JPH0528114B2

JPH0528114B2 -

Info

Publication number: JPH0528114B2
Application number: JP60162098A
Authority: JP
Inventors: Osamu Yamada
Original assignee: Nisshin Oil Mills Ltd
Current assignee: Nisshin Oillio Group Ltd
Priority date: 1985-07-24
Filing date: 1985-07-24
Publication date: 1993-04-23
Also published as: JPS6222597A

Description

【発明の詳細な説明】

(a) 産業上の利用分野本発明は、天然物由来の糖脂質を酵素的に変換
して糖グリセロールおよび脂肪酸を製造する方法
に関する。さらに詳しくは、油脂加水分解酵素の
存在下にグリセロ糖脂質の脂肪酸を部分的あるい
は完全に加水分解し、糖グリセロールまたはアシ
ル糖グリセロールおよび脂肪酸を製造する方法に
関するものである。 (b) 従来の技術天然物由来の脂質は、高等動植物から採取され
るものは脂肪酸のみのグリセリド（中性脂質）の
ほか、糖やリン酸残基を含む極性脂質と呼ばれる
ものがある。またカビ、酵母、バクテリアなどの
微生物、海草やクロレラなどの藻類、さらには魚
類などの脂質は含糖脂質（以下、単に糖脂質とい
う）や含リン脂質（以下、単にリン脂質という）
の形態で存在することが多く、これらのいわゆる
極性脂質の有効利用が期待されてている。このう
ちグリセロ糖脂質は、例えば藻類ではモノあるい
はジガラクトシルセリド、モノあるいはジグルコ
シルグリセリド、モノあるいはジマノシルグリセ
リド、スルホピラノシルグリセリドなどの分子構
造で存在しており、さらに結合脂肪酸としてはエ
イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、γ−
リノレン酸、アラキドン酸などの高度不飽和脂肪
酸が多く、細胞膜や細胞壁などの成分としても存
在するいわゆる生体構成脂質として生理活性を有
する重要なものが多い。 (c) 発明が解決しようとする問題点このようなグリセロ糖脂質を原料として糖グリ
セロールまたはアシル糖グリセーロールを製造す
る方法としては、酸あるいはアルカリ触媒で加水
分解により脱脂肪酸を行えばよいが、この方法で
は酸あるいはアルカリの作用により高度不飽和脂
肪酸が劣化し、過酸化、酸敗、重合、着色をひき
おこして後処理の精製が極めて困難になる。ま
た、これらの触媒作用をコントロールして好まし
い構造式の生成物を得ることもむずかしい。これに対して酵素法では、リパーゼは通常、モ
ノ、ジあるいはドリグリセリド（いずれも脂肪酸
のみのエステル）を加水分解する酵素であり、基
質の変質、劣化を伴わず温和な反応条件で変換さ
せることは可能であるが、リパーゼの基質特異性
のために基質が糖鎖を有するもの、さらには長鎖
高不飽和脂肪酸に対しては反応が全く進まない
か、もしくはわずかの加水分解率にどまるにすぎ
なかつた。さらに、係る糖脂質は通常の脂肪酸ト
リグリセリドに比較して高融点物が多く、また、
熱的に長時間安定な酵素がほとんどなかつたた
め、かかる糖脂質の酵素の適用はなされていなか
つた。また、グリセロ糖エステルを化学的に合成しよ
うとすれば、通常、グリセリンと当該糖類を混
合、加熱してエーテル化し、必要に応じそれを脂
肪酸と混合、加熱してエステル化せねばならず、
このような合成経路を経ると熱履歴のために糖お
よび二重結合の多い高度不飽和脂肪酸は重合、異
性化、酸化、環化、分解などの副反応を受け、し
たがつて複雑な精製工程を必要とし、結果的には
望ましい高純度の糖グリセロールまたはシアル糖
グリセロールを得ることは困難である。 (d) 問題点を解決するための手段かかる現状に鑑み、本発明者らは、天然動植物
さらには微生物などの生体中に存在するグリセロ
糖脂質を、苛酷な反応条件を伴わず、したがつて
過酸化、分解、環化などの副反応を生じさせず、
脂肪酸基を脱離させ、糖グリセロールまたはアシ
ル糖グリセロールに改質させることを目的に鋭意
