JPH01238541A - 抗血清の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗血清の製造法に関し、さらに詳しくは、がん
組織に注入された特定のフェニルマスタード化合物と特
異的に反応してがん組織を破壊することができる抗血清
の製造法に関する。

〔従来の技術〕

本発明は、癌治療に関する研究の一環としてなされたも
のであり、蛋白親和性があるフェニルマスタード化合物
をハプテンとする高活性抗血清を効率よく製造する方法
に関する。癌に対する特異的な抗体を用いるならば、癌
の治療や診断が可能であるかも知れないと言うアイディ
アは癌の免疫学的な研究を発展させた原動力であり、更
にこの分野の研究によって積み上げられた知識は免疫学
。

生物学、バイオエンジニアリング等の発展に大きな貢献
をもたらしてきた。

今日、実験的動物癌においてはヒト癌とは異なって特異
抗原が存在することが良く証明されており、このため癌
に対する特異抗体を用いて癌を治療しようという動物実
験あるいは臨床試験は、数多く試みられて来ている。し
かし、それらの抗原性はいずれも微弱であるため、癌特
異抗原の決定や精製、更にはその抗原に対する特異抗体
の生産が非常に困難であり、予期した成果が得られてい
ない。過去に行なわれた治療実験を検討してみると、こ
れらの過去の実験に使用された抗体が果たして確実に目
標癌に対する免疫特異性を持っていたか否かについては
多分に疑問が残る。更にまた、もしこれらの使用された
抗体が癌に特異的であったと仮定しても、その抗体が目
標癌と十分な反応を起こし得るだけの強い免疫親和性を
持っていたのであろうかと言う点も疑問となってくる。

これらの抗体側の問題に加えて、目標癌の抗原性が微弱
であると言う事実は、その投与された抗体を引きつける
だけの十分な強さを癌が持っていないと言うことでもあ
り、癌側の問題も加算されることになる。

上記の説明が示すように、癌の抗原性が微弱であると言
う事実は癌の免疫療法を困難なものにする基本的な問題
であり、過去の試みの不成功の原因に大きな部分を占め
ていると考えて間違いないであろう。

事実、最近のモノクローナル抗体を用いた動物実験の結
果では、癌あるいは癌関連抗原に対して確実な特異性を
持つ抗体を用いるならば目標癌の退行を起こし得ること
が証明されている。そしてこれらのモノクローナル抗体
で得られた結果は特異抗体による癌治療の可能性につい
て再認識をもたらしたばかりでなく、更にモノクローナ
ル抗体を用いるならばヒト癌の受動免疫も可能であるか
も知れないという期待をももたらすことになった。

しかしながら、癌特異性モノクローナル抗体を臨床に応
用する場合を想定してみると、新たな問題に遭遇する。

まず第一に、−偉人間の癌に特異抗原が存在するのであ
ろうかという点である。ヒト癌のうちでも、ある種の癌
、例えばメラノーマやウィルス性癌はそれぞれ特異抗原
を持っていることが知られている。しかし、全てのヒト
癌がそれぞれ特異抗原を持っているか否かについては未
だに明らかでない、更に、ある一定の範ちゅうに属する
癌（例えば同一の組織像を示す癌、または同一臓器から
発生した癌）の間に共通な抗原性があるのか否かもまた
不明である。それゆえに、一つのヒト癌を材料として癌
特異的モノクローナル抗体を誘導したとしても、その抗
体が他の患者の癌に対しても免疫特異性を示す可能性は
ほとんど期待し得ないわけである。

この問題を克服するため患者自身の癌（自家癌）を用い
てモノクローナル抗体を誘導するという方法も考えられ
るが、患者自身から得た癌の特異抗原を決定することお
よびその抗原に対するモノクローナル抗体を産生させる
という操作は長期の時間を要する方法であり、加えて個
々の患者の癌に対してそれぞれモノクローナル抗体を産
生ずるという方法は臨床的には極めて実行困難なことが
明らかである。さらに、これに変わる方法として、前も
って各種のヒト癌に対してそれぞれ特異的なモノクロー
ナル抗体を作っておき、これらを混合して用いるという
方法も考え得るかも知れないが、その混合抗体のうちの
いずれかが目標癌の抗原と免疫的に合致するか否かは全
く保証がない。

モノクローナル抗体を用いて癌の治療を行なう場合、も
う一つ問題がある。過去においては、一つの癌組織を構
成する癌細胞は全て均一な性質を持つと考えられていた
が、最近、同一癌組織を構成する癌細胞ですらいくつか
の亜集団から成り立っていることが明らかになってきた
ことである。

