JPH01242534A - 抗体およびそれを有効成分とする齲蝕予防剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

３、産業上の利用分野 本発明は、Ｕ蝕を誘発する病原菌であるストレプトコッ
カス・ミュータンス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ…ｔ
ａｎｓ　）が産生ずる水不溶性グルカン合成酵素（グル
コシルトランスフェラーゼ、ＧＴＦ−１と略記する）に
対して阻害活性を有する抗体及び該抗体を有効成分とし
て含む門蝕予防剤に関する。 〔従来の技術〕 門蝕の発生において、Ｓ、　ｍｕｔａｎｓの歯面への付
着過程が重要な役割を果たしていることが既に知られて
おり、Ｓ、　ａ＋ｕｔａｎｓの口腔内への定着（歯面へ
の付着）を制御して、門蝕を予防しようとする種々の試
みが成されている。 例えば、Ｓ、　ＩＩｕｔａｎｓに対する免疫活性を有す
る抗体を用いた鶴蝕予防方法が知られており、英国特許
第１５０５５１３号明細書には、Ｓｏｍｕｔａｎｓの菌
体で免疫した牛から得られた母乳をＳ、　ＩＩｕｔａｎ
ｓの口腔内定着の制御に用いる方法が、又特開昭６０−
３８３２７号公報には、Ｓ、　５ｕｔａｎｓの培、養か
ら得た細胞壁等の両分を哺乳動物に免疫することによっ
て得られた抗血清及び／又は乳と、グルコシルトランス
フェラーゼインヒビター、プロテアーゼ及びデキストラ
ナーゼからなる群より選ばれる１種以上のシ不ルギスト
とを組み合わせた醋蝕予防剤が記載されている。 〔発明が解決しようとする課題］ しかしながら、従来のＳ、　ｍｕｔａｎｓに免疫活性を
有する抗体の酷蝕子防効果は必ずしも十分ではなく、又
、従来の抗体は、免疫した哺乳動物の乳やその抗血清か
ら調製されるので、量産性に欠け、生産コストも高いな
どの欠点を有し、実用的ではない場合が多い。 本発明者らは、このような従来技術における問題を解決
すべく種々の検討を行った結果、鶏を用いた抗体の調製
方法に、後述の理化学的特性ををするＳ　、　ｍｕｔａ
ｎｓの水不溶性グルカン合成酵素を抗原として組み合わ
せて用いることによって、Ｓ。 ｍｕｔａｎｓの歯面への付着に対する十分な阻害効果を
有し、上述したような欠点のない抗体を調製し得るとの
新たな知見を得るに到り、本発明を完成した。 特に、鶏を用いた抗体の調製においては、必ずしも免疫
した抗原に特異的に反応する抗体が十分■（７られると
は限らない。例えば、ウィルス抗原を免疫した場合、十
分なる抗体価が得られなかった。 従って、鶏に免疫する際には、抗原を十分に吟味し、抗
体価の高いものが得られるように検討しなければならな
い。 従って、Ｓ、　ｍｕｔａｎｓの産生ずる水不溶性グルカ
ン合成酵素で鶏を免疫して、十分に高い抗体価を有する
抗体が得られるという知見は、本発明者らによって始め
て得られたものである。 本発明の目的は、Ｓ、　ｍｕｔａｎｓに対する免疫活性
を示し、Ｓ、　ｍｕｔａｎｓの歯面への付着に対する十
分な阻害効果を有し、量産性にも優れ、生産コストが低
く、安全性にも優れ、門蝕予防剤の有効成分として有用
な抗体及び該抗体を含む１蝕予防剤を提供することにあ
る。 〔課題を解決するための手段〕 本発明のＳ、　ｍｕＬａｎｓの産生する水不溶性グルカ
ン合成酵素（以後ＧＴＦ−１と略称する）に対する阻害
活性を有する抗体は、下記理化学的特性を有する血清型
がａ、ｄ又はｇであるＳ、　ｍｕｔａｎｓの産生ずるＧ
ＴＦ−１を免疫した鶏が産生ずる卵より調製された免疫
グロブリンとして得ることができる。 ０作用及び基質特異性 スクロースに作用し、水不溶性のグルカンを合成する。 ■分子量　　、 ５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し
た分子量が、１５５に〜１７０にダルトンである。 ■免疫原性 動物において免疫原となり、該酵素にたいする特異抗体
