JPH01250067A - ストレプトコッカス・・ミユータンスの検出方法 - Google Patents
ストレプトコッカス・・ミユータンスの検出方法Info
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- JPH01250067A JPH01250067A JP7455888A JP7455888A JPH01250067A JP H01250067 A JPH01250067 A JP H01250067A JP 7455888 A JP7455888 A JP 7455888A JP 7455888 A JP7455888 A JP 7455888A JP H01250067 A JPH01250067 A JP H01250067A
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- Japan
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- antigen
- antibody
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- streptococcus mutans
- latex beads
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、唾液や歯垢などの被検試料中のストレプトコ
ッカス・ミュータンスの存否、多寡を検出する方法に関
する。
ッカス・ミュータンスの存否、多寡を検出する方法に関
する。
〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕従来よ
り、ストレプトコッカス・ミュータンス(S trep
tococcus mutans)はうMJjK性細
菌として注目され、ストレプトコッカス・ミュータンス
がヒト及び動物の実験う蝕の誘発に極めて重要な役割を
果たしていることは広く知られているところである。
り、ストレプトコッカス・ミュータンス(S trep
tococcus mutans)はうMJjK性細
菌として注目され、ストレプトコッカス・ミュータンス
がヒト及び動物の実験う蝕の誘発に極めて重要な役割を
果たしていることは広く知られているところである。
ストレプトコッカス・ミュータンスは、血清学的特異性
に基づいてaからhまでの8つの異なる血清型(ser
otope)に分類されている。このうち、ヒドロ腔内
からはQ* d+ et L gの5型が分離され、特
にC型苗の分離頻度は全分離株の70〜80%にも及ぶ
。また、DNAホモロジーに基づいた分類法によれば、
Q、 el、 f型苗は互に酷似した性状を示す。一方
、d、g型苗は血清学的交叉反応も強く、DNAホモロ
ジーも同一といえる。従って、ヒドロ腔内から分離され
るストレプトコッカス・ミュータンスは、c、e、f型
Wのグループと、dyg型菌型苗ループに分けることが
でき、このため最近ではQ、e、f型苗を狭義のストレ
プトコッカス・ミュータンスといい、dsg型菌型苗ト
レプトコッカス・ソブリヌス(S treptococ
cus 5obrinus)と呼称することも多い(
なお、本発明において、ストレプトコッカス・ミュータ
ンスはかかる狭義の意味ではなく、広義の意味で用いる
)。
に基づいてaからhまでの8つの異なる血清型(ser
otope)に分類されている。このうち、ヒドロ腔内
からはQ* d+ et L gの5型が分離され、特
にC型苗の分離頻度は全分離株の70〜80%にも及ぶ
。また、DNAホモロジーに基づいた分類法によれば、
Q、 el、 f型苗は互に酷似した性状を示す。一方
、d、g型苗は血清学的交叉反応も強く、DNAホモロ
ジーも同一といえる。従って、ヒドロ腔内から分離され
るストレプトコッカス・ミュータンスは、c、e、f型
Wのグループと、dyg型菌型苗ループに分けることが
でき、このため最近ではQ、e、f型苗を狭義のストレ
プトコッカス・ミュータンスといい、dsg型菌型苗ト
レプトコッカス・ソブリヌス(S treptococ
cus 5obrinus)と呼称することも多い(
なお、本発明において、ストレプトコッカス・ミュータ
ンスはかかる狭義の意味ではなく、広義の意味で用いる
)。
このように、ストレプトコッカス・ミュータンスはう蝕
罹患にとって重要な細菌であるが、従来。
罹患にとって重要な細菌であるが、従来。
ストレプトコッカス・ミュータンスを直接の指標として
う蝕の活動度やう蝕罹患の危険度を予知する実用的なう
蝕診断方法は提案されていない。
う蝕の活動度やう蝕罹患の危険度を予知する実用的なう
蝕診断方法は提案されていない。
従来もストレプトコッカス・ミュータンスを直接分離、
固定することは十分可能であるが、しかしこれには特殊
の設備と熟練を必要とし、一般の歯科診療室で実施する
のは困難である。
固定することは十分可能であるが、しかしこれには特殊
の設備と熟練を必要とし、一般の歯科診療室で実施する
のは困難である。
本発明は上記事情に鑑みなされたもので、唾液や歯垢な
どの被検試料(検体)中のストレプトコッカス・ミュー
タンスの存否、多寡を短時間にかつ特異的に検索するこ
とができ、従ってう蝕の活動度、う蝕罹患リスクを簡単
かつ確実に予測することができるストレプトコッカス・
ミュータンスの検出方法を提供することを目的とする。
