JPH01259256A - 血液サンプルの細胞成分を分離する改良方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、一般に、リンパ球のような一定の血液細胞の
診断試験を行うための細胞成分の分離に関する。さらに
詳しくは、本発明は分析すべき血液細胞の混入のような
加齢（ニージンクりしつつあるまたは加齢された血液に
付随する問題を実質的に克服する血液分離方法に関する
。

リンパ球は体の免疫系に大きな役割を果たしている。リ
ンパ球は収集され免疫機構の化学的・生理学的性質を決
定する研究活動の主要部分において使用される。例えば
、リンパ球は癌および自己免疫病の研究の重要な部分を
なし、モノクローナル抗体技術に重要である。最も基本
的な意味において、リンパ球は感染に対する体の防御に
絶対必要な白血球である。

白血球、特にリンパ球の持つ意義のために、ヒトの血液
からのリンパ球の単離は種々の診断試験に臨床的に必要
とされる。そのような試験の中には機能試験、父親決定
試験や組織分類が含まれる。

さらに、免疫能力の評価をリンパ球の亜型（ＳＵｂ−ｔ
ｙｐｅｓ）と比率の分析を通して行うことかできる。こ
の分析はエイズ（ＡＩＤＳ）の診断に有意義であり、他
の多くの慢性感染症およびしはしは末期的感染症の予知
を可能にする。これらの細胞性試験は癌治療に使用され
る免疫調節をモニターするのにも使用される。さらに、
白血球、特にリンパ球を正確に測定することは組織適合
性を決定する上で決定的に重要である。また、リンパ球
の機能の分析はその型と免疫抑制に必要な薬物療法のレ
ベルを決定する必要があるが、この分析も非常に重要で
ある。

一定の型の血球、特定の細胞、通常はリンパ球、は他の
望ましくない細胞から分離し分析のために単離しなけれ
ばならない。血球は密度によって分離し分類することか
できるか、当業者を悩ませてきたのはこのリンパ球を他
の細胞から分離し単離することである。゛ 一般に、血液標本を患者から抽出し試験管内に放置する
と血球は大きさと密度が変化し、密度による細胞分離が
複雑になる。特に、−旦血液を取り出すとこのサンプル
は殆ど瞬時に分解工程を開始し、他の細胞成分より壊れ
やすい顆粒球（ｇ　ｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）が急速に大
きさと密度の変化を受ける。この分解の結果、顆粒球は
リンパ球と単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）の密度集団に移動
し始める。この望ましくない移動のためリンパ球と単球
の密度による分離が複雑になる。血球の抽出と分離の間
の時間間隔がさらに増すとこの問題は複雑化するだけで
ある。すなわち、血球抽出から細胞分離までの時間が増
すとリンパ球集団には望ましくない顆粒球の混入が増加
する。その結果、リンパ球および単球集団にも望ましく
ない顆粒球が存在するのでリンパ球の診断試験を正確に
行うことかできない。

さらに詳しくいうと、種々の正常および異常血液サンプ
ルの観察を通して所定の細胞型密度集団内の細胞の密度
に幅広い変異性が現に存在することが発見された。事実
、血漿中を理論的沈降速度条件下で移動する血球サンプ
ルの密度分布を数学的に考察すると各細胞型はその密度
集団幅に亙ってカラスの正規分布をしており顆粒球が裾
野部分の赤血球と重複し、リンパ球が裾野部分の顆粒球
と重複し、単球か裾野部分と重複している。

細胞密度の重複か増加すると予想される方法が幾通りか
ある。試験管内加齢は細胞型の重複が起きる一つの方法
である。典型的細胞密度は多くの個体の平均値であるか
ら正規分布の両端にあるサンプルか顕著な重複を示すこ
とが予想される。確かに、病的な例は細胞集団の重複を
変化させることか予想され、事実、全集団を変えている
。これらの条件は分離能率における変異性に重要な影響
を与えている。

血球の密度および体積の変化の原因とな′る機作につい
ては鋭意研究がなされてきた。この機作は細胞膜を通し
た輸送の三つの重要な面、すなわち、拡散、促進された
輸送および能動輸送に基づいている。それらの輸送系は
種々の薬剤により活性化または阻害されることのある種
々の独立の経路を有し複雑である。Ｎａ”Ｋ＋ポンプは
そのような輸送系の一つである。

細胞環境の浸透圧の変化か細胞内外へのイオンの輸送を
もたらす結果、水の体積が必然的に変化する。この水の
体積の変化は細胞の大きさおよび密度の変化への第−義
的な影響を与える。細胞体積の調節の詳細な説明は「ヒ
オヒミ力・エト・ヒオヒュジ力・アクタ、第７７４巻（
１９８４年）第１５９−１６８頁、エルセピア・サイエ
ンス・パブリシャーズ社」に記載されている。Ｄ、リッ
クウッド博士編「ヨウ化密度勾配媒体、アイアールエル
プレス社」の第７章に密度勾配液体細胞分離の技術と方
法の詳細な説明がある。同刊行物には浸透圧が１０％増
加すると理論的には細胞の半径が２．２％減少し、それ
に伴って細胞密度が０゜４％増加する。リックウッド博
士は「ニコデンッ」とＮａＣＩの使用により分離媒体の
密度および浸透圧が独立に調節されることを述べている
。ニコデンツは米国ニューヨーク州つェストベリ在アキ
ュレート・ケミカル・アンド・サイエンチフイッり・コ
ーポレーション社の市販する密度勾配媒体に対する登録
商標名であり、このものは分子量が８２１で密度が２．
１ｇ／ｍｌである。化学的分類名はＮ、Ｎ−ヒス（２，
３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジ
ヒドロキシプロピル）アセタミド］−２，４，６−トリ
ヨードイソフタルアミドである。この媒体をリンパ球か
ら単球を分離するのに使用することが記載されているだ
けでなく、浸透圧が増加するにつれて単球の純度が変化
する。沈降勾配が使用された。

液体勾配媒体を使用する細胞の分離では三つの型の勾配
を使用している。第一のものは沈降勾配である。沈降速
度の変化があるため、所定の時間内に分離すべき細胞の
一群は試験管底に集まるが、別の群は上溝液体中に留と
まる。第二および第三の分離型は浮遊密度勾配である。

これらのうち、前者は不連続勾配である。すなわち、サ
ンプルを勾配の最上層に置く。沈降後、−群の細胞が勾
配液体の最上層に存在し他の群の細胞が密度勾配液体の
中または下に存在する。後者の浮遊密度勾配は連続勾配
と呼ばれる。この媒体では遠心すると媒体中の大きな分
子が媒体底部へ向かって移動し連続密度勾配を生じる。

この媒体中の細胞はそれぞれの密度に従って勾配中にそ
の位置をしめる。

そこで、上記のように密度集団の重複が予想され、その
ようなものとして、本明細書で第一に関心のある分野は
連続勾配を使用する細胞分離方法である。

ゲル分離法の機作は従来の浮遊密度分離法とは基本的に
異なる。すなわち、ゲル分離法では、ゲルは遠心力下に
試験管底から赤血球の塊により移動させられ、圧縮され
たときにその密度が１．０９ｇ／ｍｌに達する。密度が
約１．０５５−１゜０８０　ｇ　／　ｍ　］のこのゲル
は圧縮された塊が成長するに従って試験管内を浮力によ
り上昇する。ゲルは細胞懸濁液がゲルの密度に近似する
位置に最終的に沈澱する。すなわち、赤血球、白血球お
よび血漿の組み合わせがゲルの密度に等しいかまたは実
質的に同等の密度を示すレベルに落ち着く。