し、かも−っの癌組織の中で大勢を支配している亜集団
をなんらかの方法で抑制すると、これまで抑圧されてい
た他の亜゛集団の癌が代わって台頭して来ることも判明
している。このため、理論的には、不完全な治療はその
治療に対して感受性のあるいくつかの亜集団の構成を変
えるだけに終わることになるであろう。そして、このよ
うな経過を通って生存した亜集団はその用いられた療法
に抵抗性を持ち、しかもその癌組織の大勢を占める亜集
団となる。すなわち、モノクローナル抗体の特質である
ところの極めて明確な免疫特性は、逆に目標癌組織内の
一つの亜集団をしか攻撃できないという不利をもたらす
ことになる。もし各種の癌に対する特異モノクローナル
抗体を作り、これらを混合して用いると仮定しても目標
癌の亜集団の構成が明らかでない以上多くは期待し得な
いであろう。

しかも、同−癌組織内の亜集団の構成は変異あるいは宿
主防御反応による選択等によって動的に変化することも
知られており、モノクローナル抗体の特異性の目標をど
こに定めるか、あるいはまた、どのような特異性をもつ
抗体を前もって揃えておけばよいのかを決定することは
極めて困離である。

以上の問題を克服するため、その存在が不確かな癌特異
抗原に代えてハプテンを用い、癌組織に選択的にハプテ
ンを人工的に結合させ、次いでこのハプテンに対する特
異抗血清を投与することにより癌組織を破壊して癌を治
療する方法が試みられている。この試みにおいて、用い
られたハプテンは、ｐ−（ジー（２−クロロエチル）ア
ミノコ−フェニルアラニン（以下、フェニルアラニンマ
スタードという）であり、これに対する特異抗血清は、
フェニルアラニンマスタードと蛋白の結合物を温血動物
に初回免疫し、次いで追加免疫した後、該温血動物の血
液から得られたものであった〔キャンサー０リサーチ（
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）第２６巻１８９３
〜１９０４頁、１９６６年発行、及びキャンサー０リサ
ーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）第３９巻６
〜１６頁、１９７９年発行〕。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記キャンサー・リサーチの二輪文に記載の特異抗血清
の製法では、蛋白に対する抗体が優位に生成したり、抗
体活性が低かったりして、得られる抗血清はフェニルア
ラニンマスタードの抗体が優位に含まれるものでなく、
従って、フェニルアラニンマスタードを用いた上記治療
法には、実用上用いることができないものであった。

本発明は、このような問題点を解決すると共に。

フェニルアラニンマスタードとは異なるが、同様の目的
に使用できる化合物からの新規な抗血清の製造法をも提
供するものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、蛋白で温血動物を免疫した後、一般式（Ｉ） ＣＱ　Ｃ，ＨｚＣＨｚ （ただし、大中、Ｒ１は−ＣＨ＝ＣＨ−又は−ＣＨ，−
ＣＨ（ＮＨ２）−を示し、Ｒ２は水素原子又はアルキル
基を示し、ｎは０，１又は２を示す）で表わされるフェ
ニルマスタード化合物と蛋白との結合物で該温血動物を
少なくとも１回免疫し、この後、該温血動物から血清を
採取することを特徴とする抗血清の製造法に関する。

本発明においては、最初に、蛋白で温血動物を免疫する
。これは、最初から一般式（Ｉ）で表わされるフェニル
マスタード化合物と蛋白との結合物を温血動物に免疫す
ると該フェニルマスタード化合物に対する抗体が優位に
産生されず、蛋白に対する抗体が優位に産生されたり、
抗体活性が低かったりするのに対し、蛋白でいったん免
疫したのちに、上記結合物で免疫すると上記フェニルマ
スタード化合物に対する抗体が優位に産生されるという
本発明者らの知見に基づ、く。

蛋白での免疫において、該蛋白は、温血動物−匹当り、
Ｏ，ＯＯ１〜０．１ｍｇ用いられるのが好ましい。

蛋白は緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、エチレンジアミ
ン四酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等）に分散させて用いら
れ、必要に応じて免疫賦活剤を添加して、静脈注射、腹
腔内注射、皮下注射等により免疫させる。

蛋白としては、ザルコーマ１８０．ルイス肺がん、ウォ
ーカ２５６．゛吉日肉腫等の動物がん、胃がん、肺がん
、皮膚がん等のヒトがん等のがん細胞又はがん組織、牛
、馬等の動物の筋肉、肝、腎。

