JPH01233298A - 抗体、その製造法、ｈｍｌｃを測定するための試薬、ならびにモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、心筋ミオシン−Ｌ鎖（ＨＭＬＣ）に対する特
異的抗体、その製造法および該抗体をＢＭＬＯの測定の
ための免疫試薬に使用することに関する。

従来の技術 ミオシンは、約５０００００の分子量を有する蛋白質で
ある。ミオシンは、約２０００００の分子量を有する２
個のＥ鎖、約２６０００の分子量を有する２個のＬ鎖１
　（ＨＭＬＣ１）および約１８０（７０の分子量を有す
る２個のＬ鎖Ｂ（ＨＭＬＣｌ　）からなる。ミオシンは
、心筋および骨格筋の太いクイ２メント中に存在する。

梗！１に不可避の心筋壊死によりミオシンが分解するこ
とがらＨＭＬＣは、血漿中に達し、それ故に心筋梗塞の
診断および経過制御に適当であると思われるのみならず
、心筋損傷の程度を越えて壊変をも生じうる特異的パラ
メーターを生じる（サーキュレーション（Ｃ１ｒｃｕｌ
ａｔｉｏｎ　）５８　（１９６８）　１１３０１．Ｔａ
ｐ、　Ｃａｒｄｉｏ、　！。

４４（１９８０）　１８５、Ａｍ、　Ｊ、　Ｃａｒｄｉ
ｏｌ。

４１　（１９７８）６４１、サーキュレーション（０１
ｒｃｕｌａｔｉＯｎ　）　６０　Ｃ補遺１）（１９７９
）１６９）。

血漿中のＨＭＬＣの半減期は約７０〜８０分間で極めて
僅かであるので、梗塞の確率事象ないしは広幅の経過曲
線による後の減少により、ＨＭＬＣ！の放出は持続して
いるものと推測することができる。従って、兎に角一定
の１梗塞酵素′ＯＸ、ＯＫ−ＭＢＸ　ＧＯＴおよびＬＤ
Ｈとは異なり、ＨＭＬＣを測定することにより確実な診
断および経過制御が可能となる。更に、不安定な狭心症
の判断を確実に明言することも可能になると思われる。

それというのも、このような場合には、恐らく存在する
であろうと思われる心筋梗塞によって同様にＨＭＬＣは
一掃されるからである（　Ａｍ、　Ｊ、　０ａｒｄｉｏ
ｌ　５４　Ｃ１９８４）　９６４　）。

しかし、この場合には僅かなＢＭＬＯ量のみが血漿中に
到達するので、敏感で特殊な測定法が必要とされる。通
常、このような場合には、殊に免疫測定法が検出法とし
て適当である。

ＢＭＬＯのラジオイムノアッセイは、既にＡｍ。

Ｊ、０１ｌｎ、　Ｐａｔｈ、　７１　（１９７８）　３
０９〜３１８に記載されている。これは、競合的ラジオ
イムノアッセイであり、この場合試料からのＨＭＬＣお
よび沃素化ＨＭＬＣは、固体相に吸嘴されているポリク
ローナル抗体の８囲で競争的阻害する。しかし、この方
法の欠点は、ＨＭＬ（３と骨格筋−Ｌ鎖（ＳＭＬＣ）と
の交叉反応性が使用感れる抗血清に対して３、８％であ
ることＫある。

実際に、ＨＭＬＣに対する抗血清ｉ　ＳＭＬＣ抗体を除
去することによって浄化するか或いはアフイ；ティクロ
マトグラフィーで分取することによつて浄化することが
提案されているが、それによってこれまでにＳＭＬＣと
の十分に僅かな交叉反応を示す、ＨＭＬＣに対する抗体
を提供することはできなかった。すなわち、Ｊａｐ、　
０１ｒｃｕ１ａｔｉＯｎ４４（１９８０）１８５〜１８
６には、免疫サン間インチ試験で交叉反応率は８％であ
ることがａ認されていた。０１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　５
８　（１９７８）１１３０〜１１３６には、免疫サン間
インチ試験で交叉反応率は２．９〜１０％であることが
報告されて込る。それに応じて実際の交叉反応率は、本
質的に高い。２．９％の免疫サンＶインチ試験で測定さ
れた値については、実際の交叉反応率は、（２，９）”
％、すなわち８．４％である。

モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ工ｍ
ｍｕｎｏｌＯｇ７　）　１９　（１９８２）　４５１〜
４５５には、前記欠点を、ポリクローナル抗体の代りに
モノクローナル抗体を使用することによって克服するこ
とが試みられてｂる。しかし、またこの抗体は、不満足
な交叉反応率（１７％）のみを示す。また、欧州特許第
２０５１７７号鞠細書釦記載されたモノクローナル抗体
は、特異的１１ＭＬＯ−測定には不適当である。患者の
血清からのＨＭＬＣど反応する、前記欧州特許明細書に
記載された全部の抗体は、十分ＫＩＩＩＩＭＬＣｉとも
反応する。

発明を達成するための手段 本発明の目的は、前記欠点を克服しかつＳＭＬＣＩｃ比
して僅かな交叉反応率を有するＨＭＩ、（：！に対する
抗体およびこの種の抗体の製造法を提供するととくある
。

本発明の対象は、５％以下、有利に２％以下、特に有利
に１％以下のＳＭＬＣＫ比しての交叉反応率を有するＨ
ＭＬＣに対する抗体である。この種の抗体は、次に記載
した本発明方法により得ることができる。

本発明の他の対象は、１つの動物種をヒトＨＭＬＣで免
疫化しかつ粗製血清を取得することによってＨＭＩ、Ｏ
に対する抗体をシ造する方法であり、この方法は、粗裂
血−ａｔ場合によっては予備ｎ羨後に１珪Ｒ＃Ａを基礎
とするＳＭＬＣ−免疫吸着剤でのネガティブの免疫吸着
により精製することを特徴とする。

意外なことに、本発明方法によれは、ＳＭＬＣに対する
交叉反応率が５％以下、有利に２％以下、特に有利に１
％以下にある、ＨＭＬＣに対する抗体ｔ−得ることがで
きることが判明した。

交叉反応率の測定は、ＨＭＬＣもしくはＥＩＭＬＯを固
定相として使用しかつＳＭＬＣに対する抗体を試料につ
き最大０．１μμ使用する際に行なわれた。検出反応は
、ｌ（ＭＬＣ！−抗体のＦｃｒ一部分の方向に向いた抗
体と、測定可能な基（例えば、ＰＯＤ　）とからの結合
体により行なわれた。

ＨＭＬＣおよびＳＭＬＣは、例えばＣ１ｒｃｕ１．　Ｒ
ａｇ。

１９（１９８５）６１１およびＢｉｏｅｈｅｍ、　Ｊ。

１１９（１９７０）３１に記載逼れているように当業者
に周知の方法により、心筋ないしは骨格筋から単離する
ことができる。免疫化するためには、ＨＭＬＣｌ　、　
ｌ（ＭＬＯｌまたはＨＭＩ、Ｏｌと■とからなる混合物
は免疫原として使用することができる。免疫化は、全て
の任意の動物独につき当業者に周知の方法により行なう
ことができる。

この場合に得られる粗製血清は、珪酸塩を基礎とするＳ
ＭＬＣ−免疫吸着剤でのネガティブな免疫吸着に直接に
使用することができる。

しかし、差当り、例えばイオン交換クロマドグ２フイー
および透析により予備精製を実施することは有利である
。

場合によっては、こうして前処理された粗製血清は、珪
酸塩を基礎とするＳＭＬＣ−免疫吸着剤でネガティブに
免疫吸着される。このために、粗製血清は、カラム上に
与えられ、この場合、意外なことに、５％以下、有利に
２％以下、特に有利に１％以下の交叉反応率を有するよ
うなＨＭＬＣＫ対する抗体は、結合芒れす、より高い交
叉反応率を有する抗体が結合でれる。引続き、カラムは
、このために常用の試薬（例えば、燐酸塩緩衝液−７，
５、ＰＢＳ　）で蛋白質不含になるように洗浄される。

