JPH012578A - 新規なｄｎａ鎖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はプロモーター機能を有するＤＮＡ　ｉｉｉに関
するものである．さらに詳しくは、ダイズ種子貯蔵タン
パク質であるグリシニンの中間サブユニット＾２Ｂ１．
をコードする遺伝子に由来するＤＮＡ　Ｍ４及びこれと
実質的に相同な塩基配列を有するＤＮＡ鎖に関するもの
である。

［従来の技術、発明が解決しようとする問題点］近年、
種子貯蔵タンパク質の生合成，アミノ酸配列．プロセシ
ング等に関する研究が注目されている． ダイズ種子貯蔵タンパク質の大半は塩可溶性のグロプリ
ンで、これが完熟種子中の全タンパク質の７０−１１０
％を占めている．こめグロプリンを超遠心分離処理する
と、フＳ成分であるコングリシニンとＩＩｓ成分である
グリシニンとに分かれる．グリシニンは分子量３．８　
Ｘ　１０’で、酸性サブユニット（Ａ）群６個（Ａ　ｒ
　ａ　．八ｌｂ＋＾２．＾ｓ，　Ａ４．　Ａｌｌ）と塩
基性サブユニット（Ｂ）群５個（Ｂ＋−．　Ｂｉｂ．　
Ｂ２　．Ｂｓ．Ｂ４）　　とからなる両サブユニットが
ジス−ルフィド結合した５種の中間サブユニット　（Ａ
ＩａＢ２＋＾１ｂＢｌｂ＋＾２ＢＩＭ＋＾３Ｂ４．　Ａ
ＳＡ４Ｂ３）の６量体から構成され、種子の子葉細胞中
のプロテインボディー（タンパク質顆粒）中に存在して
いる。

グリシニンタンパク質の生合成に関する研究によると、
グリシニンタンパク質はＮ末端側からシグナルペブチド
ー酸性サブユニットー塩基性サブユニットの順序で連結
したグリシニン前駆体タンパク買として翻訳される。こ
の前駆体のシグナルペプチド部分は小胞体で、ｃｏ−ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌに切断され、その結果生じる
酸性サブユニットー塩基性サブユニットからなるポリペ
ブチドはさらに各サブユニットに切断され両ユニットが
ジスルフィド結合した中間サブユニットが形成される。

先に本発明者は、グリシニン前駆体タンパク質をコード
するｃＤＮ＾５ｆ！ｊをクローニングし、その塩基配列
を解析してグリシニンの各中間サブユニツトのアミノ酸
配列を明らかにした。

