JPH0453848B2 - - Google Patents
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Description
請求の範囲
１ () 分子量が3500より小さく、
() フロレスカミンに本質的に反応性の物質を
実質的に含まず、そして () ヒト白血球抽出物の透析物からゲル濾過お
よびオクタデシルシランカラムを用いる逆相高
速液体クロマトグラフイーで水中のエタノール
勾配により溶出することにより得ることがで
き、かつまた、 () 次のおおよそのエタノール濃度範囲、0.0〜
0.4％、36〜40％、72〜76％、85〜89％、94〜
95％、97〜99％および100％を有する溶出画分
として前記勾配からそれぞれ溶出することがで
きるヒト免疫系モジユレーター。 ２ おおよそ0.0〜0.4％のエタノール濃度範囲を
有する溶出画分として勾配から溶出することがで
きるアンプリフアイアー１である請求の範囲第１
項のモジユレーター。 ３ おおよそ36〜40％のエタノール濃度範囲を有
する溶出画分として勾配から溶出することができ
るアンプリフアイアー２である請求の範囲第１項
のモジユレーター。 ４ おおよそ72〜76％のエタノール濃度範囲を有
する溶出画分として勾配から溶出することができ
るアンプリフアイアー３である請求の範囲第１項
のモジユレーター。 ５ おおよそ85〜89％のエタノール濃度範囲を有
する溶出画分として勾配から溶出することができ
るアンプリフアイアー４である請求の範囲第１項
のモジユレーター。 ６ おおよそ94〜95％のエタノール濃度範囲を有
する溶出画分として勾配から溶出することができ
るアンプリフアイアー５である請求の範囲第１項
のモジユレーター。 ７ おおよそ100％のエタノール濃度範囲を有す
る溶出画分として勾配から溶出することができる
アンプリフアイアー６である請求の範囲第１項の
モジユレーター。 ８ おおよそ97〜99％のエタノール濃度範囲を有
する溶出画分として勾配から溶出することができ
るＳ−サプレツサーである請求の範囲第１項のモ
ジユレーター。 ９ ヒト白血球抽出物から、ヒト生体の免疫系の
直接または間接応答に影響する性質を有する免疫
系モジユレーターを製造する方法であつて、この
モジユレーターはフロレスカミンに本質的に反応
性の物質を実質的に含まず、そして(1)ヒト白血球
抽出物を透析分子量限界約3500の透析膜で透析
し、(2)透析物をゲル濾過して複数個の分画に分画
化し、(3)モジユレーター確認分画を選択して集
め、(4)集められたモジユレーター確認分画を逆相
クロマトグラフイーカラムに付し、(5)カラムを水
中のエタノール勾配で溶出することを特徴とす
る、免疫系モジユレーターの製造方法。 １０ 活性成分として () 分子量が3500より小さく、 () フロレスカミンに本質的に反応性の物質を
実質的に含まず、そして () ヒト白血球抽出物の透析物からゲル濾過お
よびオクタデシルシランカラムを用いる逆相高
速液体クロマトグラフイーで水中のエタノール
勾配により溶出することにより得ることがで
き、かつまた、 () 次のおおよそのエタノール濃度範囲、0.0〜
0.4％、36〜40％、72〜76％、85〜89％、94〜
95％、97〜99％および100％を有する溶出画分
として前記勾配からそれぞれ溶出することがで
きるヒト免疫系モジユレーターを含有する、ヒ
トが以前暴露された抗原に対するヒト免疫系応
答を増大もしくは減少させる医薬組成物。 発明の背景 ヒト免疫系はきわめて複雑で、現在でも完全に
は理解されていない。現在では２種の主要な態
様、すなわち、循環抗体によつて仲介される液体
性免疫と、名称のとおりリンパ細胞によつて仲介
される細胞性免疫とがあると考えられている。体
液性免疫は、から非免疫受給者に血清免疫グロブ
リンによつて運搬され、このような血清が仲介す
る輸送によつて免疫応答を生じ、これは多くの場
合即時的に生じる。細胞仲介免疫は未梢血白血球
によつて輸送される。細胞によつて輸送される免
疫応答は、数時間といた期間を経て緩徐に発現す
る。 細胞仲介免疫の代表的な発現は遅延型過敏性反
応であり、本明細書ではDHと略する。DH皮膚
反応は、適当な抗原が皮下注射された場合に認め
られる。24〜48時間以内に、局所的炎症（発赤）
および腫脹と肥厚（硬結）が、感受性の高い個体
に認められ、感受性の程度は反応のサイズおよび
強度によつて測定される。DH反応はまた、特徴
的な組織学的所見、とくに炎症領域における血管
周囲にリンパ球および単球の浸潤を生じる。DH
反応の部位にみられる細胞は、未梢血白血球群に
由来するものである。 細胞仲介免疫の機構は、まだ完全にはわかつて
いない。応答を仲介する細胞は、抗原の挑戦にさ
まざまな方法で応答できる。この種の応答には、
与えられた抗原に対して特異的な感受性をもつ細
胞の増殖、各種の免疫機能を仲介する細胞たとえ
ば抗体の誘導および増加、異物細胞や腫瘍に対す
る反応が含まれる。これらの応答パターンの質お
よび量は多くの因子、たとえば胸腺や副腎皮質の
ホルモン、インターフエロン、その他の細胞性応
答の奏効体たとえばヒスタミン、セロトニン、プ
ロスタグランジンによつて影響される。 本発明は、白血球の透析抽出液から単離され、
細胞仲介免疫応答に強力に影響する免疫系モジユ
レーターの発見に基づくものである。これは、特
異的抗原に対する過剰反応または不適当な反応に
よる各種臨床症状の治療およびある種のアレルギ
ー症状の緩和に有用である。 従来技術 1954年、H.S.Lawrenceは、ツベルクリン感受
性供与者の白血球から調製した溶解質がツベルク
リン非反応受給者にその感受性を運ぶことができ
ることを報告した〔J.Clin.Invest.33、951
（1954）〕。この仕事についての最近の総説として
Lawrence、H.S.：The Harvey Lactures68、
239（1974）、またその時点での論文を集めたもの
としては、M.S.Ascher、A.A.Gottlieb、C.H.
Kirkpatrick編：Transfer Factor：Basic
Properties and ClinicalApplications、
Academic Press、Inc.、New York（1976）およ
びA.Kahnら編：Immune Regulators in
Transfer Factor、Academic Press、Inc.、
New York（1976）がある。この感受性の輸送は
白血球溶解質中の因子によるものと推測され、そ
の後、輸送因子という機能的な名称が付された
（B.Amos、H.Koprowski編：Cell−Bound
Antibodies中でNajarian、J.S.、Feldman、J.D.
の論文に対する批評でLawrence、H.S.による）。
この輸送因子による現像はヒトでしかみられず、
このため、活性の根源を単離し、性状を明らかに
する研究は徐々にしか進まなかつた。 輸送因子を明確にするには、２名の患者、すな
わち与えられた抗原に対してDH反応を示すこと
がわかつている供与者と、同一抗原を挑戦させて
もDH反応が起こらない（この抗原に対する細胞
仲介免疫をもたないと考えられる）ことがわかつ
ている受給者を確定する必要がある。供与者の血
液から調製した白血球を破壊し、細胞内容物を透
析する。濃縮した透析物を適当な緩衝液にとり、
受給者の前腕または他の便利な部位に皮下注射す
る。約２日後、受給者の同一部位または他の部位
に、この抗原を皮下注射して挑戦させる。典型的
なDH反応は約１週後に観察される。このように
して輸送された免疫は、受給者に２年間ぐらい保
持されるという。 輸送因子の精製および同定の作業は、それに伴
う構造的ないし化学的基準がないため、また精製
後に認められる現像が最初の透析物により誘導さ
れる現象と質的に異なる場合が多いため、進歩が
妨げられていた。輸送因子の語が精製プレパレー
シヨンについても用いられ、またDH皮膚反応以
外の基準でモニターされて文献中に現れるが、こ
の語が、実際、単一の生化学的実体を指している
のか、あるいは単一の生化学的機能を表す活性に
対して用いらているのかも明瞭ではない。本明細
書においては、輸送因子の語はLawrenceによつ
て単離され、Lawrenceによつて最初に特徴づけ
られた活性すなわち特定の抗原に対する免疫を高
度の感受性をもつ供与者から感受性をもたない受
給者へ輸送する能力をもつ粗白血球溶解物に限定
して用いることにする。 ヒト輸送因子のこれまでの分別化では、各種の
活性物質の存在が明らかにされている。
Vandenbark、A.A.ら〔J.Immunol.118、636
（1977）〕は、白血球抽出液の透析物をSephadex
Ｇ−25（Phar−macia、Inc.、Uppsala、Sweden
の商標名）クロマトグラフイーに付した結果を報
告している。in vivoにおける生物活性は光学密
度254nｍまたは280nｍに示す２個の主ピークに
のみ認められた。１つのピークフラクシヨンは、
抗原反応性供与者からそれまでは非反応性であつ
た受給者に、有意な皮膚試験反応性を輸送すると
報告されている。他方のピークは自発活性（抗原
を加えない場合の皮膚反応）を生じ、また抗原と
組合せると皮膚反応を有意に増大させた。各ピー
クフラクシヨンは等電集束または１％酢酸もしく
は５％メタノールの溶媒系を用いたオクタデシル
シラン樹脂充填カラム上逆相クロマトグラフイー
によつてさらに分別化された。しかしながら、こ
の再分別化後の生物活性試験の結果は報告されて
いない。 Gottlieb、A.A.ら（Transfer Factor：Basic
Properties and Clinical Applications、263頁）
は白血球透析物分画化のモニタリングの手段とし
てフロレスカミンを用いた。フロレスカミン
〔Hoffman−LaRoche、Inc.、Nutley、N.J.、
Bohlen、P.ら：Arch.Biochem、Biophys.155、
213（1973）〕は一級アミノ基を有する物質と反応
し、強い螢光をもつ生成物を与え、これによつて
タンパクおよび他の一級アミノ基をもつ化合物の
高感度定量が可能である。透析された白血球抽出
物質をSephadex Ｇ−10（Pharmacia、Inc.、
Uppsale、Swedenの商標名）カラムで分画化し
たところ、生物活性はフロレスカミン反応性主ピ
ークについて認められた。抗原を加えても加えな
くても、遅延型過敏性反応が認められ、この応答
は抗原存在時の方が幾分大きかつた。 透析された白血球抽出物はGottlieb、A.A.らに
よりさらに分画化され、J.Reticuloendothelial
Soc.21、403（1977）に報告されている。抽出物は
まず、表示された透析分子量それぞれ約12000お
よび3500の透析膜を用いて、分子量分別透析に付
した。後者の膜を通過した、分子量範囲3500未満
の物質をＳ分画、分子量範囲3500〜12000の物質
をＬ分画と名づけた。両分画をSephadex Ｇ−10
上ゲル過に付した。生物活性はこの場合も、フ
ロレスカミン反応性ピーク分画に認められた。し
かしながら、活性は供与者の免疫状態の機能では
ないようであつた。しかも、２種の異なる作用が
認められた。第一の作用は、抗原の添加なく、ま
た供与者および受給者の免疫状態とは無関係な
DH反応の誘導であつた。この種の活性を本明細
書では、のちに定義するようにインデユーサーと
呼ぶ。第二の活性は、供与者が感受性を有するが
それまで暴露されたことのない抗原に対する皮内
反応の増大であつた。この、フロレスカミン反応
性クロマトグラフイー分画に認められた活性は、
受給者がすでに感受性を有する抗原に対するDH
反応を増大するようであつた。いずれの場合も、
供与者の感受性とは無関係のようであつた。Ｓフ
ラクシヨンをさらにヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフイーによつて分画したところ、添加抗原
なしにDH反応を生じる生物活性は、フロレスカ
ミンとの反応で検知される主ポリペプチドフラク
シヨンにはなかつた。 さらにJ.Immunol.124、885（1980）には、
Gottlieb、A.A.らにより、インデユーサー（抗原
を添加しないでDH反応を生じる）およびアンプ
リフアイアー（受給者が感受性を有する抗原の存
在下にDH反応を生じる）を、長い150cm、
Sephadex Ｇ−10カラムで分画化した場合のデー
タが示されている。アンプリフアイアーは主フロ
レスカミン反応性分画に存在したが、インデユサ
ーはこの分画にはなかつた。さらにヒドロキシア
パタイトを用いて分画したが、アンプリフアイア
ーの活性はフロレスカミン反応性ピークに留まつ
た。対照比較試験により、この活性は、同一処置
を施した赤血球溶解にも、また同一精製操作を行
つた食塩水にもないことが確認された。 Gottlieb、A.A.らは、Immune Regulators in
Transfer Factor〔A.Kahn、C.Kirkpatrick、
Hill編、Academic Press、Inc.、New York
（1979）、339頁〕と題する論文中で、データは示
していないが、サプレツサーと呼ばれる別の活性
がオーグメンター活性からヒドロキシアパタイト
クロマトグラフイーによつて分離できたことを示
唆している。オーグメンターはＳ透析分画に発見
され、常に主フロレスカミン反応性分画に存在し
た。このオーグメンターは、以前にBCGに暴露
された無感作患者に全身投与すると有効であると
考えられた。さらに、Ｌ透析分画に認められたサ
プレツサー活性は、ヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフイーにおいて、フロレスカミン反応性物
質の場合より高い塩濃度で溶出すると述べられて
いる。透析白血球抽出物の分画化が試みられた他
の研究としては、Wilson、G.B.ら〔J.Lab.Clin.