を生成させ得る。 なお、上記５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は以下の操作に従って行なったもの
である。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ操作条件； ５ＤＳ−ＰＡＧＥはレムリー（Ｌａｅｍｍｌ＋）らの方
法により行う。 すなわち、後述の粗精製または精製標品を個々に２％Ｓ
ＤＳ、５％２−メルカプトエタノール及び２０％グリセ
ロールを含む６２．５ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６
，８）中で１００°Ｃ１３分間処理する。 電気泳動は、０．１％のＳＤＳを含む７．５％の分離ゲ
ルと、４％の濃縮ゲル中、室温下、ｌＯ麟＾、２時間の
条件で行う。なお、分子量マーカーとしては、フェリチ
ン（ｆｅｒｒｉ口ｎ、２２０にダルトン）、ホスフォリ
ラーゼｂ　　（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ−１ａｓｅ　ｂ、９
４にダルトン）、牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅｓｅ
ｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　、　６７　ｋダルトン）、カ
タラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ、　６０　ｋダルトン）、
オブアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ　、４３　ｋダル
トン）及び乳酸脱水素酵素（ＩａｃｔａＬｅ　ｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ　。 ３６にダルトン）（いずれもファルマシア社製）を用い
、バンドの検出はクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ
）による染色によって行なうことができる。 本発明の抗体（以後抗ＧＴＦ−Ｉと称する）を得るため
に用いるＧＴＦ−１としては、上記特性を有する酵素で
あればどのようなものでも利用でき、例えば以下のよう
にしてＳｏｍｕｔａｎｓの培養上清から精製して得るこ
とができる。 即ち、血清型がａ、ｄ又はｇ型である Ｓｌｍｕｔａｎｓを適当な培地で培養し、その培養上清
から精製される。 ここで用いるｇ型苗としては、Ｓ、ｍｕｔａｎｓ　６７
１５株、　ＡＴＣＣ２７３５１株等の公知で、容易に入
手可能な閏を用いることができ、例えば、Ｓ、ｍｕｔａ
ｎｓ　６７１５株は大阪大学歯学部から、ＡＴＣＣ２７
３５１株はアメリカンタイプ　カルチャーコレクション
〔＾ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）　）から入手できる。 又、ａ型閉やｄ型苗についても公知の菌株を同様に入手
して用いればよい。 又、培地としては、少なくともグルコースを含む培地が
利用でき、例えば、ＴＴＹ墳地（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ
　、　ＴｒｙｐｔｏｓｅＳＹｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ
の複合培地）　、Ｂ　ＨＩ　　（Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｒ
ｔ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地、ＦＭＣ培地などを用いる
ことが出来る。 又、培養温度は、菌体増殖が得られ、且つＧＴＦ−［の
生産に適した範囲内であれば良いが、良好な菌体増殖と
ＧＴＦ−Ｉの生産という点からは、通常３７°Ｃ程度と
