JPH0123119B2 - - Google Patents
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- JPH0123119B2 JPH0123119B2 JP55169103A JP16910380A JPH0123119B2 JP H0123119 B2 JPH0123119 B2 JP H0123119B2 JP 55169103 A JP55169103 A JP 55169103A JP 16910380 A JP16910380 A JP 16910380A JP H0123119 B2 JPH0123119 B2 JP H0123119B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- interferon
- microcarriers
- medium
- added
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は、インターフエロン産生方法に関する
ものであり、更に詳しくは、正に荷電した化学的
残基を有するミクロキヤリヤ上に増殖した動物細
胞をインターフエロン誘発剤で処理してインター
フエロンを産生させる方法に関するものである。 インターフエロンは各種のウイルスや二重鎖
RNA等の誘起剤の刺戟により動物細胞が産生す
るタンパク質であり、ウイルスの細胞内増殖を抑
制する作用を有する。インターフエロンの作用は
ウイルス種に関しては非特異的であるが、動物種
に関しては特異的である。すなわち、ある動物種
の細胞で産生されたインターフエロンは他の動物
種に対しては作用しない。近年ある種のウイルス
性疾患さらには腫瘍に対するインターフエロンの
治療効果が認められるに至り、その医療薬として
の可能性が注目を集めている。インターフエロン
を医薬として応用するためには、ヒトの何らかの
細胞を用いて生体外でインターフエロンを産生さ
せこれを分離精製することが必要となる。ヒト・
インターフエロンを産生させる為の細胞としてこ
れまでは血液より分離した白血球が用いられるこ
とが多かつたが、次第に胎児あるいは新生児由来
の二倍体細胞がこれに代わろうとしている。白血
球の供給は不特定多数の人間にたよらざるを得
ず、また白血球の産生したインターフエロン標品
中には各種のリンフオカインが混入している恐れ
が多い。従つて白血球から得られるインターフエ
ロン標品の安全性に対する監視は必ずしも容易で
はない。これに対して二倍体細胞にあつては一個
体由来のものを大量に培養することが可能である
ので、得られるインターフエロン標品の安全性の
確認は白血球由来の場合に比して容易であると考
えられている。 従来、二倍体細胞等の係留依存性細胞の培養方
法としては、ルー瓶もしくはローラ瓶を用いる培
養方法が知られているが、この方法により大量の
係留依存性細胞を培養することはかなり困難であ
ると考えられている。すなわち、この方法におい
ては、細胞はルー瓶の底面もしくはローラ瓶の側
面に単層に増殖するだけであるため大量培養にあ
たつては、極めて多数のルー瓶もしくはローラ瓶
を扱う必要があり、取り扱いが極めて煩雑となる
ためである。 最近、係留依存性細胞の大量培養に適したミク
ロキヤリヤ培養法と称される培養法が開発された
（特開昭53−62889）。 この培養法は、正に荷電した化学的残基を有す
るミクロキヤリヤ（以下、単にミクロキヤリヤと
呼称する）を懸濁させた培地中に種細胞を接種
し、懸濁状態で培養する方法であり、接種された
細胞はミクロキヤリヤ表面に付着し、そこで増殖
する。ミクロキヤリヤ培養法は、細胞付着表面積
を大きくすることが容易であり、かつ、その取り
扱いも容易であるため、特に係留依存性細胞の大
量培養に適した培養法といえる。 一方、培養細胞にインターフエロンを産生させ
る技術として、スーパーインダクシヨン法と呼ば
