JPH062064B2 - 新規なｄｎａ鎖 - Google Patents
新規なｄｎａ鎖Info
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- JPH062064B2 JPH062064B2 JP15558187A JP15558187A JPH062064B2 JP H062064 B2 JPH062064 B2 JP H062064B2 JP 15558187 A JP15558187 A JP 15558187A JP 15558187 A JP15558187 A JP 15558187A JP H062064 B2 JPH062064 B2 JP H062064B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glycinin
- dna
- gene
- subunit
- kbp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はプロモーター機能を有するDNA鎖に関するもの
である。さらに詳しくは、ダイズ種子貯蔵タンパク質で
あるグリシニンの中間サブユニットA2B1aをコードする
遺伝子に由来するDNA鎖及びこれと実質的に相同な塩基
配列を有するDNA鎖に関するものである。
である。さらに詳しくは、ダイズ種子貯蔵タンパク質で
あるグリシニンの中間サブユニットA2B1aをコードする
遺伝子に由来するDNA鎖及びこれと実質的に相同な塩基
配列を有するDNA鎖に関するものである。
［従来の技術、発明が解決しようとする問題点］ 近年、種子貯蔵タンパク質の生合成，アミノ酸配列，プ
ロセシング等に関する研究が注目されている。
ロセシング等に関する研究が注目されている。
ダイズ種子貯蔵タンパク質の大半は塩可溶性のグロブリ
ンで、これが完熟種子中の全タンパク質の70〜80％を占
めている。このグリブリンを超遠心分離処理すると、７
ｓ成分であるコングリシニンと11ｓ成分であるグリシニ
ンとに分かれる。グリシニンは分子量3.6×105で、酸性
サブユニット(A)群６個(A1a, A1b, A2, A3, A4,A5)と塩
基性サブユニット(B)群５個(B1a, B1b, B2, B3, B4)と
からなる両サブユニットがジスルフィド結合した５種の
中間サブユニット(A1aB2, AA1bB1b, A2B1a, A3B4, A5A4
B3)の６量体から構成され、種子の子葉細胞中のプロテ
インボディー（タンパク質顆粒）中に存在している。
ンで、これが完熟種子中の全タンパク質の70〜80％を占
めている。このグリブリンを超遠心分離処理すると、７
ｓ成分であるコングリシニンと11ｓ成分であるグリシニ
ンとに分かれる。グリシニンは分子量3.6×105で、酸性
サブユニット(A)群６個(A1a, A1b, A2, A3, A4,A5)と塩
基性サブユニット(B)群５個(B1a, B1b, B2, B3, B4)と
からなる両サブユニットがジスルフィド結合した５種の
中間サブユニット(A1aB2, AA1bB1b, A2B1a, A3B4, A5A4
B3)の６量体から構成され、種子の子葉細胞中のプロテ
インボディー（タンパク質顆粒）中に存在している。
グリシニンタンパク質の生合成に関する研究によると、
グリシニンタンパク質はＮ末端側からシグナルペプチド
−酸性サブユニット−塩基性サブユニットの順序で連結
したグリシニン前駆体タンパク質として翻訳される。こ
の前駆体のシグナルペプチド部分は小胞体で、co-trans
lationalに切断され、その結果生じる酸性サブユニット
−塩基性サブユニットからなるポリペプチドはさらに各
サブユニットに切断され両ユニットがジスルフィド結合
した中間サブユニットが形成される。
グリシニンタンパク質はＮ末端側からシグナルペプチド
−酸性サブユニット−塩基性サブユニットの順序で連結
したグリシニン前駆体タンパク質として翻訳される。こ
の前駆体のシグナルペプチド部分は小胞体で、co-trans
lationalに切断され、その結果生じる酸性サブユニット
−塩基性サブユニットからなるポリペプチドはさらに各
サブユニットに切断され両ユニットがジスルフィド結合
した中間サブユニットが形成される。
先に本発明者は、グリシニン前駆体タンパク質をコード
するcDNA５種をクローニングし、その塩基配列を解析し
てグリシニンの各中間サブユニットのアミノ酸配列を明
らかにした。
するcDNA５種をクローニングし、その塩基配列を解析し
てグリシニンの各中間サブユニットのアミノ酸配列を明
らかにした。
グリシニン前駆体タンパク質をコードしている各遺伝子
は種子の登熟期に急激に、しかも極めて強く発現してい
るので、これらの遺伝子の転写をコントロールしている
プロモーターは、遺伝子組換え技術において宿主細胞、
特に植物細胞中に外来遺伝子を導入し、これを強力に発
現させる場合に有効に利用することが期待されるが、こ
れまでのところこれらのプロモーターに関する報告例は
見当らない。
は種子の登熟期に急激に、しかも極めて強く発現してい
るので、これらの遺伝子の転写をコントロールしている
プロモーターは、遺伝子組換え技術において宿主細胞、
特に植物細胞中に外来遺伝子を導入し、これを強力に発
現させる場合に有効に利用することが期待されるが、こ
れまでのところこれらのプロモーターに関する報告例は
見当らない。
［問題点を解決するための手段］ 本発明は、グリシニンを構成している５種の中間サブユ
ニットの遺伝子群の中でも発現量の多いA2B1aをコード
する遺伝子をダイズの染色体ライブラリーよりクローニ
ングし、そのプロモーター部分を特定化することによっ
て完成されたものである。
ニットの遺伝子群の中でも発現量の多いA2B1aをコード
する遺伝子をダイズの染色体ライブラリーよりクローニ
ングし、そのプロモーター部分を特定化することによっ
て完成されたものである。
すなわち本発明は、プロモーター機能を有し、かつ表１
に示す塩基配列を有することを特徴とするDNA鎖であ
る。
に示す塩基配列を有することを特徴とするDNA鎖であ
る。