上記平衡点において伸長したゲル塊は赤血球の塊の浮力
により下から支えられている。ゲル塊最上部の細胞懸濁
液はゲル塊自体よりも密度が低い。

この状況により遠心するとゲルは自重により圧縮される
。圧縮されるとゲルは試験管の中心に向かって内側に押
され、ゲル塊が収縮ないし閉じる速度およびその程度は
細胞勾配の速度によって規制される。

ゲルの密封が起きると細胞の流れが弱まり、しはしはゲ
ル塊に捕捉された細胞の細い流れとなり、本質的に大理
石模様を形成する。ゲルの下方に捕捉された血漿は細胞
がゲルの下で圧縮されるにつれて泡を形成し易く、その
大きさが十分に大きいとゲル中を上昇してゲル表面にい
わゆる「熱熔岩模様」を生じる。次いで、ゲルは血漿の
抜けたスペースを埋めるように沈澱する。

ケル閉塞か起きる条件、すなわち、細胞勾配の浮力かゲ
ルを圧縮する浮力よりも下がる条件を数学的に近似する
ことができる。当然、平衡点ではこれらの浮力は等しい
。系が勾配に作用している点を無視すると概念を単純化
できる。従って、そのようにして密度と存在する相の体
積百分率との積の和を等しいと置くことができる。赤血
球は見掛は密度が約１．１０ｇ／ｍｌであり、白血球の
密度は約１．０７５ｇ／ｍｌ、血漿の密度は約１゜０２
７ｇ／ｍ！であり、ゲルの密度は約１．０５５−１．０
８０ｇ／ｍｌの範囲である。二つの境界条件、すなわち
、一方は全白血球に対するものであり、他方は全赤血球
に対するものであるが、これらの条件は上記の白血球お
よび赤血球に対する密度の値を使用し、かつゲルに対す
る密度の値を人為的に選択して１．０６５ｇ／ｍ＋とし
て以下の通り定義することができる。

血漿と白血球だけの場合、 １．０７５（Ｘ）　＋　１．０２７（＋−Ｘ）　＝　１
．０６５　Ｑ）（ただし、Ｘは白血球の百分率（％）を
表す。）・（１，０６５−１，０２７）　−（１，０７
５−１，０２７）・−０，７９−−７９％白血球 血漿と赤血球だけの場合、 １．１０（Ｘ）　　＋　１．０２７（１−Ｘ）　　・　
１．０６５　　（α）（ただし、Ｘは赤血球の百分率（
％）を表す。）・（１，０６５−１，０２７）　−（１
，１０−１，０２７）・−０，５２・−５２％赤血球 従って、密度が約１．０６５ｇ／ｍｌのゲルを使用する
場合は、そのゲルは血漿中に懸濁液中の細胞の混合状態
に応じて約５０−８０％の充填細胞体積を持つ細胞懸濁
液流に接すると閉塞する。

ゲル密度が変化すると境界条件が変化するのは明らかで
ある。

粘性液体中で重力下に運動する球状粒子の終端速度を数
学的に近似する等式を展開することもできるか、この等
式は単一粒子に対してだけ適用できる。そのような等式
から速度は粒子と媒体の密度差の直接関数であり、粒径
の二乗の直接関数であり、媒体の粘性の逆関数である。

しかしながら、この等式を各細胞型に適用したとすれば
予測される結果は実際の相分離において起きてし八る結
果と若干矛盾するようである。実際の分離工程では赤血
球が最初であるようだ。

この現象は細胞の懸濁液の密度が高いため大量の細胞流
か生じ、多くの赤血球が等しい集団径で＝２０− 一団となって行動するという観察で説明されていた。赤
血球が最初と最後になりそうであるとみなされてきた。

すなわち、最初になるのは集合および大量効果の故であ
り、最後になるのは分離中に細胞懸濁液が薄くなるにつ
れて個々の細胞が上記等式に従って最小の細胞が最後に
到達するように移動するからである。従って、細胞懸濁
液勾配の前端は裾野端とは異なる影響の下に移動する。

従って、赤血球の混入が必然的に予測される。

懸濁された細胞が充填された細胞集団に接近するにつれ
て本来小さい細胞よりも速く移動する大きい細胞が細胞
懸濁液の密度増加のために移動速度が低下し始める。赤
血球濃度約６０％では懸濁液の密度はリンパ球の密度に
近付く。そのような流れは開いたゲルを支持するのに十
分な密度を持っているので、白血球の移動はそれらの密
度に応じて、低下したり逆方向になるが依然としてゲル
上方でゲルが閉じる前の位置にあることが予想できる。

分離工程のこの段階で下方に移動しつつある多数の赤血
球がそのような白血球の上に積み重なってこの動作に対
抗しようとする。白血球は赤血球を停滞させるのでこの
挙動は少なくとも部分的に赤血球の混入をも説明してい
るかも知れない。

すなわち、細胞は個々の相の密度に応じて層を形成し始
める。従って、この意味で濃縮された細胞懸流液は独自
の密度分離勾配として作用する。ゲルは平衡に到達する
前に閉じるが、実質的密度分離か起きる前は閉じない。

ゲルの密度が増加するとゲルは試験管内で下方に位置し
圧縮力の増加のため閉塞が早く起きることか予想できる
。この動作はゲルの密度が増加するにつれて細胞の収率
が大きくなることによって実証される。例えば、密度ｔ
、ｏｓ５ｇ／＋ｎｌのゲルでは７０−８０％になり得る
。この収率の利点は高純度の相分離を望む場合は、分離
されたリンパ球の純度が逆に作用するので、失われるこ
とがある。従って、これらの二つのパラメータの間で最
適の選択をしなければならない。上記の議論に鑑み、大
多数のサンプルの純度が９０％を超えることを要求する
適用はゲルの物理的性質を変えるたけでは満足すること
ができない。

−旦ゲルが密封されると個々の細胞はゲルと置換するの
に十分な密度を持たない。従って、細胞が血漿（密度：
１．０２７ｇ／ｍ＋）から出てゲル（選択された密度：
　１．ｏ６ｓｇ／ｍｌ）に入るにつれて細胞の相対密度
は無視し得る。ゲルの粘度は血漿の約１００，０００倍
であるが、これによりさらに細胞の速度が減少する。従
って、血漿中２インチを数分間で移動する細胞はゲル中
にそれ自体の直径の深さに沈むのに数日を要することに
なる。換言すると、ゲルは閉じる扉を持っており、その
扉より上方の細胞を除去できる状態においている。その
ような細胞はリンパ球に富む赤血球と白血球の混合物か
ら成る。

従来の液体密度分離媒体とは異なり、ゲル媒体は浮遊密
度分離法においては個々の細胞には作用せず、懸濁液中
の変化する細胞勾配の平均浮遊密度に基づいて試験管内
に位置を占める。細胞型の相対速度と細胞自体の浮遊密
度効果の双方によりゲルの最上部にある細胞はリンパ球
に富む。赤血−２３＝ 球混入は細胞溶解により除去することができる。