するとよい。 又、培養時間は、培養温度、培地の種類等の培養条件に
よって異なるが、ＧＴＦ−１の最適収７に達する時期を
選択して決定すれば良く、１８〜２４時間程度とすれば
よい。 又、その他の培養条件についても、上記の観点から適宜
選択すれば良い。 次に、菌体からＧＴＦ−１を抽出する。 Ｓ、　ｍｕｔａｎｓのＧＴＦ−１は、Ｆｕｒｕｔａ＋Ｔ
、　　らの方法（Ｆｕｒｕｔａ、Ｔ、＋ｅｔ　ａｌ；　
Ｊ、Ｇｅｎｅｒａｌ旧ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。 、１３１，２８５−２９３（１９８！ｉ）　）　４．：
従い、ＢＨＩ透析培地にＳ、　５ｕｔａｎｓ４植菌し、
成育後遠心分離により菌体を除去し、上清に硫酸アンモ
ニウムを加え５０％硫酸アンモニウム画分の沈澱をｌ１
ｉｓｔｉｄｉｎｅ−１１ｃＩ　に透析しクロマトフオー
カシングカラムクロマトグラフィーを行った後、ヒドロ
キシアパタイトのカラムクロマトグラフィーを行い精製
標品を得ることが出来る。 抗体を得るための抗原として、以上の操、作で得られた
菌体培養上清もしくは硫安１縮標品、クロマトフオーカ
シング後の粗精製標品、もしくは、精製標品としてのＧ
ＴＦ−１等を用いるこ１とができる。 次に、本発明の抗ＧＴＦ−１抗体の調製方法について詳
述する。 本発明の抗ＧＴＦ−１抗体は、上述のＧＴＦ−■で免疫
された鶏の卵から調製することができる。 免疫される鶏としては、特に制限はないが、抗体の量産
性という点からは、白色レグホーン等の卵用種を用いる
と良い。 又、ＧＴＦ−１による免疫方法としては、皮下注射、筋
肉注射、腹腔内投与等による通常の方法や、点鼻１点眼
等の方法によって１．〒うことができる。更に、ＧＴＦ
−１の投与量は、所望の抗体価が得られ、且つ鶏に対し
て悪影響を与えない量を適宜選択すれば良い。 通常、初回免疫から数週間で投与抗原に対して特異的に
反応する抗体が鶏卵（卵黄）中に得られる。　　　　　
′ 尚、必要に応じて例えばＦＣＡ（フロイント完全アジュ
バント）、ＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント）等
のアジュバントをＣ；ＦＴ−１と共に併用しても良い。 免疫から１力月以上経過した鶏から採取した卵から本発
明の抗ＧＴＦ−１抗体を調製することができる。 尚、卵黄中の抗体価は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳ＾）
、ラジオイムノアンセイ等を用いて測定することができ
、免疫後に２週程度の間隔で抗体価を測定することによ
り抗体価の推移を追跡することができる。 後述の実施例においては、ＥＬＩＳＡでの測定により抗
体価の推移を追跡し、抗体価が十分に上昇した段階の卵
を採取して、本発明の抗ＧＴＦ−Ｉ抗体を調製した。 又、通常、約３カ月間にわたって高抗体価を得ることが
できる。 尚、免疫後、抗体価の残少が見られた場合、適当な間隔
で適宜追加免疫することにより抗体価を高くすることが
できる。 本発明の抗ＧＴＦ−Ｔ抗体は、例えば上記のようにして
免疫した鶏の卵黄に含まれる免疫グロブリンを抽出・分
離することによって得ることができる。この抽出・分離
方法としては、例えば、デキストラン硫酸やポリエチレ
ングリコールを用いた沈澱法や、プロパツールやクロロ
ホルムを用いた抽出法等通常用いられている免疫グロブ
リンを抽出・分離できる種々の方法等が利用できる。 以上のようにして得られた本発明の抗ＧＴＦ−

【抗体は
、Ｓ、　ｍｕｔａｎｓの産生ずるＧＴＦ−１に対して特
異的に抗体として反応する。即ち、ＧＴＦ−Ｔに対して
酵素活性の阻害活性を有する。 Ｓ、　ｍｕｔａｎｓの産生するＧＴＦ−１に対して阻害
活性を有する本発明の抗ＧＴＦ−Ｉ抗体は、Ｓ、　ｍｕ
ｔａｎｓの歯面への付着を阻害することによって、Ｓ、
　ｍｕｔａｎｓの口腔内での活動を制御し、鶴蝕を予防
