JPH01257490A - コバルトフリーコリノイドの製造法 - Google Patents
コバルトフリーコリノイドの製造法Info
- Publication number
- JPH01257490A JPH01257490A JP8674788A JP8674788A JPH01257490A JP H01257490 A JPH01257490 A JP H01257490A JP 8674788 A JP8674788 A JP 8674788A JP 8674788 A JP8674788 A JP 8674788A JP H01257490 A JPH01257490 A JP H01257490A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cfc
- cobalt
- methanosarcina
- culture
- corrinoid
- Prior art date
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、コバルトフリーコリノイド（以下、ＣＦＣと
略す）の製造法に関する。
略す）の製造法に関する。
ＣＦＣはビタミンＬｘ合成の前駆体であり、ビタミンＢ
、ｔの金属アナログ合成の出発原料として、あるいは、
ビタミンＬｘの代謝拮抗物質として興味の持たれている
化合物である。
、ｔの金属アナログ合成の出発原料として、あるいは、
ビタミンＬｘの代謝拮抗物質として興味の持たれている
化合物である。
ＣｌＩＣの存在は、１９６５年、トウーヘイにより初め
て光合成細菌であるクロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕ
ｍ）から、分離、報告されたが、これまでに、光合成細
菌であるロドスピリラム（Ｒ１＋ｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌ
ｕｍ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ）属や、放線菌ストレプトマイセス・オ
リヴアセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｓ＋ｙｃｅｓ ｏｌｉｖ
ａｃｅｕｓ）゛から単離されているに過ぎず、その他の
菌株からは単離されていない。
て光合成細菌であるクロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕ
ｍ）から、分離、報告されたが、これまでに、光合成細
菌であるロドスピリラム（Ｒ１＋ｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌ
ｕｍ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ）属や、放線菌ストレプトマイセス・オ
リヴアセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｓ＋ｙｃｅｓ ｏｌｉｖ
ａｃｅｕｓ）゛から単離されているに過ぎず、その他の
菌株からは単離されていない。
このようにｃｐｃを生産する菌株の種類は少なく、また
、従来知られている菌株から得られるＣＦＣは極めて微
量であるため、工業的な技術の確立が望まれている。
、従来知られている菌株から得られるＣＦＣは極めて微
量であるため、工業的な技術の確立が望まれている。
本発明者らは、ＣＦＣを高濃度に生産できる微生物を得
ることを目的に鋭意研究した結果、メタノサルシナ属に
属する微生物がコバルトを含まない培地で培養するとＣ
ＦＣを培地中に蓄積生産することを見出し本発明を完成
した。
ることを目的に鋭意研究した結果、メタノサルシナ属に
属する微生物がコバルトを含まない培地で培養するとＣ
ＦＣを培地中に蓄積生産することを見出し本発明を完成
した。
即ち、本発明は、メタノサルシナ属に属し、ＣＦＣを生
産する能力を有する微生物を培養し、ＣＦＣを生成させ
、これを採取することを特徴とするＣＦＣの製造法を提
供するものである。
産する能力を有する微生物を培養し、ＣＦＣを生成させ
、これを採取することを特徴とするＣＦＣの製造法を提
供するものである。
本発明に使用される微生物は、メタノサルシナ属に属し
、ｃｐｃを生産する能力を有する微生物であれば、野生
株、変異株、細胞融合あるいは遺伝子組み換えその他の
遺伝的手法によって得られる株のいずれのものでもよい
、その−例として、ＤＳＭ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａ
ｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍ）ｋｒｏｏｒ−ｇａｎｉｓｍ
ｅｎ）より入手可能なメタノサルシナ バーケリ（Ｍｅ
ｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ） ＤＳＭ
８０４を挙げることができる０本国の菌学的性質は、
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。