Med.93、819（1979）〕のin vitroにおいて白血球
の遊走に影響する４種の活性、すなわち２種の抗
原非依存性活性（抗原なしで応答を生じる）、１
種の抗原依存性特異的インヒビターおよび１種の
抗原依存性エンハンサーについての報告がある。
抗原依存性インヒビターは、適当な供与者特異性
の抗原のみがin vitroの白血球遊走の有意な阻害
を生じたので、輸送因子と共通の性質をもつてい
る。抗原依存性の白血球遊走強化は、抗原特異性
に関する特徴づけがなされていない。しかしなが
ら、上記活性がヒト免疫系のin vivo機能に何ら
かの関係を有するのかどうか、またその治療的有
用性との関連については、全く知られていない。 発明の要約 本発明はヒト免疫系のモジユレーターに関す
る。より詳細には、本発明は（）分子量が3500
より少さく、（）フロレスカミンに本質的に反
応性の物質を実質的に含まず、そして（）ヒト
白血球抽出物の透析物からゲル濾過およびオクタ
デシルシランカラムを用いる逆相高速液体クロマ
トグラフイーで水中のエタノール勾配により溶出
することにより得ることができるヒト免疫系モジ
ユレーターに関し、さらにまた本発明はこのよう
なフロレスカミンに本質的に反応性の物質を実質
的に含まない、ヒト生体の免疫系の直接または間
接応答に影響する性質を有する免疫系モジユレー
ターをヒト白血球抽出物から製造する方法に関
し、この方法は(1)ヒト白血球抽出物を透析分子量
限界約3500の透析膜で透析し、(2)透析物をゲル濾
過して複数個の分画に分画化し、(3)モジユレータ
ー確認分画を選択して集め、(4)集められたモジユ
レーター確認分画を逆相クロマトグラフイーカラ
ムに付し、次いで(5)カラムを水中のエタノール勾
配で溶出することを特徴とする方法である。本明
細書におけるモジユレーターの語は、動物もしく
はヒト生体、その部分またはそれから得られた成
分の、上記生体が以前に暴露されたことがある抗
原に対する応答、すなわち上記動物もしくはヒト
の免疫系機能に特異的に帰することができる応答
に、直接または間接的に作用する物質と定義され
る。したがつて、免疫応答に対する作用を含めた
一般的作用を有する物質は、ここに定義したモジ
ユレーターの語には包含されない。本明細書に述
べるモジユレーターはDH皮膚反応試験において
活性を発現する。したがつて、その主作用は細胞
仲介免疫系に対するものと考えられる。しかしな
がら、ここに述べるモジユレーターは全免疫系に
広範な作用を有し、体液性免疫系にも作用するこ
とがある。本明細書において論じるに際し、輸送
因子、インデユーサー、アンプリフアイアーおよ
びサツプレツサーの語は、それぞれ皮膚反応にお
けるDH応答に関連したそれぞれの活性と定義さ
れる。 輸送因子の語は上述の粗白血球抽出液の抽出物
を示す。輸送因子活性は、与えられた抗原に対し
て感受性を有することがわかつている供与者の白
血球から輸送因子プレパレーシヨンを調製し、同
一抗原に感受性のないことがわかつている受給者
に皮下注射した場合に発現する。受給者にその後
その抗原を挑戦させるとDH応答が観察される。
受給者は、正常時、輸送因子活性を注射しない場
合、応答を生じない。輸送因子は、与えられた抗
原に以前暴露されていない受給者にも作用が認め
られることから、上述のモジユレーターではな
い。しかも、輸送因子の作用は与えられた抗原に
関して特異的であるが、ここに述べるアンプリフ
アイアーおよびサプレツサーは、受給者が以前に
暴露された抗原に非特異的に作用する。 インデユーサーは、抗原の添加なく、供与者お
よび受給者の感受性とは無関係にDH応答を生じ
る活性と定義される。 アンプリフアイアーは、受給者が感受性を有す
る抗原の注射後に、正常より大きな応答の産生を
特徴とする。アンプリフアイアー活性は供与者の
特異的免疫感受性には依存しない。 サプレツサー活性は、受給者が感受性を有する
抗原とサプレツサーを同時に注射した場合、受給
者に正常より小さいDH応答を生じるという結果
によつて観察される。 本発明において、ヒト免疫系のモジユレーター
は白血球抽出液の透析物から単離された。６種の
モジユレーターはアンプリフアイアー活性を有
し、２種はサプレツサー活性を有する。アンプリ
フアイアーは、無感作状態および免疫機能低下状
態の治療に局所的または全身的に用いて有用と考
えられ、一方、サプレツサーは局所的感作亢進状
態たとえばうるしによる障害の治療に有用であ
る。これらのアンプリフアイアーはアンプリフア
イアー１〜６と命名する。サプレツサーはＳ−サ
プレツサーおよびＬ−サプレツサーと命名する。 好ましい態様の詳細な説明 本発明は免疫応答をモジユレートする機能をも
つ物質の発見に基づくものである。現在の技術で
は、ヒト個体が以前に暴露された抗原に対する応
答を増強または抑制するモジユレーターの同定が
可能である。しかしながら、この種の物質によつ
て、各種の修飾された機能が現れる。たとえば、
反応の特続、感受性の閾値、および炎症、リンパ
球増殖もしくは循環抗体産生等の応答の種類であ
る。この種の修飾機能はそれを検知および定量す
るために用いた試験系によつて定義されることは
明らかである。本発明のモジユレーターにはDH
応答のアンプリイフアイアーやサプレツサーが含
まれるばかりでなく、他の適当な試験系で検知、
定量される免疫修飾の他の表現も包含される。 本明細書に述べるモジユレーターは、したがつ
て、免疫系の成分間の細胞間伝達の自然手段を構
成するモジユレーター物質の系の一部でしかな
い。この場合、免疫応答の状態は絶えず当面の抗
原挑戦のレベルおよび活性に応じてモニターさ
れ、修飾される。したがつて、本発明からこの種
のモジユレーター系の存在が明らかである以上、
他のモジユレーターが発見されることもあり得
る。他の精製技術および他の試験操作を用いた今
後の研究が、この種のモジユレーターの同定およ
び精製を導くであろう。しかしながら、本発明は
この種のモジユレーターの存在を明らかにし、各
種の免疫性関連状態の治療に有用な新しい、予期
しない性質を有する数種のモジユレーターの単離
および特徴づけを始めて行うことにより、この種
の発見への道を開くものである。 アンプリフアイアー１は、与えられた抗原に対
する感受性を有する受給者のDH皮膚反応に対し
て促進および増強効果を示す点を特徴とする。抗
原とともに投与されたアンプリフアイアー１によ
つて生じる反応は、皮下注射後約６〜14時間で強
度がピークに達し、以後急速に消退する（一方、
アンプリフアイアー１がない場合には、抗原の注
射後24〜30時間で、正常のDH応答はピークに達
する）。本発明のアンプリフアイアー１は、本発
明の他のモジユレーターから、オクタデシルシラ
ンカラムを用い０〜100％（ｖ／ｖ）エタノール
−水勾配で溶出する逆相クロマトグラフイーによ
り分離できる。アンプリフアイアー１はカラムか
ら、少なくとも水中15％（ｖ／ｖ）エタノールで
溶出され、このアプリフアイアーの大部分は水中
約15％（ｖ／ｖ）から約20％（ｖ／ｖ）エタノー
ル（パーキンエルマー濃度測定装置の読み取り濃
度）中に溶出される。得られた溶出画分の屈折率
測定値1.3324〜1.3326から計算されたエタノール
濃度は０〜0.4％である。アンプリフアイアー１
はフロレスカミンとはほとんど反応せず、フロレ
スカミン反応性の主ピークとは逆相クロマトグラ
フイーで分離される。アンプリフアイアー１は、
表示の分子量透析限界3500の透析膜を通過する。 アンプリフアイアー２も、抗原に対する応答の
促進および増強を生じるが、促進の程度はアンプ
リフアイアー１に対する応答よりもわずかながら
小さい。反応部位はアンプリフアイアー１＋抗原
による場合よりも局限され、かなり長期間（７日
まで）特続する。驚くべきことは、最大増強活性
が適的濃度においてのみ認められ、至適濃度を超
えると増強作用が低下するばかりかDH応答の抑
制を生じる。アンプリフアイアー２はオクタデシ
ルシランから少なくとも45％（ｖ／ｖ）エタノー
ル−水溶液によつて溶出し、このアンプリフアイ
アーの大部分は水中約45％（ｖ／ｖ）〜約53％
（ｖ／ｖ）エタノール（パーキンエルマー濃度測
定装置の読み取り濃度）中に溶出される。得られ
た溶出画分の屈折率測定値1.3428〜1.3440から計
算されたエタノール濃度は36〜40％である。フロ
レスカミンとは反応せず、白血球抽出液の透析物
から単離される他のモジユレーターおよびこの抽
出液におけるフロレスカミン反応性物質の主ピー
クから、逆相クロマドクラフイーによつて分離さ
れる。アンプリフアイアー２の分子量およびサイ
ズは、表示の分子量透析限界約3500の透析膜を通
過する程度である。 アンプリフアイアー３，４および５は、抗原に
対する応答の増強をもたらす。希釈研究によれ
ば、アンプリフアイアー３および５の活性は希釈
によつて増強される。アンプリフアイアー４の活
性も増強されるが、データは幾分あいまいであ
る。アンプリフアイアー３，４および５は、オク
タデシルシランから、それぞれ少なくとも70％
（ｖ／ｖ）、80％（ｖ／ｖ）および89％（ｖ／ｖ）
エタノール−水溶液によつて溶出される。これら
のアンプリフアイアーの大部分は、以下のエタノ
ール−水濃度範囲（パーキンソンエルマー濃度測
定装定装置の読み取り濃度）で溶出される：アン
プリフアイアー３は70％（ｖ／ｖ）〜74％（ｖ／
ｖ）、アンプリフアイアー４は80％（ｖ／ｖ）〜
84％、（ｖ／ｖ）、アンプリフアイアー５は89％
（ｖ／ｖ）〜94％（ｖ／ｖ）。得られた各溶出画分
の屈折率測定値1.3531〜1.3543、1.3567〜1.3580
および1.3592〜1.3596から計算されたエタノール
濃度はそれぞれ、72〜76％、85〜89％および94〜
95％である。これらのアプリフアイアーはいずれ
もフロレスカミンと反応性を示さず、すべてたが
いからまた本明細書に述べた他のモジユレーター
から、逆相クロマトグラフイーによつて分離でき
る。アンプリフアイアー３，４および５は、いず
れも表示透析分子量限界約3500の透析膜を通過す
る。 アンプリフアイアー６はDH反応において抗原
に対し増強応答を生じ、全身作用を有するこも明
らかにされている。アンプリフアイアー１を除く
本明細書記載の増強性モジユレーターの大部分に
共通している点は、最大応答のための至適用量が
ある点で、これは単離されたサンプルを希釈して
いきながら効果を比較することにより確認され
る。アンプリフアイアー６はオクタデシルシラン
から100％（ｖ／ｖ）エタノール（パーキンエル
マー濃度測定装置の読み取り濃度）で溶出され
る。得られた溶出分画の屈折率測定値1.3610〜
1.3620から計算されたエタノール濃度は100％で
ある。このアンプリフアイアーはフロレスカミン
と反応せず、本明細書に記載の他のモジユレータ
ーとは逆相クロマトグラフイーによつて分離でき
る。アンプリフアイアー６の分子量およびサイズ
は、表示透析分子量限界約3500の透析膜を通過す
る程度である。 Ｓサプレツサーは表示透析分子量限界3500の透
析膜を通過した透析物から単離される。Ｓサプレ
ツサーは、逆相クロマトグラフイーにより０〜
100％（ｖ／ｖ）エタノール−水勾配で溶出して
同定可能であり、少なくとも部分的にアンプリフ
アイアー１および２から分離できる。Ｓサプレツ
サーはオクタデシルシランから水中エタノール67
％〜100％（ｖ／ｖ）の範囲で溶出され、96％
（ｖ／ｖ）〜99％（ｖ／ｖ）（パーキンエルマー濃
度測定装置の読み取り濃度）で溶出する分画に明
瞭に存在する。この分画の屈折率測定値1.3602〜
1.3606から計算されたエタノール濃度は97〜99％
である。Ｓサプレツサーは逆相クロマトグラフイ
ーにおける主フロレスカミン反応性ピークとの分
離性から判断して、フロレスカミンと反応して螢
光を生じることはない。DH皮膚反応の抑制は、
Ｓサプレツサーを受給者がDH応答を示す試験抗
原の注射前またはその注射と同時に注射した場合
に発現する。抑制は可逆性で、短時間作用型で、
DHの発現する約72時間遅延させる。アンプリフ
アイアー２をＳサプレツサーと同時に注射すると
抑制は認められない。 Ｌサプレツサーは、表示透析分子量限界12000
の透析膜を通過するが、透析分子量限界限3500の
膜では透析されない白血球抽出分画中に存在す
る。Ｓサプレツサーの活性に似て、Ｌサプレツサ
ー活性は可逆性で、抑制効果は約72時間特続す
る。Ｌサプレツサーはヒドロキシアパタイトクロ
マトグラフイーにより主フロレスカミン反応性ピ
ークから分離されることから判断して、フロレス
カミンと反応しない。 以下の実施例中の操作は、ヒト供与者から得ら
れた材料、およびヒト受給者に対する試験につい
て述べたものである。用いた操作および試薬は、
ヒトの治療用の無菌、非毒性生成物が得られるよ
うに選択した。特定の抗原に対する供与者および
受給者の感受性はあらかじめ試験した。 例 １ 精製操作 Ａ 白血球の調製 白血球は、全血サンプルの分画化または白血
球泳動のいずれかを用い、標準方法で調製し
た。前者の方法では、全血サンプル450mlを
Macrodex（Pharmacia Corporation、
Piscataway、N.J.の商標名、生理食塩水中６
％（ｗ／ｖ）デキストラン70）中1xgで沈降さ
せて分画化し、白血球から赤血球を分離した。
この方法で約１〜２×109の白血球が回収され
た。白血球泳動は大量の細胞を得る場合に好ま
しかつた。Haemonetics（Haemonetics
Corp.、Braintree、Mass.の商標名）30s型細
胞分離機を使用した。この系には、末梢血から
の白血球の回収および沈降による最終白血球プ
レパレーシヨンからの赤血球の除去を効果的に
するため、46.7％クエン酸三ナトリウム
（Haemonetics、Braintree、Mass、）30c.c.およ
び500mlの６％（ｗ／ｖ）Voltex（McGaw
Co.、Irvine、Calif.の商標名）、高分子量デン
プンプレパレーシヨンを下塗りした。いずれの
場合も、37℃で60分間インキユベートしたの
ち、白血球に富んだ血漿が得られた。血漿を
400xgで15分間遠沈後、0.5M食塩水で３回洗浄
して白血球を回収した。洗浄後、白血球ペレツ
トを−20℃で凍結保存した。細胞分離機を６回
作動させて、白血球の平均収量は１×1010個で
あつた。 Ｂ 透析 白血球抽出液は滅菌状態で調製した。白血球
ペレツトを５ｍＭ重炭酸アンモニウム10mlに再
懸濁し、ドライアイス−アセトン浴中で10回凍
結、融解をくり返した。溶解物をまず、透析分
子量限界12000のセルロース透析チユーブ
（Arthur H.Thomas、Inc.、Chicago、Ill.）を
用い、５ｍＭ重炭酸アンモニウムに対して透析
した。緩衝液を３回交換し、透析液を合して凍
結乾燥し、小容量の重炭酸アンモニウムに再溶
解し、透析分子量限界3500のセルロースチユー
ブを用い、５ｍＭ重炭酸アンモニウムに対して
前回と同様に透析した。第２の透析における残
留液を本明細書ではＬ分画、透析液をＳ分画と
呼ぶ。各分画を次の使用まで−20℃で凍結保存
した。 Ｃ ゲル過 Sephadex Ｇ−10（Pharmacia、Inc.、
Uppsala、Swedenの商標名）を５ｍＭ重炭酸
アンモニウム中で一夜膨潤させ、ついでオート
クレーブで処理した。微粉末を除去したのち、
1.5cm×151cmカラムに充填し、５ｍＭ重炭酸ア
ンモニウムで平衡化した。再溶解したＳ分画の
フロレスカミン反応性物質400mg〔Bohlen、P.