することができる。 以上記載のごとく本発明は、通常の哺乳動物から調製さ
れる製法に比べて、容易に、且つ大量に調製でき、しか
も卵黄から抗体を調製するという簡単な操作により免疫
グロブリンのうちＩｇＧ画分だけを特異的に分離精製す
ることができ、門蝕予防剤の有効成分として有用なる抗
体を提供するものである。 これらの抗体含有画分は、通常のａｉ蝕予防剤に配合し
、本発明に係る關蝕予防剤を調製することができる。 即ち、本発明のＭ蝕子防剤は練り歯磨き・粉歯磨き・液
状歯磨き等の歯磨き頬、マウスウォッシュ、口腔用パス
タ、歯肉７ノサージクリーム、うがい用錠剤、トローチ
、チューインガム、缶飲料等口腔内商材だけではなく、
その目的においては種々の食品にも適用されるものであ
る。 本発明抗体の鶴蝕予防材への配合量は、その投与形態に
応じた投与量に従って適宜選択すれば良く、例えば、１
０３以上の抗体価を有する抗体を０、　ＯＯＯ１〜１０
重量％程度とすることができる。 尚、本発明の献蝕予防剤の他の成分としては、使用目的
、使用形態等に応じた適当な成分が用いられる。例えば
練り歯磨きの場合では、炭酸カルシウム、燐酸水素カル
シウム、ピロリン酸カルシウム、不溶性メタリン酸ソー
ダ、水化アルミナ。 無水ケイ酸等の研磨剤、グリセリン、ソルビット。 プロピレングリコール等の保湿剤、ラウリル硫酸ナトリ
ウム、ラウロイルサルコシンナトリウム。 石鹸末等の発泡剤、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、カラギーナン等のバインダー、さらに適当なる香
料成分、甘味剤、保存剤等の成分を水と混合し、常法に
従って製造する。又、マウスウォッシュ等の口腔洗浄剤
その他においても、製品の性状に応じた成分が適宜配合
される。 尚、本発明においては、歯牙着色除去剤１口臭予防剤、
フッ素等の虫歯予防剤、抗酵素予防剤等の種々の薬効成
分を配合することも可能である。 よって、本発明の献蝕予防剤は、前記免疫卵より調製し
た卵黄抗体を用いることにより、ストレプトコッカス・
ミュータンスによるプラークの形成を効果的に抑制し、
飴蝕の発生を良好に防止する。しかも、前記卵黄抗体は
安全性が高いため、本発明のび蝕子防剤は使用上の安全
性が高いものである。 〔実施例〕 以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。 尚、以下における％表示は、特に、衛定されていない場
合には、重量／容■％を示す。 実施例１ （ａ）抗原の調製 Ｓ　９ｍｕｔａｎｓ　６７１５株（血清型ｇ、大阪大学
歯学部から入手）を１５１のＢＩＴ透析培地で３７°Ｃ
１１８時間培養した。培養液を連続遠心により菌体と培
養上清とに分離した。分離した培養上１ｎに対して５０
％飽和の硫安沈澱処理を行い、得られた沈澱物を遠心分
離法により回収した。次に、この沈澱物をｌ１ｉｓｔｉ
ｄｉｎｅ−ＨＣＩ　緩衝液（ｐＨ６，２）に溶解した溶
液を同緩衝液に対して透析し、更に、該溶液中に生じた
沈澱を遠心分離法により除去した後、その上清液をポリ
バッフｙ　−ＰＢＥ９４　（＋’ｏｌｙｂｕｆｆｅｒＰ
ＢＥ９４　、ファルマシア社製）の２．５Ｘ２５ｃｍＯ
カラムにかけた。 カラムに吸着した両分は、パリハンファ−７４（Ｐｏｌ
ｙｂｕｆｆｅｒ　７４、ファルマシア社製）を用いたｐ
ｌ＋勾配１次いで０．１Ｍ′ａ度のＮａｃｌ？：ｉ７液
によって選択的に溶出させた。 溶出された各両分のＧＴＦ活性を以下に記載した方法で
、又タンパク質含量を２８０ｎｍ紫外吸収法で測定した
ところ、０．１　ＭのＮ　ａ　ｃ　Ｉ　ｍＷの両分中に
顕著なＧＴＦ活性が認められた。 ＧＴＦ活性の測定； 試料１０μｎを、基質としての２０ｍＭ　［１４Ｃ−グ
ルコース］スクロース（〔口（−ｇｌｕｃｏｓｅ　）ｓ
ｕｃｒｏｓｅ）　（０，０５ｃｉ／Ｎｏ１）　　と２０
，１７ＭのデキストランＴＩＯを含む０．２門リン酸緩
衝液（ｐｌ＋　６．０　）の１０μｆと混合し、３７°