どの被検試料(検体)中のストレプトコッカス・ミュー
タンスの存否、多寡を短時間にかつ特異的に検索するこ
とができ、従ってう蝕の活動度、う蝕罹患リスクを簡単
かつ確実に予測することができるストレプトコッカス・
ミュータンスの検出方法を提供することを目的とする。
〔課題を解決するための手段及び作用〕本発明者は、上
記目的を達成するため検討を重ねた結果、ストレプトコ
ッカス・ミュータンスの血清学的特異性を利用し、その
特異的な抗原、血清型特異多糖抗原に対するモノクロー
ン抗体やウサギ等の動物のポリクローン抗体を使用し、
これを被検試料と反応させることにより、この被検試料
中に上記抗体に対応するストレプトコッカス・ミュータ
ンスの血清型特異抗原が存在すれば、凝集反応等の抗原
抗体反応が生じ、従ってかかる反応の有無、凝集等の程
度を判定すれば、特殊な測定機器を用いなくてもストレ
プトコッカス・ミュータンスの存否や多寡を容易に検出
することができ、ストレプトコッカス・ミュータンスの
感染の程度を決定し得ることを知見し1本発明をなすに
至ったものである。
記目的を達成するため検討を重ねた結果、ストレプトコ
ッカス・ミュータンスの血清学的特異性を利用し、その
特異的な抗原、血清型特異多糖抗原に対するモノクロー
ン抗体やウサギ等の動物のポリクローン抗体を使用し、
これを被検試料と反応させることにより、この被検試料
中に上記抗体に対応するストレプトコッカス・ミュータ
ンスの血清型特異抗原が存在すれば、凝集反応等の抗原
抗体反応が生じ、従ってかかる反応の有無、凝集等の程
度を判定すれば、特殊な測定機器を用いなくてもストレ
プトコッカス・ミュータンスの存否や多寡を容易に検出
することができ、ストレプトコッカス・ミュータンスの
感染の程度を決定し得ることを知見し1本発明をなすに
至ったものである。
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明のストレプトコッカス・ミュータンスの検出方法
は、ストレプトコッカス・ミュータンスに特異的な抗原
ないしは血清型特異多糖抗原に対するモノクローン抗体
又はこの抗原を哺乳動物や鳥類に免疫することによって
得られるポリクローン抗体を被検試料と反応させて、こ
の被検試料中に上記抗体に対応する抗原が存在するか否
かを抗原抗体反応の有無により判定することを特徴とす
るものである。
は、ストレプトコッカス・ミュータンスに特異的な抗原
ないしは血清型特異多糖抗原に対するモノクローン抗体
又はこの抗原を哺乳動物や鳥類に免疫することによって
得られるポリクローン抗体を被検試料と反応させて、こ
の被検試料中に上記抗体に対応する抗原が存在するか否
かを抗原抗体反応の有無により判定することを特徴とす
るものである。
ここで、ストレプトコッカス・ミュータンスの血清型特
異多糖抗原は、その目的に応じてa型苗からh型苗のう
ち適宜なものが選択使用され、またこの抗原に対するモ
ノクローン抗体やポリクローン抗体は常法に従って得る
ことができ、例えばモノクローン抗体は細胞融合法等を
採用して調製することができる。また、ポリクローン抗
体は、上記抗原を哺乳動物又は鳥類に免疫することによ
って得られるが、この場合哺乳動物としてはウサギ、鳥
類としてはニワトリなどが好適に用いられる。なお1本
発明においては、このように抗原を哺乳動物又は鳥類に
免疫することによって得られる抗体を含む抗血清或いは
乳や卵黄分画物をそのまま使用するようにしてもよく、
またこれから抗体を分離して用いてもよい。この場合、
抗体の分離、精製は常法によって行なうことができる。
異多糖抗原は、その目的に応じてa型苗からh型苗のう
ち適宜なものが選択使用され、またこの抗原に対するモ
ノクローン抗体やポリクローン抗体は常法に従って得る
ことができ、例えばモノクローン抗体は細胞融合法等を
採用して調製することができる。また、ポリクローン抗
体は、上記抗原を哺乳動物又は鳥類に免疫することによ
って得られるが、この場合哺乳動物としてはウサギ、鳥
類としてはニワトリなどが好適に用いられる。なお1本
発明においては、このように抗原を哺乳動物又は鳥類に
免疫することによって得られる抗体を含む抗血清或いは
乳や卵黄分画物をそのまま使用するようにしてもよく、
またこれから抗体を分離して用いてもよい。この場合、
抗体の分離、精製は常法によって行なうことができる。
本発明は上記モノクローン抗体やポリクローン抗体を検
査薬として使用するものであるが、これらのモノクロー
ン抗体やポリクローン抗体は適宜な担体に担持させて用
いることが好ましい。担体は種々選定されるが、ラテッ
クスビーズの使用が好適であり、ラテックスビーズを上
記抗体で感作して用いるのが好ましい。ラテックスビー
ズとしては、ポリスチレンタイプのもの、カルボキシ変
性タイプのもの、極低カルボン酸タイプのものなどがあ
るが、本発明においてはこれらのいずれのものをも使用
することができる。また、ラテックスビーズの粒径は適
宜選択することができるが、0.1〜10oIlxnの
ものを使用することが好ましい。なお、これらのラテッ
クスビーズは市販されており、市販品として例えば日本
合成ゴム社製G2801、VO706,5FL140−
L、米国シグマ社製LB1.LB3、LB5、LB6、
LB8、LBII、LB16、LB30、SD6、5D
26.5D91.CLB4、CLB9などを使用するこ
とができる。
査薬として使用するものであるが、これらのモノクロー