ら：Arch.Biochem.Biophys.155、213（1973）
にしたがい、定量基準としてのウシ血清アルブ
ミンに基づき〕をカラムに負荷した。サンプル
は５ｍＭ重炭酸アンモニウムにより、流速13
ml／時で溶出した。１カラム容量（254ml）を
0.8mlのフラクシヨンとして採集した。各フラ
クシヨン100μをとつて、254nｍにおける紫
外線吸収およびフロレスカミンとの反応性を調
べた。結果は第１図に示すとおりである。 主フロレスカミン反応性ピークが得られた。
このパターンは供与者間で変動はなかつた。フ
ロレスカミン反応性との関係でのモジユレータ
ー活性の位置は一連の10倍希釈液にわたつて
DH応答を測定して明らかにした。DH応答の
性質は希釈によつて全く予期せぬ方向に変化し
た。フロレスカミンピークの領域の非希釈サン
プルは、抗原単独に対する対照応答に比べて抗
原に対するDH応答が低下した。10-2および
10-3の希釈で、驚くべきことに、DH応答は対
照に比し増強された。さらに驚くべきことに、
10-5のオーダーに希釈するとDH応答の抑制が
認められた。このような異常な応答性を示す分
画を、本明細書ではモジユレーター確認分画と
呼ぶ。この分画を選びさらに精製した。このよ
うな実験から、問題の活性（モジユレーター確
認分画）は主フロレスカミン反応性ピークとこ
れに先立つ小フロレスカミン反応性ピークを含
む領域に存在することがわかつた。次の精製工
程では、分画１５２〜１７８（第１図に示す）
を集め、凍結乾燥した。この分画の両側にさら
に収集分画を広げれば最終収率が改良される可
能性もある。最適の分画選択はまだ確定してい
ない。 一部の実験では、もつと短い（80cm）
SephadexG−10カラムを用いてゲル過を行
つた。長いカラムの方が分離が改善される点を
除き、結果はほぼ同様であつた。とくに、長い
カラムでは、主フロレスカミン反応性ピークか
ら抗原非依存性のインデユーサーが分離され
た。 ゲル過に代えて、排除分子量限界5000のス
ルホン化ポリスチレンジビニルベゼン
（Shodex Ｓ−802／ｓ、昭和電工製）の１×25
cmカラムを用い、流速0.8ml／分の水で溶出す
る高速ゲル排除クロマトグラフイーにより精製
することも可能であつた。 Ｄ 逆相クロマトグラフイー オクタデシルシランのカラムを用い、０〜
100％（ｖ／ｖ）勾配のエタノール水溶液で溶
出する逆相高圧液体クロマトグラフイーにより
さらに精製を行つた。カラムにサンプル30mg
（フロレスカミン反応性に基づいて）を負荷し、
流速0.5ml／分で溶出し、１ml分画を集めた。
一部のプレパレーシヨンでは、エタノール−水
勾配に続いて、100％エタノールにより同速度
で溶出を行つた。 各フラクシヨンを凍結乾燥し、生理食塩水
0.5mlに再溶解した。各フラクシヨン0.1mlを、
あらかじめ受容者が感受性を示すことを確認し
た抗原とともに皮内注射し、24時間後の皮膚反
応を調べた。結果を第２図に示す。 第２図に示す分離により、抗原ストレプトキ
ナーゼ（SK）に感受性を示さない供与者から
物質を得た。受容者はストレプトキナーゼに感
受性を示すことがわかつていた。受容者が、モ
ジユレーターのない場合に示すSKに対する皮
膚反応を第２図に水平な線として示した。この
線より上にくればアンプリフアイアー活性、こ
れ以下の応答は正常より低く、サプレツサー活
性を示唆する。参考のため、第２図に、フロレ
スカミン反応物質ならびに各種の小分子（セロ
トニン、ヒスタミン、アスコルビン酸、ニコチ
ンアミドおよびリン酸ハイドロコーチゾン）で
血管反応性、炎症誘発性または抗炎症性が知ら
れている物質を含む分画の位置を示す。実線は
各分画の溶出したままの濃度での皮膚反応性を
示している。 各分画の結果を、数種の希釈度で投与した集
合分画（０〜１０，１０〜２０，２０〜３０）
と比較した。希釈度が高いほど、逆に、10〜20
の集合分画では最大のアプリフアイアー活性を
示した。アンプリフアイアー１の最大活性を示
す分画５、ならびに分画１４の希釈効果を、
SKに対して感受性を示す個体で測定した。結
果は、抗原およびモジユレーター注射後７，１
２および24時間の発赤および硬結領域の縦横を
mmで示した。モジユレーターは生理食塩水で希
釈した。このデータは第１表に示す。 アンプリフアイアー１の場合（第２図の分画
５）、試験した全希釈度で強い促進およ増強作
用が認められ、検討した全濃度で試験部位の飽
和を示している。しかしながら、分画１４で
は、10〜1000倍希釈でのみ有意な増強が認めら
れ、したがつて、アンプリフアイアー２活性に
は明瞭な至適濃度が得られた。ある程度の促進
もみられたが、アンプリフアイアー１ほど明瞭
ではなかつた。 第２図の非希釈サンプルについての測定で得
られたアンプリフアイアー活性のこと２ピーク
は、必ずしも、全プレパレーシヨンにおけるア
ンプリフアイアーの真の位置を示すものではな
い。これにはいくつかの理由がある。第一に、
供与者により白血球中のモジユレーター濃度が
異なるたである。白血球中に他の物質があり、
これがプレパレーシヨンに影響する場合もあ
る。試験した受容者側の生物学適な変動もあ
る。最後に、アンプリフアイアー２の場合、濃
度によつて逆の効果を示すことが関係する。と
くに第２図において、分画１２〜１８の領域で
活性が低下したのは、この領域ではアンプリフ
アイアーが上記至適濃度にあつた結果であるこ
とは明瞭である。適当に希釈した場合、アンプ
リフアイアー２の活性ピークは分画１４〜１６
の領域に認められるべきである。この結論を第
２図に点線で示した。これはアンプリフアイア
ー２活性を至適希釈において測定したとしての
推測曲線である。 分画２１〜３０にはＳサプレツサー活性がみ
られた。抗原と同時に注射すると、Ｓサプレツ
サーは注射６または24時間後のDH応答の発現
を効果的に防止した。これに対し、抗原単独を
注射した場合には、24時間後に明瞭なDH応答
が認められ、アンプリフアイアー１または２も
存在するところでは、もつと強い応答さえ認め
られた。結果を第３図に示す。患者の左腕に、
第２図に示し溶出勾配の分画を集め１：10およ
び１：100に希釈したものを、患者の腕に示し
たようにHP−PK−１にはHP−１（分画１〜
１０を合す）、HP−PK−２にはHP−２（分画
１１〜２０を合す）、HP−PK−３にはHP−
３（分画２１〜３０を合す）をPPDと混合して
一連に皮下注射した。PPD単独の対照の注射
は患者の右腕に行つた。HP−１およびHP−
２を注射した部位では、この分画中のアンプリ
フアイアーにより、対照に比べて炎症の増強が
観察された。しかしながら、HP−３処理部位
では、存在するサプレツサーの活性がこの分画
のアンプリフアイアーの活性を上回ると思わ
れ、炎症は低下した。Ｓサプレツサー活性は大
部分の供与者で、逆相クロマドグラフイーのプ
ールした分画２１〜３０にみられた。Ｓサプレ
ツサー活性が単一の分画たとえば第２図の分画
２９に認められる場合もあつた。しかしなが
ら、全プレパレーシヨンで常に単一フラクシヨ
ンにサプレツサー活性がみられるのみでなく、
このような活性の存在は供与者間で差がみられ
た。 逆相クロマトグラフイーにより分離した20か
ら30までの領域の各フラクシヨンについて数種
の希釈を行い測定すると、アンプリフアイアー
３，４および５の存在が確認された。アンプリ
フアイアー３の活性ピークは分画２１および２
２、アンプリフアイアー４の活性は分画２５に
集まり、アンプリフアイアー５の活性は主とし
て分画２７および２８に存在した。Ｓサプレツ
サーは分画２９および３０に認められた。クロ
マトグラフイーの代表的結果を第４図に示す。
第４図では、対照に対するDH応答の変化を
（ａ×ｂ）−（a*×b*）により皮膚反応の程度で
プロツトた。ａおよびｂは分画＋抗原の注射に
よつて生じた発赤部位の直径をたがいに直交す
る軸にそつて測定してmmで表示した値であり、
a*およびb*は抗原単独を注射して生じた対照
部位での相当する直径である。すなわち、この
皮膚反応の程度は抗原単独おび抗原とモジユレ
ーターの混合における病変の面積の差にほぼ相
当する。分画２９および３０にみられた対照レ
ベル０より小さな値はサプレツサー活性を、０
より大きい値はアンプリフアイアー活性を示
す。第２図に示した実験では奇数番号の分画の
み測定していることを考慮すると、第４図のパ
ターンは第２図の場合に類似している。 エタノール−水勾配がエタノール濃度99.9％
に達したのち、100％エタノールにより流速0.5
ml／分で溶出し、１ml分画を集めると、逆相カ
ラムからアンプリフアイアー６が溶出した。こ
の条件ではアンプリフアイアー６は分画３２〜
３４に検出され、見かけの濃度が最大になるの
は分画３３であつた。 アンプリフアイアー６は、受給者が感受性を
示す抗原に対する応答を促進、増大させた。２
×108の白血球から上述の精製法で生成した用
量で、以前に暴露された抗原に対する応答が疾
患により低下した患者のDH応答を改善し、場
合により回復させた。一般的に、アンプリフア
イアー６に対する応答は希釈によつて増大する
が、至的希釈度は各受給者により、また多分抗
原によつても変動した。第４表には２種の希釈
の結果を示す。Ａでは、ストレプトキナーゼ感
受性受給者にストレプトキナーゼ2.5単位と同
時にアンプリフアイアーを投与した。逆相カラ
ムから集めたアンプリフアイアーの分画1.0ml
を凍結乾燥し、生理食塩水0.3mlに再溶解した。
指示した分画0.1mlを指示したように生理食塩
水で希釈し、注射した。Ｂでは、PPD感受性
受給者に標準Aplisol PPD1/10希釈液0.05ml
を、アンプリフアイアーの指示した生理食塩水
希釈液0.1mlまたは対照として生理食品水0.1ml
とともに注射した。 アンプリフアイアー活性をもつ物質は水溶液
からエーテルで抽出できる。抽出可能な活性は
最大効果を得るに希釈を要する。しかしなが
ら、どのアンプリフアイアーがエーテル抽出さ
れるのかは不明である。上述のモジユレーター
の逆相クロマトグラフイーによる分離は本技術
分野で公知の各種逆相カラム材料を用いて実施
できる。溶出状態は変化するが、上記モジユレ
ーターの分離に最適な条件は本技術分野におけ
る通常の知識を有する者には容易に決定できる
ものである。 Ｅ Ｌ透析分画の分画化 Ｌ透析分画はヒドロキシアパタイト上クロマ
トグラフイーによつてさらに分画化できる。粉
末を除去したのち、あらかじめヒドロキシアパ
タイトを５ｍＭ重炭酸アンモニウムで平衡化
し、1.5×20cmカラムに充填した。凍結乾燥し、
0.05M重炭酸アンモニウムに再解したＬ分画を
カラムに適用した。カラムは0.05M〜0.2M重
炭酸アンモニウム勾配（115ml）で、ついで
0.2M〜0.6M重炭酸アンモニウム勾配（65ml）
で溶出した。各１mlの分画を260nｍの吸収お
よびフロレスカミンとの反応性でモニターし
た。ほぼ全勾配にわたり、各フラクシヨンを７
個ずつ合して採取した。合した分画について、
受給者が感受性を示した抗原とともに皮内注射
して生物活性を調べた。結果を第２表に示す。
相対DH応答は、硬結領域の直径を25および43
時間に測定してmmで表し、抗原単独を注射した
場合の対照反応部位と比較して第２表に示し
た。0.1Mと0.15Mの重炭酸アンモニウムの間
に溶出した分画４５０および４５１は、少なく
とも43時間、DH反応を強力に抑制した。72時
間後には４５０および４５１の分画を注射した
部位に10mm×10mmの反応がみられ、この抑制活
性は時間がたつと可逆性をもつことを示してい
る。 例 ２ 特徴および対照実験 Ａ 例1Bで白血球抽出液を製造したと同様にし
て透析赤血球抽出液を製造した。分別透析、
SephadexG−10カラムクロマトグラフイーを
例１に記載したと同様にして実施した。得られ
た分画には、免疫モジユレーター活性は認めら
れなかつた。したがつて、観察された生物活性
は、抽出および精製工程で導入されたものでは
なかつた。さらに、血小板抽出液を同一の精製
工程に付したが、モジユレーター活性はみられ
なかつた。精製アンプリフアイアーの一部は再
クロマトグラフイーに付したが、はじめの精製
時とほぼ同じ挙動を示した。 Ｂ 輸送因子に関する先行技術の記述から、観察
された受給者の感受性増大が、供与差には検地
できなかつた低レベルの感受性の輸送により、
濃縮されて受給者において感受性の増大として
現れたのではないということを、できる限り明
白にすることが重要であつた。この場合に用い
た実験方法は、地域的に局在することが明らか
な抗原または医学的に追跡できる起源の抗原に
ついて試験する方法がある。結核菌の精製タン