表 1 5′-ATATACAGTACAAATTATTCTCTACTAATCTTTATGATATG TAAACCAAAGCATGATTAATTATTTCCTAATTAAATTAAAAAAA ATTGAGTAACTAGTATCACATAAAGATCTGTCAAAACCATGAAT AGTGATAATTTCATAACACCTAATAATTTCTCTATCCCTAGAGT GAGGTCATTTTTGGACGGCCCTTCTTCTCACTTTGAGGATCCCA TCATTGTCACACGGTGTATTCATATAATTTCATATGTCATAAAC CCGCGAACATGAAATGAAACCATGGTCCCCCTCTCCACCACCGT TTTCTGGCAATTGCATGCAATACAAACACACTTGGTATTTGTCA CATAATGTTGATGTCGAACTGTCGAAGCCACCTCACACCCATGA ACTTAATGAGGTGTAACACACAAGGCTTCCATAGCCATGCATAC TGAAGAATGTCTCAAGCTCAGCACCCCACTCCTGTGACGTGTCC CTCACCCACCTTCCTCTCTTCCCTATAAATAACCACGCCTCAGG TTCTCCGCTT-3′ 本発明のDNA鎖はプロモーター機能を有し、かつ表１に
示す塩基配列を有することを特徴とするDNA鎖である。
ここで「DNA鎖」とは、ある長さを有するポリデオキシ
リボ核酸の相補的２本鎖を意味するものであって、特許
請求の範囲および表１においては、このDNA鎖が１本の
相補鎖を省略した形で記載されていることを言うまでも
ない。また、「プロモーター機能」とは、DNAからRNAへ
の転写を開始させるための信号機能をいう。
示す塩基配列を有することを特徴とするDNA鎖である。
ここで「DNA鎖」とは、ある長さを有するポリデオキシ
リボ核酸の相補的２本鎖を意味するものであって、特許
請求の範囲および表１においては、このDNA鎖が１本の
相補鎖を省略した形で記載されていることを言うまでも
ない。また、「プロモーター機能」とは、DNAからRNAへ
の転写を開始させるための信号機能をいう。
さらに本発明のDNA鎖は、基本的には表１に示す53Ｓ塩
基対の塩基配列を有するものであるが、プロモーター機
能を有する限りにおいてはその塩基配列の少なくとも一
部を有するものもしくはこれと実質的に相同な塩基配列
を有するものをも含むものである。実質的に相同な塩基
配列とは、プロモーター機能を有する限り塩基配列のい
くつかについて欠失，置換，付加等があってもよいこと
を示すものである。
基対の塩基配列を有するものであるが、プロモーター機
能を有する限りにおいてはその塩基配列の少なくとも一
部を有するものもしくはこれと実質的に相同な塩基配列
を有するものをも含むものである。実質的に相同な塩基
配列とは、プロモーター機能を有する限り塩基配列のい
くつかについて欠失，置換，付加等があってもよいこと
を示すものである。
本発明のDNA鎖は、化学合成法，ダイズの染色体遺伝子
ライブラリーよりのクローニング等合目的的な任意の方
法によって得ることができる。
ライブラリーよりのクローニング等合目的的な任意の方
法によって得ることができる。
本発明者は、ダイズの染色体遺伝子ライブラリーより、
グリシニンの中間サブユニットA2B1aをコードする遺伝
子をそのcDNAをプローブとしてスクリーニングすること
により取得した（後記実施例参照）が、その構造は第１
図に示す通りであった。
グリシニンの中間サブユニットA2B1aをコードする遺伝
子をそのcDNAをプローブとしてスクリーニングすること
により取得した（後記実施例参照）が、その構造は第１
図に示す通りであった。
すなわち、中間サブユニットA2B1aの遺伝子は、３個の
イントロンと４個のエキソンで構成されており、485個
のアミノ酸からなるグリシニンA2B1aの中間サブユニッ
ト前駆体をコードしている。第１図中、〜のフラク
ションはシグナルペプチド，〜のフラクションはA2
B1aの中間サブユニットをコードしており、この中間サ
ブユニットは で示した部位で5′側のA2サブユニットと3′側のB1aサ
ブユニットとに切断される。また、〜のフラクショ
ンがmRNAに転写されることがＳＩマッピングにより確認
されている。〜のフラクションが本発明のDNA鎖で
あるが、この塩基配列の中には真核生物のプロモーター
の構成要素であるTATAboxが含まれている。
イントロンと４個のエキソンで構成されており、485個
のアミノ酸からなるグリシニンA2B1aの中間サブユニッ
ト前駆体をコードしている。第１図中、〜のフラク
ションはシグナルペプチド，〜のフラクションはA2
B1aの中間サブユニットをコードしており、この中間サ
ブユニットは で示した部位で5′側のA2サブユニットと3′側のB1aサ
ブユニットとに切断される。また、〜のフラクショ
ンがmRNAに転写されることがＳＩマッピングにより確認
されている。〜のフラクションが本発明のDNA鎖で
あるが、この塩基配列の中には真核生物のプロモーター
の構成要素であるTATAboxが含まれている。
［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１ ダイズ染色体DNAの調製 凍結乾燥したダイズ（品種：ボンミノリ）の葉１〜５ｇ
を液体窒素存在下で乳鉢で粉砕した。これを50mlのポリ
プロピレン製遠心管に移し、15mlの50mM Tris-HCl(pH
8.0)，0.7Ｍ NaCl，10mM EDTA，１％CTAB（セチル・
トリメチル・アンモニウムブロマイド），１％メルカプ
トエタノールよりなる緩衝液中に懸濁した。これを56℃
で20分間加温しながら温和に懸濁し、25℃に冷却した
後、15mlのクロロホルム，イソアミルアルコール（24：
１）混合液を加え、温和に乳濁させた。8000×ｇで20℃
にて10分間遠心分離し、水層を回収後、再度クロロホル
ム，イソアミルアルコールによる抽出を行ない水層を回
収した。得られた水層に1.5mlの10％ CTAB，0.7Ｍ Na
Cl溶液を加えて混合後、17mlの50mM Tris-HCl(pH8.