皮膚等の蛋白、牛、馬、ヒト等からの各種血清蛋白（例
えば、血清アルブミン、血清グロブリン等）。

卵白アルブミン等が用いられる。

上記で用いられる温血動物としては、ラット。

マウス、モルモット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ等が
ある。

次に、フェニルマスタード化合物と蛋白との結合物（以
下、単に「結合物」という）について説明する。

一般式（Ｉ）で表わされるフェニルマスタード化合物と
しては、ｐ−（ジー（２−クロロエチル）アミノ）−Ｌ
−フェニルアラニン（すなわち、フェニルアラニンマス
タード）　、　ｐ　−（シー　（２−クロロエチル）ア
ミノ）−Ｌ−フェニルアラニン−ヘキシルエステル、ｐ
−（ジー（２−クロロエチル）アミノ）−Ｌ−フェニル
アラニン−アミルエステル、ｐ−（ジー（２−クロロエ
チル）アミノ）−Ｌ−フェニルアラニン−エチルエステ
ル、ｐ−（ジー（２−クロロエチル）アミノコ−シンナ
ミックアシッド等がある。一般式（Ｉ）において、Ｒ□
がアルキル基の場合、炭素数１〜８のアルキル基が好ま
しい。

また、結合物の製造に用いられる蛋白としては、前記に
例示したもの、これらを熱変性又はグアニジン変性した
もの等が使用される。熱変性は、緩衝液等の溶媒中で６
０〜９０℃に加熱して行なわれ、グアニジン変性は、蛋
白と適当量のグアニジンを緩衝液等の溶媒中で混合する
ことにより行なうことができる。蛋白としては熱変性物
又はグアニジン変性物を用いるとフェニルマスタード化
合物に対する抗体が産生じやすくなり好ましい。

結合物は、前記フェニルマスタードと蛋白を好ましくは
ｐＨ６，４〜７．２、特に好ましくはｐＨ６，６〜６．
８に調整された等強化緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、
エチレンジアミン四酢酸緩衝液。

ホウ酸緩衝液等）中、好ましくは８０℃以下、特に好ま
しくは１５〜３０℃で混合することにより得ることがで
きる。反応時間は、０．５〜２４時間であれば十分であ
る。フェニルマスタード化合物は蛋白に対して０．７〜
３０重量％使用するのが好ましく、特に約１〜１０重量
％使用するのが好ましい。フェニルマスタード化合物が
少なすぎるとこれに対する抗体の産生量が少なくなり、
多すぎると不要なフェニルマスタードがふえるだけで、
透析等によるこれの除去操作に時間がかかるようになる
。過剰のフェニルマスタードは透析等により除去してお
くのが好ましい。

フェニルマスタード化合物は、溶解性が劣るため、予め
、酸化溶液に溶解して使用するのが好ましく、また、熱
及び酸に対する安定性が劣るため取扱いに際し、温度及
び酸濃度を十分管理する必要がある。上記酸水溶液とし
ては、塩酸、硝酸。

硫酸、リン酸等の酸の０．２　　Ｎ以下、好ましくは０
．０１〜０．２Ｎの酸水溶液が用いられる。Ｗ５解時の
温度は６０〜８０℃が好ましい。温度が高すぎるとフェ
ニルマスタード化合物が分解しやすくなり、またハプテ
ン活性が消失しやすくなり、逆に低すぎると溶解しづら
くなり、溶解しても緩衝液と混ぜると結晶が析出するこ
とがある。酸水溶液１０ｍＱに対してフェニルマスター
ド化合物は１５０〜２５０ｍｇ用いられるのが好ましい
、酸水溶液とフェニルマスタードを混合してからガラス
棒、スパーチル等を用いてフェニルマスタードの結晶を
砕くようにして早急に、好ましくは５分以内、特に好ま
しくは３分以内に溶解させ、この後、直ちに１５〜３０
’Ｃに冷却するのが好ましい。

フェニルマスタード化合物は、このようにして得られる
酸水溶液の形で使用されるのが好ましい。

フェニルマスタードの酸水溶液、蛋白、ｐＨ６，４〜７
．２の緩衝液及び等強化のための生理食塩水が任意の順
序で混合され、結合物が作製される。

結合物は、上記のようにして得られた混合液の形体のま
ま、温血動物の免疫に使用するのが好ましいが、反応液
から分離して使用することができる。この場合、上記緩
衝液は、必ずしも等強化されている必要はない。分離さ
れた結合物は、上記と同様な等強化緩衝液に分散させて
使用される。

結合物は、温血動物に免疫されるが、この免疫は複数回
行なうのが好ましい。免疫は、上記結合物が分散してい
る等強化緩衝液に、必要に応じて免疫賦活剤を添加し、
これを温血動物に静脈注射。