パク誘導体、PPDは医学的に追跡可能で、か
つ地域的に局在する。PPDに対する感受性は
BCG（Bacille Calmette−Guerin）でワクチン
化された前歴のある個体に生じ、これは欧州で
は結核に対する免疫を付与するため広範に用い
られている。しかしながら、米国では許可され
たことがない。ヒストプラズミンは地域的に局
在する抗原である。ヒストプラズミンに対する
感受性は米国南部や熱帯地方に多く、ヒストプ
ラズマ症はこの地方の風土病であるが欧州には
ない。 対照実験では、供与者は米国南部生まれで、
ヒストプラズミンには皮膚試験で感受性を示す
が、PPDには反応しない者を選んだ。受給者
はずつと英国に住んでいて、PPDに対する皮
膚試験で感受性を示すか、BCG注射の前歴が
あつた。この実験に用いたアンプリフアイアー
プレパレーシヨンは上述のようにSephadex Ｇ
−10分画工程により精製したが、短い80cmカラ
ムを用いて分離程度の低いものとした。したが
つて、試験物質はアンプリフアイアー１〜６お
よびＳサプレツサーの混合物で、さらにフロレ
スカミン反応性物質も含んでいた。しかしなが
ら、結果はプレパーシヨン中に輸送因子活性が
ないことを証明として重要である。 結果は第３表に示す。２名の受給者それぞ
れ、２種類のフロレスカミン反応性ピーク
（Sephadexカラム３３および３９分画）で試験
した。フロレスカミン反応性に基づき2.4mgの
各フラクシヨンを単独にまたはPPD25単位と
ともに注射した。はじめの注射から14時間後
に、抗原を注射しなかつた部位に、ヒストプラ
ズミン、0.1mlのヒストプラズミン抗原（Park
−Davis Corp.、Detroit、Mich.、生理食塩水
１／１００ｗ／ｖ希釈液として市販）を挑戦させた。
PPDまたはヒストプラズミン単独を注射した
対照部位も適当な時間に準備した。第３表に
は、皮膚反応の強度を、注射部位に囲む硬結領
域の直径（mm）で示す。データは、受給者が、
白血球抽出液分画の注射前、後いずれも、ヒス
トプラズミンと反応する能力をもたなかつたこ
とを示している。アンプリフアイアーの促進お
よび増強の両効果が認められる。一方、ヒスト
プラズミン感受性の輸送はみられない。 Ｃ 本発明のアプリフアイアー活性の重要な点
は、試験したすべてが、促進（アンプリフアイ
アー１）および増大（アンプリフアイアー２）
活性ならびにアンプリフアイアー６を含めて全
身的に有効なことである。さらに、全身的効果
は無感作性患者（疾患で正常な免疫応答が消失
した患者）にも認めることができた。 BCGの既往があり、現在は疾患のためPPD
に非反応性である患者が、上述の例2Bのアン
プリフアイアーを10〜100倍の高用量皮下注射
したところ、PPDに応答を示すようになつた。
抗原に対する応答はアンプリフアイアーの注射
部位に局限されなかつた。 全身的効果はアンプリフアイアー６を用いた一
連の実験で劇的に示された。サルコイドーシスに
４年間罹患し、全抗原に対する応答が著しく弱く
なつていた患者の例を示す。以下に試験を行つ
た。試験第１日に、患者に破傷風トキソイドを、
単独および種々の希釈度でアンプリフアイアー６
とともに投与した。結果は、第５表に示すよう
に、破傷風トキソイド単独では硬結のない弱い発
赤反応を、アンプリフアイアー６とともに投与し
たときはわずかな増大を示した。しかしながら、
どの試験部位にも硬結はなく、患者が適当に応答
していないことを示していた。試験第２日、患者
に逆相クロマトグラフイー分画３３からのアンプ
リフアイアー６を、約２×108の白血球から抽出
された相当量を皮下注射した。試験第８日に、患
者に再度、破傷風トキソイドを、単独にまたは数
種の希釈度のアンプリフアイアー６とともに前回
同様投与した、このときは、アンプリフアイアー
６に明瞭な反応があつて、第５表に示すように硬
結も認められた。この結果は第２日に投与したア
ンプリフアイアー６の全身的効果によつて修飾さ
れ、抗原に対する応答が増大したことを示してい
る。 アンプリフアイアー６の全身的効果は、患者の
末梢血リンパ球のin vitroにおける活性化に対す
る応答の測定によつても明らかである。リンパ球
活性化はよく知られた現象である。正常人の末梢
血リンパ球サンプルを、植物ミトゲンやフイトへ
マグルチニン（PHA）などの公知活性化剤によ
り細胞培養で増殖を誘発する。増殖速度は培地か
ら分裂細胞への3H−チミジン取り込みにつて表
される。試験法はOppenheim、J.J.ら：In Vitro
Methods of Cell Mediated and Tumor
Immunity（Bloom、Davia編）573〜585頁、
Academic Press、New York、N.Y.（1976）に
記載されている。 末梢リンパ球サンプルは上記試験の第２日およ
び第８日に採取し、各種活性化剤に対する応答を
測定した。結果は第６表に示す。第２日にはリン
パ球は正常の応答レベルよりかなり低かつたが、
第８日には３種の活性化剤中の２種に対し、正常
または増大した応答を示した。すなわち、アンプ
リフアイアー６の皮下注射に対する全身的応答を
生じた。 上述の実験で、ブタ草ミトゲンはGibco
Laboratories、Grand Island、N.Y.、PHAおよ
びコンカナバリンＡはDifco Laboratories、
Detroit、Mich.から得た。結果は第６表に、3H−
チミジン取り込みをカウント／分で示した。 例 ３ 各志願者についての実験結果から、非遺伝性の
無感作性または免疫機能低下状態の受給者の免疫
応答を上述のアンプリフアイアーで増大できるこ
とが明らかである。志願者についての一部の実験
結果はSephadex Ｇ−10クロマトグラフイーによ
精製物質で、アンプリフアイアーの混合物と考え
られる物質を用いて行われた。治療方法の好まし
い態様は次のとおりである。 アンプリフアイアー１〜６は逆相クロマトグラ
フイーを用い、例１に記載したように調製、精製
する。活性分画を集め、凍結乾燥し、生理食塩水
または生理的に許容されるビークルに再溶解す
る。有効量、たとえば５×107の白血球から精製
されたアンプリフアイアー１〜６に相当する量を
含む0.1mlを皮下注射する。免疫応答の増大は、
感受性もつことがわかつている抗原に対する患者
の反応性をアンプリフアイアーの投与前後で比べ
てモニターする。アンプリフアイアーは所望の効
果に応じて、単独または配合投与する。アンプリ
フアイアーの投与によつて生じる系の修飾の特続
は患者間で異なり、上述の適当な感受性試験によ
り周期的にモニターしなければならない。所望の
免疫強化を維持するためには、医師の判断によ
り、投与をくり返す。 例 ４ アンプリフアイアーは、単独にまたは配合し
て、弱いワクチンに免疫応答を生じさせるめに使
用できる。多くの病原体、たとえば数種のブドウ
球菌変種やヒストプラズマ症、カンジダ症を生じ
る菌は、一部の患者では強い免疫応答を誘発しな
い。しかも、この種の患者に免疫機能を与える満
足できるワクチンは知られていない。この種の菌
の感染は、とくに、癌化学療法や免疫抑制剤療法
を受けている患者にとつては危険である。弱い抗
原に対する患者の免疫応答を増強することによ
り、上述のアンプリフアイアーの１種または２種
以上の投与は、この種の病原体に対するワクチン
の製造を可能にする。化学療法または移植手術を
受けようとする患者は、治療前に、ヒストプラズ
マ症やカンジダ症に罹患しやすくならないように
ワクチン化することができる。 ワクチンは、公知方法により適当な減毒および
非増殖化する方法で調製した所望の病原体の抗原
を、例１に記載の方法で製造したアンプリフアイ
アー１〜６と合して製造すのが好ましい。ワクチ
ンは常法によつて投与する。 上述のように使用すれば、アンプリフアイアー
１〜６は、医学的予防法の範囲を拡大し、免疫性
抗原の可能性を広げることが期待できる。 例 ５ 重篤なうるしによる皮膚反応または他の接触過
敏性反応はＳサプレツサー処置で予防される。接
触皮膚反応たとえばうるしや他のアレルゲンに対
する反応の主要部分はDH反応であることが知ら
れていて、この種の治療は次のように実施され
る。Ｓサプレツサーは例１に記載したようにして
精製できる。逆相クロマトグラフイーで得られた
活性分画を集め、凍結乾燥し、ついで、コールド
クリーム基剤組成物のような局所投与に適した軟
膏に導入する。反応がたとえば組織または臓器移
植のように全身性の場合は、非経口投与が好まし
い。各供与者によつてサプレツサー活性の収率は
変動するので、適用量は活性単位で表す必要があ
る。１サプレツサー単位はヒトDH反応の硬結の
直径を５mm低下させるのに必要な最小量と定義さ
れる。この定義を用いて、臨床的に必要がつて大
用量を投与する場合には100cm2あたり少なくとも
１単位の割合で用いる。処置は危険がある限り続
け、少なくとも７日に１回の間隔で行うが、臨床
上必要ならびさらに頻回に行うことができる。各
患者の反応は、患者の抗原に対する感受性の程
度、およびサプレツサーに対する反応により変動
する。この種の組成物には、ステロイドまたは他
の抗炎症剤を加えて、治療効果を増強させること
も有利である。 例 ６ 重篤なうるしおよび他の接触皮膚反応は、例１
に記載した方法で製造したＬサプレツサーにより
防止できる。この場合も、皮膚反応のDH成分が
この治療法の有効性を指示する。ヒドロキシアパ
タイトクロマトグラフイーから得られた活性分画
を集め、凍結乾燥し、局所投与に適した軟膏組成
物に導入うする。反応が全身的な場合、たとえば
組織または皮膚移植では、非経口投与が好まし
い。投与量および投与方法は、例３に述べたとほ
ぼ同じである。 ＬサプレツサーとＳサプレツサーは、別個にま
たは単一組成物に混合して適用できる。 毒性 本発明によるヒト免疫系モジユレーターはいず
れも、上記したような人体物質の抽出物であり、
その毒性は検出できない程低く、同抽出物の試験
においても、毒性もしく有害な作用は見い出され
なかつた。 一般的結論 免疫系における上述のモジユレーターは、天然
において免疫の調整を、直接細胞免疫によりおよ
び多分間接的に体液性免疫にも影響して営んでい
る物質と考えられる。この物質は高純度に調製さ
れたので、その性質を特定することができた。そ
の性質は、先行技術に報告されている輸送因子や
その部分分画とは全く異なり、予期せぬ相異も示
した。本発明のアンプリフアイアーおよびサプレ
ツサーは、各種の免疫機能亢進および低下状態を
呈する患者の治療に使用できる。この物質は特異
的な性質を有する者というよりも、正常供与者か
ら単離でき、したがつてプールした原料から大規
模な精製が容易である点でとくに重要である。本
発明のモジユレーターはその生物活性および物理
性状で定義されるものであつて、必ずしも単一化
学物質から構成されるものではない。 本発明を以上、特定の好ましい態様を参照して
説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱す
ることなくさらに改変が可能なことは当然であ
る。本発明は、一般に本発明の原理にしたがいま
た本発明の属する技術範囲内で公知、慣用の実務
による本発明からの変更に基づくすべての改変、
使用または適用を包含する。たとえば、透析およ
び透析膜による透析を本明細書では採用している
が、この語は分子および／または生物活性を、サ
イズおよび／または重量で分離する均等方法を包
含する。すなわち、透析の語は、限外過、超遠
心および電気泳動を包含するものである。
実質的に含まず、そして () ヒト白血球抽出物の透析物からゲル濾過お
よびオクタデシルシランカラムを用いる逆相高
速液体クロマトグラフイーで水中のエタノール
勾配により溶出することにより得ることがで
き、かつまた、 () 次のおおよそのエタノール濃度範囲、0.0〜
0.4％、36〜40％、72〜76％、85〜89％、94〜
95％、97〜99％および100％を有する溶出画分
として前記勾配からそれぞれ溶出することがで
きるヒト免疫系モジユレーター。 ２ おおよそ0.0〜0.4％のエタノール濃度範囲を
有する溶出画分として勾配から溶出することがで
きるアンプリフアイアー１である請求の範囲第１
項のモジユレーター。 ３ おおよそ36〜40％のエタノール濃度範囲を有
する溶出画分として勾配から溶出することができ
るアンプリフアイアー２である請求の範囲第１項
のモジユレーター。 ４ おおよそ72〜76％のエタノール濃度範囲を有
する溶出画分として勾配から溶出することができ
るアンプリフアイアー３である請求の範囲第１項
のモジユレーター。 ５ おおよそ85〜89％のエタノール濃度範囲を有