Ｃで１時間反応後、反応液全量を濾紙（＋、　ＯＸ　２
．　Ｏｃｍ）にスポットし、これをメタノールで洗浄後
、濾紙上に残ったメタノールに不溶性のグルカン中に取
り込まれた放射能量を測定し、ＧＴＦ活性を算出し、１
分間に１μｍｏｌ　のグルコースをグルカンに転移させ
る活性を１単位（Ｕ）とした。 次に、０．１　ＭのＮａｃ１４度の溶出画分を集め、こ
れに対して、８０％飽和の硫安沈澱処理を行い、沈澱物
を得た。これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｆ＋６゜０）
に溶解し、同溶液に対して透析する。更に、該）合液中
に生した沈澱を遠心分離法により除去して上清液を得た
。この上清液を粗精製標品（免疫抗原）とした。 ２Ｋ　４５品のタンパク質濃度及びタンパク質全１をＣ
ＢＢ−ＩＩ；法（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、Ｍ、Ｍ、、　Ａｎ
ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。 ７２、２４８．　（１９７６）　　〕により測定したと
ころ、タンパク質濃度が０．４ｍｇ／ｍｌ、クンバク質
全星が１３．２涌ｇであった。 更に、該標品を前述の操作条件により５ＤＳ−ｒ’ＡＣ
Ｅにかけ、クマシ・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）で
の染色を行ったところ、１６０にダルトンの位置のバン
ドをメインとする低分子量の数本のバンドが検出された
。 また、上記の５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果から算出された該
標品中のＧＴＦ−１含存率は４，０重量％であった。 これとは別に、下記の要領で活性染色を行なった。即ち
、該標品のトリス塩酸緩衝液中での処理を３７°Ｃ１３
０分で行い、かつ電気泳動を４°Ｃで行う以外は前述と
同様の操作による５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ゲルを
３７°Ｃの１％スクロースと０．０５％のデキストラン
ＴＩＯ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩
衝液（ｐＨ６，０）　　中に１８時間浸漬した０次に、
浸漬処理したゲルをＰ　Ａ　Ｓ　　（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ
　ａｃｉｄ　５ｃｈｉｆｆ）反応により染色したところ
１６０にダルトンの位置にグルカン生成を示す顕著な染
色バンドが検出された。 （ｂ）抗原の鶏への免疫 （ａ）で得たｉ■精製免疫抗原標品１．Ｏｍｊ２（ＣＢ
Ｂ−Ｃ法で測定した場合の０．４ｍｇタンパク質量を含
む）とＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）１．０ｍ
ｊ２を１：ｌ混合してＷ２Ｏ型のエマルジョンとした。 得られたエマルジョンを鶏の胸筋に１．０ｍｌずつ注射
し、初回免疫を行った後、下記の方法に従って、採取し
た卵から得たＷＳＦ（後述）の抗体価を測定し、その推
移を観察した。 次に、第１図に示すように初回免疫後８週後に卵黄中の
抗体価が下がり始めたのを確認して、前回と同様にして
２次免疫を行った。 ２次免疫終了後、約１ケ月経過した後から鶏が産生ずる
卵を集卵した。 （Ｃ）抗体の調装 卵から分離した卵黄１３ｍｌとこれと同■のＰＢＳ（リ
ン酸緩衝液、　ａｌ１７．４　）を混合し、得られた混
合液に更に１昆合液と同量（２６ｍｊ２）のクロロホル
ムを加えて、これをよ＜ＪＡｔ↑した。 撹拌終了後、混合液を室温下で３０分間放置した後、こ
れを３．００　Ｏｒｐｍ　、２０分間の遠心分離にかけ
、最上層の透明画分を回収し、抗体含有画分（Ｈａｔｅ
ｒ　５ｏｌｕｂｌｅ　ＦｒａｃＬｏｎ：Ｗ　Ｓ　Ｆ　）
