロピリデン）―5H―ジベンゾ〔ａ，ｄ）―10，
11―ジヒドロシクロヘプテン（20mg）を反応混合
物に溶解した。得られた混合物を室温、暗所で一
夜反応させ、そして反応生成物を展開溶媒として
クロロホルム：メタノール（３：１）混合物を用
いるシリカゲル薄層クロマトグラフイーにより２
回精製すると次の式を有する５―（γ―アミノプ
ロピリデン）―5H―ジベンゾ〔ａ，ｄ〕―10，
11―ジヒドロシクロペンテン―カルボキシフルオ
ロセイン接合体が得られた。 実施例 クロロホルム25ml中のデシプラミン塩酸塩
（1.33ｇ）およびクロロアセチルクロライド（0.8
ｇ）を含む溶液を２時間還流させた。クロロホル
ムを蒸発させ、残渣をアセトン25mlに溶解した。
ヨウ化ナトリウム（0.75ｇ）をアセトン溶液に加
え、そして溶液を30分間還流させた。溶液を過
し、沈殿した塩をアセトンで洗滌した。アセトン
液を蒸発させ、そして残渣をメタノール20mlに
とつた。濃水酸化アンモニウム（20ml）をメタノ
ール溶液に加え、得られた溶液を１時間還流させ
た。反応混合物をクロロホルム25mlで３回抽出
し、そして合した抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥
し、過し、そして蒸発するとＮ―アミノアセチ
ルデシプラミンが得られ、このものを更に精製す
ることなく使用した。 Ｎ―アセチルデシプラミン（５mg）およびカル
ボキシフルオレセイン（５mg）をピリジン0.5ml
に溶解した。混合物にＮ，N′―ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（15mg）を加えた。反応を室温
で２時間進行させ、その後反応生成物を展開溶媒
としてクロロホルム：アセトン（１：１）混合物
を用いるシリカゲル薄層クロマトグラフイーによ
り２回精製して次の式を有するＮ―アミノアセチ
ルデシプラミン―カルボキシフルオレセイン接合
体を得た。 実施例 ピリジン１ml中のＮ―ヒドロキシスクシンイミ
ド（５mg）、カルボキシフルオレセイン（7.5mg）
およびＮ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（20mg）を含む溶液を室温で４時間反応させ
た。カルボキシフルオレセインの活性エステルは
反応混合物にジエチルエーテル10mlを加えること
により沈殿させた。沈殿を過し、ジエチルエー
テルでよく洗滌し、そしてジメチルスルホキサイ
ド0.5mlに再溶解した。次に、Ｌ―チロキシン
（10mg）を溶液に加え、反応を室温で２時間進行
させ、その後反応生成物を展開溶媒としてクロロ
ホルム：メタノール（３：１）混合物を用いてシ
リカゲル薄層クロマトグラフイーにより２回精製
して次の式を有するＬ―チロキシン―カルボキシ
フルオロセイン接合体を得た。 実施例 メタノール５ml中酢酸アンモニウム（0.89ｇ）、
３―オキソジゴキシゲニン（389mg）およびシア
ノホウ水素化ナトリウム（63mg）を含む溶液を48
時間室温でかくはんした。溶液を濃塩酸を加えて
PH１に調節し、減圧で蒸発乾涸した。残渣を水10
mlにとり、クロロホルム10mlで３回抽出した。水
層を固形水酸化カリウムを用いてPH11に調節し
た。得られた溶液をメチレンクロライド10mlで５
回抽出した。有機層を合し、乾燥しそして減圧で
蒸発乾涸させると３―アミノ―３―デオキシジゴ
キシゲニンが得られ、このものを更に精製するこ
となく使用した。 カルボキシフルオロセインの活性エステルをピ
リジン05mlにＮ―ヒドロキシスクシンイミド（５
mg）、カルボキシフルオロセイン（7.5mg）および
Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド（20
mg）を溶解することにより製造した。反応を室温
で２時間反応させ、その後次の式を有する３―ア
ミノ―３―デオキシジゴキシゲニン―カルボキシ
フルオレセイン接合体を単離した。 上記の操作に従つて以下のトレーサーも製造さ
れた。 実施例 XI Ｏ―アミノアセチル―プロプラノロール―カル
ボキシフルオレセイン接合体 実施例 XII ２―プロピル―５―アミノペンタン酸―カルボ
キシフルオレセイン接合体 実施例 ２―ブチル―５―アミノ―ペンタン酸―カルボ
キシフルオレセイン接合体 実施例 アミノプリミドン―カルボキシフルオロセイン
接合体 実施例 １―（4′―ニトロフエニル）―１―ヒドロキシ
―２―アミノ―３―ヒドロキシプロパン―カル
ボキシフルオレセイン接合体 実施例 ｐ―アミノフエノール―カルボキシフルオレセ
イン接合体 実施例 Ｎ―（２―アミノエチル）―エトスクシミド―
カルボキシフルオレセイン接合体 実施例 N′―デスエチル―Ｎ―アセチル―プロカイン
アミド―カルボキシフルオレセイン接合体 実施例 N′―デスエチル―N′―アミノアセチル―Ｎ―
アセチル―プロカインアミド―カルボキシフル
オレセイン接合体 実施例 １―アミノ―２―フエニル―２―（2′―ピリジ
ル）―４―（ジイソプロピルアミノ）―ブタン
―カルボキシフルオレセイン接合体 実施例 XI ３，3′，5′―トリヨード―Ｌ―チロニン―カル
ボキシフルオレセイン接合体 実施例 XII ３，3′，５，5′―テトラヨード―Ｄ―チロニン
―カルボキシフルオレセイン接合体 実施例 Ｎ―アミノアセチル―イミノジベンジルカルボ
キシフルオレセイン接合体 実施例 カルブヒドラジノイミノ―ジベンジルカルボキ
シフルオレセイン接合体 実施例 ジベンゾスベロンヒドラゾンフルオレセイン接
合体 実施例 ５―アミノ―10，11―ジヒドロ―5H―ジベン
ゾ〔ａ，ｄ〕―シクロヘプテン 前述の如く、本発明のトレーサーは螢光偏光免
疫定量法に使用するのに有効な試薬である。以下
の実施例は螢光偏光技術を使用する免疫定量法で
の本発明のトレーサーの適合性を具体的に説明す
るものである。この検定法は次の一般操作に従つ
て実施される。 １ 標準または供試血清の測定量を試験管に分配
し、緩衝剤で希釈する； ２ 任意に界面活性剤を含有する本発明のトレー