する溶出画分として勾配から溶出することができ
るアンプリフアイアー４である請求の範囲第１項
のモジユレーター。 ６ おおよそ94〜95％のエタノール濃度範囲を有
する溶出画分として勾配から溶出することができ
るアンプリフアイアー５である請求の範囲第１項
のモジユレーター。 ７ おおよそ100％のエタノール濃度範囲を有す
る溶出画分として勾配から溶出することができる
アンプリフアイアー６である請求の範囲第１項の
モジユレーター。 ８ おおよそ97〜99％のエタノール濃度範囲を有
する溶出画分として勾配から溶出することができ
るＳ−サプレツサーである請求の範囲第１項のモ
ジユレーター。 ９ ヒト白血球抽出物から、ヒト生体の免疫系の
直接または間接応答に影響する性質を有する免疫
系モジユレーターを製造する方法であつて、この
モジユレーターはフロレスカミンに本質的に反応
性の物質を実質的に含まず、そして(1)ヒト白血球
抽出物を透析分子量限界約3500の透析膜で透析
し、(2)透析物をゲル濾過して複数個の分画に分画
化し、(3)モジユレーター確認分画を選択して集
め、(4)集められたモジユレーター確認分画を逆相
クロマトグラフイーカラムに付し、(5)カラムを水
中のエタノール勾配で溶出することを特徴とす
る、免疫系モジユレーターの製造方法。 １０ 活性成分として () 分子量が3500より小さく、 () フロレスカミンに本質的に反応性の物質を
実質的に含まず、そして () ヒト白血球抽出物の透析物からゲル濾過お
よびオクタデシルシランカラムを用いる逆相高
速液体クロマトグラフイーで水中のエタノール
勾配により溶出することにより得ることがで
き、かつまた、 () 次のおおよそのエタノール濃度範囲、0.0〜
0.4％、36〜40％、72〜76％、85〜89％、94〜
95％、97〜99％および100％を有する溶出画分
として前記勾配からそれぞれ溶出することがで
きるヒト免疫系モジユレーターを含有する、ヒ
トが以前暴露された抗原に対するヒト免疫系応
答を増大もしくは減少させる医薬組成物。 発明の背景 ヒト免疫系はきわめて複雑で、現在でも完全に
は理解されていない。現在では２種の主要な態
様、すなわち、循環抗体によつて仲介される液体
性免疫と、名称のとおりリンパ細胞によつて仲介
される細胞性免疫とがあると考えられている。体
液性免疫は、から非免疫受給者に血清免疫グロブ
リンによつて運搬され、このような血清が仲介す
る輸送によつて免疫応答を生じ、これは多くの場
合即時的に生じる。細胞仲介免疫は未梢血白血球
によつて輸送される。細胞によつて輸送される免
疫応答は、数時間といた期間を経て緩徐に発現す
る。 細胞仲介免疫の代表的な発現は遅延型過敏性反
応であり、本明細書ではDHと略する。DH皮膚
反応は、適当な抗原が皮下注射された場合に認め
られる。24〜48時間以内に、局所的炎症（発赤）
および腫脹と肥厚（硬結）が、感受性の高い個体
に認められ、感受性の程度は反応のサイズおよび
強度によつて測定される。DH反応はまた、特徴
的な組織学的所見、とくに炎症領域における血管
周囲にリンパ球および単球の浸潤を生じる。DH
反応の部位にみられる細胞は、未梢血白血球群に
由来するものである。 細胞仲介免疫の機構は、まだ完全にはわかつて
いない。応答を仲介する細胞は、抗原の挑戦にさ
まざまな方法で応答できる。この種の応答には、
与えられた抗原に対して特異的な感受性をもつ細
胞の増殖、各種の免疫機能を仲介する細胞たとえ
ば抗体の誘導および増加、異物細胞や腫瘍に対す
る反応が含まれる。これらの応答パターンの質お
よび量は多くの因子、たとえば胸腺や副腎皮質の
ホルモン、インターフエロン、その他の細胞性応
答の奏効体たとえばヒスタミン、セロトニン、プ
ロスタグランジンによつて影響される。 本発明は、白血球の透析抽出液から単離され、
細胞仲介免疫応答に強力に影響する免疫系モジユ
レーターの発見に基づくものである。これは、特
異的抗原に対する過剰反応または不適当な反応に
よる各種臨床症状の治療およびある種のアレルギ
ー症状の緩和に有用である。 従来技術 1954年、H.S.Lawrenceは、ツベルクリン感受
性供与者の白血球から調製した溶解質がツベルク
リン非反応受給者にその感受性を運ぶことができ
ることを報告した〔J.Clin.Invest.33、951
（1954）〕。この仕事についての最近の総説として
Lawrence、H.S.：The Harvey Lactures68、
239（1974）、またその時点での論文を集めたもの
としては、M.S.Ascher、A.A.Gottlieb、C.H.
Kirkpatrick編：Transfer Factor：Basic
Properties and ClinicalApplications、
Academic Press、Inc.、New York（1976）およ
びA.Kahnら編：Immune Regulators in
Transfer Factor、Academic Press、Inc.、
New York（1976）がある。この感受性の輸送は
白血球溶解質中の因子によるものと推測され、そ
の後、輸送因子という機能的な名称が付された
（B.Amos、H.Koprowski編：Cell−Bound
Antibodies中でNajarian、J.S.、Feldman、J.D.
の論文に対する批評でLawrence、H.S.による）。
この輸送因子による現像はヒトでしかみられず、
このため、活性の根源を単離し、性状を明らかに
する研究は徐々にしか進まなかつた。 輸送因子を明確にするには、２名の患者、すな
わち与えられた抗原に対してDH反応を示すこと
がわかつている供与者と、同一抗原を挑戦させて
もDH反応が起こらない（この抗原に対する細胞
仲介免疫をもたないと考えられる）ことがわかつ
ている受給者を確定する必要がある。供与者の血
液から調製した白血球を破壊し、細胞内容物を透
析する。濃縮した透析物を適当な緩衝液にとり、
受給者の前腕または他の便利な部位に皮下注射す
る。約２日後、受給者の同一部位または他の部位
に、この抗原を皮下注射して挑戦させる。典型的
なDH反応は約１週後に観察される。このように
して輸送された免疫は、受給者に２年間ぐらい保
持されるという。 輸送因子の精製および同定の作業は、それに伴
う構造的ないし化学的基準がないため、また精製
後に認められる現像が最初の透析物により誘導さ
れる現象と質的に異なる場合が多いため、進歩が
妨げられていた。輸送因子の語が精製プレパレー
シヨンについても用いられ、またDH皮膚反応以
外の基準でモニターされて文献中に現れるが、こ
の語が、実際、単一の生化学的実体を指している
のか、あるいは単一の生化学的機能を表す活性に
対して用いらているのかも明瞭ではない。本明細
書においては、輸送因子の語はLawrenceによつ
て単離され、Lawrenceによつて最初に特徴づけ
られた活性すなわち特定の抗原に対する免疫を高
度の感受性をもつ供与者から感受性をもたない受
給者へ輸送する能力をもつ粗白血球溶解物に限定
して用いることにする。 ヒト輸送因子のこれまでの分別化では、各種の
活性物質の存在が明らかにされている。
Vandenbark、A.A.ら〔J.Immunol.118、636
（1977）〕は、白血球抽出液の透析物をSephadex
Ｇ−25（Phar−macia、Inc.、Uppsala、Sweden
の商標名）クロマトグラフイーに付した結果を報
告している。in vivoにおける生物活性は光学密
度254nｍまたは280nｍに示す２個の主ピークに
のみ認められた。１つのピークフラクシヨンは、
抗原反応性供与者からそれまでは非反応性であつ
た受給者に、有意な皮膚試験反応性を輸送すると
報告されている。他方のピークは自発活性（抗原
を加えない場合の皮膚反応）を生じ、また抗原と
組合せると皮膚反応を有意に増大させた。各ピー
クフラクシヨンは等電集束または１％酢酸もしく
は５％メタノールの溶媒系を用いたオクタデシル
シラン樹脂充填カラム上逆相クロマトグラフイー
によつてさらに分別化された。しかしながら、こ
の再分別化後の生物活性試験の結果は報告されて
いない。 Gottlieb、A.A.ら（Transfer Factor：Basic
Properties and Clinical Applications、263頁）
は白血球透析物分画化のモニタリングの手段とし
てフロレスカミンを用いた。フロレスカミン
〔Hoffman−LaRoche、Inc.、Nutley、N.J.、
Bohlen、P.ら：Arch.Biochem、Biophys.155、
213（1973）〕は一級アミノ基を有する物質と反応
し、強い螢光をもつ生成物を与え、これによつて
タンパクおよび他の一級アミノ基をもつ化合物の
高感度定量が可能である。透析された白血球抽出
物質をSephadex Ｇ−10（Pharmacia、Inc.、
Uppsale、Swedenの商標名）カラムで分画化し
たところ、生物活性はフロレスカミン反応性主ピ
ークについて認められた。抗原を加えても加えな
くても、遅延型過敏性反応が認められ、この応答
は抗原存在時の方が幾分大きかつた。 透析された白血球抽出物はGottlieb、A.A.らに
よりさらに分画化され、J.Reticuloendothelial
Soc.21、403（1977）に報告されている。抽出物は
まず、表示された透析分子量それぞれ約12000お
よび3500の透析膜を用いて、分子量分別透析に付
した。後者の膜を通過した、分子量範囲3500未満
の物質をＳ分画、分子量範囲3500〜12000の物質
をＬ分画と名づけた。両分画をSephadex Ｇ−10
上ゲル過に付した。生物活性はこの場合も、フ
ロレスカミン反応性ピーク分画に認められた。し
かしながら、活性は供与者の免疫状態の機能では
ないようであつた。しかも、２種の異なる作用が
認められた。第一の作用は、抗原の添加なく、ま
た供与者および受給者の免疫状態とは無関係な
DH反応の誘導であつた。この種の活性を本明細
書では、のちに定義するようにインデユーサーと
呼ぶ。第二の活性は、供与者が感受性を有するが
それまで暴露されたことのない抗原に対する皮内
反応の増大であつた。この、フロレスカミン反応
性クロマトグラフイー分画に認められた活性は、
受給者がすでに感受性を有する抗原に対するDH
反応を増大するようであつた。いずれの場合も、
供与者の感受性とは無関係のようであつた。Ｓフ
ラクシヨンをさらにヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフイーによつて分画したところ、添加抗原
なしにDH反応を生じる生物活性は、フロレスカ
ミンとの反応で検知される主ポリペプチドフラク
シヨンにはなかつた。 さらにJ.Immunol.124、885（1980）には、
Gottlieb、A.A.らにより、インデユーサー（抗原
を添加しないでDH反応を生じる）およびアンプ
リフアイアー（受給者が感受性を有する抗原の存
在下にDH反応を生じる）を、長い150cm、
Sephadex Ｇ−10カラムで分画化した場合のデー
タが示されている。アンプリフアイアーは主フロ
レスカミン反応性分画に存在したが、インデユサ
ーはこの分画にはなかつた。さらにヒドロキシア
パタイトを用いて分画したが、アンプリフアイア
ーの活性はフロレスカミン反応性ピークに留まつ
た。対照比較試験により、この活性は、同一処置
を施した赤血球溶解にも、また同一精製操作を行
つた食塩水にもないことが確認された。 Gottlieb、A.A.らは、Immune Regulators in
Transfer Factor〔A.Kahn、C.Kirkpatrick、
Hill編、Academic Press、Inc.、New York
（1979）、339頁〕と題する論文中で、データは示
していないが、サプレツサーと呼ばれる別の活性
がオーグメンター活性からヒドロキシアパタイト
クロマトグラフイーによつて分離できたことを示
唆している。オーグメンターはＳ透析分画に発見
され、常に主フロレスカミン反応性分画に存在し
た。このオーグメンターは、以前にBCGに暴露
された無感作患者に全身投与すると有効であると
考えられた。さらに、Ｌ透析分画に認められたサ
プレツサー活性は、ヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフイーにおいて、フロレスカミン反応性物
質の場合より高い塩濃度で溶出すると述べられて
いる。透析白血球抽出物の分画化が試みられた他
の研究としては、Wilson、G.B.ら〔J.Lab.Clin.