検討を行つた結果、耐熱性油脂加水分解を温和な
反応条件下に作用させることにより、容易に脂肪
酸基を脱離することができ、糖グリセロールまた
はアシル糖グリセロールおよび脂肪酸を製造する
方法を見出し、本発明を完成するに至つたもので
ある。以下に本発明を詳細に説明する。本発明において使用するグリセロ糖脂質とは、
天然物由来の中でも、カビ、酵母、バクテリアな
どの微生物、海草やクロレラなどの藻類、淡水産
あるいは海水産魚類、高等動植物などの生体から
抽出される脂質に含まれるものである。その一般
的な構造式は、下記（）〜（）で示され、こ
こに脂肪酸残基R₁およびR₂はともに炭素

【式】

【式】数が11〜23の飽和あるいは不飽和脂肪酸残基であ
り、かつＧが単糖類あるいはその二量体の残基で
表されるものである。かかる脂肪酸としては、オ
クタン酸（C₈:₀）、ラウリン酸（C₁₂:₀）、パル
ミチン酸（C₁₆:₀）、パルミトオレイン酸
（C₁₆:₁）、ステアリン酸（C₁₈:₀）、オレイン酸
（C₁₈:₁）、リノール酸（C₁₈:₂）、リノレン酸
（C₁₈:₃）、ベヘン酸（C₂₂:_O）、エルシン酸
（C₂₂:₁）、エイコサペンタエン酸（C₂₀:₅）、ド
コサヘキサエン酸（C₂₂:₆）、アラキドン酸
（C₂₀:₄）、テトラコサテトラエン酸（C₂₄:₄）な
どがあげられ、また糖類としてはキシロース、グ
ルコース、フルクトース、マンノース、ガラクト
ース、フコースのどの中性単糖、グルクロン酸な
どの酸性単糖、グルコサミン、ガラクトサミンな
どのアミノ単糖など、あるいはそれらの二量体な
どがあげられる。なお、脂肪酸残基R₁およびR₂
のうち少くとも１つがエイコサペンタエン酸、γ
−リノレン酸またはアラキドン酸のいずれかの残
基である場合には、これらの生理活性作用が有効
に利用できる。このようなグリセロ糖脂質は一般に融点が高
く、例えば、ある種のクロレラ細胞から抽出され
る糖脂質はモノガラクトシル・ジエイコサペタエ
ン酸グリセリドが主成分で、その融点は50〜60℃
である。このため、従来、油脂の加水分解に用い
られてきた油脂加水分解酵素（至適温度：30〜45
℃）では熱的に長時間安定なものがほとんどなか
つた事実とも相まつて、かかる糖脂質を加水分解
し、糖グリセロールまたはシアル糖グリセロール
および脂肪酸を製造することは産業的に行われた
ことはなかつたが、本発明では耐熱性酵素を使用
することにより、これを可能ならしめることがで
きた。本発明の特徴の１つは、この耐熱性酵素を
糖脂質の加水分解酵素として使用することであ
り、耐熱性酵素は50℃以上でも活性を維持できる
ものであればいずれでもさしつかえない。このよ
うな酵素は、動植物あるいは微生物の生体ないし
分泌液から単離、精製し採取することができる
が、微生物由来のものが簡便である。例えば、シ
ユードモナス属（Pseudomonas）ではシユード
モナス・フルオレツセンス（Pseudomonas
fluorescens）由来のリパーゼ（例えば天野製薬
(株)製、商品名「Lipase Ｐ」）、キヤンデイダ属
（Candida）ではキヤンデイダ・シリンドラセ
（Candida cylindracea）由来のリパーゼ（例え
ば名糖産業(株)製・商品名「リパーゼ−OF」、天
野製薬(株)製・商品名「LipaseAY」）、キヤンデイ
ダ・リポリテイカ（Candida lipolytica）由来の
リパーゼ（例えば天野製薬(株)製・商品名
「LipaseL」）など、ペニシリウム属
（Penicillium）ではペニシリウム・シクロピウム
（Penicillium cyclopium）由来のリパーゼ（例
えば天野製薬(株)・商品名「LipaseGT(G)」）、ア
ルカリゲネス属（Alcaligenes）では微工研菌寄
第3783号の株由来のリパーゼ（例えば名糖産業
(株)製・商品名「Lipase−PL）、ヒユーミコラ属
（Humicola）ではヒユーミコラ・ラニユギノサ
（Humicola lanuginosa）由来のリパーゼ（例え
ば天野製薬(株)製、商品名「Lipase CE」）、ムコー
ル属（Mucor）ではムコール・ミーハイ
（Mucor miehei）由来のリパーゼ（例えばノ
ボ・インスタントリー社製・商品名
