JPH012600A - プロテインｃ活性測定用キット - Google Patents
プロテインｃ活性測定用キットInfo
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- JPH012600A JPH012600A JP62-234491A JP23449187A JPH012600A JP H012600 A JPH012600 A JP H012600A JP 23449187 A JP23449187 A JP 23449187A JP H012600 A JPH012600 A JP H012600A
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- Japan
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- activity
- kit
- plasma
- protein
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はプロティンＣ（以下ｐｃと略す）活性測定用キ
ットに関する。更に詳しくは、血漿よりＰＣを分離する
ことなく、直接血漿中のＰＣ活性を酵素学的に測定する
ことができるＰＣ活性測定川用・７トに関する。
ットに関する。更に詳しくは、血漿よりＰＣを分離する
ことなく、直接血漿中のＰＣ活性を酵素学的に測定する
ことができるＰＣ活性測定川用・７トに関する。
（従来の技術）
ＰＣはビタミンに依存性血漿蛋白質の一つであり、Ｃａ
トイオンの存在下でトロンビン−トロンボモジュリン複
合体によって活性型プロティンＣ（以下ＰＣａと略す）
に活性化される。ＰＣａは凝固系補酵素の第Ｖ因子及び
第■囚子を選択的に失活化し強力な抗凝固作用を示すと
ともに、血管ブラスミノーゲンアクチベーターを遊離さ
せ線溶促進作用を示す血漿蛋白質の一つとして注目され
ている。
トイオンの存在下でトロンビン−トロンボモジュリン複
合体によって活性型プロティンＣ（以下ＰＣａと略す）
に活性化される。ＰＣａは凝固系補酵素の第Ｖ因子及び
第■囚子を選択的に失活化し強力な抗凝固作用を示すと
ともに、血管ブラスミノーゲンアクチベーターを遊離さ
せ線溶促進作用を示す血漿蛋白質の一つとして注目され
ている。
血中ＰＣ値は、汎発性血管向凝固症候群（Ｄ Ｉ Ｃ）
や肝硬変、慢性肝炎などの肝疾患において低下すること
が知られ、また多発性血栓症を呈するＩ） Ｃ欠ｔｉ症
も近年報告されている。さらに、第■因子等の各種血液
凝固製剤中のｐｃ含量がそれらの品質にどのような影響
を与えるか注目されつつある。
や肝硬変、慢性肝炎などの肝疾患において低下すること
が知られ、また多発性血栓症を呈するＩ） Ｃ欠ｔｉ症
も近年報告されている。さらに、第■因子等の各種血液
凝固製剤中のｐｃ含量がそれらの品質にどのような影響
を与えるか注目されつつある。
従って、上記のＰＣ欠ｔｉ症やＤＩＣ１肝疾患などの診
断やこれら疾患を早期発見するうえで、また各種血液凝
固製剤中 で簡便なＰＣ定量法が要求されている。
断やこれら疾患を早期発見するうえで、また各種血液凝
固製剤中 で簡便なＰＣ定量法が要求されている。
現在、いくつかのＰＣ定量法が用いられており、その一
つとして酵素学的活性測定法が挙げられる。
つとして酵素学的活性測定法が挙げられる。
この測定法はＰＣａに特異的な合成ペプチド基質を用い
る方法である。しかし、血液中にはＰＣインヒビターが
存在し、又、アンチトロンビン■等の阻害剤で阻害され
ずに活性測定時に合成基質に作用する妨害物質が存在す
るため、合成基質を用いて直接血漿中のＰＣ活性を定量
するのは従来は困難であった。
る方法である。しかし、血液中にはＰＣインヒビターが
存在し、又、アンチトロンビン■等の阻害剤で阻害され
ずに活性測定時に合成基質に作用する妨害物質が存在す
るため、合成基質を用いて直接血漿中のＰＣ活性を定量