精製にはゲルの分離活性を補充するために化学薬剤を添
加することが必要である。

個々の細胞が浮遊密度平衡に到達しない限り細胞直径は
、上記の速度等式中に直径の二乗のパラメータが含まれ
ているために、ゲル媒体分離に重大な影響を及ぼすかも
知れない。しかしながら、細胞塊と濃縮された細胞懸濁
液は運動しているので、いつ速度効果が浮遊密度効果に
置き換えられるかを判定することは困難である。さらに
、下降する赤血球の流れに抗して白血球が上昇すること
を妨げる赤血球の捕捉効果の評価も困難である。

加齢が細胞、特に顆粒球の直径の増加を引き起こし、細
胞の大きさを強制的に減少させると加齢血液サンプルの
分離を顕著に改善することが知られている。この場合、
加齢効果は密度変化よりも５倍の直径変化を起こし、密
度は細胞が大きくなるにつれて減少する。例えは、２．
２％の直径変化の結果細胞沈降速度は５％変化する。

典型的な血液細胞の直径を見直すと、顆粒球の範囲がリ
ンパ球の範囲内に入り、単球が顆粒球の高い方の端と重
なる。赤血球の直径は最小のリンパ球の直径にほぼ同等
である。従って、細胞直径の範囲にかなりの重複がある
。それ故、適度な分離が起きることは細胞直径のほぼ一
致するので重複のずっと少ない細胞密度がゲル分離工程
において重要な役割を果たしていなければならないこと
を示している。従って、速度が沈降の状態を調節し、分
離工程の第一次的初期機作を構成しているが、分離工程
の後半、すなわち細胞濃度勾配が高くかつ依然としてゲ
ル閉塞位置上方に在るときは、密度がより主要な分離機
作となっている。細胞懸濁液が主に赤血球から成るとき
はこの細胞懸濁液が分離勾配媒体となる。

密度に従って赤血球を分離する公知方法の一つは、イオ
ン密度分離媒体を使用する方法である。

この媒体のイオン的性質が加齢されたまたは加齢しつつ
ある血液に付随する密度変化を較正すると言われている
。公知のイオン密度液体分離媒体のなかではフィコール
パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）（登録商標）が最
も有効であるようだ。

それは細胞成分密度の自然減少に抵抗すると思われるか
らである。フィコールパックは比重が１゜０７７のニュ
ートン液体でありスエーデン国つプサラ市在ファルマシ
ア・ファイン・ケミカルス・ＡＢ社により市販されてい
る。

リンパ球や単球のような単核細胞をフィコールパックを
イオン密度媒体として使用して血液標本から単離する典
型的な方法は下記の工程、即ち、所定量のフィコールパ
ックを試験管の底部に分散させる工程、 該フィコールパック上に全血または希釈血のサンプルを
ピペットで移す工程、 該血液サンプルとフィコールパックを約４００−５００
ｇで約３０−４０分間遠心する工程、および リンパ球および単球を該フィコールパック相からピペッ
トで移し取る工程 を含む。

しかしながら、この方法は種々の理由から改良できるこ
とが発見された。第一に、血液ザンプルヲフイコールパ
ック液上に最初にピペットで移す間に白血球が偶然に該
フィコールパック液面下に展開したならば比重の減少し
たフィコールパックはリンパ球と単球を分離するには不
十分である。

第二に、遠心中に血液中のより軽い相がフィコールパッ
ク媒体に運び込まれるとそれらの相は該フィコールパッ
クを通して上昇することかできない。それは４００−５
００ｇでは浮力が小さいからである。

第三に、フィコールパック液は幾分水溶性であり遠心速
度が大きくなると血液中へのフィコールパックの溶解度
が増加し比重か低下するので約４００−５００ｇより大
きい遠心力は使用できない。

換言すると、希釈血液サンプル中の水分がフィコールパ
ック密度媒体を希釈しようとし、そのため密度が変化し
良好な分離が妨げられる。

第四に、遠心が完了するとフィコールパック液の最上部
からのリンパ球と単球の撤去を注意深く行う必要がある
。これは該液のニュートン液体の性質の故である。

最後に、この分離技術は完了に最低限１−２時間を要す
るのでもつと時間的に有効な技術が切望される。

血液サンプルが液体密度媒体にピペ・ントで移されると
きに血液サンプルと液体密度媒体の間の表面接触を防止
するために仕切り装置が使用された。

このような装置は液体密度媒体を仕切りの下に押さえて
遠心が起きるまで血液サンプルと液体密度媒体との相互
作用を防止する。仕切り装置は多孔質または不透性であ
ることが知られている。

不透性の仕切りはさらに遠心の際に仕切りを自動的に開
く機構を必要とする。これらの仕切りは−・般にプラス
チック、エラストマー、発泡体および揺変性ゲル（ｔｈ
ｉｘｏｔｒｏｐｉｃ　　ｇｅｌ）から製造されると開示
されている。

これらの仕切り装置はフイコールノく・ンクのようなニ
ュートン液体を使用する細胞分離法に付随する問題の一
つに対する十分な解決を提供するものの、さらに改良す
るために他の代替法も依然として望まれている。

従って、もう一つの細胞分離技術はニュートンゲル密度
分離媒体を使用している。これらのゲルは典型的には充
填剤と一緒に使用しなければならない。しかしながら、
ニュートンゲルが高分子樹脂から製造されるときは充填
剤はわずかじかまたは全く使用しない。この場合、高粘
度液体またはゲルは重合の自然の結果であるから充填剤
を使用しなくても適当な密度を得ることができる。これ
らの充填剤のない型のゲルは本質的に疎水性であり、そ
のため選択された密度の媒体と一緒に使用される水性試
薬からの分離を必要としない。これらの試薬の詳細な説
明は以下に述べる。

このように、ニュートンゲルの疎水性のためそれらのゲ
ルは細胞分離の密度媒体に対する完璧な候補になるが、
該ゲルは実際は不満足であることが解る。それはそれら
に特徴的な不安定性のため輸送されるべき血液サンプル
に対する障壁として使用することができないからである
。

ニュートンゲルが充填剤と一緒に使用されるときは得ら
れるゲルは不満足である。それは定義によりケルを結合
する結合部位が不十分にしがないからである。さらに、
これらの充填剤は水を吸収し易いが、これは以下に述べ
る理由で致命的である。さらに好適な細胞分離技術は密
度媒体として揺変性ゲルを使用する方法である。

例えは、米国特許第３，８５２，１９４号公報明細書に
は血液サンプル中存在する軽い層を重い相から分離すべ
き二相の比重の間の比重を持つ揺変性のゲル様材料を使
用して分離する方法の一般的記載かある。このゲルと血
液サンプルは一緒に遠心され、遠心操作の間ゲルは十分
に流動して分離すべき相間に障壁を形成する。この障壁
はその上に留とまる相を従来の実験室技術により除去す
るのを可能にする。