こうして得られた溶出液は、ＨＭＬＣ−試験のための試
薬を製造するために使用することができる。しかし、溶
出液は、殊にＨＭＬＣ−免疫吸着剤でのポジティブな免
疫吸着によって後精製を行なうのが有利である。

ＢＭＬＯ−免疫吸着剤のための担体としては、珪酸塩を
基礎とする当業者に周知の吸着剤が適当である。この媒
体は、例えばグルとして粉末状または顆粒状の形で存在
することができる。

適当な担体は、例えばス７エロシル（ｓｐｈｅｒｏｓｉ
、１■）（，１Ｌｉｉ造元二ローヌーボウラン（Ｒ，ｈ
’Ｔｈｅ−ｐｏｕ１８ｎｃ　）　）、セレクテイスペル
（１３ｒｌｅｃｔｉ　８ｐｅｒｏ）　（ビールツエーオ
イロヒエミー（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｅｕｒｏｃｈｅｍｉｅ）
）またはベーカーーヒエム（Ｊ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ　
Ｃｈｅｍ）のシリカゲルである。担体には、常法により
ＳＭＬＣが場合によってはスペーサー／リンカ〜を介し
て共有結合される。

珪酸塩へのＢＭＬＯの結合を可能ならしめるために、こ
の珪酸塩は、有利に結合可能な基を有しなければならな
い。このためには、珪酸塩は、例えばトリクロル７ミ７
７″′ｃ２ビルジ２ンまたは３−（トリエトキシシリル
）プロピルアミノのような反応性シラ／と反応させるの
が有利である。この場合、これによって担体に接して生
成された官能基には、直接８ＭＬＯを結合させることが
できる。１つの好ましい構成の場合には、官能基に差轟
り二官能性試薬がスペーサーとして結合され、引続きそ
れにＢＭＬＯが結合される。

この場合、ＳＭＬＣｌと！３ＭＬｏ　ｌとからなる混合
物を使用することは、有利であることが判明した。

この場合、ＢＭＬＯｌ　：　８ＭＬ（３ｌの比は、ＩＫ
要でない。しかし、はぼ１：１の比またはＳＭＬＣｌの
過剰量は、使用するのが有利である。

媒体としては、特に次のものが好適であるニアミノプロ
ぎル基、スクシノイルアミノプロビル基、ヘキサメチレ
ンジアミノ基、ジオール基、ジアゾフルオロボレート基
、ｐ−ニトロフェニル基、エポキシゾロビル基、グルタ
ルアルデヒド基および／またはグリシドオキシプロビル
基を有する珪酸塩。場合によっては、担体材料に結合す
る前にスペーサー／リンカ−が導入芒れる。例えば、次
のような当業者に周知の二官能性リンカ−が適当である
ニ ゲルタルジアルデヒド、 Ｎ−スクシンイミジル６−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート、 エチル４−アジドフェニル−１，４−ジチオプチルイミ
デー）　Ｘ　ＨＯＩ、 ４−フルオロ−６−ニトロフェニル基シｒ。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエ
ート、 ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミｒエステル、 Ｎ−スクシンイミジル−６（４′−アジド−２′−二ト
ロフェニルーアミノ）へ＝？ｆ’／エート、スクシンイ
ミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート または スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブ
チレート。

珪酸塩担体とＳＭＬＣとの間の距離は、２０個以下の原
子であるのが好ましいことが判明する。

７〜１２個の原子の距離は、特に好ましいことが判明し
た。

珪酸塩としては、トリクロルアミノプロピルシランまた
は３−（）リエトキシシリル）プロピルアミノで活性化
されているスフエロシル（８ｐｈｅｒｏｓｉ１）を使用
し、このアミノス７エロシルを二官能性試薬としてのグ
ルタルジアルデヒｒと反応させ、かつこうして予備調製
された担体にＢＭＬＯを結合させるのが特に好ましいこ
とが判明した。

