JPH0123447B2

JPH0123447B2 -

Info

Publication number: JPH0123447B2
Application number: JP57103777A
Authority: JP
Inventors: Shoji Ono; Yoji Suzuki; Atsushi Imaizumi
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1982-06-18
Filing date: 1982-06-18
Publication date: 1989-05-02
Also published as: JPS58222032A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、百日咳毒素のサブユニツト蛋白に関
する。更に詳しくは、本発明は、百日咳菌の培養液か
ら分離・精製される毒素、LPE−HAを、その構
成要素（サブユニツト）に分離して得られるとこ
ろの、百日咳感染防御抗原活性を有する蛋白、及
びそれと組合せてインスリン分泌促進活性を発現
しうる蛋白に関するものである。百日咳は、百日咳菌（Bordetella pertussis）
の感染によつておこる伝染性疾患であり、その予
防のために百日咳ワクチンが使用されている（通
常はジフテリアと破傷風の予防も目的として三種
混合ワクチンとして使用される。）しかし、百日
咳ワクチンは従来死菌全菌体ワクチンとして使用
されており、その有効性は十分に認められている
ものの、接種局所の発赤、腫張、疼通あるいは発
熱、下痢、嘔吐、まれにはシヨツク症状等の副作
用も少なくないという問題がある。そこで、かか
る問題点を解決するために、精製ワクチンすなわ
ち百日咳防御抗原分画ワクチン（コンポーネント
ワクチン）の開発が試みられている（例えば、特
公昭57−5203号、特開昭57−50925号参照）。百日咳菌の産生する毒素、LPF−HAは分子量
約107000の蛋白であり、これは、生体に白血球増
多症をひきおこす白血球増多活性（LPA）、生体
にヒスタミンに対する感受性を増強させる作用を
示すヒスタミン増感活性（HSA）、生体のインス
リン分泌を促進するインスリン分泌促進活性
（IAA）あるいは赤血球凝進活性（HA活性）を
有している。そして、百日咳菌の培養液から、副
作用に関与する内毒素や易熱性毒素を除去して
HA活性を有する画分を得、これにホルマリンを
作用させてこれまた副作用の原因と考えられてい
るLPAやHSAを失活（トキソイド化）させるこ
とによつて、前述のコンポーネントワクチンが調
製されている。かくして得られたコンポーネント
ワクチンの内毒素やLPAは、全菌体ワクチンの
１／１０〜1/25以下に低下しており、ワクチン接種時
の副作用も非常に改良されていることが臨床的に
も確められている。しかしながら、このコンポー
ネントワクチンにおいてもLPAの低下は必ずし
も十分ではなく、特にHSAの減弱は不十分であ
り、その改良が望まれていた。本発明者らは、百日咳毒素の分子構造と種々の
活性発現との関係を鋭意研究した結果、特定のサ
ブユニツトのみが百日咳感染防御抗原活性を有し
ており、このサブユニツト蛋白を用いれば、副作
用の全くない百日咳ワクチンが得られることを知
見すると共に、このサブユニツト蛋白と他のサブ
ユニツト蛋白を組合せると、インスリン分泌促進
活性が発現することを知見し、本発明に到達し
た。即ち、本発明は、蔗糖密度勾配法による分子量
が約32000で、アミノ酸組成及び組成比（重量％）
がAsp7.0，Thr5.6Ser11.1，Glu13.6，Gly8.4，
Ala6.0，Cys2.8，Val5.7，Met3.5，Ile4.0，
Leu7.0，Tyr5.0，Phe5.1，Lys4.0，His3.4，
Arg4.6，Pro3.2であり、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動において単一のバンドを与え、白血球
増多活性、ヒスタミン増感活性、インスリン分泌
促進活性は共に有せず、百日咳感染防御抗原活性
を有するところの百日咳毒素のサブユニツト蛋白
Ｔ２３４である。その他にサブユニツト蛋白とし
ては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動において共に単
一のバンドを与え、単独では、白血球増多活性、
ヒスタミン増感活性、インスリン分泌促進活性の
いずれも有しないが、サブユニツト蛋白Ｔ２３４
と組合せることによつてインスリン分泌促進活性
を発現しうるところの百日咳毒素のサブユニツト
蛋白Ｔ１００とＴ５００がある。Ｔ１００は、
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分
子量が約25000で、アミノ酸組成及び組成比（重
量％）がAsp8.5，Thr4.9，Ser14.0，Glu15.6，
Gly10.7，Ala5.7，Cys2.5，Val4.8，Met3.0，
Ile4.0，Leu5.1，Tyr4.2，Phe4.5，Lys3.3，
His3.7，Arg5.4のサブユニツト蛋白であり、Ｔ５
００は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法
による分子量が約10000で、アミノ酸組成及び組
成比（重量％）が、Asp9.0，Thr4.7，Ser13.0，
Glu16.5，Gly10.9，Ala5.2，Cys2.6，Val4.4，
Met3.0，Ile3.6，Leu6.8，Tyr3.6，Phe4.8，
Lys4.0，His3.8，Arg4.0のサブユニツト蛋白であ
る。本発明の百日咳毒素のサブユニツト蛋白は、百