上記米国特許は広範囲のゲル様物質の利用を示唆してい
る。それらの材料に対して要求される属性として引用さ
れている三つの基準は下記の通りである。

（ａ）分離しようとする二相の間の比重（ｂ）分離しよ
うとする相に関して化学的に不活性 （ｃ）静止時は本質的に非流動性（半固定）同様に、米
国特許第３，９２０，５４９号公報明細書には同第３，
８５２，１９４号公報明細書の方法の変形例と改良方法
が開示されている。この改良方法はゲル様物質の比重よ
りも大きいの固体要素を使用している。遠心中は、「付
勢子」（ｅｎｅｒｇｉｚｅｒ）と呼ばれる固体要素が普
通血液捕集管の底に置かれるゲルを押し、管壁に沿うゲ
ルの上昇運動を容易にする。そのようにして付勢子が血
液画分の分離を促進し相間のよりきれいな分離を可能に
する。

同様に、米国特許第４，１９０，５３５号公報明細書に
開示の技術は明らかにリンパ球、単球および血小板を凝
固阻止処理血液から抽出する手段を対象としている。こ
れには三つの基本的な工程が関与している。すなわち、 （ｉ）血液成分に対して化学的に不活性であり比重か約
１．０６５−１．０７７ｇ／ｍｌの水不溶件部変性ゲル
様物質を凝固阻止処理血液のサンプル中に置く工程、 （２）ゲルー血液ザンプルを少なくとも１２００Ｇの力
で十分な時間遠心して該ゲル様物質が重い血球と血漿、
血小板、リンパ球および単球との間に障壁を形成するよ
うにする工程、および（３）血漿、血小板、リンパ球お
よび単球を該障壁の最上部から撤去する工程。

１２００Ｇを超える遠心力下で障壁を形成する能力を有
する揺変性の非ニユートン性水不溶性ゲル様物質を使用
することにより米国特許第４，１９０．５３５号公報明
細書に開示の方法はより速い分離方法およびフィコール
バック液で得られるよりもより完全な分離を提供する。

揺変性ゲルを使用することにより得られる有利な結果は
基本的に該ゲルがしはしば遠心を含む撹はん下にのみ移
動可能であるこ稈に帰される。従って、全血または希釈
血標本を、揺変性ゲルと一緒に該ゲルの疎水性により遠
心の前に何等相互作用を起こすことなく、管の中に注入
することができる。この特性だけが揺変性ゲルの優秀性
の証拠である。さらに、揺変性ゲルを使用すると高速遠
心を使用することができ、ごく短時間に遠心を起こすこ
とができる。それは、この型のゲルは遠心中に成分に分
離したり水相で希釈されことがないからである。勿論、
フィコールパックのようなイオン性液体媒体に対する４
００Ｇの遠心速度と異なり、１２００Ｇ近辺の遠心速度
を使用することができる。さらに、遠心時間は３０−４
０分間（フィコールパック）から約１０分間（揺変性ゲ
ル）に短縮される。

揺変性ゲルは本質的に油と典型的には充填剤粒子を含有
する樹脂とから調製される。このように、揺変性ゲルは
イオン性液体とニュートンゲルに対する改良であるが、
充填剤粒子によりこれらのゲルに水が存在することが結
合部位の数、従ってゲルの粘度を変えるのに顕著な効果
がある。このようなゲルの粘度の変更は十分な期間貯蔵
した後の生成物の分離性能に影響することがある。さら
に、　□揺変性ゲルは典型的には非常に浸透圧が低く細
胞密度の変化を較正することができない。

しかしながら、揺変性ゲルを血漿の浸透圧を変更する化
学薬剤と一緒に使用して細胞の直径と細胞の密度を変え
ることか可能である。

さらに詳しくいうと、細胞の直径と細胞の密度を変える
化学薬剤の使用により血漿の浸透圧を変えることか可能
である。このように、与えられた細胞型の細胞をその細
胞型の集団の中心に向けて移動させ、密度の範囲を縮め
ることができる。その移動は細胞集団の重複の程度を少
なくする効果を持つ。例えは、リンパ球の沈降状態を導
く大きなリンパ球は集団のリンパ球中心に向かって引き
戻すことかできる。小さい裾野の顆粒球は顕著な影響を
受けない。それはそのような高浸透圧薬剤処理は密度の
比較的小さい細胞には効果がないからである。しかしな
がら、同時に、大きな顆粒球の密度は顆粒球集団の中心
に向かって移動するように変えられる。この後者の動作
は、さもないと浮力密度効果のため大きな顆粒球が赤面
球塊から上方に移動を強制される分離工程の終わりでは
重要になる。全体的結果は、密度／大きさ調整剤の使用
により分離工程中にリンパ球は引き戻され、顆粒球は管
を降下するのを促進される。つまり、細胞型は大きな分
離距離を与えられているので、ケルはリンパ球集団中に
顆粒球が捕捉されることがなく閉しることができ、純度
を改善することかできる。

特に、米国特許出願第９２３，９０９号明細書には新鮮
または加齢凝固阻止処理血液サンプルを低分子量有機お
よび／または無機イオン性物質を含有する高調液および
／または親油性置換基を含有していてもよい分子を有す
る高分子物質を含有する等調液または高調液を混合し、
該血液サンプルと該液との接触を約１分間以上維持する
ことか一般的に記載されている。

一般に、この方法はゲル分離媒体を使用して顆粒球を含
む白血球の浮遊密度の見掛けの変化を阻止することによ
って凝固阻止処理したヒト血液サンプルからのリンパ球
と単球の純度または品質を維持するための方法である。

＝３５＝ 以上は血漿の細胞密度と細胞直径を変えるのに使用され
る化学薬剤の一例である。たいていの水溶性安定化試薬
を揺変性ゲルと直接接触して使用すると性能の低下の可
能性を生じるが、美観上の問題を提起するゲルの外観か
変化する可能性も生しる。ゲルがある時間水性試薬また
は媒体と接触すると水が充填剤粒子を膨潤させて水性界
面においてゲルの白い層として見える大きさになる。時
の経過とともにこの白色化がゲル塊全体に進行する。吸
収された水の塊が顕著であればゲル密度が減少する。

細胞培養培地の添加は、抽出と同時に血液サンプルに添
加されれば、細胞の退化を最小にするイン・ヒポ型の環
境を提供する。この場合、ＲＰＭ１１６４０のような細
胞培養の全血への０．５：ｌ希釈をすると非イオン性密
度分離媒体とともに使用すると血液抽出徒長期間に互っ
て良好な分離が可能になる。安定化試薬を使用しないと
１５−３０分以内に汚染の増加が観察し得る。全血に対
する安定化試薬の希釈率を増加すると血液抽出と細胞分
離の間の良好な分離性能に対する有効時間か増加する。

安定化試薬を全血に対して１：１に添加すると良好な性
能を得るために必要となる遠心前の時間を顕著に延長す
る。分離前に１８−２４時間の中断期間を許容するよう
な安定化試薬の量が理想的である。これにより、参考実
験室に送る前に医師が血液標本、密度媒体および安定化
試薬を含有する収集管を遠心する必要がなくなる。しか
しながら、最初の試験では２：１および３：１のオーダ
ーの希釈は２４時間後、１：１希釈よりも性能が悪かっ
た。この理由は分かつていない。

垂直管内の細胞の沈澱は細胞を安定化液から分離させ易
く、結果が良くないことも観察されている。必要な分析
を行うのに十分な細胞を得るのに少なくとも３−４ｍ１
の全血が必須であることを理解することが重要である。