Med.93、819（1979）〕のin vitroにおいて白血球
の遊走に影響する４種の活性、すなわち２種の抗
原非依存性活性（抗原なしで応答を生じる）、１
種の抗原依存性特異的インヒビターおよび１種の
抗原依存性エンハンサーについての報告がある。
抗原依存性インヒビターは、適当な供与者特異性
の抗原のみがin vitroの白血球遊走の有意な阻害
を生じたので、輸送因子と共通の性質をもつてい
る。抗原依存性の白血球遊走強化は、抗原特異性
に関する特徴づけがなされていない。しかしなが
ら、上記活性がヒト免疫系のin vivo機能に何ら
かの関係を有するのかどうか、またその治療的有
用性との関連については、全く知られていない。 発明の要約 本発明はヒト免疫系のモジユレーターに関す
る。より詳細には、本発明は（）分子量が3500
より少さく、（）フロレスカミンに本質的に反
応性の物質を実質的に含まず、そして（）ヒト
白血球抽出物の透析物からゲル濾過およびオクタ
デシルシランカラムを用いる逆相高速液体クロマ
トグラフイーで水中のエタノール勾配により溶出
することにより得ることができるヒト免疫系モジ
ユレーターに関し、さらにまた本発明はこのよう
なフロレスカミンに本質的に反応性の物質を実質
的に含まない、ヒト生体の免疫系の直接または間
接応答に影響する性質を有する免疫系モジユレー
ターをヒト白血球抽出物から製造する方法に関
し、この方法は(1)ヒト白血球抽出物を透析分子量
限界約3500の透析膜で透析し、(2)透析物をゲル濾
過して複数個の分画に分画化し、(3)モジユレータ
ー確認分画を選択して集め、(4)集められたモジユ
レーター確認分画を逆相クロマトグラフイーカラ
ムに付し、次いで(5)カラムを水中のエタノール勾
配で溶出することを特徴とする方法である。本明
細書におけるモジユレーターの語は、動物もしく
はヒト生体、その部分またはそれから得られた成
分の、上記生体が以前に暴露されたことがある抗
原に対する応答、すなわち上記動物もしくはヒト
の免疫系機能に特異的に帰することができる応答
に、直接または間接的に作用する物質と定義され
る。したがつて、免疫応答に対する作用を含めた
一般的作用を有する物質は、ここに定義したモジ
ユレーターの語には包含されない。本明細書に述
べるモジユレーターはDH皮膚反応試験において
活性を発現する。したがつて、その主作用は細胞
仲介免疫系に対するものと考えられる。しかしな
がら、ここに述べるモジユレーターは全免疫系に
広範な作用を有し、体液性免疫系にも作用するこ
とがある。本明細書において論じるに際し、輸送
因子、インデユーサー、アンプリフアイアーおよ
びサツプレツサーの語は、それぞれ皮膚反応にお
けるDH応答に関連したそれぞれの活性と定義さ
れる。 輸送因子の語は上述の粗白血球抽出液の抽出物
を示す。輸送因子活性は、与えられた抗原に対し
て感受性を有することがわかつている供与者の白
血球から輸送因子プレパレーシヨンを調製し、同
一抗原に感受性のないことがわかつている受給者
に皮下注射した場合に発現する。受給者にその後
その抗原を挑戦させるとDH応答が観察される。
受給者は、正常時、輸送因子活性を注射しない場
合、応答を生じない。輸送因子は、与えられた抗
原に以前暴露されていない受給者にも作用が認め
られることから、上述のモジユレーターではな
い。しかも、輸送因子の作用は与えられた抗原に
関して特異的であるが、ここに述べるアンプリフ
アイアーおよびサプレツサーは、受給者が以前に
暴露された抗原に非特異的に作用する。 インデユーサーは、抗原の添加なく、供与者お
よび受給者の感受性とは無関係にDH応答を生じ
る活性と定義される。 アンプリフアイアーは、受給者が感受性を有す
る抗原の注射後に、正常より大きな応答の産生を
特徴とする。アンプリフアイアー活性は供与者の
特異的免疫感受性には依存しない。 サプレツサー活性は、受給者が感受性を有する
抗原とサプレツサーを同時に注射した場合、受給
者に正常より小さいDH応答を生じるという結果
によつて観察される。 本発明において、ヒト免疫系のモジユレーター
は白血球抽出液の透析物から単離された。６種の
モジユレーターはアンプリフアイアー活性を有
し、２種はサプレツサー活性を有する。アンプリ
フアイアーは、無感作状態および免疫機能低下状
態の治療に局所的または全身的に用いて有用と考
えられ、一方、サプレツサーは局所的感作亢進状
態たとえばうるしによる障害の治療に有用であ
る。これらのアンプリフアイアーはアンプリフア
イアー１〜６と命名する。サプレツサーはＳ−サ
プレツサーおよびＬ−サプレツサーと命名する。 好ましい態様の詳細な説明 本発明は免疫応答をモジユレートする機能をも
つ物質の発見に基づくものである。現在の技術で
は、ヒト個体が以前に暴露された抗原に対する応
答を増強または抑制するモジユレーターの同定が
可能である。しかしながら、この種の物質によつ
て、各種の修飾された機能が現れる。たとえば、
反応の特続、感受性の閾値、および炎症、リンパ
球増殖もしくは循環抗体産生等の応答の種類であ
る。この種の修飾機能はそれを検知および定量す
るために用いた試験系によつて定義されることは
明らかである。本発明のモジユレーターにはDH
応答のアンプリイフアイアーやサプレツサーが含
まれるばかりでなく、他の適当な試験系で検知、
定量される免疫修飾の他の表現も包含される。 本明細書に述べるモジユレーターは、したがつ
て、免疫系の成分間の細胞間伝達の自然手段を構
成するモジユレーター物質の系の一部でしかな
い。この場合、免疫応答の状態は絶えず当面の抗
原挑戦のレベルおよび活性に応じてモニターさ
れ、修飾される。したがつて、本発明からこの種
のモジユレーター系の存在が明らかである以上、
他のモジユレーターが発見されることもあり得
る。他の精製技術および他の試験操作を用いた今
後の研究が、この種のモジユレーターの同定およ
び精製を導くであろう。しかしながら、本発明は
この種のモジユレーターの存在を明らかにし、各
種の免疫性関連状態の治療に有用な新しい、予期
しない性質を有する数種のモジユレーターの単離
および特徴づけを始めて行うことにより、この種
の発見への道を開くものである。 アンプリフアイアー１は、与えられた抗原に対
する感受性を有する受給者のDH皮膚反応に対し
て促進および増強効果を示す点を特徴とする。抗
原とともに投与されたアンプリフアイアー１によ
つて生じる反応は、皮下注射後約６〜14時間で強
度がピークに達し、以後急速に消退する（一方、
アンプリフアイアー１がない場合には、抗原の注
射後24〜30時間で、正常のDH応答はピークに達
する）。本発明のアンプリフアイアー１は、本発
明の他のモジユレーターから、オクタデシルシラ
ンカラムを用い０〜100％（ｖ／ｖ）エタノール
−水勾配で溶出する逆相クロマトグラフイーによ
り分離できる。アンプリフアイアー１はカラムか
ら、少なくとも水中15％（ｖ／ｖ）エタノールで
溶出され、このアプリフアイアーの大部分は水中
約15％（ｖ／ｖ）から約20％（ｖ／ｖ）エタノー
ル（パーキンエルマー濃度測定装置の読み取り濃
度）中に溶出される。得られた溶出画分の屈折率
測定値1.3324〜1.3326から計算されたエタノール
濃度は０〜0.4％である。アンプリフアイアー１
はフロレスカミンとはほとんど反応せず、フロレ
スカミン反応性の主ピークとは逆相クロマトグラ
フイーで分離される。アンプリフアイアー１は、
表示の分子量透析限界3500の透析膜を通過する。 アンプリフアイアー２も、抗原に対する応答の
促進および増強を生じるが、促進の程度はアンプ
リフアイアー１に対する応答よりもわずかながら
小さい。反応部位はアンプリフアイアー１＋抗原
による場合よりも局限され、かなり長期間（７日
まで）特続する。驚くべきことは、最大増強活性
が適的濃度においてのみ認められ、至適濃度を超
えると増強作用が低下するばかりかDH応答の抑
制を生じる。アンプリフアイアー２はオクタデシ
ルシランから少なくとも45％（ｖ／ｖ）エタノー
ル−水溶液によつて溶出し、このアンプリフアイ
アーの大部分は水中約45％（ｖ／ｖ）〜約53％
（ｖ／ｖ）エタノール（パーキンエルマー濃度測
定装置の読み取り濃度）中に溶出される。得られ
た溶出画分の屈折率測定値1.3428〜1.3440から計
算されたエタノール濃度は36〜40％である。フロ
レスカミンとは反応せず、白血球抽出液の透析物
から単離される他のモジユレーターおよびこの抽
出液におけるフロレスカミン反応性物質の主ピー
クから、逆相クロマドクラフイーによつて分離さ
れる。アンプリフアイアー２の分子量およびサイ
ズは、表示の分子量透析限界約3500の透析膜を通
過する程度である。 アンプリフアイアー３，４および５は、抗原に
対する応答の増強をもたらす。希釈研究によれ
ば、アンプリフアイアー３および５の活性は希釈
によつて増強される。アンプリフアイアー４の活
性も増強されるが、データは幾分あいまいであ
る。アンプリフアイアー３，４および５は、オク
タデシルシランから、それぞれ少なくとも70％
（ｖ／ｖ）、80％（ｖ／ｖ）および89％（ｖ／ｖ）
エタノール−水溶液によつて溶出される。これら
のアンプリフアイアーの大部分は、以下のエタノ
ール−水濃度範囲（パーキンソンエルマー濃度測
定装定装置の読み取り濃度）で溶出される：アン
プリフアイアー３は70％（ｖ／ｖ）〜74％（ｖ／
ｖ）、アンプリフアイアー４は80％（ｖ／ｖ）〜
84％、（ｖ／ｖ）、アンプリフアイアー５は89％
（ｖ／ｖ）〜94％（ｖ／ｖ）。得られた各溶出画分
の屈折率測定値1.3531〜1.3543、1.3567〜1.3580
および1.3592〜1.3596から計算されたエタノール
濃度はそれぞれ、72〜76％、85〜89％および94〜
95％である。これらのアプリフアイアーはいずれ
もフロレスカミンと反応性を示さず、すべてたが
いからまた本明細書に述べた他のモジユレーター
から、逆相クロマトグラフイーによつて分離でき
る。アンプリフアイアー３，４および５は、いず
れも表示透析分子量限界約3500の透析膜を通過す
る。 アンプリフアイアー６はDH反応において抗原
に対し増強応答を生じ、全身作用を有するこも明
らかにされている。アンプリフアイアー１を除く
本明細書記載の増強性モジユレーターの大部分に
共通している点は、最大応答のための至適用量が
ある点で、これは単離されたサンプルを希釈して
いきながら効果を比較することにより確認され
る。アンプリフアイアー６はオクタデシルシラン
から100％（ｖ／ｖ）エタノール（パーキンエル
マー濃度測定装置の読み取り濃度）で溶出され
る。得られた溶出分画の屈折率測定値1.3610〜
1.3620から計算されたエタノール濃度は100％で
ある。このアンプリフアイアーはフロレスカミン
と反応せず、本明細書に記載の他のモジユレータ
ーとは逆相クロマトグラフイーによつて分離でき
る。アンプリフアイアー６の分子量およびサイズ
は、表示透析分子量限界約3500の透析膜を通過す
る程度である。 Ｓサプレツサーは表示透析分子量限界3500の透
析膜を通過した透析物から単離される。Ｓサプレ
ツサーは、逆相クロマトグラフイーにより０〜
100％（ｖ／ｖ）エタノール−水勾配で溶出して
同定可能であり、少なくとも部分的にアンプリフ
アイアー１および２から分離できる。Ｓサプレツ
サーはオクタデシルシランから水中エタノール67
％〜100％（ｖ／ｖ）の範囲で溶出され、96％
（ｖ／ｖ）〜99％（ｖ／ｖ）（パーキンエルマー濃
度測定装置の読み取り濃度）で溶出する分画に明
瞭に存在する。この分画の屈折率測定値1.3602〜
1.3606から計算されたエタノール濃度は97〜99％
である。Ｓサプレツサーは逆相クロマトグラフイ
ーにおける主フロレスカミン反応性ピークとの分
離性から判断して、フロレスカミンと反応して螢
光を生じることはない。DH皮膚反応の抑制は、
Ｓサプレツサーを受給者がDH応答を示す試験抗
原の注射前またはその注射と同時に注射した場合
に発現する。抑制は可逆性で、短時間作用型で、
DHの発現する約72時間遅延させる。アンプリフ
アイアー２をＳサプレツサーと同時に注射すると
抑制は認められない。 Ｌサプレツサーは、表示透析分子量限界12000
の透析膜を通過するが、透析分子量限界限3500の
膜では透析されない白血球抽出分画中に存在す
る。Ｓサプレツサーの活性に似て、Ｌサプレツサ
ー活性は可逆性で、抑制効果は約72時間特続す
る。Ｌサプレツサーはヒドロキシアパタイトクロ
マトグラフイーにより主フロレスカミン反応性ピ
ークから分離されることから判断して、フロレス
カミンと反応しない。 以下の実施例中の操作は、ヒト供与者から得ら
れた材料、およびヒト受給者に対する試験につい
て述べたものである。用いた操作および試薬は、
ヒトの治療用の無菌、非毒性生成物が得られるよ
うに選択した。特定の抗原に対する供与者および
受給者の感受性はあらかじめ試験した。 例 １ 精製操作 Ａ 白血球の調製 白血球は、全血サンプルの分画化または白血
球泳動のいずれかを用い、標準方法で調製し
た。前者の方法では、全血サンプル450mlを
Macrodex（Pharmacia Corporation、
Piscataway、N.J.の商標名、生理食塩水中６
％（ｗ／ｖ）デキストラン70）中1xgで沈降さ
せて分画化し、白血球から赤血球を分離した。
この方法で約１〜２×109の白血球が回収され
た。白血球泳動は大量の細胞を得る場合に好ま
しかつた。Haemonetics（Haemonetics
Corp.、Braintree、Mass.の商標名）30s型細
胞分離機を使用した。この系には、末梢血から
の白血球の回収および沈降による最終白血球プ
レパレーシヨンからの赤血球の除去を効果的に
するため、46.7％クエン酸三ナトリウム
（Haemonetics、Braintree、Mass、）30c.c.およ
び500mlの６％（ｗ／ｖ）Voltex（McGaw
Co.、Irvine、Calif.の商標名）、高分子量デン
プンプレパレーシヨンを下塗りした。いずれの
場合も、37℃で60分間インキユベートしたの
ち、白血球に富んだ血漿が得られた。血漿を
400xgで15分間遠沈後、0.5M食塩水で３回洗浄
して白血球を回収した。洗浄後、白血球ペレツ
トを−20℃で凍結保存した。細胞分離機を６回
作動させて、白血球の平均収量は１×1010個で
あつた。 Ｂ 透析 白血球抽出液は滅菌状態で調製した。白血球
ペレツトを５ｍＭ重炭酸アンモニウム10mlに再
懸濁し、ドライアイス−アセトン浴中で10回凍
結、融解をくり返した。溶解物をまず、透析分
子量限界12000のセルロース透析チユーブ
（Arthur H.Thomas、Inc.、Chicago、Ill.）を
用い、５ｍＭ重炭酸アンモニウムに対して透析
した。緩衝液を３回交換し、透析液を合して凍
結乾燥し、小容量の重炭酸アンモニウムに再溶
解し、透析分子量限界3500のセルロースチユー
ブを用い、５ｍＭ重炭酸アンモニウムに対して
前回と同様に透析した。第２の透析における残
留液を本明細書ではＬ分画、透析液をＳ分画と
呼ぶ。各分画を次の使用まで−20℃で凍結保存
した。 Ｃ ゲル過 Sephadex Ｇ−10（Pharmacia、Inc.、
Uppsala、Swedenの商標名）を５ｍＭ重炭酸
アンモニウム中で一夜膨潤させ、ついでオート
クレーブで処理した。微粉末を除去したのち、
1.5cm×151cmカラムに充填し、５ｍＭ重炭酸ア
ンモニウムで平衡化した。再溶解したＳ分画の
フロレスカミン反応性物質400mg〔Bohlen、P.