グリシニン前駆体タンパク買をコードしている各遺伝子
は種子の登熟期に急激に、しかも極めて強く発現してい
るので、これらの遺伝子の転写をコントロールしている
プロモーターは、遺伝子組換え技術において宿主細胞、
特に植物細胞中に外来遺伝子を導入し、これを強力に発
現させる場合に有効に利用することが期待されるが、こ
れまでのところこれらのプロモーターに関する報告例は
見当らない． ［問題点を解決するための手段］ 本発明は、グリシニンを構成している５種の中間サブユ
ニットの遺伝子群の中でも発現量の多い＾２Ｂ１，をコ
ードする遺伝子をダイズの染色体ライブラリーよりクロ
ーニングし、そのプロモーター部分を特定化することに
よって完成されたものである． すなわち本発明は、プロモーター機能を有し、かつ表１
に示す塩基配列の少なくとも一部の、または少なくとも
一部と実質的に相同な塩基配列を有することを特徴とす
るＤＮＡ　鎖である．１−ユ ５′−＾ＴＡＴＡＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＴＡＴＴＣＴＣ
ＴＡＣＴ＾＾ＴＣＴＴＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＡＡＡＣＣ
ＡＡＡＧＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣＴＡＡＴ
Ｔ＾＾ＡＴＴＡＡＡＡＡＡ＾ＡＴＴＧＡＧＴ＾＾ＣＴＡ
ＧＴＡＴＣＡＣＡＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＡＡＡＣ
ＣＡＴＧ＾＾Ｔ＾ＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＣＡＴ＾＾ＣＡ
ＣＣＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＣＣＴＡＧＡＧ
ＴＧＡ　Ｇ　ＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＡ　Ｃ　ＧＧ　Ｃ
　Ｃ　ＣＴＴＣＴＴＣＴ　ＣＡ　ＣＴＴＴＧＡ　Ｇ　Ｇ
ＡＴＣＣ　Ｃ＾ＴＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡ
ＴＴＣＡＴＡＴＡＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＣＡＴＡ＾＾
ＣＣＣＧＣＧＡＡＣＡＴＧ＾＾＾ＴＧＡＡＡ（：ＣＡＴ
ＧＧＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＧＴＴＴＴＣ
ＴＧ　Ｇ　ＣＡＡＴＴＧ　ＣＡＴ　Ｇ　ＣＡＡＴＡ　Ｃ
ＡＡＡ　ＣＡ　ＣＡ　ＣＴＴＧ　ＧＴＡＴＴＴＧＴＣ＾
ＣＡＴＡＡＴＧＴＴＧＡＴＧＴＣ　ＧＡＡ　ＣＴＧＴＣ
　ＧＡＡ　ＧＣ　ＣＡ　Ｃ　ＣＴＣＡ　ＣＡＣ　Ｃ　Ｃ
ＡＴＧＡＡＣＴＴ＾＾ＴＧＡＧＧＴＧＴ＾＾ＣＡＣＡＣ
ＡＡＧＧＣＴＴＣＣＡＴＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴＡＣＴＧ
ＡＡ　ＧＡＡＴＧＴＣＴＣＡＡＧ　ＣＴＣＡ　ＧＣＡ　
Ｃ　ＣＣ　ＧＡ　ＣＴＣ　ＣＴＧＴＧＡ　Ｃ　ＧＴＧＴ
ＣＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＴＣＣＣ
ＴＡＴＡ＾＾Ｔ＾＾ＣＣＡＣＧＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＴ
ＣＣＧＣＴＴ−３’ 本発明のＤＮＡ　！Ｉはプロモーター機能を有し、かつ
表１に示す塩基配列の少なくとも一部の、または少なく
とも一部と実質的に相同な塩基配列を有することを特徴
とするＤＮＡ　鎮である。ここでｒＤＮＡ鎖Ｊとは、あ
る長さを有するポリデオキシリポ核酸の相補的２本鎖を
意味するものであって、特許請求の範囲および表１にお
いては、このＤＮＡ　ｖＡが１本の相補鎖を省略した形
で記載されていることは言うまでもない．また、「プロ
モーター機能」とは、ＤＮＡからＲＮＡへの転写を開始
させるための信号機能をいう。

さらに本発明のＤＮＡ鎖は、基本的には表１に示す５３
５塩基対の塩基配列を有するものであるが、プロモータ
ー機能を有する限りにおいてはその塩基配列の少なくと
も一部を有するものもしくはこれと実質的に相同な塩基
配列を有するものをも含むものである．実質的に相同な
塩基配列とは、プロモーター機能を有する限り塩基配列
のいくつかについて欠失，置換．付加等があってもよい
ことを示すものである。

本発明のＤＮＡ　Ｍ４は、化学合成法．ダイズの染色体
遺伝子ライブラリーよりのクローニング等合目的的な任
意の方法によって得ることができる。

本発明者は、ダイズの染色体遺伝子ライブラリーより、
グリシニンの中間サブユニットＡ２Ｂｌａをコードする
遺伝子をそのｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニング
することにより取得した（後記実施例参照）が、その構
造は第１図に示す通りであった。