サー（濃度既知）を各試験管に加える； ３ 濃度既知の抗血清を試験管に加える； ４ 反応混合物を室温で培養する；そして ５ 抗体に結合されたトレーサーの量を試料中の
リガンドの量の基準として螢光偏光技術により
測定する。 実施例 フエニトイン検定 Ａ 必要な材料： １ 牛γ―グロブリン0.01％およびアジ化ナト
リウム0.01％を含むりん酸ナトリウム
（0.1M、PH7.5）からなるBGG緩衝剤。 ２ ５％コール酸ナトリウムを添加したBGG
緩衝剤中に約105nMの濃度で２―β―アミ
ノエチルフエニトイン―カルボキシフルオレ
セインからなるトレーサー。 ３ 0.005％塩化ベンザルコニウムを含むBGG
緩衝剤で適切に希釈されたフエニトインに対
して高められた抗血清からなる抗血清。 ４ フエニトインを含む人血清またはその他の
生物学的流体の試料。 ５ クヴエツト、クヴエツトとして使用される
10×75mmガラス培養管。 ６ ±0.001単位の精度でもつて螢光偏光を測
定し得る螢光計。 Ｂ 検定法： １ 小量の試料（0.366μl）を、試料15μlをピ
ペツトでとり、そして希釈容器に600μlBGG
緩衝剤で希釈することにより、各クヴエツト
に入れる。次に、希釈試料15μlをクヴエツト
にピペツトでとり、次に600μlBGG緩衝剤を
ピペツトでとる。 ２ クヴエツトに40μlトレーサーおよび
1000μlBGG緩衝剤をピペツトでとることに
よりトレーサーを加える。 ３ クヴエツトに40μl抗血清次いで
1000μlBGG緩衝剤をピペツトでとることに
より抗血清を加えて反応を開始させる。 ４ 全クヴエツトの内容物をよく混和し、周囲
の温度で15分間培養する。 ５ 螢光偏光を螢光計で読み、そして標準曲線
を作図して未知のものを測定する。 Ｃ ０〜40μy／mlの間の濃度でフエニトインを
含有する一連の血清標準品の結果を以下に示
す。各濃度を二回検定し、そして平均する。 フエニトインの濃度（μy／ml） 偏光 ０ 0.222 2.5 0.196 5.0 0.178 10.0 0.154 20.0 0.132 40.0 0.110 螢光の偏光はフエニトイン濃度が増加するにつ
れて一定の方式で減少することがみられ、標準曲
線の構成と可能とする。同一の方式で処理した未
知の試料を標準曲線を参照して定量することがで
きる。これによりフエニトインの測定について２
―β―アミノエチルフエニトイン―カルボキシフ
ルオレセインの有用性が実証される。 実施例 フエノバルビタール検定 Ａ 必要な材料： １ BGG緩衝剤（フエニトイン参照） ２ 0.01％アジ化ナトリウム、0.01％牛γ―グ
ロブリン、および0.125％ドデシル硫酸ナト
リウムを含むトリスHCl緩衝剤PH7.5中約
110nMの濃度のアミノフエノバルビタール
カルボキシフルオレセインからなるトレーサ
ー。 ３ 0.005％ベンザルコニウムクロライドを含
むBGG緩衝剤中適切に希釈されたフエノバ
ルビタールに対する抗血清からなる抗血清。 ４ 人血清またはフエノバルビタールを含むそ
の他の生物学的流体。 ５ クヴエツト（フエニトイン参照） ６ 螢光計（フエニトイン参照） Ｂ 検定方式書： １ 小量の試料（0.196μl）を、試料10μlをピ
ペツトでとり、そして500μlBGG緩衝剤で希
釈容器で希釈することにより、クヴエツトに
入れる。次に、希釈された試料10μl次いで
BGG緩衝剤500μlをクヴエツトにピペツトで
とる。 ２ 各クヴエツトにトレーサー40μlおよび
BGG緩衝剤1000μlをピペツトでとることに
よりトレーサーを加える。 ３ 抗血清40μl次いでBGG緩衝剤1000μlをピ
ペツトでとることにより抗血清を加えて反応
を開始させる。 ４ 全クヴエツトの内容物をよく混和し、そし
て周囲の温度で15分間培養する。 ５ 螢光偏光を螢光計で読み、そして標準曲線
を作図して未知のものを測定する。 Ｃ ０〜80μy／mlの間の濃度でフエノバルビタ
ールを含有する一連の血清標準品の結果を以下
に示す。各濃度を二回検定しそして平均する。 フエノバルビタールの濃度（μl） 偏光 ０ 0.250 5.0 0.231 10.0 0.196 20.0 0.150 40.0 0.104 80.0 0.077 螢光の偏光はフエノバルビタール濃度が増加す
るにつれて一定の方式で減少することがみとめら
れ、標準曲線の構成を可能とする。同一の方式で
処理した未知の試料を標準曲線を参照して定量す
ることができる。これによりフエノールバルビタ
ールの測定についてアミノフエノバルビタール―
カルボキシフルオレセインの有用性が実証され
る。 実施例 テオフイリン検定 Ａ 必要な材料： １ 0.01％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する
BGG緩衝剤（フエニトイン検定参照）中
2nMの８―アミノエチルテオフイリン―カ
ルボキシフルオレセインからなるトレーサ
ー。 ２ BGG緩衝剤で適切に希釈されたテオフイ
リンに対して高められた抗血清からなる抗血
清。 ３ テオフイリンを含有する人血清またはその
他の生物学的流体の試料。 ４ クヴエツト（フエニトイン検定参照） ５ 螢光計（フエニトイン検定参照） Ｂ 検定方式書： １ 全クヴエツトにトレーサー1.0mlを入れる。 ２ 全クヴエツトに試料2.0μlを加える。 ３ 全クヴエツトに抗血清1.0mlを加える。 ４ よく混和し、そして周囲の温度で15分間培
養する。 ５ 螢光計で螢光偏光を読み、標準曲線を作図
する。 Ｃ ０〜40μy／mlの間の濃度でテオフイリンを
含有する一連の血清標準品の結果を示す。各濃
度を二回検定し、平均値を示す。 テオフイリンの濃度（μy／ml） 偏光 ０ 0.158 2.5 0.118 ５ 0.105 10 0.091 20 0.076 40 0.063 螢光の偏光はテオフイリン濃度が増加するにつ
れて一定の方式で減少することがみられ、標準曲
線の構成を可能とする。同一の方式で処理した未
知の試料は標準曲線を参照して定量することがで
き、これによりテオフイリンの測定について８―