日咳菌の培養液から分離・精製される毒素、
LPF−HAから得られる。培養の容易さという点
から、百日咳菌の中でも、百日咳Ｉ相菌を用いる
のが好ましい。培養手段としては公知のいかなる
手段を採用しても良いが、いわゆる、ステナー・
シヨルテー培地（SS培地と称する）（ジヤーナル
オブジエネラルマイクロバイロジー（J.
gen.Microbiol）63巻、211−220頁、1971年参照）
が、近年、百日咳菌の大量培養のために広く用い
られている。本発明者らが提案したシクロデキス
トリン又はその誘導体を含有する培地、例えば、
メチルβ−シクロデキストリン（Meβ.CD）を含
有するSS培地は特に好ましいものである（例え
ば、特願昭56−163478号参照）。培養方法及び条
件は特に限定されるものではなく、従来公知の方
法及び条件を採用できるが、静置培養よりは振と
う培養の方が好ましく、培養温度は35℃前後、培
養時間は10〜100時間が適当である。培養物（培養培地と菌体）から、生成された
LPF−HAを採取する方法、手段も特に限定され
るものではなく、公知の方法、手段を利用でき
る。例えば、百日咳Ｉ相菌（ボルデテラ・パタシ
ス東浜株）を300μｇ／mlのMeβ−CDを含むSS培
地にて35℃で18時間培養し、得られる培養液の遠
心上清（PH8.6）を、PH8.0の0.01Mリン酸緩衝液
で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに通
過せしめる。そして、得られる通過液をPH6.0に
調整した後、今度は、PH6.0の0.01Mリン酸緩衝
液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに
吸着させ、これを0.5M塩化ナトリウムを含む
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で溶出して蛋白分画
を得る。この蛋白分画をハプトグロビン−セフア
ロースを支持体とするアフイニテイ−クロマトグ
ラフイーに吸着させ、0.5MNaCl及び3Mのチオ
シアン化カリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液で脱
着してLPF−HAを得ることができる。上記の如くして分離・精製されたLPF−HAか
ら、そのサブユニツト蛋白Ｔ２３４，Ｔ１００及
びＴ５００を分離し採取する方法も特に限定され
るものではなく、公知の方法及び手段を適当に組
合せて行なうことができる。例えば、精製LPF
−HAを、8Mの尿素を含むPH7.5の0.015Mのリン
酸緩衝液中で各サブユニツトに分離させ、得られ
た溶液を同じ緩衝液で平衡化たCMセフアロース
CL−6Bのカラムにかける。そして、未吸着画分
を集め、これを透析膜を用いて濃縮し、その後セ
フアクリルＳ−２００を用いてゲル過を行な
う。かかるゲル過によつてサブユニツト蛋白Ｔ
１００とＴ５００が分離される。上記CMセフア
ロースCL−６Ｂのカラムにおいて、吸着された
蛋白を4Mの尿素と0.5MのNaclを含むPH7.5の
0.1Mのリン酸緩衝液を用いて流出させ蛋白の含
まれるフラクシヨンを集め、これを前記と同様に
濃縮とゲル過を行なう。かかる処理によつて、
少量の未解離LPF−HAとサブユニツト蛋白Ｔ２
３４が分離される。本発明のサブユニツト蛋白Ｔ２３４は、蔗糖密
度勾配法で測定した分子量が約32000（32000±
3000）である。また、アミノ酸組成と組成比（重
量％）は第１表に示した通りである。そして、ポ
リアクリルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度
7.5％、1N KOH−氷酢酸緩衝液（PH4.3））電気
泳動（デイスク電気泳動）において単一のバンド
を与える。各種生物学的活性の測定法の詳細は後述する
が、その概略は次の通りである。即ち、マウスに
サブユニツト蛋白を静注し、３日後に白血球数を
測定することによりLPAを、４日後にグルコー
スを負荷し、血中のインスリンレベルを測定する
ことによりIAAを、６日後にヒスタミンを腹腔
に注射し、30分後の体温によつてHSAを調べる。
本発明のサブユニツト蛋白Ｔ２３４は、前記３種
類の活性はいずれも実質的に有しない。百日咳感
染防御抗原活性は次の様にして測定される。即
ち、まず抗原（トキソイド化したLPF−HA又は
サブユニツト蛋白）を不完全フロイントアジユバ
ントにて家兎に免疫し、免疫血清から硫安分画等
により抗体（IgG画分）を得る。次に、抗体と
LPF−HAとを37℃、１時間インキユベートし、
マウスに静注し、各種抗体の中和能を調べると共
に、上記の抗体をマウスの腹腔内に投与し、百日
咳Ｉ相菌を脳内接種することによる感染実験から
百日咳感染防御抗原活性を検討する。本発明のサ
ブユニツト蛋白Ｔ２３４は、LPH−HAと同様の
百日咳感染防御抗原活性を有している。以上の如く、本発明のサブユニツト蛋白Ｔ２３
４は、百日咳ワクチンの副作用の原因である
LPAやHSAを有せず、感染防御抗原活性は十分
に有しているので、副作用のほとんどない百日咳
ワクチンを製造するために用いることができる。本発明のサブユニツト蛋白Ｔ１００とＴ５００
は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測
定した分子量が、それぞれ約25000（25000±2000）
と約10000（10000±1000）である。アミノ酸組成
と組成比（重量％）は、それぞれ第１表に示した
通りである（6N塩酸で、110℃、24時間加水分解
を行ない、日立−８３５高速アミノ酸分析機にて
分析した）。そして、いずれも、ポリアクリルア
ミドゲル電気