すなわち、中間サブユニット＾２Ｂ１！の遺伝子は、３
個のイントロンと４個のエキソンで構成されており、４
８５個のアミノ酸からなるグリシニンＡ２Ｂ１ｍの中間
サブユニット前駆体をコードしている。第１図中、ＯＮ
Ｏのフラクションはシグナルペプチド、ＯＮＯのフラク
ションはＡ２Ｂｌ−の中間サブユニットをコードしてお
り、この中間サブユニットは「暮」で示した部位で５′
側のＡ２サブユニットと３′側のＢ１ｍサブユニットと
に切断される。また、ＯＮＯのフラクションがｍＲＮ＾
に転写されることがＳＩマツピングにより確認されてい
る。■〜■のフラクションが本発明のＤＮＡ　Ｍ４であ
るが、この塩基配列の中には真核生物のプロモーターの
構成要素であるＴＡＴＡｂｏｘが含まれている。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１　ダイズ染色体ＤＮＡの調製 凍結乾燥したダイズ（品ａ！＝ボンミノリ）の葉１〜５
ｇを液体窒素存在下で乳鉢で粉砕した。これを５０ｍｊ
のポリプロピレン製遠心管に移し、１５ｍ１！の５０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ（ｐＨ８，０）、　０．７Ｍ　
　ＮａＣＲ，１０ｍＭＥＤＴ＾、１％ＣＴＡＢ　（セチ
ル・トリメチル・アンモニウムブロマイド）、１％メル
カプトエタノールよりなる！ｌ衝液液中懸濁した。これ
を５６℃で２０分間加温しながら温和に懸濁し、２５℃
に冷却した後、１５ｍＪのクロロホルム、イソアミルア
ルコール（２４：１）混合液を加え、温和に乳濁させた
。８０００　ｘｇで２０℃にて１０分間遠心分離し、水
層を回収後、再度クロロホルム、イソアミルアルコール
による抽出を行ない水層を回収した。得られた水層に１
．５１１１の１０％ＣＴＡＢ、　０．７Ｍ　　ＮａＣｌ
！溶液を加えて混合後、１部１ｍｌの５０ｍＭ　　Ｔｒ
ｌｓ−ＨＣｊ（ｐＨ８，０）、　１０ｍＭＥＤＴＡ、　
１％ＣＴＡＢ溶液を加え混合し、２５℃で３０分間放置
した。これを１５００ｘ　ｇで２０℃にて１５分間遠心
分離し、上清を完全に捨てて沈殿を回収した。

沈殿に７ｍｊの５０％Ｃ５Ｃｊ　（ｗ／ｗ）溶液を加え
完全に溶かした後、４００Ｉ＆ｊのＩＯＢ／ｍＪのエチ
ジウムブロマイド溶液を加えて混和後、日立ＲＰ　ＳＳ
Ｔローターで２０℃にて４４０００回転で２６時間遠心
分離を行なった。遠心分離後、ＵＶハンド干二ターによ
りＤＮＡを含むフラクションをパスツールピペットで回
収した。回収したＤＮＡ溶液に、２０倍希釈ＳＳＣ溶液
（３Ｍ　、　ＮａＣｊ、　０．３　Ｍクエン酸ナトリウ
ム）で飽和したイソプロパツールを３ｆｆｌｊ加え混和
し、エチジウムブロマイドをイソプロパツール抽出によ
り除去した。この抽出操作を５回行なった後、水層を透
析膜に穆し、ｔＪ２の１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−４１Ｃｊ
（ｐＨ８，０）。

１　ｍＭ　　ＥＤＴＡに対して３回透析を行なった。凍
結乾燥葉１ｇから２５０〜３００．ｇの染色体ＤＮＡを
得た。

実施例２　ダイズ遺伝子ライブラリーの作成実施例１で
得られたダイズ染色体ＤＮ＾５０．ｇを１０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ（ｐＨ７，５）、７ｍＭ　　ＭｇＣｊ、
、　１００ｍＭＮａＣ４＋を含む！ｌ衝液液中制限酵素
ＩＡｂｏｌ　（宝酒造社製）１００ユニツトで部分分解
した後、これをシミ１ｍ密度勾配溶液　（２０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐＨ７，５）　。