アミノエチルテオフイリン―カルボキシフルオレ
セインの有用性が実証される。 実施例 ジゴキシン検定 Ａ 必要な材料： １ 牛γ―グロプリン0.01％およびアジ化ナトリ
ウム0.01％を含有する0.1Mりん酸ナトリウム
PH7.5からなるBGG緩衝剤。 ２ BGG緩衝剤で約2nMの濃度のジゴキシンカ
ルボキシフルオレセインからなるトレーサー。 ３ BGG緩衝剤で適切に希釈されたジゴキシン
に対して高められたウサギ抗血清からなる抗血
清。 ４ ジゴキシンを含有する人血清またはその他の
生物学的流体の試料。 ５ 沈殿試薬……５％トリクロロ酢酸（水中） ６ クヴエツト、クヴエツトとして使用される10
×75mmガラス培養管。 ７ ±0.001単位の精度でもつて螢光偏光を測定
し得る螢光計。 Ｂ 検定方式書： １ 試験管中の５％トリクロロ酢酸100μlに標準
品または未知の試料100μlを加える。試料を含
む試験管に栓をし、ふり混ぜる。 ２ トリクロロ酢酸中の標準品または試料を含む
試験管を遠心分離する。 ３ 35℃でBGG緩衝剤1.8mlおよび抗血清25μlの
試験管にトリクロロ酢酸上澄溶液150μlを加え
る。 ４ 抗血清および上澄液の入つた試験管を35℃で
６分間培養し、この時間に管の螢光偏光を測定
する。この測定が標準または未知のものの背景
となる螢光偏光である。 ５ 上澄液を抗血消に加えた後10分でトレーサー
25μlを試験管に加える。 ６ トレーサー添加後６分で標準品および試料管
の螢光偏光を測定し、そして先に測定した背景
となる螢光偏光を差引くと形成されていた抗体
―トレーサー複合体の螢光偏光が得られる。 ７ ０〜5ny／mlの間の濃度でジゴキシンを含む
一連の血清標準品の結果を以下に示す。各濃度
で４個の試料を検定し、平均した。 ジゴキシン濃度（ny／ml） 偏光 ０ 0.142 0.5 0.134 1.0 0.123 2.0 0.106 3.0 0.092 5.0 0.070 螢光の偏光はジゴキシン濃度が増加するにつれ
て一定の方式で減少することがみとめられ、標準
曲線の構成を可能とする。同一の方式で処理した
未知の試料は標準曲線を参照して定量することが
でき、これによりジゴキシンについてジゴキシン
カルボキシフルオレセインの有用性が実証され
る。 次の表には、上記の実施例で製造されたトレー
サーを使用し、上記の操作に従つて実施した種々
の螢光偏光検定を要約する。使用するトレーサー
を実施例番号で同定し、そして測定される特定の
リガンドを示す。実施例No. リガンド フエノバルビタール フエニトイン フエニトイン テオフイリン テオフイリン バルプロン酸 ノルトリプチリン；アミトリプチリ
ン イミプラミン；デシプラシン チロキシン ジゴキシン XI プロプラノロール XII バルプロン酸 バルプロン酸 プリミドン クロラムフエニコール アセトアミノフエン エトスクシイミド Ｎ―アセチルプロカインアミド Ｎ―アセチルプロカインアミド ジイソピラマイド XI トリヨードチロニン XII チロキシン イミプラミン；デシプラミン イミプラミン；デシプラミン ノルトリプチリン；アミトリプチ ノルトリプチリン；アミトリプチリ
ン 上記の結果から明らかな如く、本発明のトレー
サーは螢光偏光免疫定量法で有効な試薬である。
上記特性に加えて、本発明のトレーサーは高度の
熱安定性、高度の結合偏光、高収量を有し、かつ
製造および精製が比較的容易である。 本発明を特定の変形について記述してきたが、
その詳細は限定と解釈すべきではない。種々の均
等物、変化および変形は、本発明の精神および範
囲を逸脱することなく、なし得ることが明白であ
り、またこのような均等な態様は本発明に包含さ
れることが企図されているものと解すべきであ
る。
導体を形成させることにより誘導される。反応性
水素の除去によりＲで表わされるリガンド―類似
体を形成し得るリガンドの具体例には例えばプロ
カインアミド、チロキシンおよびキニジンが包含
される。アミノ誘導体がリガンド―類似体として
有用であるリガンドの具体例にはテオフイリン、
バルプロン酸、フエノバルビタール、フエニトイ
ン、プリミドン、ジイソピラミド、ジゴキシン、
クロラムフエニコール、サリシレート、アセトア
ミノフエノン、カルバムアゼピン、デシプラミン
およびノルトリプチリンが包含される。更に、リ
ガンドは、抗体と結合するために必要なエピトー
プ部位を保持しながら、官能基の１個またはそれ
以上の付加または除去により構造上変形してリガ
ンド―類似体を形成させることもできる。しか
し、このような変形されたリガンド―類似体はイ
ミノ基を経てカルボキシフルオレセインに結合さ
れる。 本発明のトレーサーは一般には既知の技術に従
つて製造される。例えば、式 Ｒ―Ｘ （） （式中Ｒは先の定義のとおりであり、そしてＸ
は反応性水素である）を有する化合物を式 （式中Ｚは水酸基または活性エステルであり、
そしてカルボキシ基が好ましくは安息香酸環の４
―または５―位に結合している）を有する化合物
で不活性溶媒の存在下に処理して式（）の化合
物を生成させる。 本文で使用される「活性エステル」なる用語
は、カツプリング剤の存在下にカルボキシ炭素か
ら容易に「除去される」部分を称する。このよう
なカルボキシフルオレセインの「活性エステル」
は当業者により容易に確かめられ、カルボキシフ
ルオレセインと化合物例えばＮ―ヒドロキシ―ス
クシンイミド、１―ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル・水和物またはｐ―ニトロフエノールとをカツ
プリング剤例えばジシクロヘキシルカルボジイミ
ドおよび溶媒の存在下で反応させることによつて
製造される。このようにして得られたカルボキシ
フルオレセインの活性エステルを次に式（）の
化合物と反応させて式（）のトレーサーを得
る。 式（）の化合物が水溶性であるときは、反応
メカニズムは水溶液中でカルボキシフルオレセイ
ンと式（）の化合物とのカツプリング剤として
水溶性カルボジイミド例えば１―エチル―３―