腹腔内注射、皮下注射等により行なうことができる。

結合物による免疫は、蛋白による免疫から５〜１５日後
に行なうのが好ましく、特に７日前後の後に行なうのが
好ましい、また、結合物による免疫を２回以上行なう場
合、その間隔は２〜４週間とするのが好ましい。

蛋白による免疫を皮下注射により行ない、結合物による
免疫を腹腔内注射により行なうのが本発明を効果的に行
なうのに好ましい。

上記の免疫によって動物の血清内に、上記結合物に対す
る抗体だけでなく、同時に前記フェニルマスタード化合
物に対する抗体（抗フェニルマスタード化合物抗体）及
び前記蛋白に対する抗体も産生ずる。

この後、温血動物から血液を採取し、遠心分離等により
上清を採取する方法などの常法によって抗血清を得るこ
とができる。

温血動物からの採血は、結合物による最終の免疫から２
〜４週間後に行なうのが好ましく、結合物による免疫を
連数回行なうときは、最終の免疫から２週間前後が好ま
しい。

なお、蛋白による免疫及び結合物による免疫に際し用い
られる免疫賦活剤としては、フロイントの完全アジュバ
ント、カリミョウバン、アラム等があり、これらは、常
法に従い使用される。これらは高抗体価の血清を得るた
めには使用した方が好ましい。

上記からも明らかなように、上記抗血清中には、前記結
合物に対する抗体及び前記蛋白に対する抗体が含まれる
が、これらはがん治療には不用であるため、また、場合
によっては副作用の原因になることもあるので該血清か
ら除くのが好ましい。

このためには、該血清又はこれを生理食塩水で希釈した
ものに前記結合物及び蛋白を添加し、それぞれの抗体と
結合された後、遠心分離、ろ過等により除くことができ
る。このように、不用な抗体を除く場合、これに必要な
抗原の最少量は、血清の希釈系列を作製し、一定量の抗
原を添加し、抗原−抗体反応物の生成の有無を確認する
方法等の常法によって決定することができる。

このようにして得られた抗血清は、さらに精製して抗フ
ェニルマスタード化合物抗体を分離することができる。

精製方法としては、上記抗血清にエチレンジアミン−酢
酸緩衝液等の緩衝液を添加して沈殿を生じさせ、これを
採取することにより行なうことができ、さらに該沈殿を
クォータライズドアミノエチル（ＱＡＥ）−セファデッ
クス、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロー
ス、ヒドロキシアパタイト、プロティンＡ結合セファロ
ース等のカラム剤を用いたカラムクロマトによってさら
に精製を行なうことができる。ＱＡＥ−セファデックス
を用いる場合、溶離液としてカラムクロマトし、抗フェ
ニルマスタード化合物抗体分画を集め、他の吸着型カラ
ム剤の場合は、例えばＩ・Ｈ８・２のトリス緩衝液を溶
離液として吸着させたのち、ｐＨ２〜３のグリシン−塩
酸緩衝液を溶離液として抗フェニルマスタード化合物抗
体を溶出し、その分画を集める。集められた抗フェニル
マスタード化合物抗体は、この後、凍結乾燥して粉末状
にすることができる。これは、水、生理食塩液、緩衝液
等に溶解して使用に供される。このようにして、抗フェ
ニルマスタード化合物抗体はＩｇＧ抗体である。

本発明により得られる抗血清又はこれの精製物（ＩｇＧ
抗体である抗フェニルマスタード化合物抗体）を用いた
かん治療は、抗フェニルマスタード化合物抗体に対して
抗原となるフェニルマスタード化合物を、温血動物又は
ヒトのがん組織又はその近傍に、注射器等で直接に注入
しておき、この後、上記抗血清又は、これの精製物をが
ん組織又はその近傍に注射器等で直接投与する方法、静
脈注射する方法等によって行なうことができる。

この治療によって、がん組織に注入されたフェニルマス
タード化合物とこれに対する抗体が特異的に反応し、が
ん組織が破壊される。

この場合、フェニルマスタード化合物の注入量は、がん
組織の容積１１当り、０．０１〜１ｍｇであるのが好ま
しく、抗血清又はこれの精製物の注入量は、注入したフ
ェニルマスタード化合物に対応した量であるのが好まし
い。

このようながん治療は、皮膚がん、乳がん、胃がん、肝
臓がん等の固形がんの治療に適している。

本発明は、フェニルマスタード化合物を用いる場合に関
するものであるが、蛋白と結合してハプテン作用を有し
うるナイトジエンマスタード誘導体の全てに応用できる
ものである。