１　Ｍ　ＮａＣｊ、　１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１０〜４
０％４０％シミに重層し、日立Ｉ’５４ＧＴ　Ｏ−ター
”ｔ”　２８００（１回転、２０℃にて１６時間遠心分
離した。　０５＋＋＋ｊづつ分画したフラクションの１
部を０．８％アガロースゲル電気泳動によりｔｓｉ＜ｂ
ｐ　〜２０Ｋｂｐ　１７）ＤＮ＾断片２ＩＬｇを得た。

次にこのＤＮＡ断片１　ｈｇとλファージベクターＥＭ
ＢＬ３　　（プロメガ社製）のアーム１終ｇとをＴ４　
ＤＮ＾リガーゼ（宝酒造社製）により連結を行ない、Ｅ
ＭＢＬ３のＢａｍＨＩ切断部位にダイズ染色体ＤＮＡが
挿入されたハイブリッドＤＮＡを得た。連結反応は６８
ｍＭ　　　Ｔｒｌｓ−ＨＣ＋Ｉ’　　（ｐＨ７，６）、
　　［ｉ、６ｍＭ　　　ＭｇＣｊｚ、　　ｌＱｍＭＤＴ
Ｔ、　６６終Ｍ　　ＡＴＰを含む溶液中で１２℃にて１
２時間行なった。得られたハイブリッドＤＮＡについて
１ｎｖｉｔｒｏバツケーにット（ギガバック；プロメガ
社製）を用いてｉｎ　ｖｌｔｒｏパッケージング［Ｂｅ
ｃｋｅｒ。

Ａ　＆　Ｍ、　Ｇｏｌｄ；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃ
ａｄ、　Ｓｃ１．７２．５８１（１９７５）］　を行な
い、ダイズ遺伝子ライブラリー（３，Ｏｘ　１０′ＰＦ
ｔｌ／ｐｇ）とした。

実施例３　グリシニン遺伝子のスクリーニング前記実施
例２で得られたダイズ由来のＤＮＡを含むＥＭＢＬ３フ
１−ジの集合である遺伝子ライブラリーを大腸菌ＬＥ　
３９２　（Ｆ−、ｈｓｄＲ５１４（Ｙ　ｋ−。

ｍｌ（−）、　５ｕｐＥ４４．５ｕｐＦ５８．　ｊａｃ
Ｙｌ、　ｇａｊＫ２．　ｇａｊＴ２２゜ｍｅｔａｌ、　
ｔｒｐＲ５５，λ−）に感染させ、プラークを形成させ
た。大腸菌ＬＥ３９２はプロメガ社製を用いた。

得られたプラークからグリシニン遺伝子を含むクローン
は、プラークハイブリダイゼーション法［Ｂｅｎｔｏｎ
、　Ｗ、Ｄ、＆　Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ；　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　１９６，１８０（１９７７）］　を使用して、ニッ
クトランスレーションキット（アマジャムジャパン社製
）で３２ｐ標識したグリシニンＡ２Ｂ１１１サブユニツ
トｃＤＮＡ［Ｍｏａ＋＋ａａ、　Ｔ。

ｅｔ　ａｌ；　ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ５，１８８：１
１７（１９８５）］　で選択した。グリシニンＡ２Ｂ１
ｍサブユニットｃＤＮ＾とハイブリダイズしたプラーク
については、グリシニンＡ２ＢＩａの＾２サブユニット
のＮ−末端より６番〜１１番目のアミノ酸配列に対応す
る化学合成りＮＡ［Ｍｏｍａ＋ａ、　Ｔ、ａｔ　ａｌ；
　ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ５，１８８：１１７（１９８
５）］を３２ｐで標識したものをプローブとして再度プ
ラークハイブリダイゼーションを行ない最も強くパイプ
リダイゼーションシグナルを示したものを選択した。