「Lipase3A」）、リゾプス属（Rhizopus）では、
リゾプス・キネンシス（Rhizopus chinensis）由
来のリパーゼ（特開昭59−156282記載の方法で調
製される耐熱製リパーゼ）などがあげらられる。
なお本発明はこれらの属、種の微生物およびリパ
ーゼに限定されるものではなく、これらの属ある
いは種に属する変異株、栄養要求性株、薬剤耐性
株からの耐熱性リパーゼを用いてもさしつかえな
い。またリパーゼは一般に分子量が数万〜十数万
の糖蛋白質であるが、分子量を巨大化することに
より耐熱性を増すことも可能あり、このような改
質操作によつて得られる耐熱性リパーゼを用いる
こともできる。次に、上記の耐熱性酵素は、これを固定化物と
して使用することもできる。一般には酵素は、対
PHおよび温度安定性改良、活性維持、再使用など
を目的として水不溶性の固定化物とする方法がと
られているが、固定化用担体としてはセルロー
ス、デキストラン、ポリスチレン、ポリアクリル
アミド、ポリビニルアルコール、イオン交換樹
脂、磁性体、活性炭、アルミナ、光架橋性樹脂、
アルギン酸塩などが使用される。本発明ではこれ
らの固定用担体に吸着、イオン結合、共有結合あ
るいは包括させた耐熱性酵素を使用することがで
きる。例えば、特開昭60−98984号に記載された
ムコール・ミーハイ（Mucor miehei）由来の熱
安定性リパーゼを多孔性弱アニオン交換樹脂に固
定化する方法、特開昭52−104506号に記載のある
キヤンデイダ・シリンドラセ（Candida
cylindracea）由来の耐熱性リパーゼをケイソウ
土粉末に吸着させる方法などによる固定化酵素が
使用できる。本発明の方法により糖脂質を加水分解するには
次のようにする。すなわち、前記の構造式（）
〜（）のいずれか１種または２種以上の組成の
糖脂質をガラスまたはステンレス製容器に採り、
必要に応じて最小限の不活性有機溶媒、たとえば
ヘキサン、ヘプタンなどで糖脂質を溶解させ、こ
れに適量の水、さらに必要に応じて酵素反応に最
適なPHに調整した緩衝液、および耐熱製酵素もし
くはその固定化物を添加したのち、撹拌もしくは
振とうしながら不活性気体たとえば、窒素ガスな
どを吹き込みながら、50℃以上好ましくは、50〜
70℃まで昇温し、この状態で酵素反応を行わしめ
る。なお、糖脂質を前述の不活性有機溶媒に溶解さ
せ、水およびポリビニルアルコールやポリビニル
ピロリドンなどの非反応性乳化剤との共存下で、
常温活性の非耐熱性リパーゼを作用させても加水
分解反応は進行する。しかしながら、この方法で
は有機溶媒および乳化剤を使用することによる製
造コストのアツプがさけられず、また加水分解反
応に長時間を要し、経済的に不利である。これに
対し、本発明の方法では耐熱性酵素を用い、これ
が活性を示す程度の50〜70℃の加温処理のみで、
また糖脂質の融点がさらに高温の場合は50〜70℃
で溶解させるに必要最小限量の溶媒を使用するの
みで、酵素反応を容易に行わしめることができ
る。加水分解反応の進行状況は、遊離する脂肪酸
の中和価を測定することによりチエツクできる。
また本発明の方法によれば、化学反応による糖グ
リセロースまたはシアル糖グリセロールの製造法
に比較して温和な反応であり、また必要に応じて
基質特異性、例えば１，３−位置特異性のある酵
素、例えば前述の酵素のうちMucor miehei由来
のリパーゼ（ノボ・インダストリー社製）、
Penicillium cyclopium由来のリパーゼ（天野製
薬(株)製）などを用いれば生成物である糖グリセロ
ールまたはシアル糖グリセロールが単一組成の高
純度品として得られるなどの利点があり、さらに
適当な反応条件を設定するこによつても、これら
の生成物の組成を調整することも可能である。反応終了後、水層と油層を分離し、水層からは
必要に応じて吸着処理、溶剤分別処理、噴霧乾燥
処理などを行い、糖グリセロールまたはシアル糖
グリセロールをえることができる。また、油層中
には分離した脂肪酸が含まれており、これは前述
のごとく生理活性のある脂肪酸であり、吸着処
理、蒸留処理、溶剤分別処理などを行い、精製し
た高純度脂肪酸を得ることができる。 (e) 実施例実施例１溶剤分別、カラムクロマトグラフイーにより、