するのは従来は困難であった。
従って、抗体カラムや吸着剤などを用いて血漿からＰＣ
を分離するという前処理が必要である。しかし、これら
の方法では使用する血漿もある程度多量に要求されるう
え、時間と手間がかかり、多（の試料を迅速に処理する
場合に不利である。吸着剤を用いて前処理をする操作で
は、ＰＣの回収率に欠点があり、又、抗体カラムを用い
た場合は回収率は良いが該カラムは非常に高価であると
いう問題点がある。
を分離するという前処理が必要である。しかし、これら
の方法では使用する血漿もある程度多量に要求されるう
え、時間と手間がかかり、多（の試料を迅速に処理する
場合に不利である。吸着剤を用いて前処理をする操作で
は、ＰＣの回収率に欠点があり、又、抗体カラムを用い
た場合は回収率は良いが該カラムは非常に高価であると
いう問題点がある。
合成基質を用いる他にも、ＰＣの抗凝固作用を利用する
生物学的活性測定法がある。この方法はｐｃをヘビ毒で
活性化した後、血液凝固系に加え、その凝固時間延長作
用を測定するものであるが、感度が高い方法とは言い難
い。
生物学的活性測定法がある。この方法はｐｃをヘビ毒で
活性化した後、血液凝固系に加え、その凝固時間延長作
用を測定するものであるが、感度が高い方法とは言い難
い。
又、免疫学的にｐｃを定量する方法がある。この方法は
ＰＣに対するポリクローナル又はモノクロール抗体を用
いた抗原抗体反応によってＰＣ抗原量を定量するもので
、ラジオイムノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ
法、Ｌａｕｒｅｌｌ法などが実施されている。免疫学的
定量法はＰＣ抗原量は正確に測定できるが、用いる抗体
は非常に高価であり、操作時間も長く、又、ＰＣに正常
の活性があるかどうかは末法では確認できない。
ＰＣに対するポリクローナル又はモノクロール抗体を用
いた抗原抗体反応によってＰＣ抗原量を定量するもので
、ラジオイムノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ
法、Ｌａｕｒｅｌｌ法などが実施されている。免疫学的
定量法はＰＣ抗原量は正確に測定できるが、用いる抗体
は非常に高価であり、操作時間も長く、又、ＰＣに正常
の活性があるかどうかは末法では確認できない。
本発明者らは、上述したような従来のＰＣ定量法の問題
点を解決すべく鋭意研究を行った結果、血漿からＰＣを
分離する前処理もなく、操作が簡便で短時間に多量の試
料を測定できる酵素学的活性測定法を見出し本発明ｐｃ
活性測定用キットを完成した。
点を解決すべく鋭意研究を行った結果、血漿からＰＣを
分離する前処理もなく、操作が簡便で短時間に多量の試
料を測定できる酵素学的活性測定法を見出し本発明ｐｃ
活性測定用キットを完成した。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明の目的は、正確で簡便なＰＣ活性測定用キットを
提供することにある。
提供することにある。
（問題点を解決するための手段）
本発明は合成ペプチド基質に作用するＰＣａ以外の血漿
中の妨害物質を特異的に阻害することによって、血漿よ
りＰＣを分離することなく直接血５嚢中のＰＣａの活性
を測定可能な新規な測定法に基づくＰＣ活性測定用キッ
トである。
中の妨害物質を特異的に阻害することによって、血漿よ
りＰＣを分離することなく直接血５嚢中のＰＣａの活性
を測定可能な新規な測定法に基づくＰＣ活性測定用キッ
トである。
本発明キットは下記成分で構成される。
ａ）プロティンＣ活性化物質
ｂ）アンチトロンビン■
Ｃ）低分子量トロンビン阻害剤
ｄ）合成ペプチド基質
以下に本発明キットに関してさらに詳細に説明する。
１）血漿の希釈
血漿中にはＰＣａを阻害するＰＣインヒビターが存在す
るため、これらを抑える何らがの処置を施さない限りＰ
Ｃａ活性を正確には測定できない０本発明においては、
約１０倍以上に血漿を希釈することによってＰＣインヒ