実施例４　グリシニンＡ２Ｂ１ｍ’遺伝子を含むファー
ジＤＮＡの調製 前記実施例３で得られたファージ（２Ｘ　１０’個）を
８０ｍｊ　　ＴＹＥ培地［Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ｅ
ｔ　ａｔ；Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ″Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏ。

（１９８２）］で増殖させた大腸菌ＬＥ３９２に室温で
２０分間吸着させた。

次に、これを４ｊ！のＴＹＥ培地に移植し、３７℃で６
〜８時間培養し、ライセードを得た。ライセードを６０
００Ｘ　ｇ　、　４℃にて１０分間遠心分離し、上清を
０．５　Ｍ　　ＮａＣｌ、　１０％ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）　８００Ｇになるように調整し、０℃で
１時間放置することによりファージとＰＥＧとの共沈殿
を形成させた。この沈殿を６０００Ｘｇ、４℃にて１０
分間遠心分離を行なって回収し、２ＱｍＲの５０ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ（ｐＨ７，５）、　１０ｍＭ　　Ｍ
ｇＳＯ４ＭＡ街液に懸濁した。このファージ・ＰＥＧ懸
濁液に２０ｍＲのクロロホルムを加え混和後、２０００
Ｘｇ、４℃にて１０分間遠心分離を行ない、水層とクロ
ロホルム層を分離し、水層を回収した。この操作を繰り
返し、ファージ懸濁液を塩化セシウムのステップ密度勾
配液（ＳＯ＋＊ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７，５）、
　１０ｍＭ　　ＭｇＳＯ４，１，７ｇ／ａｊ　Ｃ５Ｃｊ
−ｔ、５ｇ／ａｊＣｓＣｊ−１，４５ｇ／ｅｊ　Ｃ５Ｃ
ｊ）に重層し、日立ＲＰＳ　４０Ｔローターで２２００
０回転、４℃で２時間遠心分離した。ファージをパスツ
ールピペットで回収後、透析膜に容し、５０５Ｍ　　Ｔ
ｒｉｓ−）ＩＣｊ　（ｐＨ７，５）。

１０ｍＭ　　ＭｇＳＯ４溶液２１に対して透析を行なっ
た。

得られたファージ懸濁液にＤＮａｓｅ　Ｉ　（宝酒造社
製）、　ＲＮａｓｅＡ　　（ファルマシア社製）をそれ
ぞれ１　ｇｇ／ｌａｊおよび１０ｘｇ／ｓｊの濃度にな
るように加え、３７℃で３０分間処理して混在する大腸
菌ＤＮＡ。

ＲＮＡを消化後、０．５％ＳＤＳ、　５０＋＊Ｍ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ（ｐＨ７，５）、　０．４　ＭＥＤＴ＾
、ｌｓｇ／＊ｊブロテネースＫ（ＢＲＬ社製）溶液を０
．２容量加え、ＤＮａｓｅＩ　。

ＲＮａｓｅＡを分解失活させた０次に、５０℃で１５分
間処理してプロテネースＫを失活させた。

このファージ懸濁液に等量のｌｈＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｊ（ｐＨ８，０）　、　　１　ｍＭ　　ＥＤＴＡで飽和
したフェノールを加え、穏やかに混和した。　１０００
ｘ　ｇで１０分間遠心分離後、水層を回収して等量のク
ロロホルム・フェノール・イソアミルアルコール（２４
：　２５：　１　）と混和後、水層を回収した。この抽
出処理を繰り返した後、ＤＮＡをエタノール沈殿法によ
り回収した。４Ｊ２のファージライセードより１．２ｍ
ｇのＤＮＡを得た。