これため受は入れられるゲル分離管内で実地に使用でき
る安定化試薬の量には限界がある。

［発明が解決しようとする課題］ 従って、本発明の第一の目的は、加齢されたまたは加齢
しつつある血液に付随する上記の問題を克服する種々の
血液細胞の分離方法を提供することにある。

さらに、本発明の第二の目的は、リンパ球以外の細胞の
リンパ球集団への重複を実質的に除去しながらリンパ球
を血液サンプルから分離する方法を提供する。

本発明の第三の目的は、リンパ球以外の細胞のリンパ球
集団への重複を実質的に除去しながらリンパ球を血液サ
ンプルから分離してリンパ球が診断試験を受けることが
できるようにする方法を提供する。

本発明の第四の目的は、ヒトから血液サンプルを抽出し
た後一定の血球の浮遊密度の変化を実質的に防止するこ
とにある。

本発明の第五の目的は、イオン性密度媒体を使用する方
法に付随する欠点を克服する、血液標本からリンパ球お
よび単球のような単核細胞を単離する方法を提供するこ
とにある。

本発明の第六の目的は、時間と遠心速度の観点からより
効率的な血液細胞分離または単離方法を提供することに
ある。

本発明の第七の目的は、性能低下と上記のような美観上
の問題を克服した揺変性ゲルを使用した血液細胞分離方
法を提供することにある。

本発明の第への目的は、さもないと分離性能に否定的変
化を引き起こす非イオン性密度ゲル媒体への水の移転を
除去する手段を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 広く考えると、上記の目的および利点は以下の装置を提
供することにより達成される。即ち、本発明は、未分離
全血のサンプル中の顆粒球からリンパ球と単球を分離し
浮遊密度の見掛けの変化を阻止しおよび／または顆粒球
の浮遊密度の損失を回復する装置において、 （ａ）解放端と閉塞端を有する容器、 （ｂ）該閉塞端の付近に位置し、血液構成成分に対して
化学的に不活性な、水不溶性の揺変性ゲル様物質、 （ｃ）該血液の浸透圧を変更するために提供されており
、それにより顆粒球の細胞直径と細胞密度を変化させる
、該揺変性ゲル様物質と流体連絡している化学試薬、 （ｃ＋）未分離の全血サンプルを収容するのに十分な容
積の、最初該化学試薬の付近でかつその上方にある自由
空間、および （ｅ）リンパ球および単球を顆粒球から分離する前に該
揺変性ゲル様物質による化学試薬および／または該未分
離の全血サンプルからの水の吸収を防止して該揺変性ゲ
ル様物質の細胞分離性能特性への水の吸収の影響を実質
的に除去するようにした手段、 を備えて成る装置を提供する。

本発明の別の側面によれば、浮遊密度の見掛けの変化が
阻止されるとともに顆粒球の浮遊密度の損失か回復され
る、未分離全血のサンプル中の顆粒球からリンパ球と単
球を分離する方法も提供される。この方法は下記の工程
、即ち、 ４Ｏ− （１）該血液細胞と本質的に化学的に適合し得る低分子
量有機イオン性物質を含有する高張液、該血液細胞と本
質的に化学的に適合し得る低分子量無機イオン性物質を
含有する高張液、および血液細胞用培養培地、並びにそ
れらの組み合わせより成る群から選ばれた流体と該血液
サンプルを混合する工程、 （２）血液構成成分に対して化学的に不活性の水不溶性
の揺変性ゲル様物質を上記工程（１）から得られる混合
物に導入する工程、 （３）リンパ球および単球を顆粒球から分離する前に該
揺変性ゲル様物質による該流体および／または該未分離
の全血サンプルからの水の吸収を防止して該揺変性ゲル
様物質の細胞分離性能特性への水の吸収の影響を実質的
に除去するようにした手段を提供する工程、 （４）上記工程（３）から得られる該血液−流体−ゲル
混合物を、該ゲル様物質を十分に流動させて該リンパ球
および単球と該顆粒球との間に障壁を形成させるのに十
分な力と時間、遠心する工程、および （５）該リンパ球および単球を該障壁の最上層から除去
する工程 から成る。

本願の一つの発明に従えば、該揺変性ゲル様物質による
該化学試薬および／または該未分離の全血サンプルから
の水の吸収を防止する手段は該揺変性ゲル様物質を高密
度高粘度の重合体の形成を許容し、該揺変性ゲル様物質
が水を吸収することができる有機充填剤を実質的に欠如
している有機樹脂から製造することにより提供される。

本願の別の発明に従えば、該揺変性ゲル様物質による該
化学試薬および／または該未分離の全血ザンプルからの
水の吸収を防止する手段は該揺変性ゲル様物質の製造お
よび／または硬化中に該揺変性ゲル様物質を水で予備飽
和させることにより提供される。

本願のさらに別の発明に従えば、該揺変性ゲル様物質に
よる該化学試薬および／または該未分離の全血サンプル
からの水の吸収を防止する手段は該揺変性ゲル様物質と
該化学試薬および／または該未分離の全血サンプルとの
間に障壁を挿入することにより提供される。この障壁は
密度媒体の性質を有する揺変性ゲル様物質と組み合わせ
て使用される密度媒体の性質を持たない揺変性ゲル様物
質を含めてもよい。この障壁はまた揺変性ゲル様物質と
ニュートンゲル様物質と協同して使用される多孔質発泡
体も含めてもよい。最後に、障壁はプラスチックまたは
エラストマー製仕切りを含めてもよい。

さらに別の発明に従えば、血液の浸透圧を変えるために
使用される化学試薬は、該血液細胞と本質的に化学的に
適合し得る低分子量有機イオン性物質を含有する高張液
、該血液細胞と本質的に化学的に適合し得る低分子量無
機イオン性物質を含有する高張液、および血液細胞用培
養培地、並びにそれらの組み合わせより成る群から選ば
れた流体であってもよい。

本発明は、揺変性ゲル様物質の細胞分離性能特性に対す
る水の吸収の悪影響が実質的に除去され一４３＝ だので、この揺変性ゲル様物質を分離媒体として使用す
る血液の細胞成分を分離する改良された装置と方法を提
供する。

［好適な実施態様］ 本発明は第一次的に密度媒体として揺変性ゲルを使用す
る技術に従う血液の細胞分離に関するが、本発明の一つ
の実施態様に従えは、密度媒体として例えば揺変性ゲル
とニュートンゲルの組み合わせのようなゲルの組み合わ
せを使用する技術に関する。

血液の細胞分離に使用される種類の揺変性ゲルはＡ、Ａ
、ループラー、Ａ　Ｒ，ザイン、Ｄ、Ｍ。

ヘス、Ｊ、Ｎ、ヘニアン、Ｇ　オヅストルヘル、「閉鎖
系におけるヒトリンパ球の急速、定量的分離および精製
」、モレキュラー・イムノロジー、第１６巻、第６２１
−６２４頁（１９７９年）に一般的に記載されている。

さらに、米国特許第４．１９０，５３５号公報明細書に
は適当な揺変性ゲルとその調製法が記載されている。本
質的には、血液構成成分に化学的に不活性な水不溶性の
揺変性ゲルはジメチルポリシロキサンとメチル化により
材料が疎水性になった沈澱メチル化シリカから調製する
ことができる。