（3′―ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
の存在下での直接反応により進行する。 本発明のトレーサーの製造方法が進行する温度
は限定がない。温度は反応を開始し、維持するの
に十分なものでなければならない。一般に、便宜
上また経済上、室温で十分である。本発明のトレ
ーサーを製造するに当り、反応剤の比は厳密には
臨界的ではない。式（）の化合物の各モルにつ
き、式（）の化合物１モルを用いて妥当な収率
が得られる筈である。反応の容易さおよび反応生
成物の採取のためには式（）の化合物を過剰に
用いるのが好ましい。 生成物の取扱いおよび採取を容易ならしめるた
めに、本発明のトレーサーの製造方法を不活性溶
媒の存在下に実施する。適当な不活性溶媒には出
発物質と反応することなく、また出発物質を溶解
するのに十分な溶媒が包含され、例えば水（式
（）の化合物が水溶性である場合）、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキサイド等が包含さ
れる。式（）の化合物が反応性アミン塩である
場合、適当な塩基を反応混合物に加えて反応性ア
ミンの遊離塩基を形成させる。適当な塩基には例
えばトリエチルアミンが包含される。式（）の
反応生成物は一般には本発明の方法に適用する前
に薄層もしくはカラムクロマトグラフイーを用い
て精製する。 本発明の方法によれば、測定すべきリガンドを
含む試料を式（）のトレーサーの生物学的に許
容し得る塩およびリガンドとトレーサーに対して
特異的である抗体と混合する。試料中に存在する
リガンドおよびトレーサーが抗体部位を限定する
べく競争し、結果としてリガンド―抗体およびト
レーサー―抗体複合体が生じる。トレーサーおよ
び抗体の濃度を一定に保つことにより、形成され
るリガンド―抗体複合体対トレーサー―抗体複合
体の比は試料中に存在するリガンドの量に正比例
する。従つて、混合物を偏光で励起し、トレーサ
ーおよびトレーサー―抗体複合体により発光され
る螢光の偏光を測定することにより、試料中のリ
ガンドの量を定量的に測定することが可能であ
る。 理論では、抗体に複合されていないトレーサー
の螢光偏光は低く、零に近い。特異的な抗体と複
合すると、このようにして形成されたトレーサー
―抗体複合体は、比較的小さいトレーサー分子よ
りも遅い抗体分子の回転をとり、それにより観察
される偏光を増大する。従つて、リガンドが抗体
部位についてトレーサーと競争すると、トレーサ
ー―抗体複合体の螢光の観察される偏光はトレー
サーの偏光とトレーサー―抗体複合体の偏光との
間のどこかの値となる。試料がリガンドを高濃度
で含有しているときは、観察される偏光値は遊離
リガンドの値により接近、すなわち低くなる。供
試試料がリガンドを低濃度で含有しているとき
は、偏光値は結合リガンドの値により接近、すな
わち高くなる。免疫定量法の反応混合物を垂直次
いで水平に偏光された光で順次励起し、そして発
光された光の垂直成分のみを解折することによ
り、反応混合物中の螢光の偏光を正確に測定する
ことができる。偏光と測定すべきリガンドの濃度
との正確な関係は既知の濃度をもつキヤリブレー
ターの偏光値を測定することによつて確定され
る。リガンドの濃度はこのようにして作製された
標準曲線から外挿することができる。 本発明の方法を実施するPHは式（）のトレー
サーをそのイオン化された状態で存在させるのに
十分なものでなければならない。PHは約３〜12の
範囲、更に通常では約５〜10の範囲、最も好まし
くは約６〜９であり得る。種々の緩衝剤を分折操
作中PHを達成し、維持するのに使用し得る。使用
される代表的な緩衝剤にはホウ酸塩、りん酸塩、
炭酸塩、トリス、バルビタール等が包含される。
使用される特別な緩衝剤は本発明にとつて限定的
なものではないが、個々の分折において使用され
る抗体および測定すべきリガンドに鑑み特別な緩
衝剤が好ましいこともある。緩衝剤の陽イオン部
分は一般に溶液中のトレーサー塩の陽イオン部分
を定める。 本発明の方法は適度の温度、好ましくは一定の
温度で実施される。温度は通常約０〜50℃、更に
普通には約15〜40℃の範囲にある。 分折し得るリガンドの濃度は一般に約10-2〜
10-13M、更に普通には約10-4〜10-10Mに変り得
る。より高い濃度のリガンドは当初の試料を希釈
して分折することができる。 問題のリガンドの濃度範囲に加えて、例えば分
折が定性的、半定量的または定量的であるか否
か、使用する装置、ならびにトレーサーおよび抗
体の特徴を考慮して使用すべきトレーサーおよび
抗体の濃度を普通定める。試料中のリガンドの濃
度は他の試薬、すなわちトレーサーおよび抗体の
濃度範囲を定めて普通分折の感度を最適とする
が、個々の試薬濃度は経験則で定められる。トレ
ーサーおよび抗体の濃度は当業者により容易に確
かめられる。 前述の如く、本発明の好ましいトレーサーは５
―カルボキシフルオレセインもしくは４―カルボ
キシフルオレセインまたはこれらの混合物から製
造され、次の式で表わされる。 以下の例示的で限定を企図しない実施例は本発
明の範囲内の特別のトレーサーを製造し得る方法
を当業者に更に例示するのに役立つものである。
以下の実施例で製造される化合物を具体的に示す
構造式に出てくる記号〔CF〕は次の式の部分を
示す。 （式中、出発物質として４―および５―カルボ
キシフルオレセインの混合物が使用される事実に
鑑み、カルボニル炭素は上記式中４―または５―
位に結合している）。 実施例 ｍ―またはｐ―アミノフエノバルビタール（５
mg）およびカルボキシフルオレセイン（５mg）を
ピリジン0.5mlに溶解した。混合物にＮ，N′―ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（15mg）を加え
た。反応を室温で２時間進行させ、その後反応生
成物を展開溶媒としてクロロホルム：メタノール
（２：１）混合物を用いてシリカゲル薄層クロマ
トグラフイーにより２回精製すると次の式を有す
るアミノフエノバルビタール―カルボキシフルオ