実施例５　グリシニンへ２ＢＩｍゲノミック遺伝子の塩
基配列の解析 前記実施例４で得たＤＮＡ１　ｈｇを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ（宝酒造社製）および５ａｊｌ　（宝酒造社製）を各
々４ユニツトあるいはＨｌ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　（宝酒造
社製）および５ａｊＩ各々４ユニツトを含む１０ｎ＋Ｍ
　　Ｔｒｌｓ−）ＩＣｊ（ｐＨ７，５）、　７ｍＭ　　
ＭｇＧｊａ、　７５ａ＋Ｍ　　ＮａＣｌ！、　　７ｍＭ
２−メルカプトエタノール、　１１００ＩＬ／６１’　
ＢＳＡ溶液中で３時間、３７℃に加温することによって
完全に消化した。この一部を０．７％アガロースゲル電
気泳動後、ニトロセルロースフィルターに穆し、グリシ
ニンＡ２Ｂ１ａサブユニツトｃＤＮＡの完全長を含むＤ
ＮＡを２４．で標識したものをプローブとしてサザンプ
ロットハイプリダイゼーション［Ｍａｎｌａｔｉｓ。

Ｔ、ｅｔ　ａｌ；　”Ｍｏ１ｅｃｕｌｔＬｒ　ｃｌｏｎ
ｉｎｇ”　Ｇｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒ：　Ｌ
Ｊｌｏ、（１９８２）　］を行なった。ＥｃｏＲＩと　
５ａｊｌで消化した試料については２．６Ｋｂｐと３．
７にｂｐの断片がプローブと強くパイプリダイズした。

一方、旧ｎ　ｄ　ＩＩＩと　５ａｉｌ　Ｌで消化した試
料は１．ＢＫｂ９と５．２Ｋｂｐの断片がプローブと強
くパイプリダイズした。

一方、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩと　５ａＲ１で消化した試
料は１．６Ｋｂｐと５．２Ｋｂｐの断片がプローブと強
くパイプリダイズした。

以上の結果と、グリシニンＡ２Ｂ１ｌＩサブユニツトｃ
ＤＮ＾の制限酵素切断地図［Ｍｏｍｍａ、　Ｔ、ｅｔ　
ａｌ；　ＦＥＢＳＬＥＴＴＥＲ５，１８８：１１７（１
９８５）］よりＥｃｏＲＩと５ａｊｌで切断された２、
６にｂｐおよび旧ｎ　ｄ　１１１と　５ａｊＩで切断さ
れた１、６Ｋｂｌ）の断片にグリシニンＡ３８１ｍサブ
ユニット構造遺伝子の５′末側の一部およびその５′末
フラ子の３′末側の一部及びその３′末フランキング領
域が存在することが推定された。

そこで、前記実施例４で得たファージＤＮＡをＥｃｏＲ
ＥおよびＳａｊ　Ｉあるし）は旧ｎ　ｄ　ＩＩＩおよび
Ｓａｊ　Ｉで消化して各々２．６Ｋｂｐおよび３．７に
ｂｐあるいは１．６Ｋｂｐおよび５．２にｂｐのＤＮＡ
断片を大量に調製した。消化の条件は、先に述べた条件
をスケールマツプしたものであり、各ＤＮＡ断片の抽出
、精製１回収については常法［Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ
、ｅｔ　ａｌＨ＠Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ
”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏ
。

（１９８２）］　に従った。

得られた４種のＤＮＡ断片については、そのままあるい
はＡｌｕｌ　、　　ＤｄｅＩ　、　　）ｉｐａｌｌ　、
　　５ａｕ３＾■。

Ｔａｇｌ　（いずれも宝酒造）で消化後、核酸塩基配列
の解析の常法であるマキサム・ギルバート法［Ｍａｘａ
ｍ、＾、Ｍ、＆−Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ；　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　７４．５８０（１９７７）］で塩基配列を決
定した。