ビターの影響を無視することができた。
るため、これらを抑える何らがの処置を施さない限りＰ
Ｃａ活性を正確には測定できない０本発明においては、
約１０倍以上に血漿を希釈することによってＰＣインヒ
ビターの影響を無視することができた。
血漿を希釈する緩衝液としては、トリス塩酸等の１１街
剤により生体内条件に近いｐ Ｈに調製したものを用い
るのが好ましい。通常に使用される緩衝液と同様、生体
内条件に合わせるために、塩化ナトリウム等の塩類を加
えてもよい。
剤により生体内条件に近いｐ Ｈに調製したものを用い
るのが好ましい。通常に使用される緩衝液と同様、生体
内条件に合わせるために、塩化ナトリウム等の塩類を加
えてもよい。
又、血漿中の種々のプロテアーゼの作用を抑えるために
、ＰＣａの活性に影響を及ぼさない程度に大豆トリプシ
ンインヒビター（ＳＢＴＩ）、アプロチニン等のプロテ
アーゼインヒビターを加えることもできる。さらに、最
終反応停止時の弱酸性下で不溶の蛋白質の析出を防ぐた
めに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の安定化剤を加
えてもよい。
、ＰＣａの活性に影響を及ぼさない程度に大豆トリプシ
ンインヒビター（ＳＢＴＩ）、アプロチニン等のプロテ
アーゼインヒビターを加えることもできる。さらに、最
終反応停止時の弱酸性下で不溶の蛋白質の析出を防ぐた
めに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の安定化剤を加
えてもよい。
尚、血漿は通常の方法により調製したものを使用するこ
とができ、例えばクエン酸存在下に採血した後遠心分離
して得たクエン酸加血漿等を用いることができる。
とができ、例えばクエン酸存在下に採血した後遠心分離
して得たクエン酸加血漿等を用いることができる。
２）ＰＣ活性化物質
ＰＣ活性化物質としては、トロンビン−トロンボモジュ
リン複合体、ヘビ毒等が挙げられるが、本来の生理条件
を考慮すると、トロンビン−トロンボモジュリン複合体
が好ましい、トロンビンとトロンボモジュリンは複合体
としてから反応系に加えてもよいし、それぞれ個々に加
えることもできる。
リン複合体、ヘビ毒等が挙げられるが、本来の生理条件
を考慮すると、トロンビン−トロンボモジュリン複合体
が好ましい、トロンビンとトロンボモジュリンは複合体
としてから反応系に加えてもよいし、それぞれ個々に加
えることもできる。
又、ＰＣの活性化にはＣａ”イオンが必要とされている
ので、ＰＣ活性化の反応系において至適濃度となるよう
に、Ｃａ１イオンを血脩希釈用棋衝液中やＰＣ活性化物
質の溶液中に加えておくのが好ましい。
ので、ＰＣ活性化の反応系において至適濃度となるよう
に、Ｃａ１イオンを血脩希釈用棋衝液中やＰＣ活性化物
質の溶液中に加えておくのが好ましい。
３）妨害物質の阻害剤
ＰＣを活性化するために加えたトロンビンはＰＣ活性を
測定するのに用いる合成基質に対して作用し測定上の妨
害となるので、ＰＣを活性化した後、トロンビンに対す
る阻害剤を加える必要がある。この阻害剤はトロンビン
を阻害するけれどもＰＣａには無影響であるものが利用
でき、アンチトロンビン■などを用いることができる。
測定するのに用いる合成基質に対して作用し測定上の妨
害となるので、ＰＣを活性化した後、トロンビンに対す
る阻害剤を加える必要がある。この阻害剤はトロンビン
を阻害するけれどもＰＣａには無影響であるものが利用
でき、アンチトロンビン■などを用いることができる。
アンチトロンビン■の阻害反応はヘパリンの存在により
著しく促進されるため、ヘパリンを共存させるのが実際
的で好ましい。
著しく促進されるため、ヘパリンを共存させるのが実際
的で好ましい。
しかし、アンチトロンビン■のみではその他の妨害物質
の活性を抑えることはできない、事実、アンチトロンビ
ン■−ヘパリンを加えるのみで、合成基質を用いてｐｃ
活性を測定した結果、免疫学的定量法によるＰＣｆｉに
