JPH01257485A - 酵素によるトリグリセライドの合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素によるトリグリセライドの合成方法に関
し、更に詳しくは、リパーゼを用いて脂肪酸または脂肪
酸エステルとグリセロールまたは部分グリセライドとか
ら、トリグリセライドを合成する際に１．３位位置特異
性を有するリパーゼと特異性を示さないリパーゼとを混
合して酵素触媒として用いることを特徴とするトリグリ
セライドの合成方法に関するものである。

このような技術を利用する例としては、チッコレート用
の原料油脂として知られているカカオバターの代用脂の
製造が挙げられるが、その他、反応基質や酵素触媒を選
択することにより、任意の脂肪酸組成を有する任意のト
リグリセライドを製造でき、食品分野のみならず医薬・
薬学分野などの分野において、様々な用途が考えられて
いる。

本発明はこのような種々の用途に対応できるトリグリセ
ライドの製造法に関するものである。

〔従来技術と問題点〕

リパーゼは脂肪または高級脂肪酸のエステルを加水分解
する酵素であるが、適当な条件の下でこれを脂肪酸とア
ルコールの存在する系に作用させると、加水分野の逆反
応によってグリセライドを生成する性質がある。しかし
ながら通常の反応条件では、反応平衡は加水分解に片寄
っているため、リパーゼでトリグリセライドの合成を行
うことは困難であるとされていた。

このような問題に対し、反応系に少量の動物性または植
物性高分子蛋白質を添加して、合成反応を促進させる方
法（特公昭５１−７７５４号）や、部分グリセライドの
製造に関する方法（特開昭６１−２４７３９０号、同６
１−２５７１９２号、同６２−１９０９０号）、また、
トリグリセライドを一旦加水分解して得た部分グリセラ
イドに脂肪酸を混合し、トリグリセライドを再合成する
方法（特開昭６０−１９４９５号、同６０−２０３１９
６号、同６０−２３４５８９号）などが提案されている
が、このような方法では目的とするトリグリセライドの
収率が低く、しかも反応速度が充分ではないので、企業
化を企てる上で極めて不都合であった。

本発明はこのような欠点を改善し、任意のトリグリセラ
イドを効率良く製造する方法を提供するものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、任意のトリグリセライドを効率良く製造
する方法について鋭意検討した結果、特異性を示さない
リパーゼを単独で使用した場合、トリグリセライドの合
成収率が低（、しかも反応速度も低いこと、また１、３
位位置特異性を有するリパーゼを単独で使用した場合、
部分グリセライドが合成されトリグリセライドが合成さ
れに（いことを知見し、該知見に基づき両者の酵素を適
切な混合比率で使用することを試みた結果、所期の目的
が達せられることを見出し、本発明を完成させたもので
ある。

即ち、本発明はリパーゼを用いて、脂肪酸または脂肪酸
エステルとグリセロールまたは部分グリセライドとから
トリグリセライドを合成するに際し、１．３位位置特異
性を有するリパーゼと特異性を示さないリパーゼを混合
して反応させることを特徴とするトリグリセライドの合
成方法を内容とするものである。