れる二重鎖RNA等のインターフエロン誘発剤を
用いて細胞を刺激した後、シクロヘキシミド、ア
クチノマイシンＤなどの代謝阻害剤で細胞を処理
することによりインターフエロン産生を一層増殖
せしめる方法（米国特許3773924号）、UV法と呼
ばれる、インターフエロン誘発剤を用いて細胞を
刺激する前後数時間の間に細胞に紫外線を照射し
てインターフエロン産生を一層増強せしめる方法
等の方法が知られている。 本発明者等は、二倍体細胞等の培養細胞由来の
インターフエロンを大量に産生させる方法とし
て、上記、培養方法およびインターフエロン産生
方法に着目し、ミクロキヤリヤ培養法で培養した
細胞に、スーパーインダクシヨン法により、イン
ターフエロンを産生させることを試みてきたが、
この方法においては、低単位のインターフエロン
しか産生しないことがしばしばあり、安定して高
単位のインターフエロンを産生することができな
い。 本発明の目的は、かかる問題点を解消し、大量
産生に適する効果の顕著なインターフエロン産生
方法を提供することにある。 上記本発明の目的は、ミクロキヤリヤ上に増殖
した動物細胞をインターフエロン誘発剤にて処理
するに際し、細胞が付着、増殖したミクロキヤリ
ヤを、グルココルチコイドおよび負に荷電した水
溶性高分子で処理するインターフエロン産生方法
により達成される。 まず本発明方法の前提となるミクロキヤリヤ培
養法による二倍体細胞等の係留依存性細胞の培養
方法について説明する。 ミクロキヤリヤを懸濁し、必要に応じて適当な
濃度の血清を含む、培地中に種細胞を接種し、ゆ
るやかに撹拌しながら適当な温度で培養を行な
う。 ミクロキヤリヤとしては、多糖類、たとえば、
デキストラン、デキストリン、澱粉、セルロー
ス、およびこれらの置換基誘導体等あるいはある
種の合成重合体、たとえば、ポリビニルアルコー
ル、ヒドロキシ置換アクリレート又はメタクリレ
ート、ポリスチレン等よりなる微小粒状体に適当
量のアミン残基を結合させたものなどが用いられ
る。 ミクロキヤリヤ濃度は、ミクロキヤリヤ材質、
培養すべき細胞の種類により異なるが、培地１ml
あたりのミクロキヤリヤ表面積がおよそ10cm2〜
100cm2となるような濃度範囲が好ましい。培地組
成、血清濃度等は、培養すべき細胞と種類、細胞
濃度等に応じて適当に選ばれる。 接種された細胞は、ミクロキヤリヤ表面に付着
し、増殖をはじめ、およそ数日間から10日間適当
な温度で培養を続けることにより細胞がミクロキ
ヤリヤ表面をほゞ完全に蓋いつくすまで増殖す
る。その間、必要に応じて、酸素の供給、PH調
製、栄養素の添加、培地交換等を行なう。 次にミクロキヤリヤ培養法で培養した細胞によ
るインターフエロン産生について詳しく説明す
る。 培養された細胞は、必要に応じてインターフエ
ロン誘発に先だち、インターフエロン産生を増強
せしめる目的で、低単位のインターフエロンを含
む培地でおよそ数時間ないしは１日間インキユベ
ートされる。 本発明者等は、インターフエロン誘発に先だ
ち、インターフエロン産生を増強せしめる目的で
細胞が付着、増殖したミクロキヤリヤが懸濁して
いる培地中に負に荷電した水溶性高分子およびグ
ルココルチコイドを添加することにより相乗的効
果が得られることを見出した。 負に荷電した水溶性高分子としては、たとえ
ば、カルボキシメチルセルローズ（以下CMCと
略称する）、ポリアルギネート、ポルグルタメー
ト、ペクチン等のカルボキシル基を有する水溶性
高分子、リン酸セルローズ等のリン酸基を有する
水溶液高分子、デキストランサルフエート、ヘパ
リン等の硫酸基を有する水溶性高分子等が好まし
く用いられる。これら水溶性高分子の好適な濃度
および添加の時期は、用いる水溶性高分子の種類
により、異なるためそれぞれ適当な条件が選ばれ
る。たとえば、イオン強度の弱いカルボキシル基
を有するCMCの場合には、0.05％以上１％以下、