〔作用〕

本発明によって得られる抗血清又はこれの精製物は、予
め、がん組織にフェニルマスタード化合物を注入してお
き、この後、該フェニルマスタード化合物の抗体を含む
抗血清又はこれの精製物を投与することにより、がん組
織又はその近傍で抗原−抗体反応が起こり、補体の関与
のよるアルサス反応によって血管が破壊されると共に、
産生される免疫活性物質の作用によってがん組織が破壊
される。このようにフェニルマスタード化合物を抗原と
することによって、従来問題となっていた患者自身のが
んの特異抗原を決定する必要がないこと、がん細胞の亜
集団を考慮する必要がないこと、流血中のかん抗原の影
響を受けることがないこと等から、がんの種類に関係な
く、がん局所で抗原抗体反応を起こさせ、がんを治療す
ることができる。

〔実施例〕

製造例１ フェニルアラニンマスタード（ＰＡＭ）　水ｍ液の調製 ＰＡＭ水溶液は、以下において、用時に次のようにして
調製された。ガラスの試験管に精製したフェニルアラニ
ンマスタード２００ｍｇを入れ、７５℃に加温した水槽
中に胃き、７５℃に保持した０、１Ｎ　ＨＣｆｌ　　１
０ｍＱ　を加えた。ガラス捧でｐｈＭを素早くすり潰す
ようにして３分以内に溶解した。溶解後直ちに、２５℃
の水槽中に移し、２５℃に予め保持した０、１５Ｍ＋　
ｐＨ８，０（７）ＩＪリン酸緩衝液加えてｐＨ６，６に
調整した。次いで、０．１５Ｍ＋　ｐＨ６，６のリン酸
緩衝液で４０ｍ　Ｑまでメスアップして、ＰＡＭ水溶液
（ＰＡＭの濃度は５　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑ　）をｔＡ製
した。この調製液は直ちに、次のキャリア蛋白との結合
に用いられた。

製造例２ ＰＡＭとウサギ血清ガンマグロブリン（ＲｙＧ）の結合
物の作製ＲγＧの乾燥粉末７５０ｍｇを０．１５Ｍ、ｐ
Ｈ６，６のリン酸緩衝液２１０ｍＱで溶解し、次いで８
０’Ｃ１３０分間煮沸して蛋白を変性した後、再び３７
℃に戻し、これにＰＡＭ水溶液４０ｍ１２をかきまぜな
がら滴下した。この混合液をかきまぜながら、２５℃で
１２時間保持した。続いて、さらに４０　ｒｎ　ｎのＰ
ＡＭ水溶液を滴下して４時間２５℃で保温した。次いで
、このＰＡＭとＲｙＧの結合物を含む溶液を透析膜チュ
ーブ（分画分子量８０００）に入れて、０．ＯＩＭ、ｐ
Ｈ６，６のリン酸緩衝液に対して４℃で一昼夜透祈した
。透析後、透析膜内の液を凍結乾燥して、上記結合物の
粉末１・１２０”ｇを得た・　　、−１；へ実施例Ｉ ＰＡＭとＲｙＧの結合物を用いた抗血清の作製ＲｙＧ０
．１　　ｍｇの１ｍ＋２生理食塩液溶解液１ｍＱのフロ
イントの完全アジュバントをよく混合し、ウサギの両側
後肢及び頚部両側の皮下に１／４ずつ注射した（初回免
疫）。ついで、１週間後に製造例２で得られたＰＡＭと
ＲｙＧの結合物３０　ｒｎ　ｇを生理食塩液２ｍｆｌに
溶解して腹腔内に注射した。その後、更に３週間後に同
じ結合物１５ｍｇを生理食塩液１　ｒｎ　Ｑに溶解して
腹腔内に注射した。１週間後に耳動脈から採血し、遠心
分離で血清を分離し、採取した。得られた血清を５６℃
で３０分間加温して非動化した。

この血清中の抗ＲγＧ抗体を除去するため、予め一部の
血清を取り、その段階希釈液を作って、これとＲｙＧと
の免疫反応により、抗ＲγＧ抗体を完全に吸収するのに
必要なＲｙＧ量を決定した。

この後、上記血清に計算量のＲｙＧを混合して、−晩、
４０℃に保存した。ついで、遠心分離して、その上清を
取り、ダブルゲルデイフユージョン（ｄｏｕｂｌｅ　ｇ
ｅｌｄｉｆｆｕｓｉｕｎ　）法で抗ＲγＧ抗体の有無を
調べた。この結果、沈降線は生成せず、該抗体が完全に
除去されていることがわかった。

このようにして得られた抗ＰＡＭ抗血清の抗体価は、ダ
ブルゲルデイフュージョン法による抗体希釈系列で２５
６倍であった（以下、抗体価は、ダブルゲルデイフュー
ジョン法による抗体希釈系列の希釈倍数で示す）。

なお、上記の方法において、初回免疫を省略したこと以
外は、同様に行なって抗ＰＡＭ抗血清を得た。この抗血
清の抗体価は６４倍であった。

製造例３ ＰｈＭとウォーカ２５６腫よう抽蛋白の結合物の作製 ウィスター系ラットのウォーカ２５６腫ようをリン酸緩
衝液で洗い、赤血球を除き組織を破砕した。これを蒸留
水で洗い、３倍量の蒸留水を加えた後、４０００ｒ、ｐ
、ｍ　、１０分間、４℃で遠心分離した。上清を凍結感
想した。この乾燥粉末８００ｍｇを０．１５Ｍ、ｐＨ６
，６のリン酸緩衝液２１０ｍＱで溶解し、次いで８０’
Ｃ，３０分間煮沸して蛋白を変性した後、再び３７℃に
戻し、これにＰＡＭ水溶液４０ｍ１２をかきまぜながら
滴下した。

この混合液をかきまぜながら、２５℃で１２時間保持し
た。続いて、さらに４０ｍＱのＰＡＭ水溶液を滴下して
４時間２５℃で保温した０次いで、このＰＡＭとウォー
カ２５６腫よう抽出蛋白の結合物を含む溶液を透析膜チ
ューブ（分画分子量８０００）に入れて、０．ＯＩＭ、
ｐＨ６，６（７）＋Ｊン酸緩衝液に対して４℃で一昼夜
透析した。透析後、透析膜内の液を凍結乾燥して、上記
結合物の粉末１０００ｍｇを得た。

実施例２ ＰＡＭとウォーカ２５６腫よう抽出蛋白の結合物を用い
た抗血清の作製 製造例３におけるのと同様にして得たウォーカ２５６Ｉ
ｌｌよう抽出蛋白（熱変性する前のもの）０．１ｍｇ　
の１ｒｎＱ生理食塩液溶解液に１ｍｇのフロイントの完
全アジュバントをよく混合し、ウサギの両側後肢及び頚
部両側の皮下に１／４ずつ注射した（初回免疫）、この
後は、ＰＡＭとＲγＧの結合物の代わりに製造例３で得
られたＰＡＭとウォーカ２５６腫よう抽出蛋白の結合物
を用いたこと以外は実施例１に準じて行ない抗ＰＡＭ抗
血清を得た。これの抗体価は、１２８倍であった。

なお、上記の方法において初回免疫を省略したこと以外
は同様にして得た抗ＰＡＭ抗血清の抗体価は６４倍であ
った。

製造例４ ＰＡＭとメチルコラントレン（ＭＣＩ）ファイプロザル
コーマ抽出蛋白の結合物の作製ウィスター系ラットのＭ
ＣＩファイプロザルコーマをウィスター系ラットのウォ
ーカ２５６腫ように換えて使用したこと以外、製造例３
に準じて、ＰＡＭとＭＣＩファイプロザルコーマ抽出蛋
白の結合物の粉末を９８０ｍｇ得た。

実施例３ ＰＡＭとＭＣＩファイプロザルコーマ抽出蛋白の結合物
を用いた抗血清の作成 製造例４におけるのと同様にして得られたＭＣＩファイ
プロザルコーマ抽呂蛋白（熱変性する前のもの）０．１
ｍｇ　の１ｍ１２生理食塩液溶解液に１ｍＱのフロイン
トの完全アジュバントをよく混合し、ウサギの両側後肢
及び頚部両側の皮下に１７４ずつ注射した（初回免疫）
。この後は、ＰＡＭとＲγＧの結合物の代わりに製造例
４で得られたＰＡＭとＭＣＩファイプロザルコーマ抽出
蛋白の結合物を使用したこと以外は実施例１に準じて行
ない抗ＰＡＭ抗血清を得た。これの抗体価は、１２８倍
であった。

なお、上記の方法において初回免疫を省略したこと以外
は同様にして得た抗ＰＡＭ抗血清の抗体価は３２倍であ
った。

製造例５ ＰＡＭとヒト血清アルブミンの結合物の作製ＲｙＧの代
わりにヒト血清アルブミンを用いてこと以外は製造例２
に準じてＰＡＭとヒト血清アルブミンの結合物の粉末を
１３２０ｍｇ得た。