0)，10mM EDTA，１％ CTAB溶液を加え混合し、25℃で3
0分間放置した。これを1500×ｇで20℃にて15分間遠心
分離し、上清を完全に捨てて沈殿を回収した。沈殿に７
mlの50％CsCl(w/w)溶液を加え完全に溶かした後、400μ
lの10mg/mlのエチジウムブロマイド溶液を加えて混和
後、日立RP 65Tローターで20℃にて44000回転で26時間
遠心分離を行なった。遠心分離後、ＵＶハンドモニター
によりDNAを含むフラクションをパスツールピペットで
回収した。回収したDNA溶液に、20倍希釈SSC溶液（３
Ｍ，NaCl，0.3 Ｍクエン酸ナトリウム）で飽和したイソ
プロパノールを３ml加え混和し、エチジウムブロマイド
をイソプロパノール抽出により除去した。この抽出操作
を５回行なった後、水層を透析膜に移し、１の10mM
Tris-HCl(pH8.0)，１mM EDTAに対して３回透析を行な
った。凍結乾燥葉１ｇから250〜300μｇの染色体DNAを
得た。
を液体窒素存在下で乳鉢で粉砕した。これを50mlのポリ
プロピレン製遠心管に移し、15mlの50mM Tris-HCl(pH
8.0)，0.7Ｍ NaCl，10mM EDTA，１％CTAB（セチル・
トリメチル・アンモニウムブロマイド），１％メルカプ
トエタノールよりなる緩衝液中に懸濁した。これを56℃
で20分間加温しながら温和に懸濁し、25℃に冷却した
後、15mlのクロロホルム，イソアミルアルコール（24：
１）混合液を加え、温和に乳濁させた。8000×ｇで20℃
にて10分間遠心分離し、水層を回収後、再度クロロホル
ム，イソアミルアルコールによる抽出を行ない水層を回
収した。得られた水層に1.5mlの10％ CTAB，0.7Ｍ Na
Cl溶液を加えて混合後、17mlの50mM Tris-HCl(pH8.
0)，10mM EDTA，１％ CTAB溶液を加え混合し、25℃で3
0分間放置した。これを1500×ｇで20℃にて15分間遠心
分離し、上清を完全に捨てて沈殿を回収した。沈殿に７
mlの50％CsCl(w/w)溶液を加え完全に溶かした後、400μ
lの10mg/mlのエチジウムブロマイド溶液を加えて混和
後、日立RP 65Tローターで20℃にて44000回転で26時間
遠心分離を行なった。遠心分離後、ＵＶハンドモニター
によりDNAを含むフラクションをパスツールピペットで
回収した。回収したDNA溶液に、20倍希釈SSC溶液（３
Ｍ，NaCl，0.3 Ｍクエン酸ナトリウム）で飽和したイソ
プロパノールを３ml加え混和し、エチジウムブロマイド
をイソプロパノール抽出により除去した。この抽出操作
を５回行なった後、水層を透析膜に移し、１の10mM
Tris-HCl(pH8.0)，１mM EDTAに対して３回透析を行な
った。凍結乾燥葉１ｇから250〜300μｇの染色体DNAを
得た。
実施例２ ダイズ遺伝子ライブラリーの作成 実施例１で得られたダイズ染色体DNA 50μｇを10mM T
ris-HCl(pH7.5)，７mM MgCl2，100mMNaClを含む緩衝液
中で制限酵素MboＩ（宝酒造社製）100ユニットで部分分
解した後、これをショ糖密度勾配溶液（200mM Tris-HC
l (pH7.5)，１Ｍ NaCl，10mM EDTA,10〜40％ショ糖）
に重層し、日立RPS 40Tローターで28000回転，20℃に
て16時間遠心分離した。0.5mlづつ分画したフラクショ
ンの１部を0.6％アガロースゲル電気泳動により15Kbp〜
20KbpのDNA断片２μｇを得た。
ris-HCl(pH7.5)，７mM MgCl2，100mMNaClを含む緩衝液
中で制限酵素MboＩ（宝酒造社製）100ユニットで部分分
解した後、これをショ糖密度勾配溶液（200mM Tris-HC
l (pH7.5)，１Ｍ NaCl，10mM EDTA,10〜40％ショ糖）
に重層し、日立RPS 40Tローターで28000回転，20℃に
て16時間遠心分離した。0.5mlづつ分画したフラクショ
ンの１部を0.6％アガロースゲル電気泳動により15Kbp〜
20KbpのDNA断片２μｇを得た。
次にこのDNA断片１μｇとλファージベクターEMBL3（プ
ロメガ社製）のアーム１μｇとをT4 DNAリガーゼ（宝酒
造社製）により連結を行ない、EMBL3のBamHI切断部位に
ダイズ染色体DNAが挿入されたハイブリッドDNAを得た。
連結反応は66mM Tris-HCl（pH7.6），6.6mM MgC
l2，10mM DTT，66μM ATPを含む溶液中で12℃にて１
２時間行なった。得られたハイブリッドDNAについてinv
itroのパッケージングキット（ギガパ ク；プロメガ社
製）を用いてin vitroパッケージング[Becker,A & M. G
old; Proc. Nat. Acad. Sci. 72, 581(1975)]を行な
い、ダイズ遺伝子ライブラリー(3.0×106PFU／μg)とし
た。
ロメガ社製）のアーム１μｇとをT4 DNAリガーゼ（宝酒
造社製）により連結を行ない、EMBL3のBamHI切断部位に
ダイズ染色体DNAが挿入されたハイブリッドDNAを得た。
連結反応は66mM Tris-HCl（pH7.6），6.6mM MgC
l2，10mM DTT，66μM ATPを含む溶液中で12℃にて１
２時間行なった。得られたハイブリッドDNAについてinv
itroのパッケージングキット（ギガパ ク；プロメガ社
製）を用いてin vitroパッケージング[Becker,A & M. G