ら：Arch.Biochem.Biophys.155、213（1973）
にしたがい、定量基準としてのウシ血清アルブ
ミンに基づき〕をカラムに負荷した。サンプル
は５ｍＭ重炭酸アンモニウムにより、流速13
ml／時で溶出した。１カラム容量（254ml）を
0.8mlのフラクシヨンとして採集した。各フラ
クシヨン100μをとつて、254nｍにおける紫
外線吸収およびフロレスカミンとの反応性を調
べた。結果は第１図に示すとおりである。 主フロレスカミン反応性ピークが得られた。
このパターンは供与者間で変動はなかつた。フ
ロレスカミン反応性との関係でのモジユレータ
ー活性の位置は一連の10倍希釈液にわたつて
DH応答を測定して明らかにした。DH応答の
性質は希釈によつて全く予期せぬ方向に変化し
た。フロレスカミンピークの領域の非希釈サン
プルは、抗原単独に対する対照応答に比べて抗
原に対するDH応答が低下した。10-2および
10-3の希釈で、驚くべきことに、DH応答は対
照に比し増強された。さらに驚くべきことに、
10-5のオーダーに希釈するとDH応答の抑制が
認められた。このような異常な応答性を示す分
画を、本明細書ではモジユレーター確認分画と
呼ぶ。この分画を選びさらに精製した。このよ
うな実験から、問題の活性（モジユレーター確
認分画）は主フロレスカミン反応性ピークとこ
れに先立つ小フロレスカミン反応性ピークを含
む領域に存在することがわかつた。次の精製工
程では、分画１５２〜１７８（第１図に示す）
を集め、凍結乾燥した。この分画の両側にさら
に収集分画を広げれば最終収率が改良される可
能性もある。最適の分画選択はまだ確定してい
ない。 一部の実験では、もつと短い（80cm）
SephadexG−10カラムを用いてゲル過を行
つた。長いカラムの方が分離が改善される点を
除き、結果はほぼ同様であつた。とくに、長い
カラムでは、主フロレスカミン反応性ピークか
ら抗原非依存性のインデユーサーが分離され
た。 ゲル過に代えて、排除分子量限界5000のス
ルホン化ポリスチレンジビニルベゼン
（Shodex Ｓ−802／ｓ、昭和電工製）の１×25
cmカラムを用い、流速0.8ml／分の水で溶出す
る高速ゲル排除クロマトグラフイーにより精製
することも可能であつた。 Ｄ 逆相クロマトグラフイー オクタデシルシランのカラムを用い、０〜
100％（ｖ／ｖ）勾配のエタノール水溶液で溶
出する逆相高圧液体クロマトグラフイーにより
さらに精製を行つた。カラムにサンプル30mg
（フロレスカミン反応性に基づいて）を負荷し、
流速0.5ml／分で溶出し、１ml分画を集めた。
一部のプレパレーシヨンでは、エタノール−水
勾配に続いて、100％エタノールにより同速度
で溶出を行つた。 各フラクシヨンを凍結乾燥し、生理食塩水
0.5mlに再溶解した。各フラクシヨン0.1mlを、
あらかじめ受容者が感受性を示すことを確認し
た抗原とともに皮内注射し、24時間後の皮膚反
応を調べた。結果を第２図に示す。 第２図に示す分離により、抗原ストレプトキ
ナーゼ（SK）に感受性を示さない供与者から
物質を得た。受容者はストレプトキナーゼに感
受性を示すことがわかつていた。受容者が、モ
ジユレーターのない場合に示すSKに対する皮
膚反応を第２図に水平な線として示した。この
線より上にくればアンプリフアイアー活性、こ
れ以下の応答は正常より低く、サプレツサー活
性を示唆する。参考のため、第２図に、フロレ
スカミン反応物質ならびに各種の小分子（セロ
トニン、ヒスタミン、アスコルビン酸、ニコチ
ンアミドおよびリン酸ハイドロコーチゾン）で
血管反応性、炎症誘発性または抗炎症性が知ら
れている物質を含む分画の位置を示す。実線は
各分画の溶出したままの濃度での皮膚反応性を
示している。 各分画の結果を、数種の希釈度で投与した集
合分画（０〜１０，１０〜２０，２０〜３０）
と比較した。希釈度が高いほど、逆に、10〜20
の集合分画では最大のアプリフアイアー活性を
示した。アンプリフアイアー１の最大活性を示
す分画５、ならびに分画１４の希釈効果を、
SKに対して感受性を示す個体で測定した。結
果は、抗原およびモジユレーター注射後７，１
２および24時間の発赤および硬結領域の縦横を
mmで示した。モジユレーターは生理食塩水で希
釈した。このデータは第１表に示す。 アンプリフアイアー１の場合（第２図の分画
５）、試験した全希釈度で強い促進およ増強作
用が認められ、検討した全濃度で試験部位の飽
和を示している。しかしながら、分画１４で
は、10〜1000倍希釈でのみ有意な増強が認めら
れ、したがつて、アンプリフアイアー２活性に
は明瞭な至適濃度が得られた。ある程度の促進
もみられたが、アンプリフアイアー１ほど明瞭
ではなかつた。 第２図の非希釈サンプルについての測定で得
られたアンプリフアイアー活性のこと２ピーク
は、必ずしも、全プレパレーシヨンにおけるア
ンプリフアイアーの真の位置を示すものではな
い。これにはいくつかの理由がある。第一に、
供与者により白血球中のモジユレーター濃度が
異なるたである。白血球中に他の物質があり、
これがプレパレーシヨンに影響する場合もあ
る。試験した受容者側の生物学適な変動もあ
る。最後に、アンプリフアイアー２の場合、濃
度によつて逆の効果を示すことが関係する。と
くに第２図において、分画１２〜１８の領域で
活性が低下したのは、この領域ではアンプリフ
アイアーが上記至適濃度にあつた結果であるこ
とは明瞭である。適当に希釈した場合、アンプ
リフアイアー２の活性ピークは分画１４〜１６
の領域に認められるべきである。この結論を第
２図に点線で示した。これはアンプリフアイア
ー２活性を至適希釈において測定したとしての
推測曲線である。 分画２１〜３０にはＳサプレツサー活性がみ
られた。抗原と同時に注射すると、Ｓサプレツ
サーは注射６または24時間後のDH応答の発現
を効果的に防止した。これに対し、抗原単独を
注射した場合には、24時間後に明瞭なDH応答
が認められ、アンプリフアイアー１または２も
存在するところでは、もつと強い応答さえ認め
られた。結果を第３図に示す。患者の左腕に、
第２図に示し溶出勾配の分画を集め１：10およ
び１：100に希釈したものを、患者の腕に示し
たようにHP−PK−１にはHP−１（分画１〜
１０を合す）、HP−PK−２にはHP−２（分画
１１〜２０を合す）、HP−PK−３にはHP−
３（分画２１〜３０を合す）をPPDと混合して
一連に皮下注射した。PPD単独の対照の注射
は患者の右腕に行つた。HP−１およびHP−
２を注射した部位では、この分画中のアンプリ
フアイアーにより、対照に比べて炎症の増強が
観察された。しかしながら、HP−３処理部位
では、存在するサプレツサーの活性がこの分画
のアンプリフアイアーの活性を上回ると思わ
れ、炎症は低下した。Ｓサプレツサー活性は大
部分の供与者で、逆相クロマドグラフイーのプ
ールした分画２１〜３０にみられた。Ｓサプレ
ツサー活性が単一の分画たとえば第２図の分画
２９に認められる場合もあつた。しかしなが
ら、全プレパレーシヨンで常に単一フラクシヨ
ンにサプレツサー活性がみられるのみでなく、
このような活性の存在は供与者間で差がみられ
た。 逆相クロマトグラフイーにより分離した20か
ら30までの領域の各フラクシヨンについて数種
の希釈を行い測定すると、アンプリフアイアー
３，４および５の存在が確認された。アンプリ
フアイアー３の活性ピークは分画２１および２
２、アンプリフアイアー４の活性は分画２５に
集まり、アンプリフアイアー５の活性は主とし
て分画２７および２８に存在した。Ｓサプレツ
サーは分画２９および３０に認められた。クロ
マトグラフイーの代表的結果を第４図に示す。
第４図では、対照に対するDH応答の変化を
（ａ×ｂ）−（a*×b*）により皮膚反応の程度で
プロツトた。ａおよびｂは分画＋抗原の注射に
よつて生じた発赤部位の直径をたがいに直交す
る軸にそつて測定してmmで表示した値であり、
a*およびb*は抗原単独を注射して生じた対照
部位での相当する直径である。すなわち、この
皮膚反応の程度は抗原単独おび抗原とモジユレ
ーターの混合における病変の面積の差にほぼ相
当する。分画２９および３０にみられた対照レ
ベル０より小さな値はサプレツサー活性を、０
より大きい値はアンプリフアイアー活性を示
す。第２図に示した実験では奇数番号の分画の
み測定していることを考慮すると、第４図のパ
ターンは第２図の場合に類似している。 エタノール−水勾配がエタノール濃度99.9％
に達したのち、100％エタノールにより流速0.5
ml／分で溶出し、１ml分画を集めると、逆相カ
ラムからアンプリフアイアー６が溶出した。こ
の条件ではアンプリフアイアー６は分画３２〜
３４に検出され、見かけの濃度が最大になるの
は分画３３であつた。 アンプリフアイアー６は、受給者が感受性を
示す抗原に対する応答を促進、増大させた。２
×108の白血球から上述の精製法で生成した用
量で、以前に暴露された抗原に対する応答が疾
患により低下した患者のDH応答を改善し、場
合により回復させた。一般的に、アンプリフア
イアー６に対する応答は希釈によつて増大する
が、至的希釈度は各受給者により、また多分抗
原によつても変動した。第４表には２種の希釈
の結果を示す。Ａでは、ストレプトキナーゼ感
受性受給者にストレプトキナーゼ2.5単位と同
時にアンプリフアイアーを投与した。逆相カラ
ムから集めたアンプリフアイアーの分画1.0ml
を凍結乾燥し、生理食塩水0.3mlに再溶解した。
指示した分画0.1mlを指示したように生理食塩
水で希釈し、注射した。Ｂでは、PPD感受性
受給者に標準Aplisol PPD1/10希釈液0.05ml
を、アンプリフアイアーの指示した生理食塩水
希釈液0.1mlまたは対照として生理食品水0.1ml
とともに注射した。 アンプリフアイアー活性をもつ物質は水溶液
からエーテルで抽出できる。抽出可能な活性は
最大効果を得るに希釈を要する。しかしなが
ら、どのアンプリフアイアーがエーテル抽出さ
れるのかは不明である。上述のモジユレーター
の逆相クロマトグラフイーによる分離は本技術
分野で公知の各種逆相カラム材料を用いて実施
できる。溶出状態は変化するが、上記モジユレ
ーターの分離に最適な条件は本技術分野におけ
る通常の知識を有する者には容易に決定できる
ものである。 Ｅ Ｌ透析分画の分画化 Ｌ透析分画はヒドロキシアパタイト上クロマ
トグラフイーによつてさらに分画化できる。粉
末を除去したのち、あらかじめヒドロキシアパ
タイトを５ｍＭ重炭酸アンモニウムで平衡化
し、1.5×20cmカラムに充填した。凍結乾燥し、
0.05M重炭酸アンモニウムに再解したＬ分画を
カラムに適用した。カラムは0.05M〜0.2M重
炭酸アンモニウム勾配（115ml）で、ついで
0.2M〜0.6M重炭酸アンモニウム勾配（65ml）
で溶出した。各１mlの分画を260nｍの吸収お
よびフロレスカミンとの反応性でモニターし
た。ほぼ全勾配にわたり、各フラクシヨンを７
個ずつ合して採取した。合した分画について、
受給者が感受性を示した抗原とともに皮内注射
して生物活性を調べた。結果を第２表に示す。
相対DH応答は、硬結領域の直径を25および43
時間に測定してmmで表し、抗原単独を注射した
場合の対照反応部位と比較して第２表に示し
た。0.1Mと0.15Mの重炭酸アンモニウムの間
に溶出した分画４５０および４５１は、少なく
とも43時間、DH反応を強力に抑制した。72時
間後には４５０および４５１の分画を注射した
部位に10mm×10mmの反応がみられ、この抑制活
性は時間がたつと可逆性をもつことを示してい
る。 例 ２ 特徴および対照実験 Ａ 例1Bで白血球抽出液を製造したと同様にし
て透析赤血球抽出液を製造した。分別透析、
SephadexG−10カラムクロマトグラフイーを
例１に記載したと同様にして実施した。得られ
た分画には、免疫モジユレーター活性は認めら
れなかつた。したがつて、観察された生物活性
は、抽出および精製工程で導入されたものでは
なかつた。さらに、血小板抽出液を同一の精製
工程に付したが、モジユレーター活性はみられ
なかつた。精製アンプリフアイアーの一部は再
クロマトグラフイーに付したが、はじめの精製
時とほぼ同じ挙動を示した。 Ｂ 輸送因子に関する先行技術の記述から、観察