実施例４ ＰＡＭとヒト血清アルブミンの結合物を用いた抗血清の
作製 ＲｙＧの代わりにヒト血清アルブミンを使用し、ＰＡＭ
とＨｙＧの結合物の代わりにＰＡＭとヒト血ン＾アルブ
ミンの結合物を使用したこと以外は実施例１に準じて抗
ＲＡＭ抗血清を得た。この抗血清の抗体価は２５６倍で
あった。

なお、上記の方法において、初回免疫を省略して得られ
た抗ＲＡＭ抗血清の抗体価は６４倍であった。

実施例５ 抗ＰＡＭ抗血清の精製 実施例１〜４で得られた本発明に係る方法で得られた抗
ＰＡＭ抗血渭をエチレンジアミン−酢酸緩衝液（ｐＨ７
，０、イオン強度０．１）で２倍に希釈し、遠心分離で
沈殿物を除去した。これを、上記緩衝液で平衡化したＱ
ＡＥ−セファデックス（Ａ−５０）でカラムクロマトし
た。

カラムゲルの１／２以内の量の抗血清を１ｍＱ／ｗｉｎ
の速度で溶出し、吸光度２８０ｎｍの吸光度が０．２以
上の液を集めて透析（Ｉ２時間）し、凍結乾燥した。こ
うして得られた蛋白はＩｇＧであった。

製造例６ Ｎ−（３−（ｐ−［ビス（２−クロロエチル）アミノコ
−フェニルアラニンヘキシルエステル（ＰＡＨ）とヒト
血清ガンマグロブリン（Ｈｙ　Ｇ　）の結合物の作製 ＨｙＧの代わりにＨｙＧ及びＰＡＭ水溶液の代わりにＰ
ＡＨ水溶液を用いたこと以外は、製造例２に準じてＰＡ
ＨとＨｙＧの結合物の粉末を製造した。ただし、ＰＡＨ
水溶液は、ＰＡＭの代わりにＰＡＨを用いること以外は
製造例１に準じて用時に製造した。

実施例６ ＰＡＨとＨｙＧの結合物を用いた抗血清の作製ＲγＧの
代わりにＨｙＧ及びＰＡＭとＨｙＧの結合物の代わりに
ＰＡＨとＨｙＧの結合物を用いたこと以外は、実施例１
に準じて抗ＰＡＨ抗血清を得た。この抗血清の抗体価は
２５６倍であった。

なお、この方法において蛋白による初回免疫を省略して
も同様の抗血清を得ることができるが、この抗血清の抗
体価は６４〜１２８倍と劣るものである。

製造例７ Ｎ−（３−（ｐ−（ビス（２−クロロエチル）アミノコ
−フェニルアラニンアミルエステル（ＦＡＡ）とＨｙＧ
の結合物の作製 ＲγＧの代わりにＨｙＧ及びＰＡＭ水溶液の代わりにＦ
ＡＡ水溶液を用いたこと以外は、製造例２に準じてＦＡ
ＡとＨｙＧの結合物の粉末を製造した。ただし、ＦＡＡ
水溶液は、ＰＡＭの代わりにＦＡＡを用いること以外は
製造例１に準じて用時に製造した。

実施例７ ＦＡＡとＨｙＧの結合物を用いた抗血清の作製ＲγＧの
代わりにＨｙＧ及びＰＡＭとＨｙＧの結合物の代わりに
Ｐ、ＡＡとＨｙＧの結合物を用いたこと以外は、実施例
１に準じて抗ＰＡＡ抗血清を得た。この抗血清の抗体価
は２５６倍であった。

なお、この方法において蛋白による初回免疫を省略して
も同様の抗血清を得ることができるが、この抗血清の抗
体価は６４〜１２８倍と劣るものである。

応用例１ （Ｉ）ウォーカ２５６腫ように対する抗ＰＡＭ抗血清に
よる治療 ウォーカ２５６腫ようの細片（約２１ｆｆ１１３）をウ
ィスター系ラット（体重約２５０ｇ）の大腿部筋肉内に
移植した。８日後、群間で腫ようの容積を計り、その大
きさに差のないようにラットを群分した（Ｉ０匹／群）
、これらのラットの腫よう内にＰＡＭ溶液（濃度５　ｍ
　ｇ　／　ｍ　Ｑ　）を腫よう容積１ｄ当たり０．０３
ｍΩを注入した。

その３時間後に尾静脈から実施例２で本発明に係る方法
で得られた抗ＰＡＭ抗血清を体重１ｇ当たり０．００５
ｍＱ　　を注射した。この直後の腫よう容積及び９０日
後の腫よう容積を測定し、容積の減少率をがん消失率と
して求めた。また。