本発明に用いられるリパーゼとしては、豚すい臓リパー
ゼ等の動物起源のリパーゼの他、微生物を起源とするリ
パーゼも使用できる。それら微生物起源のリパーゼは、
はとんど特異性を示さないものと、１．３位位置特異性
を有するものとに主として分類されるが、場合により不
飽和脂肪酸にのみ特異的に作用するリパーゼを混合して
使用することもできる。特異性を示さないリパーゼとし
ては、例えばカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ　）属、例えば
カンジダ・ルゴーサ（Ｃ９ｒｕｇｏｓａ　ＡＴＣＣ１０
５７１）　　；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　）属−例えばコリネバクテリウム・ア
クネス（Ｃ，ａｃｎｅｓ）やコリネバクテリウム・エク
イ　（Ｃ，ｅｑ、ｕｉ　ＩＦＯ３７３０）　　ｉスフフ
ィロコンカス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、例
えばスフフィロコンカス・アウレウス（Ｓ、　ａｕｒ−
ｅｕｓ　ＩＦＯ３０６０）　　；シュードモナス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｓ＋ｏｎａｓ）属、例えばシェードモナス・フ
ルオレセンス（Ｐ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ
３０８１）等の各種微生物を起源とするリパーゼが使用
できる。虫た１、３位位置特異性を有するリパーゼとし
ては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｒｕａ）属、例
えばアスペルギルス・ニガー（Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｒＦ
ｏ　６３４１　）　　ｉムコール（Ｍｕ−ｃｏｒ　）属
、例えばムコール・ジャバニカス（Ｍ、　ｊ−ａｖａｎ
ｉｃｕｓ　ＩＦＯ４５６９）　　；リゾプス（Ｒｈｉｚ
ｏｐｕｓ）属、例えばリゾプス・デレマー（Ｒ，ｄｅｌ
ｅｍａｒ　ＩＦＯ４６９７）、リゾプス・キネンシス（
Ｒ，ｃｈｆｅｎｓｉｓ　　ＩＦｏ　４７６Ｂ）　、リゾ
プス・シュードキネンシス（Ｒ，ｐ−５ｅｕｄｏｃｈｉ
ｎｅｎｓｉｓ　ＨＵ↑１２７？　＞等の各種微生物を起
源とするリパーゼが使用できる。さらにまた、ゲオトリ
クム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、例えばゲオトリクム
・キャンジダム（Ｇ、　ｃａｎｄｉｄｕｍ　Ｌｉｎｋ　
ｒＦｏ　４５９８）を起源とするリパーゼを混合して用
いれば、９位にシス２重粘合を含む長鎖脂肪酸だけに特
異的に作用させることができ、種々の脂肪酸の混在する
場合においても当該脂肪酸だけに作用し、不飽和脂肪酸
に冨んだトリグリセライドを合成することもできる。

１．３位位置特異性を有するリパーゼは、グリセロール
に脂肪酸残基を結合させるエステル合成作用が大きいと
されているが、大部分ジグリセライドあるいはモノグリ
セライドを合成する。トリグリセライドをグリセロール
などから合成する場合は、位置特異性を示さないリパー
ゼが用いられるが、−船釣に位置特異性を示さないリパ
ーゼは、加水分解作用は大きいが、合成作用は比較的小
さいとされており、したがってグリセロールに脂肪酸残
基を結合させる速度が小さく、またトリグリセライドの
収率も小さい。

そこで本発明者らは鋭意検討した結果、特異性の異なる
２種類以上のリパーゼを混合して用いれば、それぞれの
特性を生かすことができ、トリグリセライドの収率が大
きく、なおかつ反応速度も大きくできることを見出した
。異種のリパーゼを用いる場合には、それぞれの混合比
を加水分解活性としてｏ、ｔ：ｉから１＝１程度の比率
で混合して用いれば、それぞれのリパーゼの特性を生か
すことができ、トリグリセライド合成作用を高めること
ができる。ここで言う加水分解活性とは、２ｇのオリー
ブオイル、ｐＨ５，６，０，１酢酸緩衝液１０ｍ１．０
．０５　Ｍ　　ＣａＣ１ｔ　　１　ｍ　ｌに酵素剤を加
え、マグネチックスクーラーで毎分５００ｒｐ−で攪拌
しつつ摂氏４０度で２時間反応させた後、５０ｍ１のエ
チルアルコールを性別して、０．０１Ｎ水酸化ナトリウ
ム水溶液で中和滴定して求めることができ、１分間当り
１マイクロモルの脂肪酸をｔｔｍするリパーゼ量を１酵
素ユニツトとした。

このような特異性の異なるリパーゼをそれぞれ個別に利
用して段階的にエステル合成反応を進行させることも可
能ではあるが、このような場合には一方のリパーゼによ
り一度結合された脂肪酸残基が、もう一方のリパーゼに
よる合成反応時に加水分解され結合が解かれてしまうた
め、効率的でなく、また収率もよくない。軟土のような
特異性の異なるリパーゼを混合して用いろ反応方法によ
って、リパーゼによるトリグリセライドの収率や反応速
度を初めて増大せしめることができ、グリセロールから
トリグリセライドを効率的に合成せしめることが可能で
ある。