さらに好ましくは0.1％以上0.5％以下の濃度を相
当する量を、インターフエロン誘発剤添加のおよ
そ５時間以上、更に好ましくは、10時間以上前に
添加するのが好適であり、また、イオン強度の強
い硫酸基を有するデキストランサルフエートの場
合には、0.0001％以上0.01％以下の濃度を相当す
る量をインターフエロン誘発剤の添加の直前もし
くはせいぜい１時間前に添加するのが好適であ
る。 グルココルチコイドとしてはヒドロコルチゾ
ン、ブレドニゾロンあるいはデキサメサゾンなど
が用いられるがこれらのみに限定されるものでは
ない。ヒドロコルチゾン、プレドニゾロンあるい
はデキサメサゾンの濃度としては通常0.01〜100
マイクロモル（μM）が用いられ、さらに望まし
くは0.1〜10μMが用いられる。グルココルチコイ
ドはインターフエロン誘発剤添加の72時間ないし
６時間前に、望ましくは48時間前に添加する。 グルココルチコイドは、インターフエロン産生
増強効果をあらわす濃度では、DNA合成および
たん白質合成に対し影響を及ぼすことなくRNA
合成を増強する。 グルココルチコイドのインターフエロン産生増
強効果は平面培養細胞でも見られることもある
が、ミクロキヤリヤ培養細胞においてより恒常的
にその効果があらわれる。すなわちミクロキヤリ
ヤ培養細胞を利用したインターフエロンの大量生
産に好適に利用される。 グルココルチコイドはインターフエロン誘発剤
による処理でひきおこされる細胞変性効果を速度
に調節し比較的安定して高単位のインターフエロ
ン産生を細胞に行なわせる働きを有している。 次に、いわゆるスーパーインダクシヨンもしく
はUV法でインターフエロン誘発処理を行なう。 すなわち、細胞が付着増殖したミクロキヤリヤ
を懸濁した培地中にインターフエロン誘発剤を添
加し、しかる後に、例えばスーパーインダクシヨ
ン法の場合は、シクロヘキシミド、アクチノマイ
シンＤ等の代謝阻害剤を適当な濃度、適当なタイ
ムスケジユールで添加し、適当な期間インキユベ
ートした後に、好ましくは、添加した前記の薬剤
等を含む古い培地を新しい培地と交換し、例えば
およそ１日の間インキユベートして培地中にイン
ターフエロンを産生せしめる。 細胞にインターフエロンを誘発させるインター
フエロン誘発剤としては種々のものが知られてい
るが、本発明方法にあつては、poly（Ｉ）：poly
（Ｃ）、poly（Ａ）：poly（Ｕ）等の二重鎖RNA等を
用いて最も効果的に実施される。 次に本発明の実施例について説明する。 実施例 １ 仔牛血清５％、ジエチルアミノエチル基を有す
る架橋デキストランミクロキヤリヤ0.3％を含む
イーグルMEM1200mlにヒト正常二倍体細胞を
105ケ／mlの割合いで接種し、ガラス製スピナー
フラスコでゆるく撹拌しながら37℃で５日間培養
した。途中、２回培養培地を仔牛血清５％を含む
新しいイーグルMEM培地と交換した。到着細胞
数は0.9×106ケ／mlであつた。次に、細胞および
ミクロキヤリヤを含む培地200mlづつを６本の小
型スピナーフラスコに分注した。細胞およびミク
ロキヤリヤを沈降させ上澄培地を捨て、２本のフ
ラスコにはヒドロコルチゾン1μM、仔牛血清５
％を含む新しいイーグルMEM培地を、さらに２
本のフラスコにはプレドニゾロン1μM、仔牛血
清５％を含む新しいイーグルMEM培地を、さら
に残りの２本のフラスコには仔牛血清５％を含む
新しいイーグルMEM培地をそれぞれ捨てた倍地
に等しい量加え一日培養を続ける。次に再び細胞
およびミクロキヤリヤを沈降させ上澄培地を捨
て、インターフエロン100国際単位／mlおよび仔
牛血清２％を含む培地を捨てた量に等しい量加
え、さらに先にヒドロコルチゾンあるいはプレド
ニゾロンを添加したフラスコにはそれぞれヒドロ
コルチゾンあるいはプレドニゾロンを同濃度にな
るように添加し、またさらにヒドロコルチゾンあ
るいはプレドニゾロンを添加したフラスコ各１本