ン抗体やポリクローン抗体は適宜な担体に担持させて用
いることが好ましい。担体は種々選定されるが、ラテッ
クスビーズの使用が好適であり、ラテックスビーズを上
記抗体で感作して用いるのが好ましい。ラテックスビー
ズとしては、ポリスチレンタイプのもの、カルボキシ変
性タイプのもの、極低カルボン酸タイプのものなどがあ
るが、本発明においてはこれらのいずれのものをも使用
することができる。また、ラテックスビーズの粒径は適
宜選択することができるが、0.1〜10oIlxnの
ものを使用することが好ましい。なお、これらのラテッ
クスビーズは市販されており、市販品として例えば日本
合成ゴム社製G2801、VO706,5FL140−
L、米国シグマ社製LB1.LB3、LB5、LB6、
LB8、LBII、LB16、LB30、SD6、5D
26.5D91.CLB4、CLB9などを使用するこ
とができる。
上記抗体でラテックスビーズを感作する方法としては、
物理吸着法や化学結合法が採用し得る。
物理吸着法や化学結合法が採用し得る。
物理吸着法は常法によって行なうことができるが、この
場合ラテックスビーズの感作に用いる抗体は250〜1
000倍程度に希釈したものが好ましく、また抗体の希
釈に用いる希釈液としては、グリシン緩衝生理食塩水、
蒸留水などが好適に用いられる。
場合ラテックスビーズの感作に用いる抗体は250〜1
000倍程度に希釈したものが好ましく、また抗体の希
釈に用いる希釈液としては、グリシン緩衝生理食塩水、
蒸留水などが好適に用いられる。
また、化学結合法も常法に従って行なうことができるが
、感作に使用する抗体は、蒸留水などの希釈液で250
〜1000倍程度に希釈したものが好ましい。
、感作に使用する抗体は、蒸留水などの希釈液で250
〜1000倍程度に希釈したものが好ましい。
本発明は、上記抗体、特に上記抗体で感作したラテック
スビーズを検査薬として唾液、歯垢等の被検試料と反応
させるもので、これにより被検試料中に上記抗体に対応
する血清型のストレプトコッカス・ミュータンスが存在
すれば、凝集等を生じるので、その抗原抗体反応の有無
、凝集等の程度を判定することにより、被検試料中に検
出しようとする血清型のストレプトコッカス・ミュータ
ンスが存在しているか否か、或いはどの程度存在してい
るかを判断することができるものである。
スビーズを検査薬として唾液、歯垢等の被検試料と反応
させるもので、これにより被検試料中に上記抗体に対応
する血清型のストレプトコッカス・ミュータンスが存在
すれば、凝集等を生じるので、その抗原抗体反応の有無
、凝集等の程度を判定することにより、被検試料中に検
出しようとする血清型のストレプトコッカス・ミュータ
ンスが存在しているか否か、或いはどの程度存在してい
るかを判断することができるものである。
ここで、被検試料中のストレプトコッカス・ミュータン
スを検出してヒトのう蝕の活動度やう蝕罹患の危険性を
一般的に診断する場合は、抗体としてO+ dy er
fs g型苗を抗原とすることにより得られたもの、
特にC型苗とg型苗とを抗原とすることにより得られた
ものを使用するのが好ましい。またこの場合、C型苗を
由来とする抗体とg型苗を由来とする抗体とを適宜割合
、望ましくは前者と後者とを重量比で1:100〜10
0 :1の割合で混合した検査薬を使用することが好ま
しく、更に、被検試料はそのまま又は凍結乾燥したもの
(ストレプトコッカス・ミュータンスの生菌又は凍結乾
燥菌)を使用することが好ましく、これにより被検試料
中にCy dp eo ft g型苗のいずれかが存在
すれば、これを検知することができる。なお、被検試料
は必要に応じて蒸留水やリン酸緩衝生理食塩水などで適
宜希釈することができる。
スを検出してヒトのう蝕の活動度やう蝕罹患の危険性を
一般的に診断する場合は、抗体としてO+ dy er
fs g型苗を抗原とすることにより得られたもの、
特にC型苗とg型苗とを抗原とすることにより得られた
ものを使用するのが好ましい。またこの場合、C型苗を
由来とする抗体とg型苗を由来とする抗体とを適宜割合
、望ましくは前者と後者とを重量比で1:100〜10
0 :1の割合で混合した検査薬を使用することが好ま
しく、更に、被検試料はそのまま又は凍結乾燥したもの
(ストレプトコッカス・ミュータンスの生菌又は凍結乾
燥菌)を使用することが好ましく、これにより被検試料
中にCy dp eo ft g型苗のいずれかが存在
すれば、これを検知することができる。なお、被検試料
は必要に応じて蒸留水やリン酸緩衝生理食塩水などで適
宜希釈することができる。
また、被検試料中のストレプトコッカス・ミュータンス
の血清型をも明確に検出する必要がある場合は、上記被
検試料を熱水抽出処理したり酸抽出処理し、被検試料中
のストレプトコッカス・ミュータンスを熱水抽出物(ラ
ンツーランダール抗原)或いは酸抽出物(亜硝酸抽出抗
原等)として用いるようにすることが好ましく、これに
より、上に述べたように血清型をより特異的に検出する
ことができる上、その血清型のストレプトコッカス・ミ
ュータンス存在量が少ない場合でも感度よく検出するこ
とができる。なお、熱水抽出や酸抽出は常法に従って行
なうことができる。
の血清型をも明確に検出する必要がある場合は、上記被
検試料を熱水抽出処理したり酸抽出処理し、被検試料中
のストレプトコッカス・ミュータンスを熱水抽出物(ラ