また、このようなリパーゼは、粉体酵素を水や緩衝液、
または基質であるグリセロールに溶解して用いることも
できるが、必要に応じて担体に固定化して固定化酵素触
媒として用いることもできる。酵素を固定化する方法と
しては、セライト、活性アルミナ、活性白土、珪藻土、
活性炭のような担体を用いる吸着法、ポリウレタン系の
樹脂、カラギーナン、アルギン酸ナトリウムや光硬化性
樹脂を用いる包括法およびグルタルアルデヒド等の各種
架橋剤で酵素と担体とを結合させる架橋法などの公知の
方法が適用できる。

本発明に用いるリパーゼは精製されたリパーゼでもよく
、また培養液を塩析することによって得られるような粗
リパーゼなどを用いることもできる。

また本発明に用いるリパーゼは微生物あるいは菌体から
抽出されたリパーゼだけでなく、リパーゼを含有した菌
体そのものを使用することもできる。リパーゼを含有し
た菌体を用いれば、酵素の場合のように精製に要する手
間や費用が省略できるので、工業的に使用する場合には
極めて都合がよい。

また菌体を用いた場合、菌体の細胞膜は疏水性・親水性
の両性を合わせ持っているので、反応基質である脂肪酸
と酵素との親和性がよく、反応速度も大きい。また、菌
体は培４！菌体そのものを利用することもできるが、前
記酵素と同様の固定化方法、あるいはスポンジ状または
網状などの多孔質材料に付着させた固定化菌体を用いる
こともできる。特に、カビ類や放線菌類などのような付
着性を有する微生物を使用する場合、種々の多孔質体か
らなる微生物保持体と共に培養を行い該保持体に微生物
を付着・増殖させ、得られた菌体を直接反応に使用する
ことができるので、経済的にも有利である。

このような微生物保持体の材料としては、微生物の持つ
粘着力、吸着力により微生物の吸着増殖を可能ならしめ
る任意の材料が適用できる０例えば高分子多孔質材料と
しては、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレ
フィン系；ブタジェンまたはイソプレンなどのジエン系
；ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル、アクリルア
ミド、ポリスチレンなどのビニル重合体；ポリウレタン
、ポリエーテル、ポリエステル、ポリカーボネートまた
はナイロンなどの縮合系；シリコン樹脂およびフン素樹
脂などの材料；無機材料としてはセラミックス、ガラス
、活性炭、セライト、活性アルミナ、活性白土、珪藻土
、および多孔質金属や金属繊維加工材料などが適用でき
る。いずれの材料においても微生物を良好に該保持体に
固定化させるためには、空隙率が１０〜９９％、孔の直
径が２〜２０００ミクロンの範囲にある多孔質材料か、
空隙率が１０〜９９％である金属加工材料等を使用する
のが好ましい。

このような種々保持体は、微生物の種類おらび培養条件
等によって適宜選択でき、例えばカンジダ・ルゴーサの
ような酵母類やコリネバクテリウム・アクネスなどのバ
クテリア類に対しては、セライトヤボリビニルアルコー
ル系樹脂からなる多孔質材料（例えば鐘紡製「ベルイー
タ−」）等の比較的孔径の小さい多孔質材料、あるいは
リゾプス属、アスペルギルス属、ムコール属などのカビ
類、あるいは放線菌類、凝集性の酵母などの場合は、比
較的孔径の大きい、例えばポリウレタン製の多孔質材料
（例えばＢｒｉｄｇｅｓｔｏｎｅ　５！、「エバーライ
トスコント」）などを用いれば容易に固定化することが
できる。また形状については、例えば球状、ブロック状
あるいはシート状等に加工して使用することができる０
寸法については、微生物の種類、培養条件、反応器の種
類等によって異なるが、球状であれば直径が概ね１〜１
００龍、ブロック状のものであれば一辺が概ね１〜１０
０鶴のものが使用される。

微生物を上記保持体に固定化させるには、通常公知の回
分、半回分、連続培養法等公知の培養方法を用いて容易
に達成される０例えば、リゾプス・キネンシスＩＰ０４
７６Ｂをペプトンを基本培地とし、ｐＨ５，６、温度３
０℃で通気培養すれば、約９０時間後には該微生物が保
持体に吸着され、反応に適した固定化微生物が形成され
る。他のカビ類や藻類についても同様に、好適な反応条
件下で容易に固定化できる。このような微生物保持体に
固定化する方法によれば、単に経済的な利点のみならず
、サスペンション系で培養して得られた微生物に比べて
、特にカビ類においてはリパーゼ活性が安定で、しかも
活性も比較的大きくなるので、工業的に使用するのに都
合がよい。