された受給者の感受性増大が、供与差には検地
できなかつた低レベルの感受性の輸送により、
濃縮されて受給者において感受性の増大として
現れたのではないということを、できる限り明
白にすることが重要であつた。この場合に用い
た実験方法は、地域的に局在することが明らか
な抗原または医学的に追跡できる起源の抗原に
ついて試験する方法がある。結核菌の精製タン
パク誘導体、PPDは医学的に追跡可能で、か
つ地域的に局在する。PPDに対する感受性は
BCG（Bacille Calmette−Guerin）でワクチン
化された前歴のある個体に生じ、これは欧州で
は結核に対する免疫を付与するため広範に用い
られている。しかしながら、米国では許可され
たことがない。ヒストプラズミンは地域的に局
在する抗原である。ヒストプラズミンに対する
感受性は米国南部や熱帯地方に多く、ヒストプ
ラズマ症はこの地方の風土病であるが欧州には
ない。 対照実験では、供与者は米国南部生まれで、
ヒストプラズミンには皮膚試験で感受性を示す
が、PPDには反応しない者を選んだ。受給者
はずつと英国に住んでいて、PPDに対する皮
膚試験で感受性を示すか、BCG注射の前歴が
あつた。この実験に用いたアンプリフアイアー
プレパレーシヨンは上述のようにSephadex Ｇ
−10分画工程により精製したが、短い80cmカラ
ムを用いて分離程度の低いものとした。したが
つて、試験物質はアンプリフアイアー１〜６お
よびＳサプレツサーの混合物で、さらにフロレ
スカミン反応性物質も含んでいた。しかしなが
ら、結果はプレパーシヨン中に輸送因子活性が
ないことを証明として重要である。 結果は第３表に示す。２名の受給者それぞ
れ、２種類のフロレスカミン反応性ピーク
（Sephadexカラム３３および３９分画）で試験
した。フロレスカミン反応性に基づき2.4mgの
各フラクシヨンを単独にまたはPPD25単位と
ともに注射した。はじめの注射から14時間後
に、抗原を注射しなかつた部位に、ヒストプラ
ズミン、0.1mlのヒストプラズミン抗原（Park
−Davis Corp.、Detroit、Mich.、生理食塩水
１／１００ｗ／ｖ希釈液として市販）を挑戦させた。
PPDまたはヒストプラズミン単独を注射した
対照部位も適当な時間に準備した。第３表に
は、皮膚反応の強度を、注射部位に囲む硬結領
域の直径（mm）で示す。データは、受給者が、
白血球抽出液分画の注射前、後いずれも、ヒス
トプラズミンと反応する能力をもたなかつたこ
とを示している。アンプリフアイアーの促進お
よび増強の両効果が認められる。一方、ヒスト
プラズミン感受性の輸送はみられない。 Ｃ 本発明のアプリフアイアー活性の重要な点
は、試験したすべてが、促進（アンプリフアイ
アー１）および増大（アンプリフアイアー２）
活性ならびにアンプリフアイアー６を含めて全
身的に有効なことである。さらに、全身的効果
は無感作性患者（疾患で正常な免疫応答が消失
した患者）にも認めることができた。 BCGの既往があり、現在は疾患のためPPD
に非反応性である患者が、上述の例2Bのアン
プリフアイアーを10〜100倍の高用量皮下注射
したところ、PPDに応答を示すようになつた。
抗原に対する応答はアンプリフアイアーの注射
部位に局限されなかつた。 全身的効果はアンプリフアイアー６を用いた一
連の実験で劇的に示された。サルコイドーシスに
４年間罹患し、全抗原に対する応答が著しく弱く
なつていた患者の例を示す。以下に試験を行つ
た。試験第１日に、患者に破傷風トキソイドを、
単独および種々の希釈度でアンプリフアイアー６
とともに投与した。結果は、第５表に示すよう
に、破傷風トキソイド単独では硬結のない弱い発
赤反応を、アンプリフアイアー６とともに投与し
たときはわずかな増大を示した。しかしながら、
どの試験部位にも硬結はなく、患者が適当に応答
していないことを示していた。試験第２日、患者
に逆相クロマトグラフイー分画３３からのアンプ
リフアイアー６を、約２×108の白血球から抽出
された相当量を皮下注射した。試験第８日に、患
者に再度、破傷風トキソイドを、単独にまたは数
種の希釈度のアンプリフアイアー６とともに前回
同様投与した、このときは、アンプリフアイアー
６に明瞭な反応があつて、第５表に示すように硬
結も認められた。この結果は第２日に投与したア
ンプリフアイアー６の全身的効果によつて修飾さ
れ、抗原に対する応答が増大したことを示してい
る。 アンプリフアイアー６の全身的効果は、患者の
末梢血リンパ球のin vitroにおける活性化に対す
る応答の測定によつても明らかである。リンパ球
活性化はよく知られた現象である。正常人の末梢
血リンパ球サンプルを、植物ミトゲンやフイトへ
マグルチニン（PHA）などの公知活性化剤によ
り細胞培養で増殖を誘発する。増殖速度は培地か
ら分裂細胞への3H−チミジン取り込みにつて表
される。試験法はOppenheim、J.J.ら：In Vitro
Methods of Cell Mediated and Tumor
Immunity（Bloom、Davia編）573〜585頁、
Academic Press、New York、N.Y.（1976）に
記載されている。 末梢リンパ球サンプルは上記試験の第２日およ
び第８日に採取し、各種活性化剤に対する応答を
測定した。結果は第６表に示す。第２日にはリン
パ球は正常の応答レベルよりかなり低かつたが、
第８日には３種の活性化剤中の２種に対し、正常
または増大した応答を示した。すなわち、アンプ
リフアイアー６の皮下注射に対する全身的応答を
生じた。 上述の実験で、ブタ草ミトゲンはGibco
Laboratories、Grand Island、N.Y.、PHAおよ
びコンカナバリンＡはDifco Laboratories、
Detroit、Mich.から得た。結果は第６表に、3H−
チミジン取り込みをカウント／分で示した。 例 ３ 各志願者についての実験結果から、非遺伝性の
無感作性または免疫機能低下状態の受給者の免疫
応答を上述のアンプリフアイアーで増大できるこ
とが明らかである。志願者についての一部の実験
結果はSephadex Ｇ−10クロマトグラフイーによ
精製物質で、アンプリフアイアーの混合物と考え
られる物質を用いて行われた。治療方法の好まし
い態様は次のとおりである。 アンプリフアイアー１〜６は逆相クロマトグラ
フイーを用い、例１に記載したように調製、精製
する。活性分画を集め、凍結乾燥し、生理食塩水
または生理的に許容されるビークルに再溶解す
る。有効量、たとえば５×107の白血球から精製
されたアンプリフアイアー１〜６に相当する量を
含む0.1mlを皮下注射する。免疫応答の増大は、
感受性もつことがわかつている抗原に対する患者
の反応性をアンプリフアイアーの投与前後で比べ
てモニターする。アンプリフアイアーは所望の効
果に応じて、単独または配合投与する。アンプリ
フアイアーの投与によつて生じる系の修飾の特続
は患者間で異なり、上述の適当な感受性試験によ
り周期的にモニターしなければならない。所望の
免疫強化を維持するためには、医師の判断によ
り、投与をくり返す。 例 ４ アンプリフアイアーは、単独にまたは配合し
て、弱いワクチンに免疫応答を生じさせるめに使
用できる。多くの病原体、たとえば数種のブドウ
球菌変種やヒストプラズマ症、カンジダ症を生じ
る菌は、一部の患者では強い免疫応答を誘発しな
い。しかも、この種の患者に免疫機能を与える満
足できるワクチンは知られていない。この種の菌
の感染は、とくに、癌化学療法や免疫抑制剤療法
を受けている患者にとつては危険である。弱い抗
原に対する患者の免疫応答を増強することによ
り、上述のアンプリフアイアーの１種または２種
以上の投与は、この種の病原体に対するワクチン
の製造を可能にする。化学療法または移植手術を
受けようとする患者は、治療前に、ヒストプラズ
マ症やカンジダ症に罹患しやすくならないように
ワクチン化することができる。 ワクチンは、公知方法により適当な減毒および
非増殖化する方法で調製した所望の病原体の抗原
を、例１に記載の方法で製造したアンプリフアイ
アー１〜６と合して製造すのが好ましい。ワクチ
ンは常法によつて投与する。 上述のように使用すれば、アンプリフアイアー
１〜６は、医学的予防法の範囲を拡大し、免疫性
抗原の可能性を広げることが期待できる。 例 ５ 重篤なうるしによる皮膚反応または他の接触過
敏性反応はＳサプレツサー処置で予防される。接
触皮膚反応たとえばうるしや他のアレルゲンに対
する反応の主要部分はDH反応であることが知ら
れていて、この種の治療は次のように実施され
る。Ｓサプレツサーは例１に記載したようにして
精製できる。逆相クロマトグラフイーで得られた
活性分画を集め、凍結乾燥し、ついで、コールド
クリーム基剤組成物のような局所投与に適した軟
膏に導入する。反応がたとえば組織または臓器移
植のように全身性の場合は、非経口投与が好まし
い。各供与者によつてサプレツサー活性の収率は
変動するので、適用量は活性単位で表す必要があ
る。１サプレツサー単位はヒトDH反応の硬結の
直径を５mm低下させるのに必要な最小量と定義さ
れる。この定義を用いて、臨床的に必要がつて大
用量を投与する場合には100cm2あたり少なくとも
１単位の割合で用いる。処置は危険がある限り続
け、少なくとも７日に１回の間隔で行うが、臨床
上必要ならびさらに頻回に行うことができる。各
患者の反応は、患者の抗原に対する感受性の程
度、およびサプレツサーに対する反応により変動
する。この種の組成物には、ステロイドまたは他
の抗炎症剤を加えて、治療効果を増強させること
も有利である。 例 ６ 重篤なうるしおよび他の接触皮膚反応は、例１
に記載した方法で製造したＬサプレツサーにより
防止できる。この場合も、皮膚反応のDH成分が
この治療法の有効性を指示する。ヒドロキシアパ
タイトクロマトグラフイーから得られた活性分画
を集め、凍結乾燥し、局所投与に適した軟膏組成
物に導入うする。反応が全身的な場合、たとえば
組織または皮膚移植では、非経口投与が好まし
い。投与量および投与方法は、例３に述べたとほ
ぼ同じである。 ＬサプレツサーとＳサプレツサーは、別個にま
たは単一組成物に混合して適用できる。 毒性 本発明によるヒト免疫系モジユレーターはいず
れも、上記したような人体物質の抽出物であり、
その毒性は検出できない程低く、同抽出物の試験
においても、毒性もしく有害な作用は見い出され
なかつた。 一般的結論 免疫系における上述のモジユレーターは、天然
において免疫の調整を、直接細胞免疫によりおよ
び多分間接的に体液性免疫にも影響して営んでい
る物質と考えられる。この物質は高純度に調製さ
れたので、その性質を特定することができた。そ
の性質は、先行技術に報告されている輸送因子や
その部分分画とは全く異なり、予期せぬ相異も示
した。本発明のアンプリフアイアーおよびサプレ
ツサーは、各種の免疫機能亢進および低下状態を
呈する患者の治療に使用できる。この物質は特異
的な性質を有する者というよりも、正常供与者か
ら単離でき、したがつてプールした原料から大規
模な精製が容易である点でとくに重要である。本
発明のモジユレーターはその生物活性および物理
性状で定義されるものであつて、必ずしも単一化
学物質から構成されるものではない。 本発明を以上、特定の好ましい態様を参照して
説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱す
ることなくさらに改変が可能なことは当然であ
る。本発明は、一般に本発明の原理にしたがいま
た本発明の属する技術範囲内で公知、慣用の実務
による本発明からの変更に基づくすべての改変、
使用または適用を包含する。たとえば、透析およ
び透析膜による透析を本明細書では採用している
が、この語は分子および／または生物活性を、サ
イズおよび／または重量で分離する均等方法を包
含する。すなわち、透析の語は、限外過、超遠
心および電気泳動を包含するものである。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
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