５′上流域の転写量始点［第１図の（＋）印］は鋳型伸
長法で３′−末端ポリ（Ａ）付加部位［ｆｌ印］はＳＩ
−マツピング法により決定した。得られた塩基配列のう
ち、グリシニンＡ４８１ａサブユニツト遺伝子の完全構
造とその５′−末および３′−末フランキング領域の一
部について第１図に示した。

第１図に示した塩基配列について、該遺伝子のｃ（ＩＮ
Ａと比較したところ、イントロンが３個所挿入されてい
るが、エキソンの塩基配列は両者で完全に一致していた
。また、ｃＤＮ＾の５′−末および３′−末の非翻訳領
域についても第１図に示した塩基配列と完全に一致して
いた。このことから、本発明のＤＮＡ　Ｍはダイズグリ
シニン＾２Ｂ１．サブユニットタンパク質をコードして
いる染色体ＯＮ＾と判断した。

この２６種の色々な程度にＡ２Ｂ１Ｍ遺伝子の５′フラ
ンキング領域を欠損したクローン群から、Ｂａ＋ｉＨＩ
と　ＨｐａｌｌでＤＮＡ断片を除いた。一方、ＡｚＢｓ
ａ　ＣＯＷ＾クローン［Ｍｏｍｍａ、　Ｔ、ｅｔ　ａｌ
；　ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ５，１８８：１１７　（１
９８５）］からＨｐａｌｌと　Ｐｓｔ　Ｉにより５′上
流域を欠損するｃＤＮ＾ＤＮＡ断片出した０次に、＾２
Ｂ１１遺伝子の上流域から７４番目のアミノ酸ＧＪ・ｎ
をコードする塩基の後で切断されたＤＮＡ断片を持つ上
記ｐＵｃ１１９群の各クローンニＡｆＢｌａ　ｃＤＮＡ
クローンのＨｐａｌｌ　／Ｐｓｔ　Ｉ断片（５′末を欠
損したｃＤＮ＾］をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し
た後、３′末のＰｓｔ　Ｉ切断部位をＭｕｎｇ　ｂｅａ
ｎヌクレアーゼ処理し、次いでクレノー酵素処理してプ
ラント型末端に加工した。このＤＮＡ断片をさら、にＰ
ｖｕＩＩで切断し、同様な酵素処理によりプラント型末
端とした後、Ｂａ１ｌＨＩリンカ−を５′および３′末
端にＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。　Ｂａｍ
ＨＩ処理後、酵母／大腸菌シャトルベクターであるＹＥ
ｐ１３プラスミド［Ｂｒｏａｃｈ、Ｊ、Ｒ，、５ｔｒａ
ｎｔｈｅｒ＋＋＋、　Ｊ、Ｎ、　ａｎｄ　）ｌｉｃｋｓ
。

Ｊ、Ｂ、ＨＧｅｎｅ、！、１２１（１９７９）］のＢａ
ｍＨ１部位に挿入することにより、Ａ２Ｂ１ｍ遺伝子の
５′上流域を種々の程度に欠損し、しかも完全なＡＪＩ
、　ｃＤＮ＾の配列をもつ一連のクローン群（２１３ク
ローン）を作製した。

これらのクローンを、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒａｖｉｓｉａｅ、　ＪＨＣ８−２４Ｃ株；　ｕ
ｒａ３−５２．　ｈｉｓ３−１１゜ｈｉｓ３−１５．１
ｅｕ２−３．１ｅｕ２−１１２．１ｎｏｌ−１３，１ｎ
ｏ４−８）にトランスフォーメーシヨンした。トランス
フす−メーションは酢酸リチウム法［１ｔｏ、　Ｈ，ｅ
ｔａｌ；　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５３，１ｅ３
（ｔ９８３）］　によった。形質転換体のスクリーニン
グは２％グルコースを含むＹＮＢ最小培地上での該酵母
の生育［ロイシンを欠く培地上で生育出来るようになる
］により、−次スクリーニングした。陽性クローンをｙ
ｐｊ培地で増殖させたオーバナイト・カルチャー（ｏｖ
ｅｒｎｉｇｈｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ）から菌を集め、ｚｙ
ｍｏｉｙａｓｅａｏｏｏｏを用いてプロトプラストにし
た後、２％ＳＤＳを加えて溶菌し、１ｍｇのプロナーゼ
Ｅを含む水を加えて３０℃、３０分間インキュベートし
た０次いでフェノール処理後、常法に従ってエタノール
沈殿を行なった。ＲＮａｓｅＡ処理後、０．５．ｇをニ
トロセルロース上に変性吸着させ、＾Ｊｌａ　ｃＤＮ＾
クローンをニックトランスレーションにより標識したも
のをプローブとして、ドットパイプリダイゼーションを
行ない二次スクリーニングとした。