本発明においては、リパーゼ酵素は１．　３位位置特異
性を有するものと、特異性を示さないものが混合されて
用いられるが、それぞれの酵素あるいは微生物は同等の
方法で固定化されてもよいが、まったく別の方法で固定
化されてもよく、あるいは固定化せずに混合使用されて
もよい、場合によっては、同−担体上に種類の異なるリ
パーゼあるいは微生物を同時に固定化して用いることも
できる。

培養で得られた微生物あるいは固定化微生物は、生菌体
のまま反応に使用することもできるが、水分含量が大き
すぎると反応平衡が加水分解側に傾き、エステル合成収
率が小さくなるため、菌体から水分を除去しておくのが
望ましい、また、このように水分を除去した状態では乾
燥菌体内のリパーゼは非常に安定であり、長期間保存す
ることができる。

微生物から水分を除去する方法としては、原則的には酵
素が失活しない温度（４０〜７０℃）で乾燥すればよい
が、単に水分を蒸発させると細胞＆ｌｌ織の収縮が起こ
り非常に堅（なり、ｍｍ内のリパーゼと外界との接触が
断たれて活性を発現することが困難となる。したがって
、菌体を乾燥させるには細胞ａｍの収縮を伴わない方法
を採用しなければならない０例えば、水溶性溶媒、例え
ばアセトン、アセトニトリルまたはメタノール、エタノ
ール、イソプロパツール等の低級アルコール類中に菌体
を漫して組織を溶媒に置換した後、溶媒を蒸発させる方
法により、細胞組織の収縮を抑えて乾燥画体を得ること
ができ、乾燥菌体内リパーゼの反応性を増大させること
ができる。この場合、乾燥方法としては真空乾燥、凍結
乾燥、低温乾燥、温風乾燥等の公知の乾燥法が使用でき
る。さらに、菌体を溶媒に浸す前に５％以下のグルタル
アルデヒド水溶液に浸して細胞組織を固定化することに
より、細胞組織の収縮をより効果的に抑えることもでき
る。このような方法によって得られる菌体の水分は、通
常１〜２０％の水分含量に調整される。固定化酵素につ
いては、上記のような水溶性溶媒による処理は必ずしも
必要ではないが、過剰の水分を迅速に除去するために同
上の溶媒処理を適用してもよく、さらに上記の乾燥方法
により１〜２０％の水分含量に調整される。

このようにして得られた乾燥画体、固定化微生物または
固定化酵素はいずれも反応基質中に；懸濁させて反応に
用いられるが、酵素周りの水分濃度が０．００５％以下
になると反応速度が極めて低くなり、また逆に２０％以
上になると反応平衡が加水分解側に傾くため、好ましく
はＯ，ＯＯ５〜２０％、より好ましくは０．０１％〜１
０％、更に好ましくは０．０２〜５％の範囲になるよう
に調整するのが望ましい。

このように水分濃度を調整する方法としては、反応前に
反応系に水分を添加することにより反応初期の水分濃度
を調整することもできるが、反応中も水分濃度を一定に
調節しながら反応させてもよい。合成反応が進行するこ
とにより水が生成して水分濃度が増すが、リパーゼ周辺
の水分濃度を常時監視しながら、増加した水分を除去す
ることによって水分濃度を一定に調節することができる
。

リパーゼ周辺の水分濃度を直接測定できない場合には、
反応基質の存在する有機溶媒相の水分濃度を測定するこ
とによって、リパーゼ周辺の水相との間の水分分配平衡
関係を利用してリパーゼ周辺の水分濃度を知ることがで
きる。このような方法を用いれば、水分濃度を一定に調
節することができるだけでなく、任意の値に適宜調節す
ることができ、例えば水分濃度を連続的に減少させなが
ら反応を進行させることも可能である。この場合には、
合成反応の進行に伴って水分濃度を減少させ、反応平衡
を合成側に傾けることができるため、トリグリセライド
の収率を更に向上させることができる。