、ｃｐｃを生産する能力を有する微生物であれば、野生
株、変異株、細胞融合あるいは遺伝子組み換えその他の
遺伝的手法によって得られる株のいずれのものでもよい
、その−例として、ＤＳＭ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａ
ｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍ）ｋｒｏｏｒ−ｇａｎｉｓｍ
ｅｎ）より入手可能なメタノサルシナ バーケリ（Ｍｅ
ｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ） ＤＳＭ
８０４を挙げることができる０本国の菌学的性質は、
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。
第８版に記載されている。
本発明において、培地としては、炭素源、窒素源、イオ
ウ源、無機塩、更に必要に応じて他の栄養素、微量要素
等を添加して、嫌気的雰囲気にした培地が使用される。
ウ源、無機塩、更に必要に応じて他の栄養素、微量要素
等を添加して、嫌気的雰囲気にした培地が使用される。
炭素源としては、メタノール、炭酸ガス、酢酸、メチル
アミン等が使用されるが、メタノールが特に好ましく、
その濃度は２ ｖ／ｖ％以下が好ましい、メタノール濃
度が高まると微生物の生育を阻害するので、培養中のメ
タノール濃度を０．０５〜１ ｖ／ｖ％に維持し、逐次
メタノールを添加し培養することもできる。
アミン等が使用されるが、メタノールが特に好ましく、
その濃度は２ ｖ／ｖ％以下が好ましい、メタノール濃
度が高まると微生物の生育を阻害するので、培養中のメ
タノール濃度を０．０５〜１ ｖ／ｖ％に維持し、逐次
メタノールを添加し培養することもできる。
窒素源としては、通常の微生物の培養に用いられる硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム
、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等が挙げら
れる。
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム
、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等が挙げら
れる。
無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、セレン
酸ナトリウム、塩化マンガンなどの他、亜鉛、ホウ酸、
銅、ニッケル、モリブデンなどの添加も有効である。
塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、セレン
酸ナトリウム、塩化マンガンなどの他、亜鉛、ホウ酸、
銅、ニッケル、モリブデンなどの添加も有効である。
微量要素としては、ビオチン、葉酸、ビタミンＢ１、Ｂ
８、Ｂ１、ニコチン酸、パントテン酸、ｐ−アミノ安息
香酸、リボ酸などのビタミン類が用いられるほか、天然
の栄養源としてコーン・ステイープ・リカー、酵母エキ
ス、ペプトン等も添加できる。
８、Ｂ１、ニコチン酸、パントテン酸、ｐ−アミノ安息
香酸、リボ酸などのビタミン類が用いられるほか、天然
の栄養源としてコーン・ステイープ・リカー、酵母エキ
ス、ペプトン等も添加できる。
コバルトは、菌体を増殖させる時点では培地中に添加し
ても差し支えないが、ＣＦＣを生産する時点ではコバル
トイオンを培地中から完全に除く必要がある。
ても差し支えないが、ＣＦＣを生産する時点ではコバル
トイオンを培地中から完全に除く必要がある。
本発明における培養は、嫌気的に行う必要がある。培養
を嫌気的に行うには、培地中にＬ−システィン、チオ硫
酸ナトリウム、クエン酸チタニウムなどの還元剤を加え
るほか、酸素を除去した窒素ガスや炭酸ガス、あるいは
これらの混合気体を培地中に通気し、更に培養容器の気
相中に酸素が混入しないようにする方法が可能である。
を嫌気的に行うには、培地中にＬ−システィン、チオ硫
酸ナトリウム、クエン酸チタニウムなどの還元剤を加え
るほか、酸素を除去した窒素ガスや炭酸ガス、あるいは
これらの混合気体を培地中に通気し、更に培養容器の気
相中に酸素が混入しないようにする方法が可能である。
培養の形式としては、回分培養法でもよいが、生産の効
率化のためには担体に菌体を固定させ、培地を連続的に
供給する方法が好ましい、固定化に用いる担体としては
、微生物が付着できる多孔性の担体であればいかなる種
類のものでも用いることが可能であるが、具体的には、
発泡煉石、シリカ多孔質が挙げられる。
率化のためには担体に菌体を固定させ、培地を連続的に
供給する方法が好ましい、固定化に用いる担体としては
、微生物が付着できる多孔性の担体であればいかなる種
類のものでも用いることが可能であるが、具体的には、
発泡煉石、シリカ多孔質が挙げられる。
培養温度は２５〜５０℃で行うが、３０〜３７℃が好ま
しい、培養ｐＨは５．８〜７．０、好ましくは６．３〜
６．８に調節する。培養は通常３〜８日で終了するが、
他の培養条件に応じて適当に変えることができる。
しい、培養ｐＨは５．８〜７．０、好ましくは６．３〜