【表】

【表】泳動とSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ポリアクリルアミドゲル濃度10％、SDS0.1％、
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.2））において共に単一
のバンドを得える。そして、いずれも、単独で
は、LPA，HSA，IAA及び百日咳感染防御抗原
活性を実質的に有しない。しかしながら、いずれ
も、サブユニツト蛋白Ｔ２３４と組合せる（併存
させる）ことによつて、ほぼ同程度のIAAを発
現するという特徴を有する。本発明のサブユニツ
ト蛋白Ｔ１００又はＴ５００は、副作用の原因で
あるLPAやHSAを実質的に有せず、Ｔ２３４と
組合せるとIAAを有する様になるので、Ｔ２３
４と組合せて糖尿病の治療薬として利用できる可
能性がある。なお、本発明において採用した各種の測定法は
以下の通りである。 (1) 蔗糖密度勾配法 10％から20％迄の密度勾配をもつた蔗糖溶液
に、試料溶液をのせ、４℃、毎分65000回転で超
遠心を20時間行ない試料の沈降位置から対照物質
（ウシ血清アルブミン、キモトリプシノーゲン）
を基にして分子量を測定した。 (2) ポリアクリルアミドゲル電気泳動ポリアクリルアミド濃度7.5％、1N KOH−氷
酢酸緩衝液（PH4.3）を用い、Davisの方法に従つ
て行なつた（B.J.Davis，Amr.N.Y.Acad.Sci.，
Nol.121，P404，1964参照）。 (3) SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動ポリアクリルアミド濃度10％、SDS0.1％、
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.2）を用い、Fairbanks
らの方法に従つて行なつた（G.T.Fairbanks
etal，Biochem.，Vol.10，p2606，1971参照）。 (4) 生物活性 (i) 白血球増多活性マウス（ddY，SPF，4W，♀）に試料を尾
静脈より静注し、３日後に、尾静脈より5μl採
血し、市販希釈液にて2000倍に希釈し、セルカ
ウンター（東亜電波K.K.製）にて白血球数を
測定した。白血球増多活性は、試料群の白血球
数と対照群の白血球数との差(A)を、基準LPF
−HAを用いた場合の白血球数と対照群の白血
球数との差(B)に対する相対的な力価として表わ
した。 (ii) インシユリン分泌促進活性白血球増多活性を測定した後、即ち、３日目
に絶食し、４日目に50％グルコースを腹腔内投
与し、15分後に尾静脈より20μl採血し10倍希釈
した血清を得、ダイナテツク社製ラジオイムノ
アツセイキツトにより、IRI（Lmmuno
Reactive Insulin）を測定した。そして(i)の場
合と同様な方法により相対的な力価を求めた。 (iii) ヒスタミン増感活性インシユリン分泌促進活性を測定した後、即
ち、６日目にマウス腹腔内にヒスタミン塩酸塩
を0.8mg／mouse投与し、30分後の直腸内体温
の低下を測定した。そして(i)の場合と同様な方
法により相対的な力価を求めた。 (5) 抗サブユニツト抗体のLPF−HAに対する結
合能 LPF−HA、Ｔ１００，Ｔ２３４，Ｔ５００を
それぞれコートしたマイクロプレートに、抗サブ
ユニツト抗体を入れ、室温で30分間反応させ、抗
体の結合能をMICRO ELISA法により測定した。
各抗体の結合能は、LPF−HAに対する抗LPF−
HA抗体の結合能を100としたときの相対値で示
した。なお、抗体としては、抗原（LPF−HAはトキ
ソイド化し、サブユニツト蛋白はそのまゝ）を不
完全フロイントアジユバントにて家兎に免疫し、
その血清から硫安分画法により得られたＩｇＧ画
分を用いた。 (6) 抗サブユニツト抗体のLPF−HAに対する中
和能 LPF−HAと濃度を一定にした各抗体とを混
ぜ、37℃、１時間インキユベートした後マウスに
静注し、LPA，HSA，IAAの中和能をみた。中
和能の値は、各活性を50％中和するのに必要な抗
体の希釈倍率を、任意にきめた基準LPF−HAを
用いた場合の抗体の50％中和希釈倍率に対する相
対的値として求めた。以下、実施例により本発明