この揺変性ゲルは好ましくは密度が約１．０５５ｇ／ｃ
ｍ３−約１．０８０ｇ／ｃｍ”であり、比重が約１．０
７７ｇ／ｃｍ３となるようにするのが最適である。

細胞分離は実際に上記のように分離管内で起きる。この
ように、第１図および第２図に図示するように、装置１
０は、例えば凝固阻止剤として作用する十分なヘパリン
ナトリウムを含有する滅菌したンリコーン塗布ガラス試
験管１２の底部にゲル１４を付着させ、次いで米国特許
第３．９２０゜５４９号公報明細書に記載のように滅菌
したポリエステル付勢子をゲル塊の中心に配置すること
により無菌的に調製することができる。他の公知の凝固
阻止剤、例えば、ＥＤＴＡ、を使用することも同様に容
易にできる。次いで、分離管を排気する。プラスチック
付勢子はゲルよりも比重が大きいので遠心すると付勢子
がゲルに貫入しゲルを試装管壁を上昇するように移動さ
せる。この動作は満足な管の性能にとって必須ではない
が、分離とゲル密封形成を容易にする。

閉鎖系分離管を使用すると血液サンプルの取り扱いにお
ける問題を最小にできる。それにも拘わらず、米国特許
第４，１９０，５３５号公報明細書に記載のような開放
管を使用することもできる。

また、他のゲル処方が同様に機能することが見いだされ
ている。例えは、米国特許第４，１０１゜４２２号およ
び同第４，３１０，４３０号公報明細書に記載のような
血漿分離管処方から変えられたゲルが同様の操作性を示
している。

このように、試験管１２は閉塞端１６と開放端１７を有
している。好適な実施態様において、上記の閉鎖系分離
管は開放端１８の上方に挿入されたときに開放端１８を
閉して開放端１８が真空密封されるように適合された閉
塞手段２０を使用して製造される。

第３図に図示するように、閉塞手段２０は典型的には注
射器２４と組み合わされたもののような針２２によって
貫通することができ、血液サンプルの浸透圧を変更する
のに使用される化学試薬２８の上方に位置する自由空間
２６内に下記のように血液サンプルを供給することがで
きるようになっている。勿論、注射器２４と針２２は患
者から血液ザンプルを抽出するのにも使用される。

前記のように、揺変性ゲルは血漿の浸透圧を変えて細胞
直径と細胞密度を変える一定の化学試薬と組み合わせて
使用するとより成功度が増す。これらの化学試薬のある
ものは上記した通りであり、また、米国特許出願第９２
３，９０９号明細書に一般的に開示されている。

同様に、血液細胞用の培養培地は顆粒球の浮遊密度の変
化を阻止しおよび／または浮遊密度の損失を回復するた
めの試薬を構成していてもよい。

これらの化学試薬２８は典型的には試験管１２のような
同じ容器内で揺変性ゲル１４と一緒に使用される。

自然環境では細胞は普通の成長を与えるホメオスタシス
系の中で生きている。これらの細胞はイン・ヒポでは加
齢効果を示し易く、場合によってはそのような系の欠如
により死亡する。多くの型の細胞媒地がイン・ビトロの
細胞成長を支持するために開発されている。最も典型的
には、細胞は分離され細胞の媒地懸濁液中で成長させら
れる。

全血の細胞分離特性は細胞培養培地を全血に添加するこ
七によって保存することができることが見いたされてい
る。血液細胞用のどんな細胞培養培地もよい結果を示す
が、ロスウェル・パーク・メモリアル・インスチチュー
ト（Ｒｏ　ｓｗｅ　１１Ｐａｒｋ　　Ｍｅｍｍｏｒｉａ
ｌ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）培地およびマツコイ（Ｍｃ
Ｃｏｙ）培地が特に有効であった。例えば、全血を約２
０−５０体積％の培地量で希釈すると分離物の純度が高
張塩溶液およびニコデンツを使用した塩溶液を用いて得
られた純度よりも一般に良好である。このように、純度
性能は約８３％から約９３％を変化することが観察され
ている。

Ｊ、に、Ａ、ニコルソンら、「新鮮血液および加齢血液
におけるＴ細胞およびＢ細胞分析の比較」、ジャーナル
・オブ・イムノロジカル・メソッズ、第７３巻、２９−
４０頁（１９８４年）には全血の細胞培養培地での希釈
が記載されており、マツコイの５ａ培地の使用が特に注
目されている。しかし、これらの著者による顆粒球から
リンパ球を分離する際に細胞培養培地の添加により良い
効果が与えられることことの開示はない。すなわち、こ
れらの著者は単に血液サンプルの通常の希釈を示してい
るだけで、細胞培養培地が本発明の態様、すなわち、希
釈剤としてだけでなく全血の保存剤としても使用する態
様において使用することができることは認識もないし示
唆もない。本発明の分離法においてゲル様物質を使用し
て血液サンプル中のリンパ球と顆粒球の分離を改良する
のに用途があることを何も言及していない。

しかし、揺変性ゲルと協同して化学試薬を使用すると性
能が悪化するとともに前記の美観上の問題が生じる。

これらの難点は、試薬が第１図の符号３０で示すように
ゲル媒体と流体連絡しているときは水が特に水溶液中の
試薬から非イオン性密度ゲル媒体に移行されることに起
因する。水の移行は揺変性ゲルを製造するのに使用され
る有機樹脂中に存在する有機充填剤の親水性に一部分起
因している。

このように、一つの実施態様において、本発明は油また
は有機樹脂あるいはシリコーンのようす無機樹脂から製
造される、シリカのような無機充填剤を最低限しか使用
しないかもしくは全く使用しない、揺変性ゲルを使用す
る。さらに詳しくは、揺変性ゲルはシリコーン油、ブタ
ジェン樹脂、ポリエステル樹脂またはブチレン樹脂から
形成することかできる。

他の実施態様では、密度媒体として使用される揺変性ゲ
ルは揺変性ゲルをゲルの製造中および／または硬化期間
中に水で予備飽和させることにより修飾または処理して
もよい。そのような予備飽和は水をゲルと混合し得られ
た混合物を水がゲルに十分に吸収されるまで放置するこ
とによって行うことができる。

そのような予備飽和の結果、粘度と密度の双方の変化が
固定され比較的低いレベルの変化か予言し得るようにな
る。この予備飽和工程を使用することにより、イン・ビ
トロでゲルに接触する化学試薬の水溶液中に存在する水
は水溶液からゲルへの追加の移行が起きなくなる。

美観上の見地からは、ゲルは既に飽和しているので経時
的に生成物の外観の目に見える変化はない。換言すると
、典型的にはシリカ粒子を含むゲルに使用される充填剤
によって水の吸収があるとしてもそれに付随する目に見
える白色化は既に起きている。

本発明の別の実施態様では、第２図に示すように、異な
る揺変性ゲルの組み合わせまたは揺変性ゲルとニュート
ンゲルの組み合わせを密度媒体として使用する。二つの
揺変性ゲルを使用する場合は、〜方は他方よりも密度が
低い。最も好適な実施態様としては、密度媒体は、密度
媒体の性質を持つ揺変性ゲルと密度媒体の性質を持たな
い揺変性ゲルの組み合わせを含む。水は密度媒体を作る
のに使用されるシリカのような充填剤または粒子に追従
し易い。そのような充填剤や粒子を放置しておくとゲル
が疎水性になり易く障壁として作用する。この障壁ゲル
は典型的にはゲル分離媒体よりも密度が低い。この組み
合わせがら生じた障壁３２は安定であるが疎水性ゲルは
最低量しか要求しない。