old; Proc. Nat. Acad. Sci. 72, 581(1975)]を行な
い、ダイズ遺伝子ライブラリー(3.0×106PFU／μg)とし
た。
実施例３ シニン遺伝子のスクリーニング 前記実施例２で得られたダイズ由来のDNAを含むEMBL3フ
ァージの集合である遺伝子ライブラリーを大腸菌LE 392
（F-, hsdR514（Ｙk -，ｍk -）， ｓｕｐＥ４４， ｓ
ｕｐＦ５８， ｌａｃＹ１， ｇａｌＫ２， ｇａｌＴ
２２， ｍｅｔＢ１， ｔｒｐＲ５５，λ-）に感染さ
せ、プラークを形成させた。大腸菌LE392はプロメガ社
製を用いた。
ァージの集合である遺伝子ライブラリーを大腸菌LE 392
（F-, hsdR514（Ｙk -，ｍk -）， ｓｕｐＥ４４， ｓ
ｕｐＦ５８， ｌａｃＹ１， ｇａｌＫ２， ｇａｌＴ
２２， ｍｅｔＢ１， ｔｒｐＲ５５，λ-）に感染さ
せ、プラークを形成させた。大腸菌LE392はプロメガ社
製を用いた。
得られたプラークからグリシニン遺伝子を含むクローン
は、プラークハイブリダイゼーション法[Benton, W.D.&
R.W.Davis; Science 196,180(1977)]を使用して、ニツ
クトランスレーションキット（アマシャムジャパン社
製）で32ｐ標識したグリシニンA2B1aサブユニットcDNA
[Momma,T.et al; FEBS LETTERS, 188:117(1985)]で選択
した。グリシニンA2B1aサブユニットcDNAとハイブリダ
イズしたプラークについては、グリシニンA2B1aのA2サ
ブユニットのＮ−末端より６番〜11番目のアミノ酸配列
に対応する化学合成DNA[Momma, T.et al; FEBS LETTER
S,188:117(1985)]を32ｐで標識したものをプローブとし
て再度プラークハイブリダイゼーションを行ない最も強
くハイブリダイゼーションシグナルを示したものを選択
した。
は、プラークハイブリダイゼーション法[Benton, W.D.&
R.W.Davis; Science 196,180(1977)]を使用して、ニツ
クトランスレーションキット（アマシャムジャパン社
製）で32ｐ標識したグリシニンA2B1aサブユニットcDNA
[Momma,T.et al; FEBS LETTERS, 188:117(1985)]で選択
した。グリシニンA2B1aサブユニットcDNAとハイブリダ
イズしたプラークについては、グリシニンA2B1aのA2サ
ブユニットのＮ−末端より６番〜11番目のアミノ酸配列
に対応する化学合成DNA[Momma, T.et al; FEBS LETTER
S,188:117(1985)]を32ｐで標識したものをプローブとし
て再度プラークハイブリダイゼーションを行ない最も強
くハイブリダイゼーションシグナルを示したものを選択
した。
実施例４ グリシニンA2B1a遺伝子を含むファージDNAの
調製 前記実施例３で得られたファージ（２×109個）を80ml
IYE培地[Maniatis, T.et al;"Molecular cloning" Cold
Spring Harbar Labo.(1982)]で増殖させた大腸菌LE392
に室温で20分間吸着させた。
調製 前記実施例３で得られたファージ（２×109個）を80ml
IYE培地[Maniatis, T.et al;"Molecular cloning" Cold
Spring Harbar Labo.(1982)]で増殖させた大腸菌LE392
に室温で20分間吸着させた。
次に、これを４のTYE培地に移植し、37℃で６〜８時
間培養し、ライセートを得た。ライセートを6000×ｇ，
４℃にて10分間遠心分離し、上清を0.5Ｍ NaCl，10％
ポリエチレングリコール(PEG) 6000になるように調整
し、０℃で１時間放置することによりファージとPEGと
の共沈殿を形成させた。この沈殿を6000×ｇ，４℃にて
10分間遠心分離を行なって回収し、20mlの50mM Tris-H
Cl(pH7.5), 10mM MgSO4緩衝液に懸濁した。このファー
ジ・PEG懸濁液に20mlのクロロホルムを加え混和後、200
0×ｇ，４℃にて10分間遠心分離を行ない、水層とクロ
ロホルム層を分離し、水層を回収した。この操作を繰り
返し、ファージ懸濁液を塩化セシウムのステップ密度勾
配液（50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgSO4,1.7g/ml C
sCl-1.5g/ml CsCl-1.45g/ml CsCl)に重層し、日立RPS 4
0Tローターで22000回転，４℃で２時間遠心分離した。
ファージをパスツールピペットで回収後、透析膜に移
し、50mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM MgSO4溶液に２
に対して透析を行なった。得られたファージ懸濁液にDN
aseＩ（宝酒造社製），RNaseA（ファルマシア社製）を
それぞれ１μg/mlおよび10μg/mlの濃度になるように加
え、37℃で30分間処理して混在する大腸菌DNA,RNAを消
化後、0.5％SDS, 50mM Tris-HCl(pH7.5), 0.4 ＭEDT
A,１mg/mlプロテネースＫ（BRL社製）溶液を0.2容量加
え、DNaseＩ，RNaseAを分解失活させた。次に、50℃で1
5分間処理してプロテネースＫを失活させた。