とグルココルチコイドを添加していないフラスコ
１本、計３本にはそれぞれ0.2％になるように
CMCを添加し、残りの３本にはCMCを添加しな
いで37℃でおよそ20時間培養を継続した。次に
polyI：polyCを50μｇ／ml、シクロヘキシミドを
10μｇ／mlとなるように全てのフラスコに加え、
37℃で４時間インキユベートし、さらにアクチノ
マイシンＤ、4μｇ／mlを加え37℃で１時間イン
キユベートした後、細胞の付着したミクロキヤリ
ヤを沈降させ、上澄液を捨て、0.2％CMCを添加
したイーグルMEM培地を捨てた量の同量加え、
さらにこの操作をもう１回繰返した。最終的に加
えた培地で37℃で約48時間インキユベートした。
途中24時間経過した時点で約２mlの培養上清をイ
ンターフエロン力価測定用標品として抜き取つ
た。最終的に用いた培地中に24時間目までおよび
48時間目まで産生されたインターフエロンの量を
FL細胞およびヴエスイキユラー・ストマテイテ
イス・ウイルスを用いたCPE阻止法で測定し、
国際単位に換算した。結果を表１に示す。
ものであり、更に詳しくは、正に荷電した化学的
残基を有するミクロキヤリヤ上に増殖した動物細
胞をインターフエロン誘発剤で処理してインター
フエロンを産生させる方法に関するものである。 インターフエロンは各種のウイルスや二重鎖
RNA等の誘起剤の刺戟により動物細胞が産生す
るタンパク質であり、ウイルスの細胞内増殖を抑
制する作用を有する。インターフエロンの作用は
ウイルス種に関しては非特異的であるが、動物種
に関しては特異的である。すなわち、ある動物種
の細胞で産生されたインターフエロンは他の動物
種に対しては作用しない。近年ある種のウイルス
性疾患さらには腫瘍に対するインターフエロンの
治療効果が認められるに至り、その医療薬として
の可能性が注目を集めている。インターフエロン
を医薬として応用するためには、ヒトの何らかの
細胞を用いて生体外でインターフエロンを産生さ
せこれを分離精製することが必要となる。ヒト・
インターフエロンを産生させる為の細胞としてこ
れまでは血液より分離した白血球が用いられるこ
とが多かつたが、次第に胎児あるいは新生児由来
の二倍体細胞がこれに代わろうとしている。白血
球の供給は不特定多数の人間にたよらざるを得
ず、また白血球の産生したインターフエロン標品
中には各種のリンフオカインが混入している恐れ
が多い。従つて白血球から得られるインターフエ
ロン標品の安全性に対する監視は必ずしも容易で
はない。これに対して二倍体細胞にあつては一個
体由来のものを大量に培養することが可能である
ので、得られるインターフエロン標品の安全性の
確認は白血球由来の場合に比して容易であると考
えられている。 従来、二倍体細胞等の係留依存性細胞の培養方
法としては、ルー瓶もしくはローラ瓶を用いる培
養方法が知られているが、この方法により大量の
係留依存性細胞を培養することはかなり困難であ
ると考えられている。すなわち、この方法におい
ては、細胞はルー瓶の底面もしくはローラ瓶の側
面に単層に増殖するだけであるため大量培養にあ
たつては、極めて多数のルー瓶もしくはローラ瓶
を扱う必要があり、取り扱いが極めて煩雑となる
ためである。 最近、係留依存性細胞の大量培養に適したミク
ロキヤリヤ培養法と称される培養法が開発された
（特開昭53−62889）。 この培養法は、正に荷電した化学的残基を有す
るミクロキヤリヤ（以下、単にミクロキヤリヤと
呼称する）を懸濁させた培地中に種細胞を接種
し、懸濁状態で培養する方法であり、接種された
細胞はミクロキヤリヤ表面に付着し、そこで増殖
する。ミクロキヤリヤ培養法は、細胞付着表面積
を大きくすることが容易であり、かつ、その取り
扱いも容易であるため、特に係留依存性細胞の大
量培養に適した培養法といえる。 一方、培養細胞にインターフエロンを産生させ
る技術として、スーパーインダクシヨン法と呼ば
れる二重鎖RNA等のインターフエロン誘発剤を
用いて細胞を刺激した後、シクロヘキシミド、ア
クチノマイシンＤなどの代謝阻害剤で細胞を処理
することによりインターフエロン産生を一層増殖
せしめる方法（米国特許3773924号）、UV法と呼
ばれる、インターフエロン誘発剤を用いて細胞を
刺激する前後数時間の間に細胞に紫外線を照射し
てインターフエロン産生を一層増強せしめる方法
等の方法が知られている。 本発明者等は、二倍体細胞等の培養細胞由来の
インターフエロンを大量に産生させる方法とし
て、上記、培養方法およびインターフエロン産生
方法に着目し、ミクロキヤリヤ培養法で培養した
細胞に、スーパーインダクシヨン法により、イン
ターフエロンを産生させることを試みてきたが、
この方法においては、低単位のインターフエロン
しか産生しないことがしばしばあり、安定して高
単位のインターフエロンを産生することができな
い。 本発明の目的は、かかる問題点を解消し、大量
産生に適する効果の顕著なインターフエロン産生
方法を提供することにある。 上記本発明の目的は、ミクロキヤリヤ上に増殖
した動物細胞をインターフエロン誘発剤にて処理
するに際し、細胞が付着、増殖したミクロキヤリ
ヤを、グルココルチコイドおよび負に荷電した水
溶性高分子で処理するインターフエロン産生方法
により達成される。 まず本発明方法の前提となるミクロキヤリヤ培
養法による二倍体細胞等の係留依存性細胞の培養
方法について説明する。 ミクロキヤリヤを懸濁し、必要に応じて適当な
濃度の血清を含む、培地中に種細胞を接種し、ゆ
るやかに撹拌しながら適当な温度で培養を行な
う。 ミクロキヤリヤとしては、多糖類、たとえば、
デキストラン、デキストリン、澱粉、セルロー
ス、およびこれらの置換基誘導体等あるいはある
種の合成重合体、たとえば、ポリビニルアルコー
ル、ヒドロキシ置換アクリレート又はメタクリレ
ート、ポリスチレン等よりなる微小粒状体に適当
量のアミン残基を結合させたものなどが用いられ
る。 ミクロキヤリヤ濃度は、ミクロキヤリヤ材質、
培養すべき細胞の種類により異なるが、培地１ml
あたりのミクロキヤリヤ表面積がおよそ10cm2〜
100cm2となるような濃度範囲が好ましい。培地組
成、血清濃度等は、培養すべき細胞と種類、細胞
濃度等に応じて適当に選ばれる。 接種された細胞は、ミクロキヤリヤ表面に付着
し、増殖をはじめ、およそ数日間から10日間適当
な温度で培養を続けることにより細胞がミクロキ
ヤリヤ表面をほゞ完全に蓋いつくすまで増殖す
る。その間、必要に応じて、酸素の供給、PH調
製、栄養素の添加、培地交換等を行なう。 次にミクロキヤリヤ培養法で培養した細胞によ
るインターフエロン産生について詳しく説明す
る。 培養された細胞は、必要に応じてインターフエ
ロン誘発に先だち、インターフエロン産生を増強
せしめる目的で、低単位のインターフエロンを含
む培地でおよそ数時間ないしは１日間インキユベ
ートされる。 本発明者等は、インターフエロン誘発に先だ
ち、インターフエロン産生を増強せしめる目的で
細胞が付着、増殖したミクロキヤリヤが懸濁して
いる培地中に負に荷電した水溶性高分子およびグ
ルココルチコイドを添加することにより相乗的効
果が得られることを見出した。 負に荷電した水溶性高分子としては、たとえ
ば、カルボキシメチルセルローズ（以下CMCと
略称する）、ポリアルギネート、ポルグルタメー
ト、ペクチン等のカルボキシル基を有する水溶性
高分子、リン酸セルローズ等のリン酸基を有する
水溶液高分子、デキストランサルフエート、ヘパ
リン等の硫酸基を有する水溶性高分子等が好まし
く用いられる。これら水溶性高分子の好適な濃度
および添加の時期は、用いる水溶性高分子の種類
により、異なるためそれぞれ適当な条件が選ばれ
る。たとえば、イオン強度の弱いカルボキシル基
を有するCMCの場合には、0.05％以上１％以下、
さらに好ましくは0.1％以上0.5％以下の濃度を相