このような水分濃度の調節は、窒素等の不活性気体のパ
ージまたはリパーゼの存在する水相または有ｊａ溶媒相
の水分吸着性物質と接触させることによって達成するこ
とができる。水分吸着性物質としては、例えば脱水した
グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコールなどの水溶性物質；モレキ
ュラーシーブ、ゼオライト、シリカゲル、セルロースパ
ウダー、ヒドロキシルアパタイト、キトサンなどの吸水
性物質；グリコース、ガラクトース、リボース、フラク
トースなどの単ｔＪ！［；シュクｄ−ス、トレハロース
、デキストリン、グリコーゲン、デンプンなどの多ＶＭ
′Ｒ；焼石膏、炭酸カルシウム、塩化カルシウムなどの
吸水性を有する塩類；水酸化カルシウムなどの潮解性を
有する塩類；または無水硫酸ナトリウムのような結晶水
を失った金属塩類などを使用することができる。具体的
には、反応器に窒素をパージして水分を気体に同伴させ
て反応系外に除去したり、またはシリカゲルなどの吸水
性物質を充填したカラムにグリセリン相または反応基質
を含有する有機溶媒相を導入して水分を吸着除去した後
、反応器に循環して反応系の水分を減少させる方法等を
用いることができる。

また本発明において反応基質は、脂肪酸または脂肪酸エ
ステルとグリセロールまたは部分グリセライドとの混合
物が用いられる。

脂肪酸としては、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸
、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸またはへヘ
ン酸等の飽和脂肪酸、あるいはミリストレイン酸、オレ
イン酸、リノール酸、リルン酸またはエイコサペンクエ
ン酸等のような不飽和脂肪酸の単独またはそれらの混合
物を使用することができる。脂肪酸エステルとしては、
軟土のような脂肪酸のメチルアルコールエステル、エチ
ルアルコールエステル、プロピルアルコールエステルな
どの低級アルコールエステルを用いることができる。

また部分グリセライドは、化学的合成法によって、ある
いはトリグリセライドを加水分解することによって得ら
れたものを用いることができる。

そのような部分グリセライドは、モノグリセライドまた
はジグリセライドのいずれであってもよいが、２位置に
はオレイン酸のような不飽和脂肪酸が結合したものを用
いることが望ましい。

また本発明において、上記反応基質を直接用いることが
できるが、必要に応じてこれらの基質をｎ−へキサン、
イソオクタン、アセトン、エタノール、メタノール、石
油エーテル、酢酸エチルのような有機溶媒に希釈して用
いることもできる。

反応温度は用いるリパーゼの至適温度であればよく、通
常２０〜６０℃の範囲である０反応を効率的に実施する
ためには、反応基質は液状である方がよく、従って上記
のような有機溶媒に基質を溶解したり、基質が溶解する
程度に反応温度を設定するのがよい。

また反応装置の様式としては、回分式、半回分式または
連続式の攪拌槽あるいは充填層などの公知のどのような
形式であってもよく、さらに！８水性または親水性の多
孔性樹脂からなる薄膜の両面あるいはチューブの内外に
、それぞれグリセリン相と脂肪酸の存在する有機溶媒相
を流す隔膜式であってもよい０反応時間は回分の場合は
概ね０６５〜１００時間、その他生回分法や連続法にお
いても、この反応条件に見合った反応時間を設定するこ
とにより、望ましい反応を行わせることができる。

〔実施例〕

以下に本発明を実施例を挙げて説明するが、もとより本
発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。