間培養し、ライセートを得た。ライセートを6000×ｇ，
４℃にて10分間遠心分離し、上清を0.5Ｍ NaCl，10％
ポリエチレングリコール(PEG) 6000になるように調整
し、０℃で１時間放置することによりファージとPEGと
の共沈殿を形成させた。この沈殿を6000×ｇ，４℃にて
10分間遠心分離を行なって回収し、20mlの50mM Tris-H
Cl(pH7.5), 10mM MgSO4緩衝液に懸濁した。このファー
ジ・PEG懸濁液に20mlのクロロホルムを加え混和後、200
0×ｇ，４℃にて10分間遠心分離を行ない、水層とクロ
ロホルム層を分離し、水層を回収した。この操作を繰り
返し、ファージ懸濁液を塩化セシウムのステップ密度勾
配液（50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgSO4,1.7g/ml C
sCl-1.5g/ml CsCl-1.45g/ml CsCl)に重層し、日立RPS 4
0Tローターで22000回転，４℃で２時間遠心分離した。
ファージをパスツールピペットで回収後、透析膜に移
し、50mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM MgSO4溶液に２
に対して透析を行なった。得られたファージ懸濁液にDN
aseＩ（宝酒造社製），RNaseA（ファルマシア社製）を
それぞれ１μg/mlおよび10μg/mlの濃度になるように加
え、37℃で30分間処理して混在する大腸菌DNA,RNAを消
化後、0.5％SDS, 50mM Tris-HCl(pH7.5), 0.4 ＭEDT
A,１mg/mlプロテネースＫ（BRL社製）溶液を0.2容量加
え、DNaseＩ，RNaseAを分解失活させた。次に、50℃で1
5分間処理してプロテネースＫを失活させた。
このファージ懸濁液に等量の10mM Tris-HCl(pH8.0)，
１mM EDTAで飽和したフェノールを加え、穏やかに混和
した。1000×ｇで10分間遠心分離後、水層を回収して等
量のクロロホルム・フェノール・イソアミルアルコール
（24：25：１）と混和後、水層を回収した。この抽出処
理を繰り返した後、DNAをエタノール沈殿法により回収
した。４のファージライセートより1.2mgのDNAを得
た。
１mM EDTAで飽和したフェノールを加え、穏やかに混和
した。1000×ｇで10分間遠心分離後、水層を回収して等
量のクロロホルム・フェノール・イソアミルアルコール
（24：25：１）と混和後、水層を回収した。この抽出処
理を繰り返した後、DNAをエタノール沈殿法により回収
した。４のファージライセートより1.2mgのDNAを得
た。
実施例５ グリシニンA2B1aゲノミック遺伝子の塩基配
列の解析 前記実施例４で得たDNA １μｇを制限酵素EcoRＩ（宝
酒造社製）およびSalＩ（宝酒造社製）を各々４ユニッ
トあるいはHindIII（宝酒造社製）およびSalＩ各々４ユ
ニットを含む10mM Tris-HCl(pH7.5)，７mM MgCl2, 75
mM NCl， ７mM２−メルカプトエタノール，100μg/ml
BSA溶液中で３時間，37℃に加温することによって完全
に消化した。この一部を0.7％アガロースゲル電気泳動
後、ニトロセルロースフィルターに移し、グリシニンA2
B1aサブユニットcDNAの完全長を含むDNAを32ｐで標識し
たものをプローブとしてサザンブロットハイブリダイゼ
ーション[Maniatis,T.et al;"Molecular cloning" Cold
Spring Harbar Labo.(1982)]を行なった。EcoRＩとSal
Ｉで消化した試料については2.6Kbpと3.7Kbpの断片がプ
ローブと強くハイブリダイズした。一方、HindIIIとSal
Ｉで消化した試料は1.6Kbpと5.2Kbpの断片がプローブと
強くハイブリダイズした。一方、HindIIIとSalＩで消化
した試料は1.6Kbpと5.2Kbpの断片がプローブと強くハイ
ブリダイズした。
列の解析 前記実施例４で得たDNA １μｇを制限酵素EcoRＩ（宝
酒造社製）およびSalＩ（宝酒造社製）を各々４ユニッ
トあるいはHindIII（宝酒造社製）およびSalＩ各々４ユ
ニットを含む10mM Tris-HCl(pH7.5)，７mM MgCl2, 75
mM NCl， ７mM２−メルカプトエタノール，100μg/ml
BSA溶液中で３時間，37℃に加温することによって完全
に消化した。この一部を0.7％アガロースゲル電気泳動
後、ニトロセルロースフィルターに移し、グリシニンA2
B1aサブユニットcDNAの完全長を含むDNAを32ｐで標識し
たものをプローブとしてサザンブロットハイブリダイゼ
ーション[Maniatis,T.et al;"Molecular cloning" Cold
Spring Harbar Labo.(1982)]を行なった。EcoRＩとSal
Ｉで消化した試料については2.6Kbpと3.7Kbpの断片がプ
ローブと強くハイブリダイズした。一方、HindIIIとSal
Ｉで消化した試料は1.6Kbpと5.2Kbpの断片がプローブと
強くハイブリダイズした。一方、HindIIIとSalＩで消化
した試料は1.6Kbpと5.2Kbpの断片がプローブと強くハイ
ブリダイズした。
以上の結果と、グリシニンA2B1aサブユニットcDNAの制
限酵素切断地図[Momma, T.et al; FEBS LETTERS, 188:1