比して、その数百倍の活性が見かけ上の活性量として測
定された。このようにアンチトロンビン■のみを添加し
てｐｃ活性を測定する場合は、ｐｃ以外に合成基質に作
用する物質が存在し正確にＰＣａの活性を測定できない
という問題点があるため、従来はカラム等でＰＣを分離
するなどの傾雑な処理が必要であった。
の活性を抑えることはできない、事実、アンチトロンビ
ン■−ヘパリンを加えるのみで、合成基質を用いてｐｃ
活性を測定した結果、免疫学的定量法によるＰＣｆｉに
比して、その数百倍の活性が見かけ上の活性量として測
定された。このようにアンチトロンビン■のみを添加し
てｐｃ活性を測定する場合は、ｐｃ以外に合成基質に作
用する物質が存在し正確にＰＣａの活性を測定できない
という問題点があるため、従来はカラム等でＰＣを分離
するなどの傾雑な処理が必要であった。
本発明者は、ｐｃ活性を測定するために用いる合成基質
に対して作用する妨害物質の活性を抑制する方法を種々
検討した結果、アンチトロンビン■のように分子量の大
きい物質でなく、低分子型のトロンビン阻害剤を用いる
ことによって、トロンビン以外の妨害−物質の活性が抑
制されることを明らかにし、ｐｃの分＃精製等の操作を
必要とせずにＰＣａの活性のみを測定することに成功し
た。
に対して作用する妨害物質の活性を抑制する方法を種々
検討した結果、アンチトロンビン■のように分子量の大
きい物質でなく、低分子型のトロンビン阻害剤を用いる
ことによって、トロンビン以外の妨害−物質の活性が抑
制されることを明らかにし、ｐｃの分＃精製等の操作を
必要とせずにＰＣａの活性のみを測定することに成功し
た。
本発明において用いることができる低分子弔トロンビン
阻害剤は、ＰＣａの活性に影響しないものを使用するの
が好ましく、分子１２，０００以下のトロンビン阻害剤
、好ましくは分子量１．０００以下の物質、例えば、（
２Ｒ，４Ｒ）−１−（Ｎ”−（３−メチル−１，２，３
，４−テトラヒドロ−８−キノリンスルホニル）−Ｌ−
了ルギニル〕−４−メチルー２−ピペリジンカルボン酸
（化合物ｌ）、ダンジルアルギニンＮ−（３−エチル−
１，５−ペンタンジイル）アミド（化合物２）等のＮ−
アリールスルホニル−し−アルギニン誘導体（Ｊ、 Ｍ
ｅｄ、 Ｃｈｅｍ、、 ２３．８２７−８３６、同１２
９３−１２９９． （１９８０）等）、Ｎ−（２−ナフ
チルルホニルクリシル）−４−アミジノフェニルアラニ
ンベペリジノ （化合物３）等のＮ−アリールスルホニ
ルグリシル−アミジノフェニルアラニン誘導体（Ｔｈｒ
ｏｍｂ。
阻害剤は、ＰＣａの活性に影響しないものを使用するの
が好ましく、分子１２，０００以下のトロンビン阻害剤
、好ましくは分子量１．０００以下の物質、例えば、（
２Ｒ，４Ｒ）−１−（Ｎ”−（３−メチル−１，２，３
，４−テトラヒドロ−８−キノリンスルホニル）−Ｌ−
了ルギニル〕−４−メチルー２−ピペリジンカルボン酸
（化合物ｌ）、ダンジルアルギニンＮ−（３−エチル−
１，５−ペンタンジイル）アミド（化合物２）等のＮ−
アリールスルホニル−し−アルギニン誘導体（Ｊ、 Ｍ
ｅｄ、 Ｃｈｅｍ、、 ２３．８２７−８３６、同１２
９３−１２９９． （１９８０）等）、Ｎ−（２−ナフ
チルルホニルクリシル）−４−アミジノフェニルアラニ
ンベペリジノ （化合物３）等のＮ−アリールスルホニ
ルグリシル−アミジノフェニルアラニン誘導体（Ｔｈｒ
ｏｍｂ。
Ｒｅｓ、３６． Ｎｏ、５．４５７−１６５ （１９８
４）等〕などが挙げられる。
４）等〕などが挙げられる。
４）合成ペプチド基質
ｐｃ活性を測定する合成ペプチド基質としては、従来の
酵素学的活性測定法で使用されているものを使用するこ
とができ、例えば、Ｐｙｒ −Ｐｒｏ −Ａｒｇ −ｐ
ＮＡ （Ｓ −２３６６：ピログルタミル−プロリル−
アルギニルール−ニトロアニリド） 、Ｄ −Ｖａｌ
−Ｌｅｕ −Ａｒｇ ｐＮＡ （Ｓ −２２６６：