６．８に調節する。培養は通常３〜８日で終了するが、
他の培養条件に応じて適当に変えることができる。
培養物からのＣＦＣの採取は通常の方法で実施できる０
例えば、培養物を遠心分離して菌体を除去し、よ清をｐ
Ｈ３，’０に調整した後、アンバーライト（Ａｍｂｅｒ
ｌｉｔｅ） ＸＡＤ −２に吸着させ、２０％ターシャ
リ−ブチルアルコールで溶出し溶剤を除去した後、ＤＥ
ＡＥ−セルロースなどの陰イオン交換樹脂、ＣＭ−セル
ロースなどの陽イオン交換樹脂を用いて分画していけば
よい、 ＣＦＣには７個の側鎖があるため、これらの手
段を繰り返し実施することにより、特定のｃＦｃを得る
ことができる。
例えば、培養物を遠心分離して菌体を除去し、よ清をｐ
Ｈ３，’０に調整した後、アンバーライト（Ａｍｂｅｒ
ｌｉｔｅ） ＸＡＤ −２に吸着させ、２０％ターシャ
リ−ブチルアルコールで溶出し溶剤を除去した後、ＤＥ
ＡＥ−セルロースなどの陰イオン交換樹脂、ＣＭ−セル
ロースなどの陽イオン交換樹脂を用いて分画していけば
よい、 ＣＦＣには７個の側鎖があるため、これらの手
段を繰り返し実施することにより、特定のｃＦｃを得る
ことができる。
以下、実施例を以て本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。
発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
メタノサルシナ バーケリＤＳＭ８０４を図−１に示し
た装置を用い、表−１に示す培地を供給し培養した。即
ち、バイオリアクター３内にメタノサルシナ バーケリ
ＤＳＭ８０４を固定した発泡煉石４を充填し、培地１を
ポンプ２により供給した。尚、５は溶出液、６はガスホ
ルダーである。
た装置を用い、表−１に示す培地を供給し培養した。即
ち、バイオリアクター３内にメタノサルシナ バーケリ
ＤＳＭ８０４を固定した発泡煉石４を充填し、培地１を
ポンプ２により供給した。尚、５は溶出液、６はガスホ
ルダーである。
徐々に希釈率を増加させ、希釈率１０．４％／日でコリ
ノイドの生産性は７．５ｍｇ／ ｌに達した。
ノイドの生産性は７．５ｍｇ／ ｌに達した。
続いて表−１からコバルトイオンを除いた培地を同じ希
釈率で連続供給した。溶出液２０ｆを除菌し、ｐｎを３
に調整後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ −２に吸着さ
せ、２０％ターシャリ−ブチルアルコールで溶出した。
釈率で連続供給した。溶出液２０ｆを除菌し、ｐｎを３
に調整後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ −２に吸着さ
せ、２０％ターシャリ−ブチルアルコールで溶出した。
溶出液からターシャリ−ブチルアルコールを除去した後
、ＤＥＡＥ−セルロースによる精製を実施した。 ＤＥ
ＡＥ−セルロースに吸着しなかった部分は、聞−セルロ
ースで生成し、非吸着部分は再度Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ
ＸＡＤ −２に吸着させ、１０％ターシャリ−ブチルア
ルコールで溶出した（これをＣＦＣ−３画分とする）。
、ＤＥＡＥ−セルロースによる精製を実施した。 ＤＥ
ＡＥ−セルロースに吸着しなかった部分は、聞−セルロ
ースで生成し、非吸着部分は再度Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ
ＸＡＤ −２に吸着させ、１０％ターシャリ−ブチルア
ルコールで溶出した（これをＣＦＣ−３画分とする）。
ＣＭ−セルロースに吸着した成分は水で溶出しくこれを
ＣＦＣ−１画分とする）、このＣＦＣ−１画分を２％酢
酸で溶出した後、再度Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ −
２、ＤＥＡＥ−セルロースで精製した（これをＣＦＣ−
２画分とする）。
ＣＦＣ−１画分とする）、このＣＦＣ−１画分を２％酢
酸で溶出した後、再度Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ −
２、ＤＥＡＥ−セルロースで精製した（これをＣＦＣ−
２画分とする）。
一方、ＤＥＡＥ−セルロースに吸着した画分は、０．５
Ｎ酢酸で溶出した後、再度Ａｌｌ１ｂｅｒｌｉｔｅ Ｘ
ＡＤ −’２ 、ＤＥＡＥ−セルロースで精製した（こ
れをＣＦＣ−４〜９両分とする）。これらの画分は、濾
紙クロマトグラフィ、濾紙電気泳動により分析を行った
。
Ｎ酢酸で溶出した後、再度Ａｌｌ１ｂｅｒｌｉｔｅ Ｘ
ＡＤ −’２ 、ＤＥＡＥ−セルロースで精製した（こ
れをＣＦＣ−４〜９両分とする）。これらの画分は、濾
紙クロマトグラフィ、濾紙電気泳動により分析を行った
。
単離されたＣＦＣの合計量は８．９μ９／Ｉ！であり、
その内訳は表−２に示した通りである。
その内訳は表−２に示した通りである。
尚、ＣＦＣ−１〜９の濾紙クロマトグラフィの結果を表
−３に、濾紙電気泳動の結果を図−２に示した。
−３に、濾紙電気泳動の結果を図−２に示した。
表 −１
イミダゾール ２．７３ ｇ
ＫＪＰＯｎ ０．７０ ｇＫ）ｌｚＰ８４