17(1985)]よりEcoRＩとSalＩで切断された2.6Kbpおよび
HindIIIとSalＩで切断された1.6Kbpの断片にグリシニン
A2B1aサブユニット構造遺伝子の5′末側の一部およびそ
の5′末フランキング領域が、またEcoRＩとSalＩで切断
された3.7KbpおよびHindIIIとSalＩで切断された5.2Kbp
の断片にA2B1aサブユニット構造遺伝子の3′末側の一部
及びその3′末フランキング領域が存在することが推定
された。
限酵素切断地図[Momma, T.et al; FEBS LETTERS, 188:1
17(1985)]よりEcoRＩとSalＩで切断された2.6Kbpおよび
HindIIIとSalＩで切断された1.6Kbpの断片にグリシニン
A2B1aサブユニット構造遺伝子の5′末側の一部およびそ
の5′末フランキング領域が、またEcoRＩとSalＩで切断
された3.7KbpおよびHindIIIとSalＩで切断された5.2Kbp
の断片にA2B1aサブユニット構造遺伝子の3′末側の一部
及びその3′末フランキング領域が存在することが推定
された。
そこで、前記実施例４で得たファージDNAをEcoRＩおよ
びSalＩあるいはHindIIIおよびSalＩで消化して各々2.6
Kbpおよび3.7Kbpあるいは1.6Kbpおよび5.2KbpのDNA断片
を大量に調製した。消化の条件は、先に述べた条件をス
ケールマップしたものであり、各DNA断片の抽出，精
製，回収については常法[Maniatis, T.et al;"Molecula
r cloning" Cold Spring Harbar Labo.(1982)]に従っ
た。
びSalＩあるいはHindIIIおよびSalＩで消化して各々2.6
Kbpおよび3.7Kbpあるいは1.6Kbpおよび5.2KbpのDNA断片
を大量に調製した。消化の条件は、先に述べた条件をス
ケールマップしたものであり、各DNA断片の抽出，精
製，回収については常法[Maniatis, T.et al;"Molecula
r cloning" Cold Spring Harbar Labo.(1982)]に従っ
た。
得られた４種のDNA断片については、そのままあるいはA
luＩ，DdeＩ，HpaII，Sau3AＩ，TagＩ（いずれも宝酒
造）で消化後、核酸塩基配列の解析の常法であるマキサ
ム・ギルバート法[Maxam, A.M.& W.Gilbert; Proc. Na
t.Acad.Sci. 74,560(1977)]で塩基配列を決定した。5′
上流域の転写開始点［第１図の（＋）印］は鋳型伸長法
で3′−末端ポリ（Ａ）付加部位 はＳＩ−マッピング法により決定した。得られた塩基配
列のうち、グリシニンA2B1aサブユニット遺伝子の完全
構造とその5′−末および3′−末フランキング領域の一
部について第１図に示した。
luＩ，DdeＩ，HpaII，Sau3AＩ，TagＩ（いずれも宝酒
造）で消化後、核酸塩基配列の解析の常法であるマキサ
ム・ギルバート法[Maxam, A.M.& W.Gilbert; Proc. Na
t.Acad.Sci. 74,560(1977)]で塩基配列を決定した。5′
上流域の転写開始点［第１図の（＋）印］は鋳型伸長法
で3′−末端ポリ（Ａ）付加部位 はＳＩ−マッピング法により決定した。得られた塩基配
列のうち、グリシニンA2B1aサブユニット遺伝子の完全
構造とその5′−末および3′−末フランキング領域の一
部について第１図に示した。
第１図に示した塩基配列について、該遺伝子のcDNAと比
較したところ、イントロンが３個所挿入されているが、
エキソンの塩基配列は両者で完全に一致していた。ま
た、cDNAの5′−末および3′−末の非翻訳領域について
も第１図に示した塩基配列と完全に一致していた。この
ことから、本発明のDNA鎖はダイズグリシニンA2B1aサブ
ユニットタンパク質をコードしている染色体DNAと判断
した。
較したところ、イントロンが３個所挿入されているが、
エキソンの塩基配列は両者で完全に一致していた。ま
た、cDNAの5′−末および3′−末の非翻訳領域について
も第１図に示した塩基配列と完全に一致していた。この
ことから、本発明のDNA鎖はダイズグリシニンA2B1aサブ
ユニットタンパク質をコードしている染色体DNAと判断
した。
この26種の色々な程度にA2B1a遺伝子の5′フランキング
領域を欠損したクローン群から、BamHＩとHpaIIでDNA断
片を除いた。一方、A2B1a cDNAクローン[Momma, T.et
al; FEBS LETTERS,188:117(1985)]からHpaIIとPstＩに
より5′上流域を欠損するcDNA断片を切り出した。次
に、A2B1a遺伝子の上流域から74番目のアミノ酸Glnをコ
ードする塩基の後で切断されたDNA断片を持つ上記pUC11
9群の各クローンにA2B1a cDNAクローンのHpaII／PstＩ
断片（5′末を欠損したcDNA］をT4DNAリガーゼを用いて
結合した後、3′末のPstＩ切断部位をMung beanヌクレ
アーゼ処理し、次いでクレノー酵素処理してブラント型
末端に加工した。このDNA断片をさらにPvuIIで切断し、
同様な酵素処理によりブラント型末端とした後、BamHＩ
リンカーを5′および3′末端にT4 DNAリガーゼを用いて
連結した。BamHＩ処理後、酵母／大腸菌シャトルベクタ
ーであるYEp13プラスミド[Broach,J.R.,Strantherm, J.