緑藻類の１種である海産性クロレラ細胞からガラ
クトースおよびエイコサペンタエン酸（C₂₀:₅ω
−３）からなる糖脂質、モノガラクトシル・ジエ
イコサペンタエン酸グリセリド（以下、MGDE
と略す）を単離した。融点は、48〜52℃であつ
た。撹拌機および冷却管付三ツ口フラスコ（１
）にMGDEG200ｇを採り、0.1Mリン酸緩衝水
溶液（PH7.0）200mlおよびシユードモナス・フル
オレツセンス（Pseudomonas fluorescens）由来
のリパーゼ（天野製薬(株)製・商品名「LipaseP」）
0.4ｇを添加した後、窒素ガスを吹き込みながら
撹拌しつつ55℃に加温した。この状態で反応を行
つたところ、３時間後の酸価はAV＝71.5となり、
７時間後にはAV＝135となつた。これにより、
３時間でMEDEG分子当り平均約１モル、７時間
で約２モルの脂肪酸が加水分解されたことを確認
した。７時間反応終了後、遠心分離法により水層
と油層を分離し、水層の水を留去して粘稠な液状
物を得た。本品は、これを酸加水分解し、酵素分
析した結果、モノガラクトシル・グリセリンであ
ることを確認した。他方、油層をメチルエステル
化し、GLC分析の結果からエイコサペンタエン
酸が高純度に生成していることを認めた。実施例２実施例１で調製したMEDEG200ｇ、0.05Mリ
ン酸緩衝液（PH6.5）50ml、ムコール・ミーハイ
（Mucor miehei）由来の１，３−位特異性のあ
る固定化リパーゼ（ノボ・インダストリー社製・
商品名「Lipase3A」）35ｇおよびｎ−ヘキサン50
mlを三角フラスコ（500ml）に採り、窒素ガスを
吹き込みながら、65℃に加温して５時間、振とう
して反応を行つた。反応後のAV＝65.0となり、
分子平均約１モルの脂肪酸が加水分解されたこと
を確認した。反応終了後、反応液をｎ−ブタノー
ル／水＝１／１で抽出し、溶剤（ｎ−ブタノー
ル）層の薄層クロマトグラフイーによりエイコサ
ペタエン酸およびモノガラクトシル・モノエイコ
サペンタエン酸グリセリドが生成していることを
確認した。比較例１実施例２において、ムコール・ミーハイ
（Mucor miehei）由来の１，３−位特異性のあ
る耐熱性固定化リパーゼの代わりにムコール・ミ
ーハイ（Mucor miehei）由来の同じく１，３−
位特異性のある非耐熱性リパーゼ（ノボ・インダ
ストリー社製・商品名「sp−225」）におきかえて
40℃で10時間反応を行つたところ、反応物中の遊
離脂肪酸の酸価測定値から算出した脂肪酸分解率
は10％となり、実施例２の場合の分解率46％（理
論分解率＝50％）に比較して反応の進行が遅かつ
た。実施例３糸状菌カニンガメラ・エレガンス
（cunninghamella elegane、NRRL1378）を培養
し、菌体から溶剤抽出してγ−リノレン酸
（C₁₈:₃ω−６）を主成分とする糖脂質を得た。
この糖脂質の構成脂肪酸はγ−リノレン酸のほか
にリノール酸、オレイン酸、ステアリン酸、パル
ミチン酸などの混合脂肪酸であり、構成糖はガラ
クトース、マンノース、グルコースなどの混合系
であつた。融点は、50〜55℃であつた。かかる糖
脂質を基質とし、この50ｇを実施例１と同様の反
応容器に採り、0.2M酢酸緩衝液（PH6.5）、10ｍ
Ｍ塩化カルシウムおよびヒユーミコラ・ラニユギ
ノサ（Humicola lanuginosa）由来のリパーゼ
（天野製薬(株)社製・商品名「LipaseCE」）２ｇを
添加し、窒素ガスを吹き込みながら撹拌して55℃
に加温して反応を行つた。反応物の酸価は５時間
後AV＝107、８時間後AV＝110となり、10時間
後に反応を停止した。反応終了後、反応物のケン
化価を常法により測定したところ、SV＝５とな
り、酵素反応によりほぼ完全に脂肪酸が加水分解
されていることを確認した。なお、反応物中の糖
および脂肪酸分析は実施例１記載の方法に準拠し
て行つた。実施例４糸状菌ペニシリウム・チアニウム
（Penicillium tianium、No.250−２株）は菌体内
にアラキドン酸（C₂₀:₄ω−６）を生合成する
（日本農芸化会昭和57年度大会講演要旨集、
p191）。同種株を用い、参考文献（Iizuka et al.