ＢＭＬＯ−カラムによる浄化後に場合によっては透析退
場の中間接続下にさらにＢＭＬＯ−免疫吸着剤での免疫
吸ｙ＃精裂を接続することは、有利であることが判明す
る。担体としては、当業者に周知の担体が適当である。

しかし、この場合も珪酸塩を基礎とする免役吸着剤を使
用することは、特に有利である。ＨＭＬＣｔ−前記担体
に結合嘔せるには、ＢＭＬＯ−免疫吸着剤を意味的に構
成させることが当てはまる。

本発明の他の対象は、ＳＭＬＣに対して５％以下、有利
に２％以下、特に有利に１％の交叉反応率を有するＨＭ
ＬＣ−抗体を使用しながらＨＭＬＣを測定するための免
疫試薬である。

この種の試薬を用いると、例えばサンドイッチ試験また
は拮抗試験を実施することができる。

サンドイッチ試験の場合には、ＨＭＬＣに対し【不動態
化された抗体およびＨＭＬＣ−抗体と測定可能な基とか
らなる結合体が使用される。この場合には、使用すべき
抗体の１個だけでも２個でも本発明方法により得ること
かできる。

測定可能な基は、例えば酵素、螢光染料および放射性標
識物質のような当業者に周知の基である。

この糧のサンドイッチ試験を用いると、５＃間以下の恒
温保持時間でなお２　ＨＥ／ＬｔのＨＭＬＣ濃度を検出
することができるが、この場合には、ＳＭＬＣとの交叉
反応率は測定することができない。

試薬は、溶液中ならびに乾燥試薬担体上もしくは乾燥試
薬担体中に存在することができる。

これにより、乾燥試薬担体に対しては試料を希釈させる
必要がないので、より短い恒温保持時間を達成すること
ができる。

試薬の１つの好ましｂ構成は、本発明方法により得られ
た、ＨＭＬＣに対して不動態化された抗体およびモノク
ローナル抗体と測定可能な基とからなる結合体を含有す
る。意外なことに、この糧の組合せ物を含有する試薬は
、試験の場合に高論感度およびＨＭＬ○測定の際に僅か
な空試験値を生じることが判明した。

モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法によりＨＭ
ＬＣで免疫化した後に得られる。抗体ＭＡＫ４Ｄ１２お
よび１Ｂ１０は、特に好適であることが判明した。この
モノクローナル抗体に相当する細胞系は、ヨーロツビア
ン・コレクション・オプ・アニマル・セル・カルチャー
ズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　
Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌＯｕｌｔｕｒｅｓ　）　（ＫＯ
ＡＯ（１！　）、英国、ボートンダウｙ　（Ｐｏｒｔｏ
ｎ　Ｄｏｗｎ　）在、に寄託番号４Ｄ１２−丘ｃｈｃａ
　８８［］２２５０３およびＩ　Ｂ　１０−　ｗｃＡｏ
。

８８０２２５０４で寄託されている。

本発明の他の対象は、ＨＭＬＣを測定する方法であり、
この方法は、試料を不動態化されている、ＨＭＬＣに対
する本発明により得られた抗体およびモノクローナル抗
体と測定可能な基とからなる結合体と一緒にすることを
特徴とする。

この場合、添加の順序は任意である。場合によっては、
恒温保持後に固体相と液状相とは分離され、かつ測定可
能な基は、２つの相の一方の相中で測定される。

実施例 次に、本発明を実施例および図面につきさらに詳説する
。

例　　１ ミオ’／７−ＬＱ（ＨＭＬＣオヨヒ１３ＭＬＯ）ノＥＤ
造および単離 ＨＭＬＣおよびＳＭＬＣｆ：０１ｒｃｕｌ　Ｒｅａ、　
ｉ　９（１９６５）６１１およびず・バイオケミカル・
ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）　１１９（１
９７０）３１に記載の方法によりヒト−骨格筋組織およ
びヒト−心筋組織から単離した。