N. and Hicks,J,B.;Gene,8,121(1979)]のBamHＩ部位に
挿入することにより、A2B1a遺伝子の5′上流域を種々の
程度に欠損し、しかも完全なA2B1a cDNAの配列をもつ一
連のクローン群（26クローン）を作製した。
領域を欠損したクローン群から、BamHＩとHpaIIでDNA断
片を除いた。一方、A2B1a cDNAクローン[Momma, T.et
al; FEBS LETTERS,188:117(1985)]からHpaIIとPstＩに
より5′上流域を欠損するcDNA断片を切り出した。次
に、A2B1a遺伝子の上流域から74番目のアミノ酸Glnをコ
ードする塩基の後で切断されたDNA断片を持つ上記pUC11
9群の各クローンにA2B1a cDNAクローンのHpaII／PstＩ
断片（5′末を欠損したcDNA］をT4DNAリガーゼを用いて
結合した後、3′末のPstＩ切断部位をMung beanヌクレ
アーゼ処理し、次いでクレノー酵素処理してブラント型
末端に加工した。このDNA断片をさらにPvuIIで切断し、
同様な酵素処理によりブラント型末端とした後、BamHＩ
リンカーを5′および3′末端にT4 DNAリガーゼを用いて
連結した。BamHＩ処理後、酵母／大腸菌シャトルベクタ
ーであるYEp13プラスミド[Broach,J.R.,Strantherm, J.
N. and Hicks,J,B.;Gene,8,121(1979)]のBamHＩ部位に
挿入することにより、A2B1a遺伝子の5′上流域を種々の
程度に欠損し、しかも完全なA2B1a cDNAの配列をもつ一
連のクローン群（26クローン）を作製した。
これらのクローンを、酵母(Saccharomycescerevisiae,
JHC8-24C株；ura3-52, his3-11,his3-15,leu2-3, leu2-
112, ino1-13, ino4-8)にトランスフォーメーションし
た。トランスフォーメーションは酢酸リチウム法[Ito,
H. etal; J.Bacteriol. 153,163(1983)]によった。形質
転換体のスクリーニングは２％グルコースを含むYNB最
小培地上での該酵母の生育［ロイシンを欠く培地上で生
育出来るようになる］により、一次スクリーニングし
た。陽性クローンをYPD培地で増殖させたオーバナイト
・カルチャー(overnight culture)から菌を集め、Zymol
yase 60000を用いてプロトプラストにした後、２％SDS
を加えて溶菌し、１mgのプロナーゼＥを含む水を加えて
30℃，30分間インキュベートした。次いでフェノール処
理後、常法に従ってエタノール沈殿を行なった。RNaseA
処理後、0.5μgをニトロセルロース上に変性吸着させ、
A2B1a cDNAクローンをニックトランスレーションにより
標識したものをプローブとして、ドットハイブリダイゼ
ーションを行ない二次スクリーニングとした。
JHC8-24C株；ura3-52, his3-11,his3-15,leu2-3, leu2-
112, ino1-13, ino4-8)にトランスフォーメーションし
た。トランスフォーメーションは酢酸リチウム法[Ito,
H. etal; J.Bacteriol. 153,163(1983)]によった。形質
転換体のスクリーニングは２％グルコースを含むYNB最
小培地上での該酵母の生育［ロイシンを欠く培地上で生
育出来るようになる］により、一次スクリーニングし
た。陽性クローンをYPD培地で増殖させたオーバナイト
・カルチャー(overnight culture)から菌を集め、Zymol
yase 60000を用いてプロトプラストにした後、２％SDS
を加えて溶菌し、１mgのプロナーゼＥを含む水を加えて
30℃，30分間インキュベートした。次いでフェノール処
理後、常法に従ってエタノール沈殿を行なった。RNaseA
処理後、0.5μgをニトロセルロース上に変性吸着させ、
A2B1a cDNAクローンをニックトランスレーションにより
標識したものをプローブとして、ドットハイブリダイゼ
ーションを行ない二次スクリーニングとした。
上記のスクリーニングで陽性であったクローンを各5′
欠損遺伝子クローン（26種）について得たので、これら
の転換体でのグリシニンA2B1aの発現を転写産物および
翻訳産物の解析により検討した。転写産物の解析は、A2
B1a mRNAの発現を、前述のニックトランスレーション標
識したA2B1a cDNAをプローブとして、ドットハイブリダ
イゼーションおよびノーザンブロットハイブリダイゼー
ション法により検索した。
欠損遺伝子クローン（26種）について得たので、これら
の転換体でのグリシニンA2B1aの発現を転写産物および
翻訳産物の解析により検討した。転写産物の解析は、A2
B1a mRNAの発現を、前述のニックトランスレーション標
識したA2B1a cDNAをプローブとして、ドットハイブリダ
イゼーションおよびノーザンブロットハイブリダイゼー
ション法により検索した。
訳産物の解析は酵母菌体溶菌上清のウェスタンブロット
法によった。なお培養菌体からのRNAの抽出はElderらの
方法によった。転写産物の5′末端の決定はＳＩヌクレ
アーゼマッピング法[Berk, A.J. and P.A. Sharp; Cel
l. 12,721(1977)]に依った。これらの結果から、グリシ
ニン遺伝子の調節領域は、酵母(Saccharomycescerevisi
ae, JHC8-24C株）中で機能し、酵母菌体から抽出したグ
リシニンmRNAの5′末端配列は、登熟期のダイズ種子か
ら抽出したそれの5′末端と完全に一致した。また、転
写産物の大きさも約1.7Kbとインタクトのそれと一致し
た。一方、ウェスタンブロットによる翻訳産物は、分子
量が約61Ｋドルトンであった。この大きさは、登熟期ダ
イズ種子から抽出したmRNAを用いて行なったグリシニン
翻訳産物の分子量と一致した。これらの結果は、酵母中
でグリシニン遺伝子の調節領域が機能していることを示
している。そこで、様々な程度に5′末端を欠損したグ
リシニン遺伝子［グリシニン遺伝子の5′フランキング