レセイン接合体が得られた。 実施例 100％エタノール100ml中の水酸化ナトリウム
（1.0ｇ）、フエニトイン（2.5ｇ）および２―ブロ
モメチルアミン臭化水素酸塩（2.0ｇ）を含む溶
液を２時間還流させ、次に減圧下に蒸発乾涸させ
た。残渣を水50mlに懸濁させ、そして6N水酸化
ナトリウムを加えてPHをPH11に調節して未反応の
フエニトインを溶解した。残留沈殿、２―β―ア
ミノエチルフエニトインを過し、水で十分に洗
滌し、そして乾燥した。 カルボキシフルオレセインの活性エステルを、
ピリジン0.5ml中にＮ―ヒドロキシスクシンイミ
ド（５mg）、カルボキシフルオレセイン（7.5mg）
およびＮ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（20mg）を溶解することにより製造した。反応
を室温で２時間進行させ、その後２―β―アミノ
エチルフエニトイン（10mg）を反応混合物に溶解
した。得られた混合物を室温、暗所で一夜反応さ
せ、その後反応生成物を展開溶媒としてクロロホ
ルム：メタノール（３：１）混合物を用いるシリ
カゲル薄層クロマトグラフイーにより２回精製す
ると次の式を有する２―β―アミノエチルフエニ
トイン―カルボキシフルオレセイン接合体が得ら
れた。 実施例 乾燥ジメチルスルホキサイド６ml中の２―カル
ボキシメチルフエニトイン（620mg）、Ｎ―ヒドロ
キシスクシンイミド（248mg）およびＮ，N′―ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（453mg）を含む
溶液を一夜室温で放置した。混合物を過し、ヒ
ドロジン（95％）0.7mlを液4.5に加えた。室温
で４時間後に水40mlおよび10％水酸化ナトリウム
0.5mlを反応混合物に加えた。沈殿２―カルボキ
シメチルフエニトインヒドラジドを過し、水で
洗滌し、乾燥しそして更に精製することなく使用
した。 Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド
（15mg）をピリジン0.5ml中の２―カルボキシメチ
ルフエニトインヒドラジン（５mg）およびカルボ
キシフルオレセイン（５mg）の溶液に加えた。反
応を室温で２時間進行させ、そして次に反応生成
物を展開溶媒としてクロロホルム：アセトン
（１：１）混合物を用いるシリカゲル薄層クロマ
トグラフイーにより２回精製して次の式を有する
２―カルボキシメチルフエニトインヒドラジド―
カルボキシフルオレセイン接合体を得た。 実施例 Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド
（15mg）をピリジン0.5ml中の８―β―アミノエチ
ルチオフイリン（５mg）およびカルボキシフルオ
レセイン（５mg）の溶液に加えた。反応を室温で
２時間進行させ、そして反応生成物を展開溶媒と
してクロロホルム：メタノール（２：１）混合物
を用いるシリカゲル薄層クロマトグラフイーによ
り２回精製して次の式を有する８―β―アミノエ
チルテオフイリン―カルボキシフルオレセイン接
合体を得た。 実施例 ８―β―アミノエチルテオフイリンの代りに８
―アミノメチルテオフイリンを用いて実施例の
操作を使用すると次の式を有する８―アミノメチ
ルテオフイリン―カルボキシフルオレセイン接合
体が得られた。 実施例 δ―バレロラクタム（7.5ｇ）を乾燥窒素雰囲
気下に乾燥テトラヒドロフラン60mlに溶解し、そ
してヘキサン中のｎ―ブチルリチウム（1.6M、
90ml）を反応フラスコに滴加し、乾燥氷―アセト
ン浴で冷却した。ｎ―ブチルリチウムの添加完了
後、反応混合物を１時間室温でかくはんし、30分
間還流させ、そして乾燥窒素雰囲気下に室温に冷
却した。１―ブロモエタン（8.0ｇ）をフラスコ
を氷浴で冷却しながら反応フラスコにゆつくり加
えた。得られた混合物を次に室温で16時間かくは
んし、その後水100mlをゆつくり加えた。得られ
た混合物を室温で30分間かくはんし、有機層を分
離した。水層をジエチルエーテル50mlで抽出し、
そして有機層を合し、硫酸ナトリウムで乾燥し
た。溶媒を蒸発させると暗色の油が得られ、この
ものは放置すると結晶化した。結晶性残渣を石油
エーテルから再結晶すると残渣3.8ｇが得られた。
残渣（2.8ｇ）を６時間6N塩酸25ml中で還流し
た。水を混合物から蒸発させると暗色の濃厚な油
―２―エチル―５―アミノペンタン酸―が得ら
れ、このものを更に精製することなく使用した。 カルボキシフルオレセインの活性エステルをピ
リジン0.5mlにＮ―ヒドロキシスクシンイミド
（５mg）、カルボキシフルオレセイン（7.5mg）お
よびＮ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド
（20mg）に溶解することにより製造した。反応を
室温で２時間進行させ、その後２―エチル―５―
アミノペンタン酸（20mg）を反応混合物に溶解し
た。得られた混合物を室温、暗所で一夜反応さ
せ、そして反応生成物を展開溶媒としてクロロホ
ルム：メタノール（３：１）混合物を用いるシリ
カゲル薄層クロマトグラフイーにより２回精製す
ると次の式を有する２―エチル―５―アミノペン
タン酸―カルボキシフルオレセイン接合体が得ら
れた。 実施例 カルボキシフルオロセインの活性エステルをピ
リジン0.5mlにＮ―ヒドロキシスクシンイミド
（５mg）、カルボキシフルオロセイン（7.5mg）お
よびＮ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド
（20mg）を溶解することにより製造した。反応を
室温で２時間進行させ、その後５―（γ―アミノ
プロピリデン）―5H―ジベンゾ〔ａ，ｄ）―10，
11―ジヒドロシクロヘプテン（20mg）を反応混合
物に溶解した。得られた混合物を室温、暗所で一
夜反応させ、そして反応生成物を展開溶媒として
クロロホルム：メタノール（３：１）混合物を用
いるシリカゲル薄層クロマトグラフイーにより２