ンツーランダール抗原)或いは酸抽出物(亜硝酸抽出抗
原等)として用いるようにすることが好ましく、これに
より、上に述べたように血清型をより特異的に検出する
ことができる上、その血清型のストレプトコッカス・ミ
ュータンス存在量が少ない場合でも感度よく検出するこ
とができる。なお、熱水抽出や酸抽出は常法に従って行
なうことができる。
被検試料中にストレプトコッカス・ミュータンスが存在
しているか否かの確認は、上述したように抗原抗体反応
の有無によって検知することができ、かかる抗原抗体反
応の有無は従来知られている適宜な検知手段によること
ができるが、−殻内には凝集反応の有無、凝集の程度を
判断することによって行なうことができる。この場合、
ヒトのう蝕の罹患危険性を予知するためには、ストレプ
トコッカス・ミュータンス数カ104CF U / m
’1以上、より望ましくは103CFU/mQの被検試
料と抗体が明確な凝集反応を生じるように検査薬の調製
や被検試料の前処理を行なうことが好ましい。
しているか否かの確認は、上述したように抗原抗体反応
の有無によって検知することができ、かかる抗原抗体反
応の有無は従来知られている適宜な検知手段によること
ができるが、−殻内には凝集反応の有無、凝集の程度を
判断することによって行なうことができる。この場合、
ヒトのう蝕の罹患危険性を予知するためには、ストレプ
トコッカス・ミュータンス数カ104CF U / m
’1以上、より望ましくは103CFU/mQの被検試
料と抗体が明確な凝集反応を生じるように検査薬の調製
や被検試料の前処理を行なうことが好ましい。
本発明によれば、唾液や歯垢などの被検試料中のストレ
プトコッカス・ミュータンスの存否、多寡を簡単かつ短
時間で確実に検出でき、従ってこれからう蝕の活動度、
う蝕罹患の危険性を容易に予知することができる。
プトコッカス・ミュータンスの存否、多寡を簡単かつ短
時間で確実に検出でき、従ってこれからう蝕の活動度、
う蝕罹患の危険性を容易に予知することができる。
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
〔実施例1〕
下記方法により免疫グロブリン、感作ラテツクスビーズ
、抗原(被検試料)を調製した。
、抗原(被検試料)を調製した。
グロブリンの1JL
ストレプトコッカス・ミュータンス(以下、S。
mutansと記述する)10449株(血清型C)の
凍結乾燥菌体を1■/威の割合で生理食塩水に懸濁浮遊
させたものをウサギに静脈注射して免疫した。
凍結乾燥菌体を1■/威の割合で生理食塩水に懸濁浮遊
させたものをウサギに静脈注射して免疫した。
その後、常法により採血し、血清を分離した。
得られた抗S 、 mutans血清型−9−血清を5
0%飽和硫酸アンモニウムで塩析した後、原血清量の1
/3量になるように生理食塩水に溶解させ、生理食塩水
に対し透析し、ウサギ抗S、mutans c型免疫グ
ロブリン(以下、単に抗C型抗体と記述する)を調製し
た。
0%飽和硫酸アンモニウムで塩析した後、原血清量の1
/3量になるように生理食塩水に溶解させ、生理食塩水
に対し透析し、ウサギ抗S、mutans c型免疫グ
ロブリン(以下、単に抗C型抗体と記述する)を調製し
た。
また、同様の免疫操作をS 、 mutans6715
株(血清型g)について行ない、ウサギ抗S 、 mu
tansg型免疫グロブリン(抗g型抗体)を調製した
。
株(血清型g)について行ない、ウサギ抗S 、 mu
tansg型免疫グロブリン(抗g型抗体)を調製した
。
夢、ラテックスビーズの準−鼠
下記A−Dのラテックスビーズをグリシン緩衝生理食塩
水中に0.5%濃度となるように懸濁させ、その1容量
部に上記免疫グロブリンのグリシン緩衝生理食塩水希釈
溶液1容量部を混合し、37℃で90分間攪拌反応させ
た。反応終了後、25℃において3700rpmで10
分間遠心して得沈渣を0.1%のウシ血清アルブミン(
Difco社H)を含んだリン酸緩衝生理食塩水2容量
部で洗浄反応することにより、非特異反応を防止するた
めにラテックスビーズの未吸着部位を被覆した。次いで
上記と同様に遠心して得たラテックスビーズをウシ血清
アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、0
.5%の割合でウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理
食塩水に浮遊させたものを感作ラテツクスビーズとした
。
水中に0.5%濃度となるように懸濁させ、その1容量
部に上記免疫グロブリンのグリシン緩衝生理食塩水希釈
溶液1容量部を混合し、37℃で90分間攪拌反応させ
た。反応終了後、25℃において3700rpmで10
分間遠心して得沈渣を0.1%のウシ血清アルブミン(
Difco社H)を含んだリン酸緩衝生理食塩水2容量
部で洗浄反応することにより、非特異反応を防止するた
めにラテックスビーズの未吸着部位を被覆した。次いで
上記と同様に遠心して得たラテックスビーズをウシ血清
アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、0
.5%の割合でウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理
食塩水に浮遊させたものを感作ラテツクスビーズとした
。
A:ポリスチレンタイプラテックスビーズ(日本合成ゴ