を詳述する。実施例１ (1) LPF−HAの分離・精製ボルデテラパタシス（Bordetella pertussis）
（百日咳菌）東浜株Ｉ相菌の凍結乾燥菌体を１％
カザミノ酸溶液に懸濁させ、脱繊維馬血液を20％
含むボルデ・ジヤングー（Bordet Gengou）培
地（以下BG培地という）で35℃、３日間培養し
た。この菌を１白金耳かき取り、更にBG培地で
24時間リフレツシユした菌をSS培地に懸濁し、
接種菌懸濁液を得た。この接種菌懸濁液を、
Meβ−CDを500μｇ／ml含むSS培地に10⁷コロニ
ー／mlとなる様に懸濁させ、振とう条件下、35℃
で18時間培養を行つた。培養後、以下の如き方法で産生されたLPF−
HAを採取した。培養液の遠心上清（PH8.6）を、
PH8.0の0.01Mリン酸緩衝液で平衡化したハイド
ロキシアパタイトカラムに通過させ（赤血球凝集
能を持つ他の蛋白Ｆ−HAをカラムに吸着させて
除く）、LPF−HAを含む通過液をPH6.0に調整し
た後、今度はPH6.0の0.01Mリン酸緩衝液で平衡
化したハイドロキシアパタイトカラムに通し
LPF−HAをカラムに吸着させ、これを0.5M塩化
ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
溶出してLPF−HAを含む蛋白分画を得た。この
蛋白分画をハプトグロビン−セフアロース４Ｂを
支持体とするアフイニテイ−クロマトのカラムに
通し、ハプトグロビンにLPF−HAを選択的に吸
着させ、これを0.5MNaCl及び3Mのチオシアン
化カリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
脱着してLPF−HAを含む分画を得た。得られた
分画を0.1Mのリン酸緩衝液に対し透析し、チオ
シアン化カリウムを除き純粋なLPF−HAを得
た。 (2) LPF−HAのサブユツニツト蛋白の分離・精
製前記(1)で得られた精製LPF−HAの0.5M食塩を
含む0.1Mリン酸緩衝液（PH７）溶液を、4M尿素
を含むPH7.5の0.015Mリン酸緩衝液に対し透析
し、得られた溶液（14.8ml、蛋白濃度0.2mg／ml）
に尿素5.7ｇを加え8M尿素溶液にし、30分間室温
に放置した。当量のPH7.5の0.015Mリン酸緩衝液
を加え、4M尿素溶液にした後、4M尿素を含むPH
7.5の0.015Mリン酸緩衝液で平衡化したCMセフ
アロースCL−６Ｂのカラムにかけた。流出パタ
ーンは第１図に示した如くであつた。蛋白の含ま
れるフラクシヨン４から３０までを集め、透析膜
を用いて濃縮し、セフアクリルＳ−２００を用い
てゲル過を行つた。流出パターンは第２図に示
した如くであつた。かゝるゲル過によつてサブ
ユニツト蛋白Ｔ１００（フラクシヨン６５〜７
２）とＴ５００（フラクシヨン７５〜７８）が分
離された。上記CMセフアロースCL−６Ｂのカラムにお
いて、フラクシヨン４０以降は4M尿素と0.5M食
塩を含むPH7.5の0.1Mリン酸緩衝液を用い、蛋白
が含まれるフラクシヨン５１から５５までを集
め、前記と同様に濃縮とゲル過を行なつた（第
３図）。かかる処理によつて少量の未解離LPF−
HAとサブユニツト蛋白Ｔ２３４（フラクシヨン
６２〜７２）が分離された。 (3) サブユニツトの分子量および電気泳動 (2)によつて得られたサブユニツト蛋白Ｔ１０
０，Ｔ５００，Ｔ２３４およびLPF−HAを１％
ドデシル硫酸ナトリウム、１％２−メルカプトエ
タノールで100℃２分間処理し、0.1％ドデシル硫
酸ナトリウムを含む10％ポリアクリルアミドゲル
で電気泳動し、第４図の如き結果を得た。ウシ血
清アルブミン、卵白アルブミン、キモトリプシノ
ーゲン等の基準物質を用いて、第４図からサブユ
ニツト蛋白Ｔ１００とＴ５００の分子量をそれぞ
れ25000±2000と10000±1000と算出した。一方、
Ｔ２３４は、SDSポリアクリルアミド電気泳動で
は３本のバンドに分離するが、PH4.3の7.5％ポリ
アクリルアミド電気泳動（第５図）では単一のバ
ンドを示した。このものの分子量は、10％から20
％迄の蔗糖密度勾配法により32000±3000と算出
した。 (4) 生物活生等の性質サブユニツト蛋白Ｔ１００，Ｔ２３４及びＴ
５００のLPA，HSA及びIAAは、第２表に示
した通りである。