実施例１、比較例１〜３ グリセロール２ｇ１オレイン酸５ｇ１ヘキサン２０ｇお
よび水分０．２ｇを含む反応液に、豚すい臓由来の位置
特異性を示さないパンクレアチックリパーゼ（商品名：
　ｒＰａｎｃｒｅａｔｉｎＪ−、和光純薬製）５０００
ユニツトおよび１．３位位置特異性を有するリゾプス・
デレマー起源の精製リパーゼ（商品名：　ｒＲｈｉｚｏ
ｐｕｓリパーゼ」、生化学工業型）５０００ユニツトを
加え、マグネチソクスクーラーで攪拌しながら、エステ
ル合成反応を実施した。エステル合成反応結果は、４．
１Ｏ１２０および４０時間反応させた後、ヘキサン相を
採取し、ゲルパーミニエイジシンクロマトグラフィー（
ＧＰＣ）によって分析し、全脂肪中のトリグリセライド
の重量を測定した。結果を第１表に示した。ただし、Ｇ
ＰＣ分析では、島津製カラム（商品名：　ｒ）（ＳＧ−
１５Ｊ及びｒＨ３Ｃ；−２０Ｊ各２本）に３０℃で溶出
液テトラヒドロフランを１ｃｃ／ｓｉｎで流し、トリグ
リセライド、ジグリセライド、モノグリセライド、およ
び脂肪酸各画骨をそれぞれ分離し、示差屈折率計で分析
を行った。

比較例として、実施例１と同一の反応基質、同一の反応
条件下で、それぞれ上記パンクレアチックリパーゼ１０
０００ユニツト（比較例１）、上記リゾプス・デレマー
由来のリパーゼ１００００ユニツト（比較例２）を加え
てエステル合成反応を実施せしめた。

また比較例３として、上記リゾプス・デレマー由来のリ
パーゼ１００００ユニツトで２０時間反応させた後ヘキ
サン相を分離し、採取された脂肪を含むヘキサン相に、
新たに実施例１と同量のグリセリンおよび水を加え、さ
らに上記パンクレアチックリパーゼ１０００Ｇユニツト
を加えて再び合成反応を継続せしめた０反応結果は実施
例１と同様の方法で分析し、第１表に示した。尚、全脂
肪とはトリグリセライド、ジグリセライド、モノ、グリ
セライドおよび脂肪酸の合計を表す。

第１表 第１表から明らかなように、同等の加水分解活性を有す
るリパーゼを利用しているにもかかわらず、特異性の異
なる２種類のリパーゼをそれぞれ単独で用いた比較例１
．２よりも、両者を混合して用いた実施例１の方がトリ
グリセライド合成速度が大きく、収率も大きくなること
がわかる。また比較例３と実施例１とを比較しても、最
終的に得られたトリグリセライドの収率は実施例１の方
が大きくなることがわかる。このことから特異性の異な
る２種類のリパーゼをそれぞれ別個に使用して２段階の
合成反応を実施せしめても、トリグリセライドの合成は
困難であることがわかる。

実施例２ グリセロール２ｇ、ヘキサン４０ｇおよび水０゜１ｇを
含む反応液に、カンジダ・ルゴーサ由来の特異性を示さ
ない精製リパーゼ（商品名：「リパーゼ」、シグマ社製
）をセライトに吸着せしめた５０００ユニツトの固定化
酵素と、１．３位位置特異性を有するリパーゼを生産す
るリゾプス・キネンシス（Ｒ，ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　Ｉ
ＦＯ４７６８）を培養して得たリパーゼを体内に含有す
る乾燥菌体５０００ユニットとを加え、脂肪酸としてカ
プロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、パル
ミチン酸、ステアリン酸、アラキシン酸あるいはベヘニ
ン酸をそれぞれ加えて、マグネチソクスクーラーで攪拌
しながら、４０℃で２４時間エステル合成反応を実施し
た。

ただし、固定化酵素は５０００ユニツトの酵素を５ｃｃ
の水に溶解した後、セライ）　０．５　ｇを加えて吸着
固定化し、５０時間減圧乾燥して製造した。

このようにして得られた固定化酵素の水分含量は約１ｆ
ｆｉｌ１％であった。一方、菌体は、ペプトン７重量部
、燐酸２水素カリウム０．１重量部、硝酸ナトリウム０
．１重量部および硫酸マグネシウム０．０５重量部を１
００重量部の水に溶解したものを培地とし、ｐｏｓ、６
に調節しながら、３０℃で４０時間培養して製造した。

さらに、得られた培養液を濾別して菌体を分離し、菌体
１重量部に対してアセトン５重量部を加えて２回洗浄を
行った。得られた半乾燥菌体を減圧下で３時間乾燥して
乾燥菌体を製造した。得られた乾燥菌体中の水分含量は
５．０重量％であった。