回精製すると次の式を有する５―（γ―アミノプ
ロピリデン）―5H―ジベンゾ〔ａ，ｄ〕―10，
11―ジヒドロシクロペンテン―カルボキシフルオ
ロセイン接合体が得られた。 実施例 クロロホルム25ml中のデシプラミン塩酸塩
（1.33ｇ）およびクロロアセチルクロライド（0.8
ｇ）を含む溶液を２時間還流させた。クロロホル
ムを蒸発させ、残渣をアセトン25mlに溶解した。
ヨウ化ナトリウム（0.75ｇ）をアセトン溶液に加
え、そして溶液を30分間還流させた。溶液を過
し、沈殿した塩をアセトンで洗滌した。アセトン
液を蒸発させ、そして残渣をメタノール20mlに
とつた。濃水酸化アンモニウム（20ml）をメタノ
ール溶液に加え、得られた溶液を１時間還流させ
た。反応混合物をクロロホルム25mlで３回抽出
し、そして合した抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥
し、過し、そして蒸発するとＮ―アミノアセチ
ルデシプラミンが得られ、このものを更に精製す
ることなく使用した。 Ｎ―アセチルデシプラミン（５mg）およびカル
ボキシフルオレセイン（５mg）をピリジン0.5ml
に溶解した。混合物にＮ，N′―ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（15mg）を加えた。反応を室温
で２時間進行させ、その後反応生成物を展開溶媒
としてクロロホルム：アセトン（１：１）混合物
を用いるシリカゲル薄層クロマトグラフイーによ
り２回精製して次の式を有するＮ―アミノアセチ
ルデシプラミン―カルボキシフルオレセイン接合
体を得た。 実施例 ピリジン１ml中のＮ―ヒドロキシスクシンイミ
ド（５mg）、カルボキシフルオレセイン（7.5mg）
およびＮ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（20mg）を含む溶液を室温で４時間反応させ
た。カルボキシフルオレセインの活性エステルは
反応混合物にジエチルエーテル10mlを加えること
により沈殿させた。沈殿を過し、ジエチルエー
テルでよく洗滌し、そしてジメチルスルホキサイ
ド0.5mlに再溶解した。次に、Ｌ―チロキシン
（10mg）を溶液に加え、反応を室温で２時間進行
させ、その後反応生成物を展開溶媒としてクロロ
ホルム：メタノール（３：１）混合物を用いてシ
リカゲル薄層クロマトグラフイーにより２回精製
して次の式を有するＬ―チロキシン―カルボキシ
フルオロセイン接合体を得た。 実施例 メタノール５ml中酢酸アンモニウム（0.89ｇ）、
３―オキソジゴキシゲニン（389mg）およびシア
ノホウ水素化ナトリウム（63mg）を含む溶液を48
時間室温でかくはんした。溶液を濃塩酸を加えて
PH１に調節し、減圧で蒸発乾涸した。残渣を水10
mlにとり、クロロホルム10mlで３回抽出した。水
層を固形水酸化カリウムを用いてPH11に調節し
た。得られた溶液をメチレンクロライド10mlで５
回抽出した。有機層を合し、乾燥しそして減圧で
蒸発乾涸させると３―アミノ―３―デオキシジゴ
キシゲニンが得られ、このものを更に精製するこ
となく使用した。 カルボキシフルオロセインの活性エステルをピ
リジン05mlにＮ―ヒドロキシスクシンイミド（５
mg）、カルボキシフルオロセイン（7.5mg）および
Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド（20
mg）を溶解することにより製造した。反応を室温
で２時間反応させ、その後次の式を有する３―ア
ミノ―３―デオキシジゴキシゲニン―カルボキシ
フルオレセイン接合体を単離した。 上記の操作に従つて以下のトレーサーも製造さ
れた。 実施例 XI Ｏ―アミノアセチル―プロプラノロール―カル
ボキシフルオレセイン接合体 実施例 XII ２―プロピル―５―アミノペンタン酸―カルボ
キシフルオレセイン接合体 実施例 ２―ブチル―５―アミノ―ペンタン酸―カルボ
キシフルオレセイン接合体 実施例 アミノプリミドン―カルボキシフルオロセイン
接合体 実施例 １―（4′―ニトロフエニル）―１―ヒドロキシ
―２―アミノ―３―ヒドロキシプロパン―カル
ボキシフルオレセイン接合体 実施例 ｐ―アミノフエノール―カルボキシフルオレセ
イン接合体 実施例 Ｎ―（２―アミノエチル）―エトスクシミド―
カルボキシフルオレセイン接合体 実施例 N′―デスエチル―Ｎ―アセチル―プロカイン
アミド―カルボキシフルオレセイン接合体 実施例 N′―デスエチル―N′―アミノアセチル―Ｎ―
アセチル―プロカインアミド―カルボキシフル
オレセイン接合体 実施例 １―アミノ―２―フエニル―２―（2′―ピリジ
ル）―４―（ジイソプロピルアミノ）―ブタン
―カルボキシフルオレセイン接合体 実施例 XI ３，3′，5′―トリヨード―Ｌ―チロニン―カル
ボキシフルオレセイン接合体 実施例 XII ３，3′，５，5′―テトラヨード―Ｄ―チロニン
―カルボキシフルオレセイン接合体 実施例 Ｎ―アミノアセチル―イミノジベンジルカルボ
キシフルオレセイン接合体 実施例 カルブヒドラジノイミノ―ジベンジルカルボキ
シフルオレセイン接合体 実施例 ジベンゾスベロンヒドラゾンフルオレセイン接
合体 実施例 ５―アミノ―10，11―ジヒドロ―5H―ジベン
ゾ〔ａ，ｄ〕―シクロヘプテン 前述の如く、本発明のトレーサーは螢光偏光免
疫定量法に使用するのに有効な試薬である。以下
の実施例は螢光偏光技術を使用する免疫定量法で
の本発明のトレーサーの適合性を具体的に説明す
るものである。この検定法は次の一般操作に従つ
て実施される。 １ 標準または供試血清の測定量を試験管に分配
し、緩衝剤で希釈する； ２ 任意に界面活性剤を含有する本発明のトレー
サー（濃度既知）を各試験管に加える； ３ 濃度既知の抗血清を試験管に加える； ４ 反応混合物を室温で培養する；そして ５ 抗体に結合されたトレーサーの量を試料中の
リガンドの量の基準として螢光偏光技術により
測定する。 実施例 フエニトイン検定 Ａ 必要な材料： １ 牛γ―グロブリン0.01％およびアジ化ナト