例　　２ 抗血清の取得 ＨＭＬＣｌ　（分子量２６０００）および１１ＭＬＯｌ
［（分子量１８０００）の混合物を免疫原として使用し
た。羊を完全７０インドアジユバント（ＯＶＡ　）中の
ＨＭＬＣｌおよび！０．１ダ／―の溶液５５μｊで第１
免疫化した。更に、免疫化を７日月、１４日目および６
０日目に行なった。

更に、全部で６０日間免疫化した。この逐次注射する場
合には、そのつどＯＶＡ中のＨＭＩ、ＣＯ，ＣＩ　５１
１Ｍｊ／＊ｏ溶液２８１１７＆使用した。６ケ月後、粗
製血清が得られた。

例　　６ 粗製血清からのＨＭＬＣＫ対するポリクローナル羊−工
ｇＧ−抗体の単離 粗製血清１１にエーロジル１５９（製造元：デグツｆ　
（Ｄｅｇｕｓｓａ　）、　）を添加し、これを室温で１
時間攪拌し、かつ遠心分離する。引続き、上澄液に硫酸
アンモニウム１．７モル／ｌを添加し、これを室温で２
時間緩徐に攪拌する。引続き、沈殿物を遠心分離し、透
析緩衝液０．２ｊ（ａ酸カリウム１５ミリモル／ｌ、塩
化ナトリウム５０ミリモル／ｌ、ｐＨ７，０）中で均質
化し、かつ４℃で４回透析緩衝液１０１を透析する。

再び遠心分離した後、透析されたγ−グロブリンをｐｘ
５２−セルロースを介して溶離下に透析緩衝液で精製す
る。

こうして精製ケれたＰＡＫ、　（ＨＭＬＣ）のＳＭＬＣ
ｉＣ対する交叉反応率は、１００％にまでである（例６
による測定）。

、例　４ ＳＭＬＣ−免疫吸着剤に対するＰＡＫ　（ＨＭＬＣ〉の
ネガティブな免疫吸着 例６により精製されたＰＡＮ　＜　ＨＭＬＣ！　）溶液
を燐酸カリウム５０ミリモル／１．．…７゜５；塩化ナ
トリウム１５０ミリモル／ｚ（ｐｎｓ）；アジド０．１
％になるまで上昇埴せ、約１５ダ／ｄの濃度で室温でＨ
ＭＬＣ−免疫吸着剤−カラム（製造、例８８照）の上に
入れ、かつＰＢＳ　／アジｒＯ１１％で蛋白質不含にな
るように洗浄する（　ＰＢＳ　：燐酸緩衝液）。

例　　５ ＥＭＬＯ−免疫吸着剤に対するＰＡＫ　（ＨＭ’ＬｒＯ
）のポジティブな免疫吸着 例４により得られた溶出液を例４に記載の条件でＨＭＬ
Ｃ−免疫吸着剤上Ｋ１１ｍ布プる（製造、例８と同様）
。アＢＢ　／アジＰＯ３１％で洗浄した後、プロピオン
酸１モル／！で室温で溶離する。

引続き、溶出液を４℃で２時間ＶＫ−水に対して透析し
、その後に４°Ｏで１晩中炭酸塩／ｌ炭酸塩緩衝液１ミ
リモル／１（ｐＨ９，５）に対して透析する。

例　　６ 交叉及比率の測定 交叉反応率を測定するために、ＰＯＤに結合ちれた、不
動態化ＨＭＬＣと、羊−Ｆａｒに対するポリクローナル
抗体（く羊〜Ｆａｒ　）　−ＰＡＷ　）とからなる試験
系を使用した。

ａ）固体相の製造 担体とし２てコスタ−社（０ｏｓｔａｒ　）　（ｐｖｃ
　）の微細滴定板を使用した。１個のキャビティーにつ
き、炭酸塩緩衝液０．２モル／Ｖ、ＰＪ４９．４中のＨ
ＭＬＣ５μ／ｌ／ｌの溶液０，１１全与え、かつ４℃で
１晩中恒温保持した。ＰＢＳで２回洗浄した後、１個の
キャビティーにつき０．２１１１７で、Ｒ８Ａ　１％お
よびＭａｉｌ　　０．９％を含有する燐酸塩緩衝液５０
ミリモル／ｌ、−７，ａを添加し、かつ室温で１時間恒
温保持した。