抗血清の注射後９０日経過時の平均生存日数（平均値上
標準偏差、ただし、９０日経過時に存命しているものの
生存日数は９０日とした）を調べた。これらの結果を表
１に示す。

なお、腫ようの容積はノギスで縦、横、厚みを計り、そ
の積で表わした（以下も同様にした）。

（２）上記（Ｉ）項において、抗ＰＡＭ抗血清の代わり
に生理食塩液を用いたこと以外は同様に行なった。この
結果を表１に示す。

（３）上記（Ｉ）項において、ＰＡＭ溶液の代わりに生
理食塩液を用いたこと以外は同様に行なった。

この結果を表１に示す。

表１　抗ＰＡＭ抗血清によるウォーカ２５６腫ようの治
療成績 応用例２ （Ｉ）ＭＣＩファイプロザルコーマに対する抗ＰＡＮ抗
血清による治療 ＭＣＩファイプロザルコーマ細胞Ｉ　Ｘ　１０’個をル
イスラット（体重約２００ｇ）の大腿部筋肉内に移植し
、その７日後に腫よう内にＰＡＭ溶液（濃度５　ｍ　ｇ
　／　ｍ　Ｑ　）を腫よう容積１ｄ当たり０．０３　　
ｍＱを注入した。その３時間後に尾静脈から実施例３で
本発明に係る方法によって得られた抗ＰＡＭ抗血清を体
重１ｇ当たり０．００５　　ｍＱを注射して治療した。

応用例１と同様にして、がん消失率及び平均生存日数を
調べた。これらの結果を表２に示す。

（２）上記（Ｉ）項において、抗ＰＡＭ抗血清の代わり
に生理食塩液を用いたこと以外は同様に行なった。この
結果を表２に示す。

（３）上記（Ｉ）項において、ＰＡＭ溶液の代わりに生
理食塩液を用いたこと以外は同様に行なった。

表２　抗ＰＡＭ抗血清によるＭＣＩファイプロザルコー
マの治療成績 応用例３ （Ｉ）抗ＰＡＭ抗血清０．００５ｍＱの代わりに、実施
例４で得られた抗ＰＡＭ抗血清を実施例５でＷＩ製して
得られた抗ＰＡＭ抗体（ラットの体重１ｇ当り１５０μ
ｇ）の生理食塩液溶液０゜００５ｍＱを用いたこと以外
は応用例２の（Ｉ）に準じて行なった。ただし、がん消
失率及び平均生存日数は抗血清注射後、１５０日経過時
に求めた。結果を表３に示す。

（２）上記（Ｉ）項において、抗ＰＡＭ抗体の生理食塩
液溶液の代わりに生理食塩液を用いたこと以外は同様に
行なった。結果を表３に示す。

（３）上記（Ｉ）項において、ＰＡＭ溶液の代わりに生
理食塩液を用いたこと以外は同様に行なった。

結果を表３に示す。

表３　抗ＰＡＭ抗体によるＭＣＩファイプロザルコーマ
の治療成績 応用例４ （Ｉ）ウォーカ２５６腫ように対する抗ＰＡＨ抗血清に
よる治療 ＰＡＭ水溶液の代わり１こＰＡＨ水溶液及び抗ＰＡＭ抗
血清の代わりに実施例６で得られた抗ＰＡＨ抗血清を用
いたこと以外は応用例１の（Ｉ）に準じて行なった。結
果を表４に示す。

（２）上記（Ｉ）項において、抗ＰＡＨ抗血清の代わり
に生理食塩液を用いたこと以外は同様に行なつた。結果
を表４に示す。

（３）上記（Ｉ）項において、ＰＡＨ水溶液の代わりに
生理食塩液を用いたこと以外は同様に行なった。結果を
表４に示す。

表４　抗ＰＡＨ抗血清によるウォーカ２５６腫ようの治
療成績 〔発明の効果〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、蛋白で温血動物を免疫したのち、一般式（ I ）▲
   数式、化学式、表等があります▼（ I ） （ただし、一般式（ I ）中、Ｒ＿１は−ＣＨ＝ＣＨ−
   又は−ＣＨ＿２−ＣＨ（ＮＨ＿２）−を示し、Ｒ＿２は
   水素原子又はアルキル基を示し、ｎは０、１又は２を示
   す）で表わされるフェニルマスタード化合物と蛋白との
   結合物で該温血動物を少なくとも１回免疫し、この後、
   該温血動物から血清を採取することを特徴とする抗血清
   の製造法。