同様に、安定な疎水性障壁３２は多孔質材料を揺変性ゲ
ルとニュートンゲルと協同して使用することにより製造
することができる。単なる例示であるが、この型の多孔
質材料にはウレタン発泡体および繊維、種々の濾過材料
およびポリプロピレンのようなプラスチック材料を含め
ることができる。このようにして形成された障壁３２は
その取り扱いおよび貯蔵中にその本来の姿を維持し、水
性試薬２８と揺変性ゲル１４の間の分離を維持する。

また別の実施態様では、多孔質発泡体は水性試薬２８を
収容することができ、得られた構成は、ニュートンゲル
が障壁３２として揺変性ゲルと試薬で飽和された多孔質
発泡体との間に保持されている。あるいは、第二の量の
揺変性ゲルを、ニュートンゲルを揺変性ゲルと接触保持
する障壁３２として使用することができる。この場合、
疎水性障壁３２を形成するのに必要なニュートンゲルの
量は安定性に要求される揺変性ゲルの実質的に大きな量
に対して小さい。

本発明のさらに別の実施態様では、障壁３２を揺変性ゲ
ル１４と化学試薬２８を含有する水溶液との間にプラス
チックまたはエラストマー製仕切りを使用して形成する
ことができる。これらの仕切りは、遠心中に開放されて
容器の所要の内容の通過を許容するように適合された、
自体を貫通する図示しないチャンネルを有する。換言す
れば、発泡体またはフィルター型の障壁とは異なって、
チャンネルを有する構造体が成形される。この構造体は
水性試薬２８または血液サンプルをゲル１４から分離さ
れた状態に保ち、分離装置が形成されるまでその場所に
保持し、分離装置の形成時に該試薬または血液サンプル
が該構造体に貫入する。

仕切りを通して延長され遠心中に開放されるチヤンネル
は該部品の製造時に例えばハニカム構造体として形成さ
れる。

従って、予備飽和もしくは充填剤の使用量を最低限にす
ることにより、あるいは水層と揺変性ゲル密度媒体との
間に障壁を介在させることにより、本発明は上記の揺変
性ゲル密度媒体による水吸収に関する問題点を克服して
いる。