反応結果は、実施例１と同様の方法で分析し、第２表に
示した。

第２表 実施例３ グリセロール２ｇ１ヘキサン２０ｇ１ラウリン酸５ｇお
よび水０．０５ｇを含む反応液に、シュウトモナス属由
来の特異性を示さない精製リパーゼ（商品名；「リバー
ゼアマノＰＪ、天野製薬製）を実施例２と同様の方法で
調整した５０００ユニツトの固定化酵素と、１，３位位
置特異性を有するリパーゼを生産するムコール・ジャバ
ニカス（Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ　ＩＦＯ４５
６９）を実施例２と同様の方法で調整した乾燥菌体５０
００ユニツトとを加えて、マグネチソクスターラーで撹
拌しながら、４０℃で２４時間エステル合成反応を実施
した。

次に、Ｗ体ｔ−アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇ
　ｉ　Ｉ−Ｉｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＩＦＯ６３４１）に変
えて、同様の実験を行った。

反応結果は、実施例１と同様の方法で分析し、第３表に
示した。

第３表 実施例４ グリセロール２ｇ、ヘキサン４０ｇ、ラウリン酸５ｇお
よび水０．０５　ｇを含む反応液に特異性を示さないリ
パーゼを生産するスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＩＦＯ３
０６０）をポリビニルアルコール系の多孔質材料（商品
名：「ベルイータ−」、鐘紡製）に付着させた５０００
ユニツトの固定化乾燥微生物と、１．３位位置特異性を
有するリパーゼを生産するりゾブス・キネンシス（Ｒｈ
ｉｚｏｐｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　５ａｉｔｏ　ＩＦ
Ｏ４７６８）をポリウレタン類の多孔質材料（商品名：
「エバーライトスコツトＨＲ−４０Ｊ、ブリジストン製
）に付着増殖せしめた固定化乾燥菌体５０００ユニツト
とを加えて、振盪器で１００ｒｐ−の回転速度で攪拌し
ながら、４０℃で２４時間エステル合成反応を実施した
。次に、特異性を示さない菌体をコリネバクテリウム・
エクイ　（Ｃｏｒｙｎｅｂａ−ｃＬｅｒｉｕｍ　ｅｑｕ
ｉ　ＩＦＯ３７３０）　、またはカンジダ・ルゴーサ（
Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ　ＩＦＯ１３６４）に変
えて、同様の実験を行った。ただし、固定化乾燥微生物
はそれぞれ３ミリ角の多孔質材料とともに培養する他は
実施例２と同様の方法で調整した。

反応結果は、実施例１と同様の方法で分析し、第４表に
示した。

第４表 〔作用・効果〕 本発明の特徴は、リパーゼを用いて加水分解の逆反応を
利用してグリセロールからトリグリセライドを合成する
に際し、特異性を示さないリパーゼと１．３位位置特異
性を示すリパーゼとを混合して用いることにより、リパ
ーゼのトリグリセライド合成作用を増大せしめることに
ある。

本発明によれば、収率あるいは反応性の面から従来困難
であるとされていたグリセロールからのグリセライドの
合成を効率的に行うことができ、製品トリグリセライド
の生産速度が太き（、収率も向上するという効果を奏す
る。

また本発明によれば、従来より非常に困難であるとされ
ていた任意の脂肪酸組成を有するトリグリセライドを製
造することができ、生理活性を有するような脂質を純度
よく製造することができるなど、当該生化学分野に大き
な利益をもたらすもので、工業的意義は頗る大である。

特許出願人　鐘淵化学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リパーゼを用いて、脂肪酸または脂肪酸エステルと
   グリセロールまたは部分グリセライドとからトリグリセ
   ライドを合成するに際し、１，３位位置特異性を有する
   リパーゼと特異性を示さないリパーゼを混合して反応さ
   せることを特徴とするトリグリセライドの合成方法。 ２、固定化されたリパーゼ、リパーゼを含有する菌体、
   リパーゼを含有する乾燥菌体、リパーゼを含有する菌体
   の固定化物及びリパーゼを含有する乾燥菌体の固定化物
   から選ばれる少なくとも１種を用いる請求項１記載の合
   成方法。