領域＋グリシニンA2B1a cDNA]での転写および翻訳活性
の強さを検索した結果、転写開始点（図中（＋）１）よ
り上流535塩基以上では、転写・翻訳活性に影響がない
が、535塩基から下流を欠損するに伴って上記両活性は
徐々に低下し、転写開始点から上流120塩基を欠損した
場合はその活性のほとんどを喪失した。これらの結果か
ら、グリシニン遺伝子の完全な発現には表１に示した塩
基配列を含む遺伝子の5′上流域が必要であることを認
めた。
法によった。なお培養菌体からのRNAの抽出はElderらの
方法によった。転写産物の5′末端の決定はＳＩヌクレ
アーゼマッピング法[Berk, A.J. and P.A. Sharp; Cel
l. 12,721(1977)]に依った。これらの結果から、グリシ
ニン遺伝子の調節領域は、酵母(Saccharomycescerevisi
ae, JHC8-24C株）中で機能し、酵母菌体から抽出したグ
リシニンmRNAの5′末端配列は、登熟期のダイズ種子か
ら抽出したそれの5′末端と完全に一致した。また、転
写産物の大きさも約1.7Kbとインタクトのそれと一致し
た。一方、ウェスタンブロットによる翻訳産物は、分子
量が約61Ｋドルトンであった。この大きさは、登熟期ダ
イズ種子から抽出したmRNAを用いて行なったグリシニン
翻訳産物の分子量と一致した。これらの結果は、酵母中
でグリシニン遺伝子の調節領域が機能していることを示
している。そこで、様々な程度に5′末端を欠損したグ
リシニン遺伝子［グリシニン遺伝子の5′フランキング
領域＋グリシニンA2B1a cDNA]での転写および翻訳活性
の強さを検索した結果、転写開始点（図中（＋）１）よ
り上流535塩基以上では、転写・翻訳活性に影響がない
が、535塩基から下流を欠損するに伴って上記両活性は
徐々に低下し、転写開始点から上流120塩基を欠損した
場合はその活性のほとんどを喪失した。これらの結果か
ら、グリシニン遺伝子の完全な発現には表１に示した塩
基配列を含む遺伝子の5′上流域が必要であることを認
めた。
［発明の効果］ 本発明のDNA鎖は宿主細胞、特に植物細胞中において強
力なプロモーター機能を有するので、遺伝子組換え技術
において外来遺伝子を宿主細胞中に導入し、これを発現
させる場合に有効に利用することができる。
力なプロモーター機能を有するので、遺伝子組換え技術
において外来遺伝子を宿主細胞中に導入し、これを発現
させる場合に有効に利用することができる。
第１図はグリシニンA2B1aの遺伝子の完全構造を示した
ものである。
ものである。
Claims (1)
- 【請求項１】プロモーター機能を有し、かつ下記の塩基
配列を有することを特徴とするＤＮＡ鎖。 5'-ATATACAGTACAAATTATTCTCTACTAATCTTTATGATATG TAAACCAAAGCATGATTAATTATTTCCTAATTAAATTAAAAAAA ATTGAGTAACTAGTATCACATAAAGATCTGTCAAAACCATGAAT AGTGATAATTTCATAACACCTAATAATTTCTCTATCCCTAGAGT GAGGTCATTTTTGGACGGCCCTTCTTCTCACTTTGAGGATCCCA TCATTGTCACACGGTGTATTCATATAATTTCATATGTCATAAAC CCGCGAACATGAAATGAAACCATGGTCCCCCTCTCCACCACCGT TTTCTGGCAATTGCATGCAATACAAACACACTTGGTATTTGTCA CATAATGTTGATGTCGAACTGTCGAAGCCACCTCACACCCATGA ACTTAATGAGGTGTAACACACAAGGCTTCCATAGCCATGCATAC TGAAGAATGTCTCAAGCTCAGCACCCCACTCCTGTGACGTGTCC CTCACCCACCTTCCTCTCTTCCCTATAAATAACCACGCCTCAGG TTCTCCGCTT-3'
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15558187A JPH062064B2 (ja) | 1987-06-24 | 1987-06-24 | 新規なｄｎａ鎖 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15558187A JPH062064B2 (ja) | 1987-06-24 | 1987-06-24 | 新規なｄｎａ鎖 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH012578A JPH012578A (ja) | 1989-01-06 |
| JPS642578A JPS642578A (en) | 1989-01-06 |
| JPH062064B2 true JPH062064B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=15609173
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15558187A Expired - Lifetime JPH062064B2 (ja) | 1987-06-24 | 1987-06-24 | 新規なｄｎａ鎖 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062064B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2092069A1 (en) * | 1992-03-27 | 1993-09-28 | Asako Iida | An expression plasmid for seeds |
-
1987
- 1987-06-24 JP JP15558187A patent/JPH062064B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS642578A (en) | 1989-01-06 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |