JPS59179074A - 細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト２倍体線維芽細胞の培養方法に係わるもの
である。さらに詳しくはヒト２倍体線紺芽１ｆｌ１１胞
のミク［１キヤリＶ培養に係わるものである。

〔１へ２化体線維芽細胞はインターフェロン、ウィルス
ワクチンあるいはウロキナーゼをはじめどづる酵素など
牟有用物質の生産基質として用いられているか、従来は
その接着依存性のゆえにガラス表面上あるいはプラスチ
ック表面上での平面培養あるいはローラーひんを用いる
回転培養で培養されていたため大量培養化が困難であっ
た。しかし近年ミクロキャリヤ培養法が開発され、ヒト
２１８体線維芽細胞なとの接着依存性細胞にも適用でき
るようになり大量培養が容易になった。ミクロキャリヤ
としてはジエチルアミンエチル基などの化学残基を結合
した架橋デキス１ヘランビーズあるいは変性コラーゲン
を結合させた架橋デキス１〜ランヒーズがよく用いられ
る。ミクロキャリヤ培養とは、これらのミクロキャリＡ
７を液体培地中に浮′ｆｉ懸濁させ、このミクロキ１？
すＶ表面上に細胞を接着、増殖せしめる細胞培養法であ
り、いわば擬似浮遊培。

養ともいえる方法である。接着依存性細胞の培養法とし
て一般に行なわれている平面培養あるいはローラー培養
法と比べて、ミクロキ１７すＡ７培養法はスケールアッ
プが容易であり、また細胞密度を高めることが可能であ
るというメリットが考えられる。しかしミクロキトリＡ
フ培養と平面培養では細胞と培養基質の間の接着様式が
異なることが考えられる。すなわち架橋デキストラン系
統の累月のミクロキトリヤは培地中では水分を含んで膨
潤した状態となり、ふつう水分含有率９０％以上となる
。細胞はミクロキトリヤの糖鎖に結合したジエチルアミ
ノエヂル基などの残基あるいは変性コラグン分子を足が
かりにしてミクロキャリヤに接着すると思われる。

ジエヂルアミノエチル基のついた糖鎖あるいは変性コラ
ーゲン分子は培地中で゛可撓性をイ１していると思われ
、デキストラン系ミク【コギトす＼７はいわば軟らかい
培養基質といえる。これに対し、通常の平面培養に用い
るｊＢ　ＷＪ基質はカラスあるいはポリスチレンなとの
プラスチックであり、含水率は非常に低くまた可撓性も
乏しいと考えられ、いわば硬い培養基質といえる。軟ら
かい培養基買上に接着、増殖した細胞は培養液側からの
みでなく裏側すなわち培養基質側からも栄養分あるいは
酸素などを摂取できると思われる。

またミクロキャリヤ培養法ではミクロキャリヤを何らか
の方法で浮遊、懸濁させることか必要となる。最も一般
的にはタービン翼なとで回転撹拌を行なうが、流動床方
式なども考案されている。いずれにしても静置平面培養
の場合と異なり、ミクロキャリヤ培養ではミクロキトリ
Ａフ上の細胞と培地の間には相対的な運動があり、細胞
の微小環境は維持され難い。ざらに接着様式にとどまら
ず、ミクロキャリＡ７表面上の細胞とガラス表面上ある
いはプラスデック表面上の細胞は１」貿を異にしている
可能性かある。

我々はヒト２倍体線維芽細胞のミクロキャリヤ培養法に
よる大量培養を目積して鋭意研究を続（プだ結果、カラ
ス表面上あるいはプラスチック表面上の細胞とミクロキ
ャリヤ表面上の細胞はその栄養要求性を異にすることを
見い出した。

すなわちヒト２倍体線維芽細胞の培地に加える添加物の
影響がミクロキャリＡ２表面上とカラス表面あるいはプ
ラスチック表面上では異なることを見い出した。

すなわち本発明は、ヒト２倍体線眉１芽細胞をミクロキ
ャリヤ上にて培養するに際し、血清とグリココチコイド
を含む培地を用いることを特徴とする細胞培養方法を提
供ターるものである。

一般に動物細胞の培養にはウシなどの動物の血清を５〜
２０％添加したイーグルＭＥＭ培地などが用いられるが
、本発明のヒト２１８体線組芽細胞の培養の培地も例外
ではない。血清中には細胞の増殖に必要不可欠な物質と
ともに細胞の増殖に対して悪影響を及ぼす物質も合まれ
でいる。ヒト２倍体線維芽細胞の培養にはウシの血清が
好ましいとされている。ウシの血清は若令のものから並
べると、ウシ胎児血清 （Ｆｏｅｔａｌ　ｃａｌｆ　　ｓｅｒｕｍ　、　Ｆｅ２
．　誕生前８〜３ケ月令）、初乳を飲む前のウシ新生児
血清（Ｐｒｅｃｏｌｏｓｔｒｕｍ　ｎｅｗｂｏｒｎｅ　
　ｃａｌｆ　　ｓｅｒｕｍ　。

ＰＮＣ３，誕生Ｏ日令）、ウシ新生児血清（Ｎｅｗｂｏ
ｒｎｅ　ｃａｌｆ　　ｓｅｒｕｍ　、　ＮＣ３，１〜１
０日令）、仔ウシ血清（Ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ　、　Ｃ
８，３ケ月令Ｊて）および成牛血清（Ｂ　ｏｖｉｎｅ　
ｓｅｒｕｍ　。

ＢＳ、６ケ月令以上）となるが、本発明方法で＋、１Ｆ
Ｃ３，ＰＮＣ３またはＮＣ８が好ましく用いられる。

本発明の培地は、血清とともにグサココルチコイドを含
むことを必須とする。グサココルヂおよび脂肪代謝にも
及びまた膜の安定化効果などもいわれている。

本発明キのグ袂ココルチコイドとしては、ハイドロコー
チシン、プレドニロンもしくはデキサメサゾンまたはこ
れらの混合物が好ましく使用される。

グサココルチコイドは無血清培地を用いてカラス表面上
あるいはプラスデック表面上で細胞を培養する際によく
用いられる培地添加物の一つであるが、血清を添加した
培地では用いられることは少ない。しかし後述の実施例
から明らかな様に、ヒト２倍体線維芽細胞のガラス表面
上あるいはプラスチック表面上での培養系で血清含有培
地、。グ２次：ｌ：ｌルヂっ伺、へ加効果は、いかなる
濃度においても細胞増殖促進効果は見られない。しかる
にヒト２倍体線維芽細胞のミクロキャリヤ表面上の培養
系では、血清含有培地への適当量のグ≠ココルチコイド
添加は著しい細胞増殖促進効果および寿命延長効果を、
示す。

ミクロキャリヤ培養系へのグサココルチコイト添加効果
は１０−８　Ｍ程度の微量でもあられれるが、１０”Ｍ
以上になるとむしろ細胞増殖を阻害する傾向が見られる
。血清添加培地を用いてヒト２倍体線維芽細胞をミラ１
］キヤリヤ培養１し する場合の好ましいグ≠ココルチコイド添加用は１０−
８〜１０−５Ｍであり、さらに１０−７〜１０　’　Ｍ
の範囲が最も好ましい。

本発明のミクロキレリヤとしては、ヒト２倍体線帷芽ｉ
胞が接着するものであれｔま特に限定されないが、ジエ
チルアミンエチル基などの化学残基を結合した架橋デキ
ストランビーズあるいは変性コラーゲンを結合させた架
橋デキストランヒ゛−スなど゛が０？ましく用いられる
。

培地とし−Ｃは、通常のものを適宜用いること発明では
この培地に血清とグ＃ココルヂコイドを含有さぜること
を特１毀とするが、グルコース、カザミノ酸、ペプトン
などをさらに添加しても構わない。

これらの培地にミクロキャリヤを浮遊、Ｄ濁させ、その
中に種細胞を接種し、ゆるやかに撹拌しながら培地を適
当なＩＩＨ，温度に制御し培養を行なう。ミクロキャリ
ヤ濃度はミクロキャリＶ材質、培養すべき細胞の種類に
より異なるが、培地１ｄあたりのミクロキャリヤ表面積
がおよそ１０ｃＡ〜１１００ｃとなるような淵１哀範囲
が好ましい。培養中適宜培地交換を実施し、数日間〜１
０日間培養を行ない、ミクロキＰすＶ表面を細胞がほぼ
完全に覆いつくずまで、続りる。

／ 本発明方法で培養・増殖した細胞はインターフェロンの
産生に特に適した細胞である。インターフェロンは、培
養細胞をインターフェロン誘発剤で処理することにより
産生Ｊることかできる。インターフェロンをＮＣ外さＶ
る技術としでは、天然型もしくは合成ＲＮＡなとのイン
ターフェロン誘発剤を用いて細胞を刺激し、インターフ
ェロンを産生きせる方法、カルシウム法と呼ばれるイン
ターフェロン誘発剤を用いる際もしくはその１０数時間
前から培地中に適量のカルシウムを加えてインターフェ
ロンｌＩＣ生を一層増強せしめる方法、スーパーインダ
クション法と呼ばれる二重鎖ＲＮＡなとのインターフェ
ロン誘発剤を用いて細胞を刺激した後、シクロヘキシミ
ド、アクチノマイシンＤなどの代開明害剤で細胞を処理
づ“ることによりインターフェロン産生を一層増強せし
める方法、ＵＶ法と呼ばれるインターフェロン誘発剤を
用いて細胞を刺激する前後数時間の間に細胞に紫外線を
照射してインターフェロン産生を一層増強せしめる方法
などがある。

本発明方法は前述の様に著しい細胞増殖促進効果および
ズｉ−命延長効果を示すが、ざらに血清の使用量を低減
させるという効果がある。細胞ｊ６符に用いる血）へは
、高価でしかも供給が限られているため細胞培養法によ
り物質生産をする場合、血清使用量は最大のコスト要因
となると同時にスクールアップの限界をも規定する。従
って血清使用量低減に成功すればその効果は大ぎい。本
発明のグ≠ココルチコイドはヒト２４８体線糺曳ｆ（Ｉ
Ｉ胞のミクロキャリヤ培養においてまさにこのような効
果を示ず。

また、本発明のり＃ココルチコイド添加培地を用いて増
’ＡＩ′：さけたミクロキャリヤ培養細胞のインターフ
ェロン産生能は、グ拐ココルチコイド無添加培地を用い
て増殖さしたミクロキャリヤ培養細胞のそれより高い１
ノベルを示Ｊ０以下に実施例を用いてグ与ココルヂ］イ
１へのミクロキャリヤｉ８ｍ系における効果をハイド１
」コーチシンを用いた例で説明する。合ゎ１て比較例と
して平面培養とミクロキ４７す゛１７培養ぐのヒト２倍
体線紺芽細胞の増殖に対するクサココルチコイドの相反
する効果を示づ。

実施例１ ガラス製ルーびん（細胞付着面積的１５０ｃｆｆｌ）３
本で培養したヒト新生児包皮由来２倍体線帷芽細胞（Ｄ
　Ｉ　Ｒ−３）２．４Ｘ１０γケをジエチルエチル基を
有するミクロキャリＡ’　０．６　Ｓ／を含むＰＮＣ８
５％添加イー　クルＭ　ｌ三Ｍ培地２００ｍρに接種し
、３７°Ｃでスピナー培養ひ／υ中で１伏目のミクロキ
ャリヤ培養を開始づる。培養途中２日目毎に撹拌を止め
、ミクロキャリ１７を沈降させ上澄のｔ８養液から１８
０ｍｇを抜き出し、再び同じ組成の新たな培地を１８０
雇加えることにより９０％培地交換し６０間培養を絹、
続しｌ〔ところ顕微鏡観察の結果、ミクロキサ９１フ表
面ははと／Ｖど細胞で覆われた。培養途中および６口重
に一部のミクロキャリー（７怠濁液を採り、１）３法に
従い細胞数を目数したとこる第１図に示づように１曽殖
していることが判った。６口重の却１胞数は２００成あ
たり１．８Ｘ１０８て゛あった。

ＰＢＳ−で細胞の（＝Ｊ”ｌ：＋＝　したミクロキャリ
ヤを洗浄後、トリプシンを用いてミクロキャリ■から細
胞を遊離せしめることにより細胞１．４４Ｘ１０８りｄ
−３よひミクロキトすＡｙ　０．６　ａを含む懸濁’ａ
　６０　ｙ＋Ｑを冑た。このうち４０ｍをとり４等分し
て１ｏｎｅ（！−リ゛つを、それぞれ新１〔なミクロキ
ャリ＼７０．５９および以下に記載した４種の組成の培
地各１９ＯｎＺｅづ゛つを含む新たなスピナー培養ひ／
Ｖに加え再び培養を継続する（ミクロキャリー＼７培養
２伏目〉。このような操作をミクロキャリＸ７培養の継
代と呼ぶ。この時の細胞接種温度は１．２　Ｘ　１０”
／ｍρである。この時用いた４９０％を同し組成の培地
で交換し６日間培養を継続する。そこで再びミクロキＡ
・リヤ培養の継代操作を行ない、それぞれ前に用いたと
同し組成の培地２本ずつ合旧８本のミクロキャリ℃フ培
養を継続する。接種細胞濃度はそれぞれ１．２×１０５
　／ｄで行なった。６日間培養後、それぞれの培地組成
の各１本はブライミングｊ理を行なう。すなわち撹拌を
止め、ミクロキトすＡｙを沈降させ上澄培地１８０ｄを
捨Ｔ　、最終′ａ度１００１Ｕ／ｄのインターフェロン
と０．２％カルボキシメチルセルロースを含むイーグル
ＭＥＭ培地を培養液量が２００　ｍＱになるように加え
２０時間培養を継続づる。つづい−Ｃ再び撹拌を止め、
ミクロキャリヤを沈降させ上澄のうち１．ＯＯｄを捨て
ポリＩ：ポリＣを最終濃厚５０μ９／ｄおよびシクロヘ
キシミドを最終温度１０μ９／ｄとなるように添加し、
４時間培養後アクチノマイシンＤを最終濃度４μＵ／威
となるように加え１時間培養する。この時点で再びｌｆ
Ｊ拌を止め、ミクロキャリＡ７を沈降μしめ上澄培地を
可能な限り（約８０ｄ）除去し、メチルセルロース０．
０５％を添加したイーグルＭ　ＩＥ　Ｍ培地１８０ｍＱ
を加え、１分間撹拌したのち撹拌を止め、ミクロキャリ
ヤを沈降せしめ上澄を可能な限り（約１８０ｄ）除去す
る。このような操作で細胞のついたミクロキャリヤを洗
浄１−る。メチルセルロース０．０５％を添加したイー
クルＭ　ＥＥ　ｔｖｌを培養容積が２００ｄになるよう
に（約１８０ｍｆｆ）加え、３７℃で４８時間培養を継
続づる。培養上清中に放出されたインターフェロン相を
ＦＬ細胞およびウエスイキュラー、ス１〜ンテイテイウ
イルスを用いたＣＰＥ阻止法−Ｕホｌｌ定し国際単位に
換紳した。

残りの各１本は再びそれぞれ前に用いたと同し培地で各
２本、接種■１胞濃度１．２Ｘ１０５／威で継代培養を
繰返ず（ミクロキャリＸ培養３代目）。たたしこの時、
ＦＣ８５％添加イーグルＭＥＭを用いた培養は細胞が増
殖しなかった。

同様に６日間培養後、各１本はインターフ１０ン産生実
験を行ない残りの各１７１＼）よＳ鉢代したくミクロキ
ャリヤ培養４伐目〉。第１図に各種培地を用いて行なっ
たミクロキトす１７に１２＋代培養経過を、表１に６日
目の到達細胞数とインターフェロン産生実験の結果をそ
れぞれ示ツ、。

第１図から明らかようにミクロキャリレ培養に用いる培
地としては、ＰＮＣ８５％Ｊ５よひハイドロコーチシン
１μＭ添加イーグルＩＶＩ　Ｅ　Ｍ、ＦＣ８５％ａ３よ
ひハイドロコーヂソン１μＭｍ加イーグ／Ｌ、ＭＥＭ、
ＰＮＣ３５％添ＩＩＩ　イー　クルＭＥＭおよびＦＣ３
５％添加イーグルＭ　Ｅ　Ｍの順に増殖支持能が高い。

特にｒ−ｃ　ｓ　ｂ％のみ添加したイーグルＭＥＭ培地
では継代ｊ８養か不能となる。また表１には各種培地を
用い゛Ｃ培＆　シた細胞によるインターフｊ］」ン産勺
、を示した。

実施例２ ガラス製ルーびん３本で培養しｌ〔ヒ１〜新生児包皮由
来２倍体線維芽細胞（Ｄ　Ｉ　Ｒ−２）　３ｘ１０７ケ
をミクロキャリヤ０．６ｇを含むＰＮＣ３５％添加イー
グルＭＥＭ培地２００厩に接種し、３７℃でスピナー培
養びん中で培養する。培養途中３日目に培地の９０％を
同じ組成の培地で交換し、５日間培養を継わ、したどこ
ろミクロギヤ９１フ表面はほぼ完全に細胞で覆われた。

細胞数は２００ｍあたり１．６Ｘ１０１’であった。Ｐ
ＢＳ−で細胞の付着したミクロキャリヤを洗浄後１〜リ
プシンを用いてミクロキャリヤから細胞を遊離せしめる
ことにより、ｊ１１１胞１．５Ｘ　１０８　ケ；Ｊ３．
Ｊ：ヒミ’７　口：Ｆ　ヤｊＪ　１７０．６　Ｕを含む
懸１蜀液５０ｍＱを（ｌｊｌた。このうら８舵づ′つを
以下に記載した３種の組成の培地１９２　ｍＱずつとミ
クロキャリヤ０．５９ずつとを含むスピナー培養びん３
本に加えれ寧代培養−りる。この日４の細胞接種濃度は
１．２　Ｘ　１０５　／ｍＵ’ｃ′ある。この時用いた
３種の組成のＪＢ地は、Ｉ−）Ｎ　Ｃ３５％添加イーグ
ルＭＥＭ、ＰＮＣ３２％およびハイドロコーチシン１μ
Ｍ添＋１０イーグルＭＥＭおよび１−’　Ｎ　Ｃ８２％
添加イーグルＭ［ＥＭである。培養途中で３日目に培地
の９０％をそれぞれ同じ組成の培地で交換し５日間培養
を継続づる。この時点て細胞数を削放し、１００１Ｕ／
ｄのインターフェロンと０．２％カルボキシメヂルセル
ロースを含むイーグルＭＥＭ培地でブライミング／ｄを
加え４時間培養後、アクチノマイシン０４μ（ｊ／ｄを
加え１時間培養づる。、１回ミクロキ１７リヤを洗浄後
、メチルセルロース０．０５％を添Ｉｌｌ　Ｌだイーグ
ルＭＥＭを１８養容積が２００ｍＱｉこなるＪ、うに加
え、３７°Ｃで４８１１５間培養を継続する。培養土清
中に放出されたインターフ」ロン量をＦ　Ｌ細胞および
ウエスイキュラー、ストマティティスウイルスを用いた
ＣＰＥ阻止法で測定し国際単位に換算した。表２に培地
組成と到達ｍ層数およびインターフェロン収□□□を示
した。

表２からハイドロコーチシン添加により血清使用ｍを５
％から２％に低減できることか明らかである。

以　　下　　余　　白 比較例１ ガラス製ルーびん７木で培養したＤＩＲ−３細胞りＸ１
０７ケをＦＣ８５％添加イーグルＭ　Ｅ　Ｍ培地５０Ｒ
認に１する１、この細胞慰濁液のうち’１．４ｍｌずつ
をそれぞれ４８．６　ｍＡずつのＦ　Ｃ３５％添加イー
グルＭＥＭを含むルーひんに加え、そのうち１本にはハ
イドロコーチシン水溶液（ｍ度０．５ミリモル）０．１
　ｍＱを加える。

ルＭＥＭ１７８ａｅを含む５００ｄ容端のスピナー培養
びん２本に加え、そのうち１木にはざらにハイドロコー
チシン水溶液（ａ度Ｏ１５ミリモル）０．４ｍを加える
。ル−びんは３７°Ｃで５日間培養しく平面培養１伏目
）、この時点でトリプシン消火により細胞を浮遊させ、
それぞれ細胞数を計数し一部の細胞を採取し、植込・力
線層数が１．１　Ｘ　１０４’／ＩｎＩ！となるように
それぞれ前に用いたと同じ組成の新しい培地を含んだ新
たなルーびんに継代する（平面培養２伏目）。６日後に
同様に細胞数を８４数し再び継代する。このような操作
を繰返し、平面培養で５回継代培養を繰返した結果を第
２図ａに示す。一方、２本のスピナー培養びんち３７℃
で培養を開始し、３１目、５　Ｅｌ　１．１に培地の９
０％をそれぞれ同し組成の新しい培地で交換し随時細胞
数を計数する〈ミクロキャリＶ培養１伐目）。７白目に
それぞれのミクロキャリヤ培養細胞をＰＢＳ−で洗浄後
１〜リブシン処理によりミクロキャリＶからｊ輪離せし
め、細胞およびミクロキャリヤ懸濁液を得る。この懸濁
液の一部と、それぞれ前に用いた同じ組成の新しい培地
を合わせ、接種細胞濃度１．１Ｘ１０Ｓ／ｄ、ミクロキ
Ｖリヤｉ１８度３　ｍｇ　／　ｄで再びミクロキャリヤ
培養系を構成する（ミクロキャリヤ培養２代目）。この
ような操作を繰返し４回継代培養した結果を第２図すに
示す。第２図ａ　、−ｂの比較から明らかなように平面
ｉ８養ではハイドロコーチシン添加により細胞増殖シよ
抑制されるのに比べ、ミクロキャリヤ培養ではハイドロ
コーチシン添加は細胞増殖に必須である。ミクロキャリ
゛ヤ培養１〜２伏目は平面培養での前培養の効果がひき
つづいているためハイドロコーチシンの効果が少ないが
３代目では差が顕箸となり４代目ではハイドロコーチシ
ン無添加ではもはや全く増殖不能となる。

比較例２ プラスチック組織培養フラスコ（１フラスコ、細胞イ」
着面積１５０ｃｍ＞３本で培養したＤＩＲ−２細胞３Ｘ
１０７ケをＰＮＣ８５％添加イーグルＭＥＭ３０ｍｉ！
に懸濁する。この細胞懸濁液１、０　ｄを４８．６　ｄ
のＰＮＣ８ｂ％添加イーグルＭＥＭを含むＴフラスコに
加える。残りの細胞懸濁液のうち２２蔵をミクロキャリ
ヤ０．６’ｌ？とＰＮＣ８５％添加イーグルＭＥＭ１７
８威を含むスピナー培養びんに加える。■フラスコは６
日間培養したところ細胞数はＩ　Ｘ　１０７に達した。

スピナー培養びんは２日目毎に９０％１地を交換し６日
間培養したところ細胞数は１．６×１０８に達した。そ
れぞれｌ〕ｌ−３３−で洗浄後１へリプシンにより細胞
懸濁液を調製し、Ｔフラスコ由来の細胞は再び−［フラ
スコ５本に、スピナー培養び／υ由来の細胞は再びスピ
ナー培養びん５本にそれぞれ継代した。培地はともにＰ
ＮＣ３５％添加イーグルＭＥＭに第３図に示した量のハ
イドロコーチシン川を添加したものを用いた。接種細胞
数は１０６／Ｔフラスコおよび２．２Ｘ１０７／スピナ
ー培養ぴんとした。

前と同様に６日間培養後それぞれ細胞数を計数した結果
を第３図に示した。

Ｔフラスコを用いた平面培養ではハイド７’−チゾン無
添加の場合最も良好な増殖示すのに対し、スピナー培養
フラスコを用いたミクロキャリψ培養ではハイドロコー
チシン１０−６Ｍ添加で最も良好な増殖を示した。

実施例３ カラス製ルーびん８本で培養したヒト新生児包皮由来２
倍体線維芽細胞（ＤＩＲ−２＞９．６×１０７を含む４
０成の細胞懸濁液を調製し、その］Ｏｄ　タ”つを変性
コラーゲンを結合したミクロキャリｒ　０．８９ずつお
よび以下に記した２種の組成の培地各１９０ｄずつを含
むスピナー培養びん２本ずつ（計４本）に加えミクロキ
レリヤ培養を開始する（ミクロキャリ−１ア培養１代目
）。この時用いた培地はＦＣ８５％添加イーグルＭ　Ｅ
　Ｍ　ｆ３よびＦＣ８５％、ハイドロ」−デシン１μＭ
添加イーグルＭＥＭの２種である。

培養途中３日目と５日目に培地の９０％を同じ組成の新
しい培地で交換し７日間培養を継続したところ、細胞数
はＦＣ８５％添＋ＪｎイーグルＭＥＭを用いた培養びん
２本ではそれぞれ８．０Ｘ１０５／ｍ１および８．／’
Ｉ　Ｘ　１０５／ｌｎｆ！、　Ｆ　Ｃ３５％、ハイドロ
コーチシン１μＭ添加イーグルＭＥＭを用いた培養びん
２本ではそれぞれ１２．５Ｘ１０５／ｄおよび１３．５
Ｘ１０５／ｄであった。同じ組成の培地で培養した２木
の培養びんの細胞ミクロキャリヤおよび培地を１本に合
わせ、再び２本に均等に分割りる。そのうち各１本はブ
ライミング処理を行なったのちインターフェロン産生実
験に用いた。残りの１本ずつはそれぞれ前に用いたと同
じ組成の培地を用いて植込み細胞数１．２Ｘ１０５／ｄ
で゛継イ曳づるくミクロキＡ・す（７培養２代目）。前
と同（菜に３日目、５日目にそれぞれ培地の９０％を１
同じ組成の新しい培地で交換し７日間培養を継続した。

細胞数はＦＣ８５％添加イーグルＭＥＭを用いｌこ培養
では７．８Ｘ１０５／厩、ＦＣ３５％、ハイドロコーチ
シン１μＭ添加イーグルＭＥＭを用いた培養で′は９．
９Ｘ１０５／ｄであった。

これらのｍ１１泡はそれぞれプライミング処理を施した
後、インターフェロン産生実験に用（１１こ。

インターフェロン産生実験の結果と到達ｍ胞故を表３（
こ示し１こ。

以　　下　　余　　白

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の結果を示す図である。第２図は比較
例１の結果を示す図であり、ａは平面ｊ８養をｂはミク
ロキャリ７培養を各々示す。 第３図は比較例２の結果を示す図である。 １・・・・・Ｐ　Ｎ　ＣＳ　ａ３よひハイドロコーチソ
ｌ／　ｍ加イーグルＭＥＭ培地 ２・・・・・・Ｆ　ＣＳ　Ｊ＞よひハイドロコーヂゾン
添加イーグルＭ　［Ｅ　Ｍ培地 ３・・・・１−）Ｎ　ＣＳ添加イーグルＭＥＩ１培地４
・・・・・・Ｆ　ＣＳ添加イーグルＭト１ｖｌ培地特許
出願人　東し株式会社 培養　日　数 第１図 ｊき　　養　　日　　ぞ（ 第　　２　　図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ヒト２倍体線繊維芽細胞をミクロキャリＡフ
   上にて培養するに際し、血清とグルココルチコイドを含
   む培地を用いることを特徴とづる細胞培養方法。
2. （２）血清かウシ血清である特許請求の範囲第（１）細
   胞培養方法。 ル （４−）　　グサココルチコイドがハイドロコーチシン
   、プレドニゾロンもしくはデキサメザゾンまたはこれら
   の混合物である特許請求の範囲第（１）項記載の細胞培
   養方法。