本発明は特に加齢された血液サンプルについて説明した
が本発明の方法は新鮮血液でも実施可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の一つの実施態様に従う装置の斜視図
である。 第へ２図は、本発明の他の実施態様に従う装置の斜視図
である。 第３図は、本発明の装置の閉塞手段の斜視図であって、
容器内に血液サンプルを供給するために注射器で貫通し
た状態を示す。 １０・・・血液細胞分離装置、１２・・・試験管、１４
・・・揺変性ゲル、１６・・・閉塞端、１８・・・開放
端、　　２ｏ・・・閉塞手段、２２・・・針、　　　　
２４・・・注射器、２６・・・自由空間、　２８・・・
化学試薬、３０・・・液体連絡点、３２・・・疎水性障
壁出願人、　ベクトン　ディキインソン　アンドカンパ
ニー ５６一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）未分離全血のサンプル中の顆粒球からリンパ球と
   単球を分離し浮遊密度の見掛けの変化を阻止しおよび／
   または顆粒球の浮遊密度の損失を回復する装置において
   、 （ａ）開放端と閉塞端を有する容器、 （ｂ）該閉塞端の付近に位置し、血液構成成分に対して
   化学的に不活性な、水不溶性の揺変性ゲル様物質、 （ｃ）該血液の浸透圧を変更するために提供されており
   、それにより顆粒球の細胞直径と細胞密度を変化させる
   、該揺変性ゲル様物質と流体連絡している化学試薬、 （ｄ）未分離の全血サンプルを収容するのに十分な容積
   の、最初該化学試薬の付近でかつその上方にある自由空
   間、および （ｅ）リンパ球および単球を顆粒球から分離する前に該
   揺変性ゲル様物質による化学試薬および／または該未分
   離の全血サンプルからの水の吸収を防止して該揺変性ゲ
   ル様物質の細胞分離性能特性への水の吸収の影響を実質
   的に除去するようにした手段、 を備えて成る装置。 （２）該水の吸収を防止する手段が該揺変性ゲル様物質
   を高密度高粘度の重合体の形成を許容し、該揺変性ゲル
   様物質が水を吸収することができる有機充填剤を実質的
   に欠如している有機樹脂から製造することにより提供さ
   れることを特徴とする、請求項１記載の装置。 （３）該揺変性ゲルが少なくとも部分的にシリコーン油
   、ブタジエン樹脂、ポリエステル樹脂およびブチレン樹
   脂の一つから形成されることを特徴とする、請求項１記
   載の装置。（４）該水の吸収を防止する手段が該揺変性
   ゲル様物質の製造中に該揺変性ゲル様物質を水で予備飽
   和させることおよび該揺変性ゲル様物質を硬化すること
   の少なくとも一つにより提供されることを特徴とする、
   請求項１記載の装置。 （５）該揺変性ゲル様物質による水の吸収を防止する手
   段が該揺変性ゲル様物質と該化学試薬および該未分離の
   全血サンプルの少なくとも一つとの間に挿入された障壁
   を含むことを特徴とする、請求項１記載の装置。 （６）該障壁が密度媒体の性質を有する揺変性ゲル様物
   質と組み合わせて使用される密度媒体の性質を持たない
   揺変性ゲル様物質を含むことを特徴とする、請求項５記
   載の装置。（７）該障壁が揺変性ゲル様物質とニュート
   ンゲル様物質と協同して使用される多孔質発泡体を含む
   ことを特徴とする、請求項５記載の装置。 （８）該多孔質材料がウレタン発泡体または繊維、プラ
   スチックおよびポリプロピレンの少なくとも一つで形成
   されていることを特徴とする、請求項７記載の装置。 （９）該化学試薬が該多孔質材料内に含有されているこ
   とを特徴とする、請求項７記載の装置。 （１０）該障壁がプラスチックまたはエラストマー製仕
   切りを含むことを特徴とする、請求項５記載の装置。 （１１）該プラスチックまたはエラストマー製仕切りが
   さらに該仕切り中を伸長し所定の物質の通過を許容する
   ように開放されるように適合されたチャンネルを有する
   ことを特徴とする、請求項１０記載の装置。 （１２）該化学試薬が、該血液細胞と本質的に化学的に
   適合し得る低分子量有機イオン性物質を含有する高張液
   、該血液細胞と本質的に化学的に適合し得る低分子量無
   機イオン性物質を含有する高張液、該血液細胞と本質的
   に化学的に適合し得る高分子量有機物質を含有する等張
   液、および血液細胞用培養培地、並びにそれらの組み合
   わせより成る群から選ばれることを特徴とする、請求項
   １記載の装置。 （１３）該容器の該開放端を密封するための閉塞手段を
   有することを特徴とする、請求項１記載の装置。 （１４）該未分離全血が凝固阻止処理されていることを
   特徴とする、請求項１記載の装置。 （１５）該閉塞手段が該容器の該開放端を真空密封する
   のに適していることを特徴とする、請求項１３記載の装
   置。 （１６）該閉塞手段が該容器に血液サンプルを供給する
   ための針であって該血液サンプルを抽出するのに適合さ
   れた針によって貫通可能であることを特徴とする、請求
   項１３記載の装置。 （１７）該高張力液が食塩水溶液であることを特徴とす
   る、請求項１記載の装置。 （１８）該無機イオン性物質の分子量が約１５００未満
   であることを特徴とする、請求項１記載の装置。 （１９）該高分子量有機物質がメトリゾイン酸、その誘
   導体およびそれらの組み合わせより成る群から選ばれる
   ことを特徴とする、請求項１記載の装置。 （２０）該高分子量有機物質がメトリゾイン酸ナトリウ
   ムおよびメトリザミド並びにそれらの組み合わせより成
   る群から選ばれることを特徴とする、請求項１記載の装
   置。 （２１）該高分子量有機物質がＮ，Ｎ’−ビス（２，３
   −ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒ
   ドロキシプロピル）アセタミド］−２，４，６−トリヨ
   ードイソフタルアミドであることを特徴とする、請求項
   １記載の装置。 （２２）該培養培地がロスウェル・パーク・メモリアル
   ・インスチチュート培地およびマッコイ培地より成る群
   から選ばれることを特徴とする、請求項１記載の装置。 （２３）該揺変性ゲル様物質の比重が約１．０５５ｇ／
   ｃｍ＾３−約１．０８０ｇ／ｃｍ＾３であることを特徴
   とする、請求項１記載の装置。 （２４）該揺変性ゲル様物質の比重が約１．０７７ｇ／
   ｃｍ＾３であることを特徴とする、請求項１記載の装置
   。 （２５）浮遊密度の見掛けの変化が阻止されるとともに
   顆粒球の浮遊密度の損失が回復される、未分離全血のサ
   ンプル中の顆粒球からリンパ球と単球を分離する方法に
   おいて、 １）開放端と閉塞端を有する容器に水不溶性の揺変性ゲ
   ル様物質を導入して該閉塞端付近に該揺変性ゲル様物質
   を位置させる工程、 ２）該血液の浸透圧を変えて該顆粒球の細胞直径と細胞
   密度を変えるように適合された化学試薬を該容器に導入
   する工程、 ３）該容器内に該揺変性ゲル様物質による化学試薬およ
   び／または該未分離の全血サンプルからの水の吸収を防
   止して該揺変性ゲル様物質の細胞分離性能特性への水の
   吸収の影響を実質的に除去するようにした手段を導入す
   る工程、 ４）該未分離全血サンプルを該容器に導入する工程、お
   よび ５）該容器を、該ゲル様物質を十分に流動させて該リン
   パ球および単球と該顆粒球との間に障壁を形成させるの
   に十分な力と時間、遠心する工程、から成る方法。 （２６）該リンパ球および単球を該障壁の最上層から回
   収する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２５
   記載の方法。 （２７）該水の吸収を防止する手段が該揺変性ゲル様物
   質を高密度高粘度の重合体の形成を許容し、該揺変性ゲ
   ル様物質が水を吸収することができる有機充填剤を実質
   的に欠如している有機樹脂から製造することにより提供
   されることを特徴とする、請求項２５記載の方法。 （２８）該揺変性ゲルが少なくとも部分的にシリコーン
   油、ブタジエン樹脂、ポリエステル樹脂およびブチレン
   樹脂の一つから形成されることを特徴とする、請求項２
   ５記載の方法。 （２９）該水の吸収を防止する手段が該揺変性ゲル様物
   質の製造中に該揺変性ゲル様物質を水で予備飽和させる
   ことおよび該揺変性ゲル様物質を硬化することの少なく
   とも一つにより提供されることを特徴とする、請求項２
   ５記載の方法。 （３０）該揺変性ゲル様物質による水の吸収を防止する
   手段が該揺変性ゲル様物質と該化学試薬および該未分離
   の全血サンプルの少なくとも一つとの間に第二障壁を挿
   入することによって提供されるを特徴とする、請求項２
   ５記載の方法。 （３１）該第二障壁が密度媒体の性質を有する揺変性ゲ
   ル様物質と組み合わせて使用される密度媒体の性質を持
   たない揺変性ゲル様物質を含むことを特徴とする、請求
   項３０記載の方法。 （３２）該第二障壁が揺変性ゲル様物質とニュートンゲ
   ル様物質と協同して使用される多孔質発泡体を含むこと
   を特徴とする、請求項３０記載の方法。 （３３）該多孔質材料がウレタン発泡体または繊維、、
   プラスチックおよびポリプロピレンの少なくとも一つで
   形成されていることを特徴とする、請求項３２記載の方
   法。 （３４）該化学試薬が該多孔質材料内に含有されている
   ことを特徴とする、請求項３１記載の方法。 （３５）該第二障壁がプラスチックまたはエラストマー
   製仕切りを含むことを特徴とする、請求項３０記載の方
   法。 （３６）該プラスチックまたはエラストマー製仕切りが
   さらに該仕切り中を伸長し所定の物質の通過を許容する
   ように開放されるように適合されたチャンネルを有する
   ことを特徴とする、請求項３５記載の方法。 （３７）該化学試薬が、該血液細胞と本質的に化学的に
   適合し得る低分子量有機イオン性物質を含有する高張液
   、該血液細胞と本質的に化学的に適合し得る低分子量無
   機イオン性物質を含有する高張液、該血液細胞と本質的
   に化学的に適合し得る高分子量有機物質を含有する等張
   液、および血液細胞用培養培地、並びにそれらの組み合
   わせより成る群から選ばれることを特徴とする、請求項
   ２５記載の方法。 （３８）該高張液が食塩水溶液であることを特徴とする
   、請求項３７記載の方法。 （３９）該無機イオン性物質の分子量が約１５００未満
   であることを特徴とする、請求項３７記載の方法。 （４０）該高分子量有機物質がメトリゾイン酸、その誘
   導体およびそれらの組み合わせより成る群から選ばれる
   ことを特徴とする、請求項３７記載の方法。 （４１）該高分子量有機物質がメトリゾイン酸ナトリウ
   ムおよびメトリザミド並びにそれらの組み合わせより成
   る群から選ばれることを特徴とする、請求項３７記載の
   方法。 （４２）該高分子量有機物質がＮ，Ｎ’−ビス（２，３
   −ジヒドロキシプロピル）−Ｓ−［Ｎ−（２，３−ジヒ
   ドロキシプロピル）アセタミド］−２，４，６−トリヨ
   ードイソフタルアミドであることを特徴とする、請求項
   ３７記載の方法。 （４３）該培養培地がロスウェル・パーク・メモリアル
   ・インスチチュート培地およびマッコイ培地より成る群
   から選ばれることを特徴とする、請求項３７記載の方法
   。 （４４）該揺変性ゲル様物質の比重が約１．０５５ｇ／
   ｃｍ＾３−約１．０８０ｇ／ｃｍ＾３であることを特徴
   とする、請求項２５記載の方法。 （４５）該揺変性ゲル様物質の比重が約１．０７７ｇ／
   ｃｍ＾３であることを特徴とする、請求項２５記載の方
   法。