当する量を、インターフエロン誘発剤添加のおよ
そ５時間以上、更に好ましくは、10時間以上前に
添加するのが好適であり、また、イオン強度の強
い硫酸基を有するデキストランサルフエートの場
合には、0.0001％以上0.01％以下の濃度を相当す
る量をインターフエロン誘発剤の添加の直前もし
くはせいぜい１時間前に添加するのが好適であ
る。 グルココルチコイドとしてはヒドロコルチゾ
ン、ブレドニゾロンあるいはデキサメサゾンなど
が用いられるがこれらのみに限定されるものでは
ない。ヒドロコルチゾン、プレドニゾロンあるい
はデキサメサゾンの濃度としては通常0.01〜100
マイクロモル（μM）が用いられ、さらに望まし
くは0.1〜10μMが用いられる。グルココルチコイ
ドはインターフエロン誘発剤添加の72時間ないし
６時間前に、望ましくは48時間前に添加する。 グルココルチコイドは、インターフエロン産生
増強効果をあらわす濃度では、DNA合成および
たん白質合成に対し影響を及ぼすことなくRNA
合成を増強する。 グルココルチコイドのインターフエロン産生増
強効果は平面培養細胞でも見られることもある
が、ミクロキヤリヤ培養細胞においてより恒常的
にその効果があらわれる。すなわちミクロキヤリ
ヤ培養細胞を利用したインターフエロンの大量生
産に好適に利用される。 グルココルチコイドはインターフエロン誘発剤
による処理でひきおこされる細胞変性効果を速度
に調節し比較的安定して高単位のインターフエロ
ン産生を細胞に行なわせる働きを有している。 次に、いわゆるスーパーインダクシヨンもしく
はUV法でインターフエロン誘発処理を行なう。 すなわち、細胞が付着増殖したミクロキヤリヤ
を懸濁した培地中にインターフエロン誘発剤を添
加し、しかる後に、例えばスーパーインダクシヨ
ン法の場合は、シクロヘキシミド、アクチノマイ
シンＤ等の代謝阻害剤を適当な濃度、適当なタイ
ムスケジユールで添加し、適当な期間インキユベ
ートした後に、好ましくは、添加した前記の薬剤
等を含む古い培地を新しい培地と交換し、例えば
およそ１日の間インキユベートして培地中にイン
ターフエロンを産生せしめる。 細胞にインターフエロンを誘発させるインター
フエロン誘発剤としては種々のものが知られてい
るが、本発明方法にあつては、poly（Ｉ）：poly
（Ｃ）、poly（Ａ）：poly（Ｕ）等の二重鎖RNA等を
用いて最も効果的に実施される。 次に本発明の実施例について説明する。 実施例 １ 仔牛血清５％、ジエチルアミノエチル基を有す
る架橋デキストランミクロキヤリヤ0.3％を含む
イーグルMEM1200mlにヒト正常二倍体細胞を
105ケ／mlの割合いで接種し、ガラス製スピナー
フラスコでゆるく撹拌しながら37℃で５日間培養
した。途中、２回培養培地を仔牛血清５％を含む
新しいイーグルMEM培地と交換した。到着細胞
数は0.9×106ケ／mlであつた。次に、細胞および
ミクロキヤリヤを含む培地200mlづつを６本の小
型スピナーフラスコに分注した。細胞およびミク
ロキヤリヤを沈降させ上澄培地を捨て、２本のフ
ラスコにはヒドロコルチゾン1μM、仔牛血清５
％を含む新しいイーグルMEM培地を、さらに２
本のフラスコにはプレドニゾロン1μM、仔牛血
清５％を含む新しいイーグルMEM培地を、さら
に残りの２本のフラスコには仔牛血清５％を含む
新しいイーグルMEM培地をそれぞれ捨てた倍地
に等しい量加え一日培養を続ける。次に再び細胞
およびミクロキヤリヤを沈降させ上澄培地を捨
て、インターフエロン100国際単位／mlおよび仔
牛血清２％を含む培地を捨てた量に等しい量加
え、さらに先にヒドロコルチゾンあるいはプレド
ニゾロンを添加したフラスコにはそれぞれヒドロ
コルチゾンあるいはプレドニゾロンを同濃度にな
るように添加し、またさらにヒドロコルチゾンあ
るいはプレドニゾロンを添加したフラスコ各１本
とグルココルチコイドを添加していないフラスコ