０．４５ ｇ ＮＨ４Ｃ１１，００ｇ ＭｇＳＯ，・７Ｈｚ０ １．００ ｇＮａＣｌ
２．２５ ｇＣａＣｌｇ ” ２Ｈｚ０
０．２５ ｇビタミン溶液＄′２０Ｉｌｊ ミネラル溶液”６ａＺ ＣｏＣ１ｚ・６Ｈｔ０ ９．６ １ｇクエン酸チ
タニウム ０．０７５麟−０ＩＬ−システィン・塩酸
０．３ｇ メタノール ８ｇ ｐＨ６，７ 注） ＊１：ビタミン溶液 ビオチン ２ ｔａｇ葉 酸
２ ｍｇピリドキシン・塩酸
１０ ｒａｇチアミン・塩酸 ５１１ｇ リボフラビン ５ ｍｇニコチン酸
５Ｉ１ｇ パントテン酸カルシウム ５ Ｂ ｐ−アミノ安息香酸 ５ＩＬｇ リポ酸 ５ Ｂ ＊２：ミネラル溶液 Ｚｎ５Ｏａ ・ＩＨｚ８ ０．１ ｇＭＩＩ
Ｃ１４・４Ｈ！ＯＯ，０３ｇ Ｈ３ＢＯ４０，３ｇ ＣｕＣｌｇ ・２ＨｔＯＯ，０１ｇ ＮｉＣｌｚ・６１ｈ０ ０．０２ ｇ表 −
２ＣＦＣ生産量 表 −３濾紙クロマトグラフィー結果（発明の効果〕 本発明によりＣＦＣを効率よく得ることができる。
０．４５ ｇ ＮＨ４Ｃ１１，００ｇ ＭｇＳＯ，・７Ｈｚ０ １．００ ｇＮａＣｌ
２．２５ ｇＣａＣｌｇ ” ２Ｈｚ０
０．２５ ｇビタミン溶液＄′２０Ｉｌｊ ミネラル溶液”６ａＺ ＣｏＣ１ｚ・６Ｈｔ０ ９．６ １ｇクエン酸チ
タニウム ０．０７５麟−０ＩＬ−システィン・塩酸
０．３ｇ メタノール ８ｇ ｐＨ６，７ 注） ＊１：ビタミン溶液 ビオチン ２ ｔａｇ葉 酸
２ ｍｇピリドキシン・塩酸
１０ ｒａｇチアミン・塩酸 ５１１ｇ リボフラビン ５ ｍｇニコチン酸
５Ｉ１ｇ パントテン酸カルシウム ５ Ｂ ｐ−アミノ安息香酸 ５ＩＬｇ リポ酸 ５ Ｂ ＊２：ミネラル溶液 Ｚｎ５Ｏａ ・ＩＨｚ８ ０．１ ｇＭＩＩ
Ｃ１４・４Ｈ！ＯＯ，０３ｇ Ｈ３ＢＯ４０，３ｇ ＣｕＣｌｇ ・２ＨｔＯＯ，０１ｇ ＮｉＣｌｚ・６１ｈ０ ０．０２ ｇ表 −
２ＣＦＣ生産量 表 −３濾紙クロマトグラフィー結果（発明の効果〕 本発明によりＣＦＣを効率よく得ることができる。
図−１は実施例１において用いた装置の略示図、図−２
は、実施例１のＣＦＣ−１〜９の濾紙電気泳動の結果を
示した図である。 １：培地 ２：ポンプ ３：バイオリアクター ４：発泡煉石 ５：溶出液 ６：ガスホルダー 出願人代理人 古 谷 馨 図−１
は、実施例１のＣＦＣ−１〜９の濾紙電気泳動の結果を
示した図である。 １：培地 ２：ポンプ ３：バイオリアクター ４：発泡煉石 ５：溶出液 ６：ガスホルダー 出願人代理人 古 谷 馨 図−１
Claims (1)
- メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属に
属し、コバルトフリーコリノイドを生産する能力を有す
る微生物を培養し、コバルトフリーコリノイドを生成さ
せ、これを採取することを特徴とするコバルトフリーコ
リノイドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8674788A JPH01257490A (ja) | 1988-04-08 | 1988-04-08 | コバルトフリーコリノイドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8674788A JPH01257490A (ja) | 1988-04-08 | 1988-04-08 | コバルトフリーコリノイドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01257490A true JPH01257490A (ja) | 1989-10-13 |
Family
ID=13895370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8674788A Pending JPH01257490A (ja) | 1988-04-08 | 1988-04-08 | コバルトフリーコリノイドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01257490A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5230783A (en) * | 1991-05-15 | 1993-07-27 | The Dow Chemical Company | Electrolytic cell and process for the labeling of proteins and peptides |
-
1988
- 1988-04-08 JP JP8674788A patent/JPH01257490A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5230783A (en) * | 1991-05-15 | 1993-07-27 | The Dow Chemical Company | Electrolytic cell and process for the labeling of proteins and peptides |
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