　　とした。 この両分は、０．７　Ｘ　１０　’の抗体価を有してい
た。 尚、該０．７　Ｘ　１０　’の抗体価を示すＷＳＦ（１
３ｍｌ　；　１３ｍｆの卵黄から調製）のたんばく質含
有濃度をピユーレ、ト法により測定し、該ＷＳＦ中の全
たんばく質量を求めたところ約２６ｍｇという値を得た
（約２．０ｍｇ／ｍｊ２　Ｘ　１３ｍｌ　）。 （ｄ）抗体価の測定方法； 抗体価の測定は、Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａによって行った。 まず、実施例２で得た精製免疫抗原標品を２．５μｇ／
ｍｆｆ１となるように５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（
ｐｌ！９．６）に溶解させて得られた溶液を、９６穴プ
レート〔イムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ　）　２　＋　グイ
ナテンク社！！！］の各ウェルに１００μｌずつ入れ、
４　’Ｃで一晩放置し、咳画分に含まれる精製抗原をプ
レートに吸着させた。 次にプレートをＰＢＳ−Ｔ（０，０５％ツイーン２０含
有ＰＢＳ、ＰＨ７，４）で５回洗浄した。洗浄後、プレ
ートを３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含むＰ　Ｂ　
Ｓ　（ｐＨ７、４）と３７°Ｃで１時間接触させて、ブ
ロッキングを行った後、ＰＢＳ−Ｔでプレートを５回洗
浄した。 ここで、先に得たＷＳＦのＰＢＳ−Ｔによる２段階稀釈
液の１００μＰを各ウェルに加え、３７°Ｃで１時間反
応させた。 反応終了後、プレートをＰｒ３Ｓ−Ｔで５回洗浄し、更
に、プレートに２次抗体としてのベルオキンダーゼ結合
抗ニワトリＩｇＧ抗体（たんばく質ｆｆｉ＋、６７　ｔ
ｔｇ　／ｍｆｆ１）の１００μＮを各ウェルに加え、２
５°Ｃで３０分間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄
した。 次に、プレートの各ウェルに０．２門　リン酸２ナトリ
ウム−０，１Ｍクエン酸緩衝液（ｐｌ＋５．０　）　５
０ｍ２に基質であるＯ−フェニレンジアミン２０ｍｇお
よび過酸化水素１０μｌを溶解した溶液を１００μＰ加
え、２５°Ｃで２０分間反応させた。 反応停止は、３Ｎ硫酸溶液１００μｌ加えることで行っ
た。 反応停止後、各ウェルの吸光度（００４９２）を測定す
ることによって抗体価を測定した。抗体価はエンドポイ
ントタイクー法により求め、吸光度が０．２となる稀釈
倍率とした。 （ｅ）抗体によるＧＴＦ−１の水不溶性グルカン合成阻
害活性の確認 （Ｃ）で得た抗体を用いてＳ、　ｍｕｔａｎｓの産生ず
るＧＴＦ−１の活性阻害実験を行った。 まず、（Ｃ）で得た０、　７　Ｘ　１０　’の抗体価を
有するＷＳＦ及びその８倍稀釈液を試験溶液とした。 これとは別に、免疫をしていない鶏（山）と同様の鶏）
の卵から（Ｃ）と同様にしてＷＳＦを調製し試馬禽ン容
ン夜とした。尚、１亥ＷＳＦがＧＴＦ−Ｉに対して特異
的に反応しないことを確認した。 また、対照としてはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いた。 次に、これらの各試験溶液を１３Ｘ１００薗の試験管に
各２５０μｌ分注した後、更に０．３ｎ＋ＬｌのＧＴＦ
−Ｔ２５０μ２をそれぞれの試験管に加えた。 混合した後、３０分間、３７°Ｃで反応させた。 反応終了後、更に、各試験管に２％のスクロースと４０
μＭのデキストランＴＩＯを含む０．２　Ｍのリン酸緩
衝液を５００７ａｌ加え再び３７１Ｃで１時間反応後、
反応液全量を４＠Ｃに氷冷し、超音波処理を行い、反応
液の濁度（ＯＤｓｓ。）を測定し、水不溶性グルカン合
成活性を算出した。 表１に、ＰＢＳを加えた時のＧＴＦ活性を１００％とし
て各ＷＳＦの効果を示した。 実施例２　　ＧＴＦ−１精製源品の調製実施例１と同様