１本、計３本にはそれぞれ0.2％になるように
CMCを添加し、残りの３本にはCMCを添加しな
いで37℃でおよそ20時間培養を継続した。次に
polyI：polyCを50μｇ／ml、シクロヘキシミドを
10μｇ／mlとなるように全てのフラスコに加え、
37℃で４時間インキユベートし、さらにアクチノ
マイシンＤ、4μｇ／mlを加え37℃で１時間イン
キユベートした後、細胞の付着したミクロキヤリ
ヤを沈降させ、上澄液を捨て、0.2％CMCを添加
したイーグルMEM培地を捨てた量の同量加え、
さらにこの操作をもう１回繰返した。最終的に加
えた培地で37℃で約48時間インキユベートした。
途中24時間経過した時点で約２mlの培養上清をイ
ンターフエロン力価測定用標品として抜き取つ
た。最終的に用いた培地中に24時間目までおよび
48時間目まで産生されたインターフエロンの量を
FL細胞およびヴエスイキユラー・ストマテイテ
イス・ウイルスを用いたCPE阻止法で測定し、
国際単位に換算した。結果を表１に示す。
【表】
実施例 ２
仔牛血清５％ジエチルアミノエチル基を有する
架橋デキストランミクロキヤリヤ0.3％を含むイ
ーグルMEM1.4にヒト正常２倍体細胞を1.5×
105ケ／mlの割合で接種し、グラス製スピナーフ
ラスコでゆるく撹拌しながら、37℃で４日間培養
した。途中１回培養培地を仔牛血清５％を含む新
しいイーグルMEM培地と交換した。到達細胞数
は6.8×105ケ／mlであつた。 次に、細胞およびミクロキヤリヤを含む培地
200mlづつを７本の小型スピナーフラスコに分注
した。細胞およびミクロキヤリヤを沈降させ上澄
培地を捨て一部のスピナーフラスコにはそれぞれ
定められた濃度のヒドロコルチゾンを添加し37℃
で１日培養を継続する。再び細胞およびミクロキ
ヤリヤを沈降させ上澄培地を捨てインターフエロ
ン100国際単位／ml、仔牛血清２％、CMC0.2％
および先にそれぞれ定められた濃度のヒドロコル
チゾンを添加したフラスコには先に添加したと同
濃度のヒドロコルチゾンをそれぞれ添加し、37℃
でおよそ20時間培養を継続した。 次に、polyI：polyCを50μｇ／ml、シクロヘキ
シミドを10μｇ／mlとなるように全てのフラスコ
に加え、37℃で４時間インキユベートし、さらに
アクチノマイシンＤ、4μｇ／mlを加え37℃で１
時間インキユベートした後、細胞の付着したミク
ロキヤリヤを沈降させ、上澄液を捨て、0.2％
CMCを添加したイーグルMEM培地を捨てた量
と同量加え、さらにこの操作をもう１回繰返し
た。最終的に加えた培地で37℃で約48時間インキ
ユベートした。最終的に用いた培地中に48時間目
まで産生されたインターフエロンの量をFL細胞
およびヴエスイキユラー・ストマテイテイス・ウ
イルスを用いたCPE阻止法で測定し、国際単位
に換算した。結果を添付図面に示す。
架橋デキストランミクロキヤリヤ0.3％を含むイ
ーグルMEM1.4にヒト正常２倍体細胞を1.5×
105ケ／mlの割合で接種し、グラス製スピナーフ
ラスコでゆるく撹拌しながら、37℃で４日間培養
した。途中１回培養培地を仔牛血清５％を含む新
しいイーグルMEM培地と交換した。到達細胞数
は6.8×105ケ／mlであつた。 次に、細胞およびミクロキヤリヤを含む培地
200mlづつを７本の小型スピナーフラスコに分注
した。細胞およびミクロキヤリヤを沈降させ上澄
培地を捨て一部のスピナーフラスコにはそれぞれ
定められた濃度のヒドロコルチゾンを添加し37℃
で１日培養を継続する。再び細胞およびミクロキ
ヤリヤを沈降させ上澄培地を捨てインターフエロ
ン100国際単位／ml、仔牛血清２％、CMC0.2％
および先にそれぞれ定められた濃度のヒドロコル
チゾンを添加したフラスコには先に添加したと同
濃度のヒドロコルチゾンをそれぞれ添加し、37℃
でおよそ20時間培養を継続した。 次に、polyI：polyCを50μｇ／ml、シクロヘキ