リウム0.01％を含むりん酸ナトリウム
（0.1M、PH7.5）からなるBGG緩衝剤。 ２ ５％コール酸ナトリウムを添加したBGG
緩衝剤中に約105nMの濃度で２―β―アミ
ノエチルフエニトイン―カルボキシフルオレ
セインからなるトレーサー。 ３ 0.005％塩化ベンザルコニウムを含むBGG
緩衝剤で適切に希釈されたフエニトインに対
して高められた抗血清からなる抗血清。 ４ フエニトインを含む人血清またはその他の
生物学的流体の試料。 ５ クヴエツト、クヴエツトとして使用される
10×75mmガラス培養管。 ６ ±0.001単位の精度でもつて螢光偏光を測
定し得る螢光計。 Ｂ 検定法： １ 小量の試料（0.366μl）を、試料15μlをピ
ペツトでとり、そして希釈容器に600μlBGG
緩衝剤で希釈することにより、各クヴエツト
に入れる。次に、希釈試料15μlをクヴエツト
にピペツトでとり、次に600μlBGG緩衝剤を
ピペツトでとる。 ２ クヴエツトに40μlトレーサーおよび
1000μlBGG緩衝剤をピペツトでとることに
よりトレーサーを加える。 ３ クヴエツトに40μl抗血清次いで
1000μlBGG緩衝剤をピペツトでとることに
より抗血清を加えて反応を開始させる。 ４ 全クヴエツトの内容物をよく混和し、周囲
の温度で15分間培養する。 ５ 螢光偏光を螢光計で読み、そして標準曲線
を作図して未知のものを測定する。 Ｃ ０〜40μy／mlの間の濃度でフエニトインを
含有する一連の血清標準品の結果を以下に示
す。各濃度を二回検定し、そして平均する。 フエニトインの濃度（μy／ml） 偏光 ０ 0.222 2.5 0.196 5.0 0.178 10.0 0.154 20.0 0.132 40.0 0.110 螢光の偏光はフエニトイン濃度が増加するにつ
れて一定の方式で減少することがみられ、標準曲
線の構成と可能とする。同一の方式で処理した未
知の試料を標準曲線を参照して定量することがで
きる。これによりフエニトインの測定について２
―β―アミノエチルフエニトイン―カルボキシフ
ルオレセインの有用性が実証される。 実施例 フエノバルビタール検定 Ａ 必要な材料： １ BGG緩衝剤（フエニトイン参照） ２ 0.01％アジ化ナトリウム、0.01％牛γ―グ
ロブリン、および0.125％ドデシル硫酸ナト
リウムを含むトリスHCl緩衝剤PH7.5中約
110nMの濃度のアミノフエノバルビタール
カルボキシフルオレセインからなるトレーサ
ー。 ３ 0.005％ベンザルコニウムクロライドを含
むBGG緩衝剤中適切に希釈されたフエノバ
ルビタールに対する抗血清からなる抗血清。 ４ 人血清またはフエノバルビタールを含むそ
の他の生物学的流体。 ５ クヴエツト（フエニトイン参照） ６ 螢光計（フエニトイン参照） Ｂ 検定方式書： １ 小量の試料（0.196μl）を、試料10μlをピ
ペツトでとり、そして500μlBGG緩衝剤で希
釈容器で希釈することにより、クヴエツトに
入れる。次に、希釈された試料10μl次いで
BGG緩衝剤500μlをクヴエツトにピペツトで
とる。 ２ 各クヴエツトにトレーサー40μlおよび
BGG緩衝剤1000μlをピペツトでとることに
よりトレーサーを加える。 ３ 抗血清40μl次いでBGG緩衝剤1000μlをピ
ペツトでとることにより抗血清を加えて反応
を開始させる。 ４ 全クヴエツトの内容物をよく混和し、そし
て周囲の温度で15分間培養する。 ５ 螢光偏光を螢光計で読み、そして標準曲線
を作図して未知のものを測定する。 Ｃ ０〜80μy／mlの間の濃度でフエノバルビタ
ールを含有する一連の血清標準品の結果を以下
に示す。各濃度を二回検定しそして平均する。 フエノバルビタールの濃度（μl） 偏光 ０ 0.250 5.0 0.231 10.0 0.196 20.0 0.150 40.0 0.104 80.0 0.077 螢光の偏光はフエノバルビタール濃度が増加す
るにつれて一定の方式で減少することがみとめら
れ、標準曲線の構成を可能とする。同一の方式で
処理した未知の試料を標準曲線を参照して定量す
ることができる。これによりフエノールバルビタ
ールの測定についてアミノフエノバルビタール―
カルボキシフルオレセインの有用性が実証され
る。 実施例 テオフイリン検定 Ａ 必要な材料： １ 0.01％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する
BGG緩衝剤（フエニトイン検定参照）中
2nMの８―アミノエチルテオフイリン―カ
ルボキシフルオレセインからなるトレーサ
ー。 ２ BGG緩衝剤で適切に希釈されたテオフイ
リンに対して高められた抗血清からなる抗血
清。 ３ テオフイリンを含有する人血清またはその
他の生物学的流体の試料。 ４ クヴエツト（フエニトイン検定参照） ５ 螢光計（フエニトイン検定参照） Ｂ 検定方式書： １ 全クヴエツトにトレーサー1.0mlを入れる。 ２ 全クヴエツトに試料2.0μlを加える。 ３ 全クヴエツトに抗血清1.0mlを加える。 ４ よく混和し、そして周囲の温度で15分間培
養する。 ５ 螢光計で螢光偏光を読み、標準曲線を作図
する。 Ｃ ０〜40μy／mlの間の濃度でテオフイリンを
含有する一連の血清標準品の結果を示す。各濃
度を二回検定し、平均値を示す。 テオフイリンの濃度（μy／ml） 偏光 ０ 0.158 2.5 0.118 ５ 0.105 10 0.091 20 0.076 40 0.063 螢光の偏光はテオフイリン濃度が増加するにつ
れて一定の方式で減少することがみられ、標準曲
線の構成を可能とする。同一の方式で処理した未
知の試料は標準曲線を参照して定量することがで
き、これによりテオフイリンの測定について８―
アミノエチルテオフイリン―カルボキシフルオレ
セインの有用性が実証される。 実施例 ジゴキシン検定 Ａ 必要な材料： １ 牛γ―グロプリン0.01％およびアジ化ナトリ
ウム0.01％を含有する0.1Mりん酸ナトリウム
PH7.5からなるBGG緩衝剤。 ２ BGG緩衝剤で約2nMの濃度のジゴキシンカ