の条件で、粗精製標品に対応する上清液を得た。その上
清液を１１０１１Ｉ’Ｊン酸緩衝液（ｐｌ＋６．０）で
、平衡化したヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ　Ｇｅｌ　
ＩＩＴＰ　、バイオランド　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製］
のカラム（＋、ＯＸ１３ｃｍ）にかけた。 カラムに吸着した両分は、０．０１〜０．５Ｍｌ７７酸
緩衝液（ｐＨ６、ｏ）の濃度勾配によって選択的に溶出
させた。 各両分の、ＧＴＦ活性及びタンパク質含遣を上述と同様
の方法で測定した結果、０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）による両分中にＧＴＦ活性が認められた。 次に、０．２門　リン酸緩衝液（ｐｌ＋６．０）による
高活性を示す溶出画分を集め、それを１０ｍＦのリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）に対して透析し、精製酵素標品を
得た。 更に、該標品を５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、クマシー・ブ
リリアント・ブルー（ＣＢＢ）での染色を行ったところ
、１６０にダルトンの位置に単一のバンドが検出され、
該精製酵素標品が分子量１６０にダルトンの酵素タンパ
ク質であることがｌｉ１認された。 更に、５０ｍ［＋酵素活性量に相当する量の精製酵素標
品を最終濃度で１％スクロース及び０．１％のアジ化ナ
トリウムを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ρＩ＋　６．
０　）に加え、蒸留水で３ｍｌに容量を調製した後、混
合し、３７゛Ｃ１１８時間酵素反応を行わせた。なお、
酵素反応は、反応溶液を氷冷して４°Ｃにすることによ
り停止させた。 酵紫反応終了後、反応生成物を１６００ｘｇの遠心分離
で処理し、沈澱した水不溶性画分と上清：夜に分けた。 水不溶性画分は、蒸留水で２度洗浄し、３ｍＥの蒸留水
に）懸濁して、水軍ン容性グルカン標品とした。 また、上清液にその２．５倍容量のエタノールを加え、
４°Ｃで１時間放置後、生した沈澱を１６００、ｇの遠
心分離で回収し、それを３　ｍｌの蒸留水に溶解させ、
更に同様の沈澱処理を再度行って回収された沈澱を再び
３ｍｌの蒸留水に溶解し水溶性グルカン標品とした。 更に、これらの標品に含まれるグルカンの量をアンスロ
ン法により定量分析して該精製酵素標品の作用によって
合成されるグルカンの種類を調べたところ、該精製酵素
標品は水不溶性グルカンを合成する作用を有するＧＴＦ
□Ｉであることが明らかとなった。 なお、得られた該精製酵素標品のタンパク質量を上述の
方法で測定したところ、０．４８　ｍｇであっ更に、上
記Ｇ　Ｔ　Ｆ　−（精製免疫抗原標品を抗原として用い
る以外は実施例１と同様にして抗体の調ｇＡを行ったと
ころ、同様にＧＴＦ−１と特異的に反応する抗体が得ら
れた。 更に、得られた抗体のＧＴＦ−３活性阻害効果を同様の
方法で試験した結果、同様に優れた効果が認められた。 次に本発明の’ｇＭ　Ｃ４予防剤の実施例を記載する。 （実施例３）　練り歯磨き ピロリン酸カルシウム　　　　　　　４２％グリセリン
　　　　　　　　　　１５％ソルビット７０％　　　　
　　　　１０％カルボキシメチルセルロース　　　１２
％サッカリンナトリウム　　　　　　０．１％ラウリル
硫酸ナトリウム　　　　　２．０％香　　料　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．　０　　％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　残　　量１００　　％ 以上の成分に実施例１で得た抗体含有画分（ＷＳＦ）０