１：ｉ）　　ＰＯＤ−結合体の製造 Ｆｃγに対する家兎からのポリクローナル抗体〔く羊−
Ｆａｒ）　−ＰＡＫ　）をメンツズーイン・エンデイモ
ロジー（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｋｎｚｙｍｏ’ｌｏｇｙ　
）　７　Ｑ（１９８０）１０４〜１４２により西洋ワサ
ビの根−ＰＯＤ　（ペルオキシダーゼ）に結合させる。

Ｃ）測定の実施 試料を燐酸塩緩衝液５０ミリモル／ｌ、ｐｋ４７．４で
希釈して例６および例４によればＰＡＮ＜　ＨＭＩ、Ｏ
＞　１．０βＩ／ゴに変えるかないしは例５によればＰ
Ａに＜　ＨＭＬ□　）　０．１μ、９／１に変える。

こうして調製された試料０゜１ａをキャビティー１個に
つき添加し、かつ室温で１時間恒温保持する。ＰＢＳで
２回洗浄した後、キャぎティー１個につきく羊−Ｆａｒ
　〉−ＰＡＫ　−ＰＯＤ−結合体Ｑ、１ｄ　（ＰＯＤ−
活性０゜２Ｕ／′ＩＬｔ）を添加し、かつ室温で１時間
恒温保持する。

ＰＢ１３で２回洗浄した後、ＡＢＴＳ■（２，２’−７
ジノージー〔６−ニテルーベンズテアゾリンースルホン
酸（６））−ジアンモニウム塩）キャビティー１個につ
き０．１　ａｔ／　（燐酸／クエン酸緩衝液１００ミリ
モル／Ａ’、ｐＪ（４，４、過鋤酸ナトリウム３、２ミ
リモル／ｊ中１．９ミリモル／ｌり全添加する。４５分
間の恒温時間後、空試験値に対する吸光度の差を４０５
　ｎｍで測定する。

交叉反応率を吸光値から測定し、この吸光値は、同じ試
料に対してＨＭＬＣで植種された固体相およびＨＭＬＣ
で植種された固体相を用いて得られる。

この場合には、ＳＭＬＣでのネガティブな免疫吸着およ
びＨＭＬＣでのポジティブな免疫吸着によりＳＭＬＣに
対してＰＡＫ　＜　ＨＭＬｃ　）の交叉反応出は検出不
可能であることが判明した（第１表）。

第１表： 工Ｓ：免疫吸着 例　７ ＥＬ、Ｔ日Ａ−サ／ｒインチ試験によるＨＭＴ、Ｏ−測
定 測定するためには、不動態化きれた ＜　ｎＭＬａ　）　−ＰＡＫ　（例５により得られた）
と、（ＮｉＭＬＯ、、＞　−ＰＡＫおよびＰＯＤからの
結合体とからなる試験系を使用した（例６ｂと同様の結
合体の製造）。

ａ）固体相ニ アｖｏ−微細滴定板、コスタ−社（０ｏａｔａｒ　）ｂ
）植種（＜　ＨＭＬＣ）　−ＰＡＮの不動態化）二〇、
１　ｍｕ／キャビティー　クエン数基緩衝液０．１モル
／ｌ！、ｐＪ（４−０中の ＜　ＨＭＬＣ）　−ＰＡＷ　５μμ／１（例５）を１晩
中４℃で恒 温保持し、かつ２回ＰＢＳ （ｆａ酸緩衝塩）で洗浄する。

０）後負荷： ０．２７／キヤビテイー　エＰ：（燐酸塩緩衝液５０ミ
リモル／ｌ、…７．４． １Ｊａｏ’ｌ　　０．９％、Ｒ８Ａ１％〔牛血清アルブ
ミン〕で洗 浄し、２回ＰＢＢで洗浄する・ ｄ）試験の実施： ０．１ゴ／キヤビテイー　ＩＰ中の試料（ＥＭＬＯもし
くはｓＭＬｃ　Ｏ〜１００　ｎ、１９．Ａｄ）を添加し
、かつ室温で２時 間恒温保持する。２回Ｐ１３Ｂ で洗浄する。

０、Ｉ　ＩＩ／／キャビアイー　エア中の（ＨＭＬＣ＞
−蹴（例５）とＰＯＤ　（例６ｂと 同様に製造）とからなる結 合体（活性Ｑ、１ｔｙ　／ｒｓＪ　）を添加し、かつ室
温で２時間 恒温保持する。２回ＰＢＢで 洗浄する。

０．１ゴ／キヤビテイー　基３［溶液（クエン酸塩ｉｔ
ｓ液０．１モル／　Ｊ、　ｐ）ｉ４．４、過硼酸ナトリ
ウム３、２ミリ モル／ｌ中ＡＢＴＢ■１．９ミリ モル／ｌ）を室温で４５分 間恒温保持する。

波長　　　　　　　ＫＩｔＩＳＡ−胱取り機で４０５　
／　４９０　ｎｍで測定。

結果は、第２表から認めることができる。

第２表 例　　８ ＥＩＭＬＯ−免疫吸着剤の製造 １５％の硝酸およびＥ、Ｏで洗浄したスフエロシル（８
ｐｈｅｒｏｓｉｌ　）　（ｏ−ヌｅボウラン社（Ｒｈｏ
ｎｅ　Ｐｏ＋ｒｌｅｎｃ　）、ｘｏｃ００５）ｅ乾燥後
にＤＭＳＯ中の６（トリエトキシシリル）プロピルアミ
ノ１０（ｖ／ｖ′）％と、８５℃で１晩中反応嘔せ、ス
７エロシルーＮＨ２に変える。反応波、遊離試薬をＤＭ
８０およびインプロパツールで洗浄除去し、吸漕剤ｔ−
５０℃で乾燥する。

ス７エロシルーＮＨ２ｔ　Ｉ　Ｑ　％　ノｆルタルアル
デヒド溶液ｐＨ３，７と混合し、かつ５５℃で２時間加
熱する。引続き、懸濁液を真空下でガラスフィルターを
介して吸ｙｌｔｆ１１遇する。次に、ス７エロシルの７
倍の容量の蒸留水で洗浄し、かつ５倍の容量の燐酸カリ
ウム１０ミリモル／ｌ。

ｐＨ８，０／塩化ナトリウム０．１モル／ｌｌで後洗浄
する。

ＳＭＬＣ１０１ｎ９ｔスフエロシル１Ｎにつキ丸底フラ
スコ中の使用したス７エロシル容量の約５０％中の燐酸
カリウム１０ミリモル／ｌ、ｐＪ（８，０／塩化ナトリ
ウム０．１モル／ｌに添加する。

このフラスコを室温で１晩中回転蒸発器で回転嘔せる。

濾過後、スフエロシルを数回０．９％のＩＪａＯ１溶液
ならびにエタノールアミノ溶液で後洗浄する。引続き、
エタノールアミノ溶液６容量部を添加し、かつ室温で１
時間恒温保持する。再度のｇ通抜、再びＮａＣ１溶液で
洗浄する。

引続き、免疫吸層剤ｆ：ＰＢ８でｐＨ７，５に調節し、
Ｉ＃Ｉ貌り：ＭＡＫ、ＩＢ１［］ かつＰＢ８　／す）　ＩＪウムアジＶで平衡にする。貯
蔵は、４°Ｃで行なわれる。

例　　９ モノクローナル抗体を用いてのＥＬ工ｆ３Ａ−サンドイ
ッチ試皺によるＨＭＬＣ−測定 測定には、不動態化された（　ＨＭＬＣ）　−ＰＡＫ（
例５により製造した）と、（ＨＭＬＣ）　−ＭＡＫ（４
Ｄ１２もしくはｌＢ１０）およびＰＯＤからの結合体と
からなる試験系を使用した（例６ｂと同様の結合体製造
）。

固体相、被覆、後負荷および測定の実施は、例７と同様
であった。

結果は、第１図から認めることができる。

曲線は、僅かな試料空試験値の場合に高い感度を得るこ
とができることを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、２つの異なるＭＡＫを用いての曲線１；　Ｍ
ＡＫ　　４　Ｄ　１２ ｎｇ／ｍＬＨＭＬＣ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、５％以下のＳＭＬＣに対する交叉反応率を有するＨ
   ＭＬＣに対する特異的抗体。 ２、２％以下のＳＭＬＣに対する交叉反応率を有する、
   請求項１記載の特異的抗体。 ３、１％以下のＳＭＬＣに対する交叉反応率を有する、
   請求項１記載の特異的抗体。 ４、哺乳動物をＨＭＬＣ I および／またはＨＭＬＣII
   で免疫化し、粗製血清を取得し、かつ珪酸塩を基礎とす
   るＳＭＬＣ−免疫吸着剤で免疫吸着精製することによつ
   て得ることができる、請求項１、２または３のいずれか
   １項に記載の特異的抗体。 ５、ＨＭＬＣに対する特典的抗体を製造する方法におい
   て、哺乳動物をＨＭＬＣ I および／またはＨＭＬＣII
   で免疫化し、粗製血清を取得し、珪酸塩を基礎とするＳ
   ＭＬＣ−免疫吸着剤で免疫吸着精製することを特徴とす
   る、ＨＭＬＣに対する特異的抗体の製造法。６、シリカ
   ゲルを免疫吸着剤の担体として使用する、請求項５記載
   の方法。 ７、ＳＭＬＣを二官能性リンカーを介して担体に結合さ
   せる、請求項５または６に記載の方法。 ８、ＳＭＬＣをグルタルジアルデヒドを介してアミノ基
   によつて活性化された担体に結合させる、請求項５から
   ７までのいずれか１項に記載の方法。 ９、ＳＭＬＣを原子２０個以下の距離をもつて担体に結
   合させる、請求項５から８までのいずれか１項に記載の
   方法。 １０、ＨＭＬＣを測定するための試薬において、５％以
   下のＳＭＬＣに対する交叉反応率を有するＨＭＬＣに対
   する特異的抗体を含有することを特徴とする、ＨＭＬＣ
   を測定するための試薬。 １１、前記抗体を不動態化された形で含有する、請求項
   １０記載の試薬。 １２、ＨＭＬＣ−抗体と測定可能な基とからなる結合体
   を含有する、請求項１１記載の試薬。 １３、ＨＭＬＣに対するモノクローナル抗体と測定可能
   な基とからなる結合体を含有する、請求項１０または１
   １に記載の試薬。 １４、モノクローナル抗体４Ｄ１２または１Ｂ１０と測
   定可能な基とからなる結合体を含有する、３請求項１３
   記載の試薬。 １５、ハイブリドーマー細胞系ＥＣＡＣＣ８８０２２５
   ０３から得ることができるモノクローナル抗体４Ｄ１２
   。 １６、ハイブリドーマー細胞系ＥＣＡＣＣ８８０２２５
   ０４から得ることができるモノクローナル抗体１Ｂ１０
   。 １７、ＨＭＬＣを測定する方法において、試料を５％以
   下のＳＭＬＣに対する交叉反応率を有するＨＭＬＣに対
   する不動態化された特異的抗体およびＨＭＬＣに対する
   モノクローナル抗体と測定可能な基とからなる結合体と
   一緒にし、相を分離し、測定可能な基を２つの相の一方
   の中で測定することを特徴とする、ＨＭＬＣの測定法。 １８、細胞系ＥＣＡＣＣ８８０２２５０３またはＥＣＡ
   ＣＣ８８０２２５０４から得ることができる抗体をモノ
   クローナル抗体として使用する、請求項１７記載の方法
   。