【表】第２表から、Ｔ１００，Ｔ２３４，Ｔ５００
はいずれも、LPA，HSA，IAAを有しないこ
とがわかる。一方、Ｔ１００とＴ２３４を組合
せると、または、Ｔ５００とＴ２３４を組合せ
ると、IAAが発現することがわかる。抗サブユニツト抗体等のLPF−HAに対する
結合能は、第３表に示した通りである。

【表】第３表から、抗Ｔ２３４抗体は、抗LPF−
HA抗体の約６割に相当するLPF−HAに対す
る結合能を有していることがわかる。この結果
は、in vitroにおいて、Ｔ２３４がLPF−HA
と同様の抗原としての活性を有していることを
示している。抗サブユニツト抗体等のLPF−HAに対する
中和能は第４表に示した通りである。

【表】抗Ｔ２３４は、LPA，HSA，IAAのいずれ
の活性においても、LPF−HAに対する相当な
中和能を有していることがわかる。感染防御実験マウス（4W，SPF，♀）１群10〜15匹を用い、
抗LPF−HA抗体又は抗Ｔ２３４抗体を腹腔内に
0.5mlずつ受動免疫し、30分後に百日咳Ｉ相菌を
５×10⁴個脳内に接種し、14日後の生残率を求め
た。抗LPF−HA抗体を用いた場合の生残率は50
％で、抗Ｔ２３４抗体を用いた場合の生残率は60
％であり、抗Ｔ２３４抗体は抗LPF−HA抗体と
ほぼ同じ感染防御能を有していることが確認され
た。なお、対照群（抗体を用いない群）の生残率は
０％であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図は実施例１の(2)に関す
るグラフであり、第１図はCMセフアローズCL
−6Bカラムクロマトグラフイーであり、第２図、
第３図は、セフアクリルＳ−２００ゲル過クロ
マトグラフイーである。蛋白濃度はLowry法に
よつた。第４図は、LPF−HAおよび各サブユニ
ツト蛋白のSDSポリアクリルアミド電気泳動図で
あり、第５図は、LPF−HAおよびＴ−２３４の
PH4.3のポリアクリルアミド電気泳動図である。

Claims

【特許請求の範囲】

１蔗糖密度勾配法による分子量が約32000で、
アミノ酸組成及び組成比（重量％）がAsp7.0，
Thr5.6，Ser11.1，Glu13.6，Gly8.4，Ala6.0，
Cys2.8，Val5.7，Met3.5，Ile4.0，Leu7.0，
Tyr5.0，Phe5.1，Lys4.0，His3.4，Arg4.6，
Pro3.2であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
において単一のバンドを与え、白血球増多活性、
ヒスタミン増感活性、インスリン分泌促進活性は
共に有せず、百日咳感染防御抗原活性を有すると
ころの百日咳毒素のサブユニツト蛋白Ｔ２３４。