．５％（抗体価０．７　Ｘ　Ｉ　Ｏ’のもの）を配合す
る。 （実施例４）　マウシュウォンシュ エタノール　　　　　　　　　　　２２゜５％サンカリ
ンナトリウム　　　　　　０．０５％ラウリルジェタノ
ールアミド　　　０．３％香　　料　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　］、　　Ｏ％水　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残　　■
１００　％ 以上の成分に実施例】で得た抗体含有両分（ＷＳ　Ｆ　
）　０．５％（抗体価０．　Ｉ　Ｘ　１０　’のもの）
を配合する。 （発明の効果） 本発明により、Ｓ、　ｍｕｔａｎｓの歯面への付着に対
する十分な阻害効果を有し、量産性にも優れ、生産コス
トが低く、安全性にも優れ、う蝕子防剤の有効成分とし
て有用な抗体及び該抗体を含むう蝕子防剤が提供された
。 特に、本発明のＳ、　ｍｕＬａｎｓに対する免疫活性を
有する抗体は、従来のｌ乳動物を免疫して得る抗体と比
較して以下のような利点を有する。 （１）本発明の抗体は、免疫した鶏の卵生に得られ、採
卵、卯の取り扱いおよび卯からの抗体の取得に特別な、
あるいはア）練した技術を必要としない。 しかも、卵黄には免疫グロブリンのうちＩｇＧクラスし
か移行しないので、ＩｇＧのみを容易に得ることができ
る。 これに対して、免疫したｌ乳動物から採血により抗体を
得る場合には、採血に熟練した技術が必要とされ、しか
も血清から大量のＩｇＧを分離・精製することは非常に
困難である。 （２）本発明の抗体の調製に用いられる鶏は、管理が容
易であり、例えばう、ト等と比較してもその管理費用が
安い。 しかも、ｌ乳動物から８ｔ！続的に多量の血液や乳を得
ることは困難であり、哺乳動物を用いる方法は抗体の量
産には適さないが、鶏は長間間にわたって安定して卵を
生み続けるので、本発明の抗体は■ノＴ可能であり、か
つ生産コストが低い。 （３）免疫したｌ乳動物の血液や乳から調製した抗体の
安定性は必ずしも良好でなく、血清中で、あるいは精製
した状態でも一８０°Ｃ程度の温度条件下での保存が必
要とされる。 本発明の抗体は、良好な安定性を有し、また保存性も良
く、例えば卵の状態で４°Ｃで１〜２箇月間保存できる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１において、免疫した鶏の抗体価のｔ
Ｉｋ移を示すグラフである。 体へ云仁ゲノ・コーポレーノヨン 手続補正書（方式） 昭和６３年７月ｑ口 昭和６３年特許願第７０３３１号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　東京都墨田区墨田五丁目１７番４号〒５３４　
　大阪市部島区友淵町１丁目５番９０号鐘紡株式会社　
特許部 電話（０６）９２１−１２５１ ６、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 明８ｔＨｔ第１頁第１８行に記載の「３．産業上の利用
分野」を別紙の通り補正する。 ８、添付書類の目録 （１）別　紙　　　　　　　　　　　　　１　通販上 別紙 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）■蝕誘発の病原菌としての血清型がａ、ｄ又は、
   ｇであるストレプトコッカス・ミュータンスの産生する
   水不溶性グルカン合成酵素を免疫した鶏が産生する卵よ
   り調製された免疫グロブリンであって、前記酵素に対し
   て阻害活性を有する抗体。
2. （２）■蝕誘発の病原菌としての血清型がａ、ｄ又は、
   ｇであるストレプトコッカス・ミュータンスの産生する
   水不溶性グルカン合成酵素を免疫した鶏が産生する卵よ
   り調製された免疫グロブリンであって、前記酵素に対し
   て阻害活性を有する抗体を有効成分として含む■蝕予防
   剤。