上記のスクリーニングで陽性であったクローンを各５′
欠損遺伝子クローン（２６ｆｌ）について得たので、こ
れらの転換体でのグリシニンＡ２Ｂ１−の発現を転写産
物および翻訳産物の解析により検討した。転写産物の解
析は、Ａ、Ｂ１’、　＋ａＲＮ＾の発現を、前述のニッ
クトランスレーション標識した＾、Ｂ１゜ｃＤＮ＾をプ
ローブとして、ドットパイプリダイゼーションおよびノ
ーザンプロットハイプリダイゼーション法により検索し
た。

翻訳産物の解析は酵母菌体溶菌上清のウェスタンプロッ
ト法によった。なお培養菌体からのＲＮＡの抽出はＥｌ
ｄｅｒらの方法によった。転写産物の５′末端の決定は
Ｓ！ヌクレアーゼマツピング法［Ｂｅｒｋ、　Ａ、Ｊ、
　ａｎｄ　Ｐ、Ａ、　５ｈａｒｐ；　Ｃｅ１１．１２．
７２１（１９７７）］　に依った。これらの結果から、
グリシニン遺伝子の調節領域は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｌｓｉａｅ、　ＪＨＣ８−２４
Ｃ株）中で機能し、酵母菌体から抽出したグリシニンｍ
ＲＮＡの５′末端配列は、登熟期のダイズ種子から抽出
したそれの５′末端と完全に一致した。また、転写産物
の大きさも約１．７にｂとインタクトのそれと一致した
。一方、ウェスタンプロットによる翻訳産物は、分子量
が約６１にドルトンであった。この大きさは、登熟期ダ
イズ種子から抽出したｍＲＮ＾を用いて行なったグリシ
ニン翻訳産物の分子量と一致した。これらの結果は、酵
母中でグリシニン遺伝子の調節領域が機能していること
を示している。そこで、様々な程度に５′末端を欠損し
たグリシニン遺伝子［グリシニン遺伝子の５′フランキ
ング領域＋グリシニンＡ２８１ａ　ｃＤＮ＾］での転写
および翻訳活性の強さを検索した結果、転写開始点（図
中（＋）１）より上流５３５塩基以上では、転写・翻訳
活性に影響がないが、５３５塩基から下流を欠損するに
伴って上記両活性は徐々に低下し、転写開始点から上流
１２０塩基を欠損した場合はその活性のほとんどを喪失
した。これらの結果から、グリシニン遺伝子の完全な発
現には表１に示した塩基配列を含む遺伝子の５′上流域
が必要であることを認めた。

［発明の効果］ 本発明のＤＮＡ　１１Ｉは宿主細胞、特に植物細胞中に
おいて強力なプロモーター機能を有するので、遺伝子組
換え技術において外来遺伝子を宿主細胞中に導入し、こ
れを発現させる場合に有効に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はグリシニンＡ２８１ａの遺伝子の完全構造を示
したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 プロモーター機能を有し、かつ下記の塩基配列の少なく
   とも一部の、または少なくとも一部と実質的に相同な塩
   基配列を有することを特徴とするＤＮＡ鎖。 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】