E.J.Appl.Micrbiol.Biotechnol.、７、173、
（1979））に準じた方法で培養し、菌体から溶剤抽
出して構成脂肪酸がアラキドン酸、リノレン酸、
リノール酸など、構成糖がカラクトース、グルコ
ールなどである糖脂質（融点50〜55℃）を得た。
この糖脂質５ｇを窒素雰囲気下にｎ−ヘキサン３
mlに溶解させ、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）、キ
ヤンデイダ・シリンドラセ（Candida
cylindracea）由来のリパーゼ（名糖産業(株)製・
商品名「リパーゼOF」）0.7ｇおよびケイソウ土
1.0ｇを添加し、50℃で実施例３と同様に反応を
行つた。7.5時間反応後の酸価はAV＝125となり、
実施例３記載の方法により加水分解がほぼ完全に
進行したことを確認した。また、反応物中の糖お
よび脂肪酸分析は実施例１に準じて行つた。実施例５ナタネ種子から、文献（日本生化学会編、生化
学実験講座３脂質の化学、p572（1974））の方
法に準拠してカラムクロマトグラフイーで糖脂質
（融点50〜60℃）を単離した。構成脂肪酸はリノ
ール酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン
酸など、構成糖はガラクトースが主体であり、モ
ノおよびジガラクトシルジグリセリドが主成分で
あつた。この糖脂質を用い、実施例４と同様に反
応を行い、約５時間後の脂肪酸分解率は96％であ
つた。反応物を実施例１と同様に処理し、水層か
らモノおよびジカラクトシル・グリセリンを、ま
た油層から上記と同様の脂肪酸混合物を得た。 (f) 発明の効果本発明は、天然物の生体から抽出されるグリセ
ロ糖脂質を耐熱性油脂加水分解酵素を用いて温和
な条件下で容易に脂肪酸を分解し、糖グリセロー
ルまたはアシル糖グリセロールに改質させる方法
であり、従来の化学的分解法もしくは合成法に比
較して熱履歴が極めて少なく、このため反応時の
重合、異性化、環化、分解などの副反応をほぼ完
全に抑制することができ、したがつて後処理とし
ての複雑な精製工程を必要とせず、また生成物で
ある糖グリセロールまたはアシル糖グリセロール
は品質の優れたものであり、化粧品、医薬品をは
じめ、安全性が高度に要求される分野への乳化
剤、界面活性剤としての利用に適するものであ
る。また、本発明の方法によれば、従来の酵素法に
よる反応に比べて有機溶剤や乳化剤といつた副原
料を必要とせず、しかも短時間に容易にさらにほ
ぼ完全に反応を進行させることができ、経済的メ
リツトは大きい。さらに本発明の方法では生理活性性のある高度
不飽和脂肪酸を劣化を伴わず分離することが可能
である。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の式（）〜（）で表わされるグリセ
ロ糖脂質の１種または２種以上に耐熱性油脂加水
分解酵素を作用させることを特徴とする糖グリセ
ロールまたはアシル糖グリセロールおよび脂肪酸
の製造法。【式】【式】【式】【式】（式中、R₁およびR₂はともに炭素数７〜23の飽
和または不飽和脂肪酸残基であり、Ｇは単糖類ま
たはその二量体の残基である。）２ R₁およびR₂のうちすくなくとも１つはエイ
コサペンタエン酸、γ−リノレン酸またはアラキ
ドン酸のいずれかの残基を含むものである特許請
求の範囲第１項記載の製造法。３グリセロ糖脂質が微生物、藻類、魚類、高等
動植物などの天然物由来の脂質中に含まれている
ものである特許請求の範囲第１項記載の製造法。４耐熱性油脂加水分解酵素が50℃以上でも活性
のある耐熱性リパーゼである特許請求の範囲第１
項記載の製造法。５耐熱性リパーゼが固定化物である特許請求の
範囲第４項記載の製造法。