シミドを10μｇ／mlとなるように全てのフラスコ
に加え、37℃で４時間インキユベートし、さらに
アクチノマイシンＤ、4μｇ／mlを加え37℃で１
時間インキユベートした後、細胞の付着したミク
ロキヤリヤを沈降させ、上澄液を捨て、0.2％
CMCを添加したイーグルMEM培地を捨てた量
と同量加え、さらにこの操作をもう１回繰返し
た。最終的に加えた培地で37℃で約48時間インキ
ユベートした。最終的に用いた培地中に48時間目
まで産生されたインターフエロンの量をFL細胞
およびヴエスイキユラー・ストマテイテイス・ウ
イルスを用いたCPE阻止法で測定し、国際単位
に換算した。結果を添付図面に示す。
添付図面は実施例２の結果を示すものである。
横軸がヒドロコルチゾン濃度（μM）、縦軸がイ
ンターフエロン力価（国際単位／ml）を示す。
横軸がヒドロコルチゾン濃度（μM）、縦軸がイ
ンターフエロン力価（国際単位／ml）を示す。
Claims (1)
- １ 正に荷電した化学的残基を有するミクロキヤ
リヤ上に増殖した動物細胞をインターフエロン誘
発剤にて処理するに際し、細胞が付着、増殖した
ミクロキヤリヤを、グルココルチコイドおよび負
に荷電した水溶性高分子により処理することを特
徴とするインターフエロン産生方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55169103A JPS5794290A (en) | 1980-12-02 | 1980-12-02 | Method for producing interferon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55169103A JPS5794290A (en) | 1980-12-02 | 1980-12-02 | Method for producing interferon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5794290A JPS5794290A (en) | 1982-06-11 |
| JPH0123119B2 true JPH0123119B2 (ja) | 1989-05-01 |
Family
ID=15880355
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55169103A Granted JPS5794290A (en) | 1980-12-02 | 1980-12-02 | Method for producing interferon |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5794290A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59179074A (ja) * | 1983-03-30 | 1984-10-11 | Toray Ind Inc | 細胞培養方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2821466A1 (de) * | 1978-05-17 | 1979-11-29 | Thomae Gmbh Dr K | Verbessertes verfahren zur herstellung von humaninterferon |
-
1980
- 1980-12-02 JP JP55169103A patent/JPS5794290A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5794290A (en) | 1982-06-11 |
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