ム社製G2801.粒径0,876−)B:カルボキシ
変性タイプラテックスビーズ(同社製vo 706) C:極低カルボン酸タイプラテックスビーズ(同社製5
FL140L−3,粒径約1−)D:極低カルボン酸タ
イプラテックスビーズ(同社製S F L 140 L
−6、粒径約1 pxn 、ラテックスビーズCより
わずかに表面荷電量が小さいもの) (被 f の調 1、ランツーランダール(Rantz −Randal
l)抗原S 、mutans E 49 (血清型a)
、 S、mutans FA−1(血清型b)、S、m
utans 10449(血清型cLS 、mutan
s B 13 (血清型d )、 S 、mutans
MT 703R(血清型e)、 S、mutans
OMZ 175 (血清型f ) 、 S、mutan
s 6715(血清型g)及びS。
ム社製G2801.粒径0,876−)B:カルボキシ
変性タイプラテックスビーズ(同社製vo 706) C:極低カルボン酸タイプラテックスビーズ(同社製5
FL140L−3,粒径約1−)D:極低カルボン酸タ
イプラテックスビーズ(同社製S F L 140 L
−6、粒径約1 pxn 、ラテックスビーズCより
わずかに表面荷電量が小さいもの) (被 f の調 1、ランツーランダール(Rantz −Randal
l)抗原S 、mutans E 49 (血清型a)
、 S、mutans FA−1(血清型b)、S、m
utans 10449(血清型cLS 、mutan
s B 13 (血清型d )、 S 、mutans
MT 703R(血清型e)、 S、mutans
OMZ 175 (血清型f ) 、 S、mutan
s 6715(血清型g)及びS。
mutans M Fe28 (血清型h)の各凍結乾
燥菌体20mgをそれぞれ生理食塩水1dに懸濁し、1
21℃で20分間加熱した後、遠心して得た上清をラン
ツーランダール抗原(以下、RR抗原と記述する)とし
て用いた。
燥菌体20mgをそれぞれ生理食塩水1dに懸濁し、1
21℃で20分間加熱した後、遠心して得た上清をラン
ツーランダール抗原(以下、RR抗原と記述する)とし
て用いた。
2、全菌体浮遊抗原
上記各S 、mutansの凍結乾燥菌体10111g
を生理食塩水1dに懸濁したものを全菌体浮遊抗原とし
て用いた。
を生理食塩水1dに懸濁したものを全菌体浮遊抗原とし
て用いた。
3、生菌浮遊抗原
S 、mutans 10449 (血清型C)及びS
、mutans6715(血清型g)をIQのプレイ
ン・ハート・イフユージョンブロス(brain he
art 1nfusion broth。
、mutans6715(血清型g)をIQのプレイ
ン・ハート・イフユージョンブロス(brain he
art 1nfusion broth。
D 1fco社製)を用いて37℃で18時間培養した
後、遠心によって集菌し、生理食塩水で2回洗浄し、生
理食塩水で550nmの濁度(○D5.。=1.0)と
なるように希釈した。これを所定倍段階に希釈したもの
を生菌浮遊抗原として用いた。
後、遠心によって集菌し、生理食塩水で2回洗浄し、生
理食塩水で550nmの濁度(○D5.。=1.0)と
なるように希釈した。これを所定倍段階に希釈したもの
を生菌浮遊抗原として用いた。
なお、生菌浮遊抗原は、ミティス・サリバリウス寒天平
板に播種して生菌数を算出すると共に。
板に播種して生菌数を算出すると共に。
連結乾燥後の重量を求め、生菌数と凍結乾燥菌体重量と
の関係を求めた。
の関係を求めた。
4、凍結乾燥菌体及び生菌体の亜硝酸抽出抗原4規定亜
硝酸ナトリウム50−と氷酢酸50鴻とを混和した後、
上記S 、mutansの凍結乾燥菌体及び生菌体の浮
遊抗原100/jJ2を加え、室温において5分間抽出
した。反応後、4規定NaOH200tJAを加えてp
Hを6.5〜7.0に中和調整し、これを亜硝酸抽出抗
原として用いた。
硝酸ナトリウム50−と氷酢酸50鴻とを混和した後、
上記S 、mutansの凍結乾燥菌体及び生菌体の浮
遊抗原100/jJ2を加え、室温において5分間抽出
した。反応後、4規定NaOH200tJAを加えてp
Hを6.5〜7.0に中和調整し、これを亜硝酸抽出抗
原として用いた。
次に、上記感作ラテツクスビーズ(検査薬)を用い、下
記方法によって上記抗原液(被検試料)と反応させ、凝
集の程度を調べることにより、S 、o+utansと
の反応性を評価し、上記検査薬の有効性を調べた。
記方法によって上記抗原液(被検試料)と反応させ、凝
集の程度を調べることにより、S 、o+utansと
の反応性を評価し、上記検査薬の有効性を調べた。
3作ラテックスビーズ凝集試験
感作ラテツクスビーズ懸濁液30IAと抗原液3−とを
スライドガラス上で混和した後、約2分30秒間隔で1
0秒間攪拌し、反応を開始してから5,10.15及び
20分後の凝集の程度を下記基準に従って5段階に評価
した。
スライドガラス上で混和した後、約2分30秒間隔で1
0秒間攪拌し、反応を開始してから5,10.15及び
20分後の凝集の程度を下記基準に従って5段階に評価
した。
凝集の判定基準
−;凝集を認めない
± ;辺縁部にわずかに小さな凝集を認める+ ;
全体にわたり小さな凝集を認める++;大きな凝集が出
現し、白濁が減少する+++;凝集のみとなり、白濁が
消失する試m閣 1、免疫グロブリン濃度の影響 免疫グロブリンを125,250,500゜1000.
2000.4000及び8000倍にグリシン緩衝生理
食塩水を用いて希釈し、上記のようにしてラテックスビ
ーズAの感作を行ない。
全体にわたり小さな凝集を認める++;大きな凝集が出
現し、白濁が減少する+++;凝集のみとなり、白濁が
消失する試m閣 1、免疫グロブリン濃度の影響 免疫グロブリンを125,250,500゜1000.
2000.4000及び8000倍にグリシン緩衝生理
食塩水を用いて希釈し、上記のようにしてラテックスビ
ーズAの感作を行ない。
感作ラテツクスビーズを得た。
次に、抗C型抗体感作ラテックスビーズAに対してはC
型苗のRR抗原の原液、抗g型抗体感作ラテックスビー
ズAに対してはg型苗のRR抗原の27倍希釈したもの
を用いて感作ラテツクスビーズ凝集試験を行なった。
型苗のRR抗原の原液、抗g型抗体感作ラテックスビー
ズAに対してはg型苗のRR抗原の27倍希釈したもの
を用いて感作ラテツクスビーズ凝集試験を行なった。
結果を第1,2表に示す。
第1,2表の結果から、抗C型抗体及び抗g型抗体感作
ラテックスビーズのいずれも500倍に希釈した免疫グ
ロブリンにより感作されたときに対応抗原によって誘発
される凝集反応の感度が最も高いことが認められた。
ラテックスビーズのいずれも500倍に希釈した免疫グ
ロブリンにより感作されたときに対応抗原によって誘発
される凝集反応の感度が最も高いことが認められた。
第 1 表 抗C型抗体感作うテックスビーズ第 2
表 抗g型抗体感作ラテックスビーズ2、ラテックスビ
ーズの相違による影響500倍に希釈された免疫グロブ
リンを用いてラテックスビーズA−Dをそれぞれ感作し
、これら感作ラテツクスビーズをRR抗原の段階希釈液
と反応させた。
表 抗g型抗体感作ラテックスビーズ2、ラテックスビ
ーズの相違による影響500倍に希釈された免疫グロブ
リンを用いてラテックスビーズA−Dをそれぞれ感作し
、これら感作ラテツクスビーズをRR抗原の段階希釈液
と反応させた。
結果を第3,4表に示す。
第3,4表の結果より抗C型抗体及び抗g型抗体で感作
されたラテックスビーズの反応性はラテックスビーズの
種類により殆んど影響を受けないものであることが認め
られた。
されたラテックスビーズの反応性はラテックスビーズの
種類により殆んど影響を受けないものであることが認め
られた。
3、各種抗原の血清型の影響
500倍に希釈された免疫グロブリンで感作したラテッ
クスビーズAと種々の血清型に属するS。
クスビーズAと種々の血清型に属するS。
mutansの全菌体浮遊抗原、1.25■/mQの凍
結乾燥菌体を含む亜硝酸抽出抗原、及びRR抗原の原液
と26倍希釈液とをそれぞれ用い、感作ラテツクスビー
ズ凝集試験を行なった。結果を第5〜8表に示す。
結乾燥菌体を含む亜硝酸抽出抗原、及びRR抗原の原液
と26倍希釈液とをそれぞれ用い、感作ラテツクスビー
ズ凝集試験を行なった。結果を第5〜8表に示す。
また、500倍に希釈された免疫グロブリンで感作した
ラテックスビーズAと、抗原としてストレプトコッカス
・ビオジェネス(S 、 pyogenes)の2株、
ストレプトコッカス・サンギス(S 、sanguis
)の4株、ストレプトコッカス・サリバリウス(S。
ラテックスビーズAと、抗原としてストレプトコッカス
・ビオジェネス(S 、 pyogenes)の2株、
ストレプトコッカス・サンギス(S 、sanguis
)の4株、ストレプトコッカス・サリバリウス(S。
5alivarius)の1株、ストレプトコッカス・
フエカーリス(S 、 faecalis)の1株の1
0■を生理食塩水1mQに懸濁した全菌体浮遊抗体とを
用い、感作ラテツクスビーズ凝集試験を行なった。結果
を第9表に示す。
フエカーリス(S 、 faecalis)の1株の1
0■を生理食塩水1mQに懸濁した全菌体浮遊抗体とを
用い、感作ラテツクスビーズ凝集試験を行なった。結果
を第9表に示す。
第5〜9表の結果から認められるように、抗C型抗体感
作ラテックスビーズは、血清型c、e及びfの全菌体浮
遊抗原と約10分間の反応で明瞭な凝集反応を生じ、ま
た抗g型抗体感作ラテックスビーズは血清型a及びgの
全菌体浮遊抗原と凝集反応を生じた。
作ラテックスビーズは、血清型c、e及びfの全菌体浮
遊抗原と約10分間の反応で明瞭な凝集反応を生じ、ま
た抗g型抗体感作ラテックスビーズは血清型a及びgの
全菌体浮遊抗原と凝集反応を生じた。
従って、抗C型抗体及び抗g型抗体を用い、特にこれら
を混合して使用することにより、唾液や歯垢から採取し
た検体中のS 、 mutansの存否を該S 、 m
utansの血清型の如何に拘らず検出し得ることが認
められた。
を混合して使用することにより、唾液や歯垢から採取し
た検体中のS 、 mutansの存否を該S 、 m
utansの血清型の如何に拘らず検出し得ることが認
められた。
一方、全菌体を抽出処理することによって得られた亜硝
酸抽出抗原やRR抗原を使用した場合、抗C型抗体や抗
に型抗体との特異性が高まり、従って検体中のS 、
mutansの血清型をも検知するためにはRR抗原や
亜硝酸抗原の使用が好ましいことが認められた。
酸抽出抗原やRR抗原を使用した場合、抗C型抗体や抗
に型抗体との特異性が高まり、従って検体中のS 、
mutansの血清型をも検知するためにはRR抗原や
亜硝酸抗原の使用が好ましいことが認められた。
なお、第9表の結果は、抗C型及び抗g型抗体がS 、
pyogenes 19618の全菌体浮遊抗原に対し
弱い交叉凝集反応を生じることを示しているが、S 、
pyogenes 19618のRR抗体や亜硝酸抽出
抗体を用いる場合には、かかる交叉反応は生じないもの
である。
pyogenes 19618の全菌体浮遊抗原に対し
弱い交叉凝集反応を生じることを示しているが、S 、
pyogenes 19618のRR抗体や亜硝酸抽出
抗体を用いる場合には、かかる交叉反応は生じないもの
である。
第 7 表 抗C型抗体感作うテックスビーズ第 8
表 抗g型抗体感作ラテックスビーズ4、各種抗原の濃
度の影響 500倍に希釈した免疫グロブリンで感作されたラテッ
クスビーズAと、段階希釈された全菌体浮遊抗原、亜硝
酸抽出抗原及び生菌浮遊抗原とを用い、感作ラテツクス
ビーズ凝集試験を行なった。
表 抗g型抗体感作ラテックスビーズ4、各種抗原の濃
度の影響 500倍に希釈した免疫グロブリンで感作されたラテッ
クスビーズAと、段階希釈された全菌体浮遊抗原、亜硝
酸抽出抗原及び生菌浮遊抗原とを用い、感作ラテツクス
ビーズ凝集試験を行なった。
結果を第10〜13表に示す。
第10.11表に示されたように、抗C型抗体及び抗g
型抗体感作ラテックスビーズは、いずれも2.5■/m
Q濃度の血清型Cの全菌体浮遊抗原まで凝集反応を生じ
、また亜硝酸抽出抗原を用いた場合には0.31■/d
の濃度まで凝集反応を生じ、感度が23倍向上すること
が認められた。
型抗体感作ラテックスビーズは、いずれも2.5■/m
Q濃度の血清型Cの全菌体浮遊抗原まで凝集反応を生じ
、また亜硝酸抽出抗原を用いた場合には0.31■/d
の濃度まで凝集反応を生じ、感度が23倍向上すること
が認められた。
また、第12.13表の結果からも、亜硝酸抽出抗原の
使用は感度を向上させることが知見された。
使用は感度を向上させることが知見された。
〔実施例2〕
実施例1で用いた物理吸着法による感作ラテツクスビー
ズ〔抗C型抗体、抗g型抗体をグリシン緩衝生理食塩水
で希釈したもので感作したラテックスビーズ(以下、G
BS希釈による抗C型又は抗g型抗体感作ラテックスビ
ーズと記述する)〕と、化学結合法による抗g型抗体感
作ラテックスビーズ、蒸留水希釈d吸収抗C型抗体感作
ラテックスビーズとの効果を比較した。
ズ〔抗C型抗体、抗g型抗体をグリシン緩衝生理食塩水
で希釈したもので感作したラテックスビーズ(以下、G
BS希釈による抗C型又は抗g型抗体感作ラテックスビ
ーズと記述する)〕と、化学結合法による抗g型抗体感
作ラテックスビーズ、蒸留水希釈d吸収抗C型抗体感作
ラテックスビーズとの効果を比較した。
結果を第14〜16表に示す。
化8“合法による 型 体感−ラテックスビーズの調
整 ラテックスビーズAを蒸留水中、に0.5%濃度になる
ように懸濁させ、その1容量部に0.1モルW S C
(water 5oluble carba+aide
、 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)
−カルボジイミド−ハイドロクロライド)溶液1容量部
を加え。
整 ラテックスビーズAを蒸留水中、に0.5%濃度になる
ように懸濁させ、その1容量部に0.1モルW S C
(water 5oluble carba+aide
、 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)
−カルボジイミド−ハイドロクロライド)溶液1容量部
を加え。
37℃で2時間培養した後、25℃において7000r
pmで10分間遠心した。沈渣を蒸留水2容量部で洗浄
し、上記と同様に遠心して得たラテックスビーズに蒸留
水で希釈した免疫グロブリン(抗g型抗体)1容量部を
加え、37℃で2時間培養した。上記と同様に遠心した
後、0.1%のウシ血清アルブミンと0.05%のNa
N、を含むリン酸緩衝生理食塩水2容量部で洗浄し、更
に上記と同様に遠心し、沈渣を0.1%のウシ血清アル
ブミンと0.05%N a N 3とを含むリン酸緩衝
生理食塩水1容量部に浮遊したものを感作ラテツクスビ
ーズとした。
pmで10分間遠心した。沈渣を蒸留水2容量部で洗浄
し、上記と同様に遠心して得たラテックスビーズに蒸留
水で希釈した免疫グロブリン(抗g型抗体)1容量部を
加え、37℃で2時間培養した。上記と同様に遠心した
後、0.1%のウシ血清アルブミンと0.05%のNa
N、を含むリン酸緩衝生理食塩水2容量部で洗浄し、更
に上記と同様に遠心し、沈渣を0.1%のウシ血清アル
ブミンと0.05%N a N 3とを含むリン酸緩衝
生理食塩水1容量部に浮遊したものを感作ラテツクスビ
ーズとした。
ラテックスビーズAを蒸留水中に0.5%濃度になるよ
うに懸濁させ、その1容量部に蒸留水で希釈した免疫グ
ロブリン(抗C型抗体)1容量部を加え、37℃で2時
間培養した。25℃において7000rpmで10分間
遠心した後、0.1%のウシ血清アルブミンと0.05
%のNaN3を含むリン酸緩衝生理食塩水2容量部で洗
浄し、更に上記と同様に遠心し、沈渣を0.1%のウシ
血清アルブミンと0.05%Na N、とを含むリン酸
緩衝生理食塩水1容量部に浮遊したものを感作ラテツク
スビーズとした。
うに懸濁させ、その1容量部に蒸留水で希釈した免疫グ
ロブリン(抗C型抗体)1容量部を加え、37℃で2時
間培養した。25℃において7000rpmで10分間
遠心した後、0.1%のウシ血清アルブミンと0.05
%のNaN3を含むリン酸緩衝生理食塩水2容量部で洗
浄し、更に上記と同様に遠心し、沈渣を0.1%のウシ
血清アルブミンと0.05%Na N、とを含むリン酸
緩衝生理食塩水1容量部に浮遊したものを感作ラテツク
スビーズとした。
第14〜15表の結果より、化学結合法による感作ラテ
ツクスビーズは物理吸着法による感作ラテツクスビーズ
と同様の効果を有すること、また蒸留水で希釈した免疫
グロブリン感作ラテツクスビーズは感度が高いことが知
見された。
ツクスビーズは物理吸着法による感作ラテツクスビーズ
と同様の効果を有すること、また蒸留水で希釈した免疫
グロブリン感作ラテツクスビーズは感度が高いことが知
見された。
出願人 ラ イ オ ン 株式会社
代理人 弁理士 小 島 隆 司
Claims (1)
- 1、ストレプトコッカス・ミュータンスに対するモノク
ローン抗体又はこの抗原を動物に免疫することによって
得られるポリクローン抗体を被検試料と反応させて、こ
の被検試料中に上記抗体に対応する抗原が存在するか否
かを抗原抗体反応の有無により判定することを特徴とす
るストレプトコッカス・ミュータンスの検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7455888A JPH01250067A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | ストレプトコッカス・・ミユータンスの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7455888A JPH01250067A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | ストレプトコッカス・・ミユータンスの検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01250067A true JPH01250067A (ja) | 1989-10-05 |
Family
ID=13550679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7455888A Pending JPH01250067A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | ストレプトコッカス・・ミユータンスの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01250067A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03279398A (ja) * | 1990-03-29 | 1991-12-10 | Taiyo Kagaku Co Ltd | 抗体及びそれを有効成分とするう蝕予防組成物 |
| EP0871890A4 (en) * | 1995-07-28 | 2001-05-02 | Us Navy | Rapid immunoassay for streptococcus mutans |
| WO2001081927A1 (fr) * | 2000-04-25 | 2001-11-01 | Tokuyama Dental Corporation | Procede de detection du streptococcus sobrinus et anticorps contre ce dernier |
| JP2004279113A (ja) * | 2003-03-13 | 2004-10-07 | Tokuyama Corp | 抗原又は抗体の抽出液の製造方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6028937A (ja) * | 1983-07-25 | 1985-02-14 | Kitasato Inst:The | 非う蝕性抗体および組成物 |
| JPS61112028A (ja) * | 1984-11-06 | 1986-05-30 | Lion Corp | う蝕予防剤 |
-
1988
- 1988-03-30 JP JP7455888A patent/JPH01250067A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6028937A (ja) * | 1983-07-25 | 1985-02-14 | Kitasato Inst:The | 非う蝕性抗体および組成物 |
| JPS61112028A (ja) * | 1984-11-06 | 1986-05-30 | Lion Corp | う蝕予防剤 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| EP0871890A4 (en) * | 1995-07-28 | 2001-05-02 | Us Navy | Rapid immunoassay for streptococcus mutans |
| WO2001081927A1 (fr) * | 2000-04-25 | 2001-11-01 | Tokuyama Dental Corporation | Procede de detection du streptococcus sobrinus et anticorps contre ce dernier |
| JP2004279113A (ja) * | 2003-03-13 | 2004-10-07 | Tokuyama Corp | 抗原又は抗体の抽出液の製造方法 |
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