ルボキシフルオレセインからなるトレーサー。 ３ BGG緩衝剤で適切に希釈されたジゴキシン
に対して高められたウサギ抗血清からなる抗血
清。 ４ ジゴキシンを含有する人血清またはその他の
生物学的流体の試料。 ５ 沈殿試薬……５％トリクロロ酢酸（水中） ６ クヴエツト、クヴエツトとして使用される10
×75mmガラス培養管。 ７ ±0.001単位の精度でもつて螢光偏光を測定
し得る螢光計。 Ｂ 検定方式書： １ 試験管中の５％トリクロロ酢酸100μlに標準
品または未知の試料100μlを加える。試料を含
む試験管に栓をし、ふり混ぜる。 ２ トリクロロ酢酸中の標準品または試料を含む
試験管を遠心分離する。 ３ 35℃でBGG緩衝剤1.8mlおよび抗血清25μlの
試験管にトリクロロ酢酸上澄溶液150μlを加え
る。 ４ 抗血清および上澄液の入つた試験管を35℃で
６分間培養し、この時間に管の螢光偏光を測定
する。この測定が標準または未知のものの背景
となる螢光偏光である。 ５ 上澄液を抗血消に加えた後10分でトレーサー
25μlを試験管に加える。 ６ トレーサー添加後６分で標準品および試料管
の螢光偏光を測定し、そして先に測定した背景
となる螢光偏光を差引くと形成されていた抗体
―トレーサー複合体の螢光偏光が得られる。 ７ ０〜5ny／mlの間の濃度でジゴキシンを含む
一連の血清標準品の結果を以下に示す。各濃度
で４個の試料を検定し、平均した。 ジゴキシン濃度（ny／ml） 偏光 ０ 0.142 0.5 0.134 1.0 0.123 2.0 0.106 3.0 0.092 5.0 0.070 螢光の偏光はジゴキシン濃度が増加するにつれ
て一定の方式で減少することがみとめられ、標準
曲線の構成を可能とする。同一の方式で処理した
未知の試料は標準曲線を参照して定量することが
でき、これによりジゴキシンについてジゴキシン
カルボキシフルオレセインの有用性が実証され
る。 次の表には、上記の実施例で製造されたトレー
サーを使用し、上記の操作に従つて実施した種々
の螢光偏光検定を要約する。使用するトレーサー
を実施例番号で同定し、そして測定される特定の
リガンドを示す。実施例No. リガンド フエノバルビタール フエニトイン フエニトイン テオフイリン テオフイリン バルプロン酸 ノルトリプチリン；アミトリプチリ
ン イミプラミン；デシプラシン チロキシン ジゴキシン XI プロプラノロール XII バルプロン酸 バルプロン酸 プリミドン クロラムフエニコール アセトアミノフエン エトスクシイミド Ｎ―アセチルプロカインアミド Ｎ―アセチルプロカインアミド ジイソピラマイド XI トリヨードチロニン XII チロキシン イミプラミン；デシプラミン イミプラミン；デシプラミン ノルトリプチリン；アミトリプチ ノルトリプチリン；アミトリプチリ
ン 上記の結果から明らかな如く、本発明のトレー
サーは螢光偏光免疫定量法で有効な試薬である。
上記特性に加えて、本発明のトレーサーは高度の
熱安定性、高度の結合偏光、高収量を有し、かつ
製造および精製が比較的容易である。 本発明を特定の変形について記述してきたが、
その詳細は限定と解釈すべきではない。種々の均
等物、変化および変形は、本発明の精神および範
囲を逸脱することなく、なし得ることが明白であ
り、またこのような均等な態様は本発明に包含さ
れることが企図されているものと解すべきであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中、Ｒは、カルボキシフルオレセイン部分
のカルボニル炭素に結合している単独の反応第一
または第二アミノ基を有する分子量50〜4000のリ
ガンド―類似体であり、而して前記リガンド―類
似体が前記リガンドと共通するエピトープ少なく
とも１個を有し、それにより共通抗体により特異
的に認識可能とする）を有するトレーサーおよび
前記トレーサーおよび前記リガンドを特異的に認
識し得る抗体を試料と混和し；そして次に試料中
のリガンドの量の基準として螢光偏光技術により
抗体に結合されたトレーサーの量を測定すること
を特徴とする試料中のリガンドを測定する方法。 ２ 前記リガンドが薬物またはその代謝産物であ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ Ｒ基に結合しているカルボニル基がカルボキ
シフルオレセイン部分の４―または５―位にも結
合している特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 前記薬物がステロイド、ホルモン、抗喘息
剤、制ガン剤、抗不整脈剤、抗けいれん剤、抗関
節炎剤、抗うつ剤、グリコシド心臓剤またはその
代謝産物である特許請求の範囲第３項記載の方
法。 ５ Ｒが100〜2000の範囲内の分子量を有する特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 前記薬物が抗けいれん剤である特許請求の範
囲第５項記載の方法。 ７ 前記抗けいれん剤がフエノバルビタールであ
る特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 前記抗けいれん剤がフエニトインである特許
請求の範囲第６項記載の方法。 ９ 前記抗けいれん剤がプリミドンである特許請
求の範囲第６項記載の方法。 １０ 前記薬物がステロイドである特許請求の範
囲第５項記載の方法。 １１ 前記ステロイドがジゴキシンである特許請
求の範囲第９項記載の方法。 １２ 前記薬物が抗不整脈剤である特許請求の範
囲第５項記載の方法。 １３ 前記抗不整脈剤がプロプラノロールである
特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４ 前記薬物が抗喘息剤である特許請求の範囲
第５項記載の方法。 １５ 前記喘息剤がテオフイリンである特許請求
の範囲第１４項記載の方法。
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