Ｄ−バリル−ロイシル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリ
ド） 、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ （Ｓ
−２２３８： Ｄ−フェニルアラニル−ピペリジノ−ア
ルギニル−ｐ−ニトロアニリド）等の発色合成基質やＢ
ｏＣ−Ｌｅｕ −Ｓｅｒ −Ｔｈｒ −Ａｒｇ −？ｌ
Ｃ＾（３１１２−Ｖ ： ｔ−ブトキシカルボニルロイ
シル−セリルートレオニル−アルギニル−４−メチルク
マリンアミド）等の螢光合成基質が挙げられる。
酵素学的活性測定法で使用されているものを使用するこ
とができ、例えば、Ｐｙｒ −Ｐｒｏ −Ａｒｇ −ｐ
ＮＡ （Ｓ −２３６６：ピログルタミル−プロリル−
アルギニルール−ニトロアニリド） 、Ｄ −Ｖａｌ
−Ｌｅｕ −Ａｒｇ ｐＮＡ （Ｓ −２２６６：
Ｄ−バリル−ロイシル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリ
ド） 、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ （Ｓ
−２２３８： Ｄ−フェニルアラニル−ピペリジノ−ア
ルギニル−ｐ−ニトロアニリド）等の発色合成基質やＢ
ｏＣ−Ｌｅｕ −Ｓｅｒ −Ｔｈｒ −Ａｒｇ −？ｌ
Ｃ＾（３１１２−Ｖ ： ｔ−ブトキシカルボニルロイ
シル−セリルートレオニル−アルギニル−４−メチルク
マリンアミド）等の螢光合成基質が挙げられる。
上記の合成ペプチド基質はＰＣａによって分解され発色
又は螢光物質が産生されるため、これら分解産物を比色
定量又は螢光定量することによってｐｃ活性が定量的に
求められる。
又は螢光物質が産生されるため、これら分解産物を比色
定量又は螢光定量することによってｐｃ活性が定量的に
求められる。
尚、合成ペプチド基質とＰＣａの酵素反応は、反応系を
弱酸性にすることで停止できる。従って、クエン酸、酢
酸等の弱酸を反応停止剤として用いるのが好ましい。
弱酸性にすることで停止できる。従って、クエン酸、酢
酸等の弱酸を反応停止剤として用いるのが好ましい。
５）キットの使用法
次に、本発明ｐｃ活活性測定中キット使用法について説
明する。概略は以下の通りである。
明する。概略は以下の通りである。
■血漿を希釈し、ＰＣ活性化物質を加えることによって
ＰＣを活性化する。
ＰＣを活性化する。
■ｐｃ活性化完了後、合成５’Ｈに作用するＰＣａ以外
の血漿中の妨害物質に対する阻害剤（アンチトロンビン
ｍ、Ｎ”−アリールスルホニル−Ｌ−アルギニンアミド
化合物）を加える。
の血漿中の妨害物質に対する阻害剤（アンチトロンビン
ｍ、Ｎ”−アリールスルホニル−Ｌ−アルギニンアミド
化合物）を加える。
■合成ペプチド基質を加え酵素反応を行い、そして反応
を停止後、ＰＣａによる分解産物の発色又は螢光を測定
することによってｐｃ−５性の測定を行う。
を停止後、ＰＣａによる分解産物の発色又は螢光を測定
することによってｐｃ−５性の測定を行う。
以下の実施例において、本発明ｐｃｃ性測定用キー／
ト及びその使用法の一例を示す。
ト及びその使用法の一例を示す。
（実施例）
〜キット構成成分（各１バイアル中）〜ａ））ロンビン
−トロンボモジュリン？！＋合体＜’ｔＢ乾燥品） １０Ｕ／ｍｆｆ１）ロンビン−〇、８５ ｎ ＋＊ｏｌ
／ ｖｄトロ７ポモジユリン ・４−の蒸留水で溶かして使用。
−トロンボモジュリン？！＋合体＜’ｔＢ乾燥品） １０Ｕ／ｍｆｆ１）ロンビン−〇、８５ ｎ ＋＊ｏｌ
／ ｖｄトロ７ポモジユリン ・４−の蒸留水で溶かして使用。
ｂ）アンチトロンビンｍ−ヘパリン複合体（凍結乾燥品
） ２５Ｕ／−アンチトロンビンｌｌｌ−１００Ｕ／−ヘパ
リン ・下記ｄの溶液４−で溶かして使用。
） ２５Ｕ／−アンチトロンビンｌｌｌ−１００Ｕ／−ヘパ
リン ・下記ｄの溶液４−で溶かして使用。
Ｃ）化合物ｌ水溶液 ５ ｍｌ （１００Ｉｊｇ／ ＋
ｄ）ｄ ） Ｓ −２３（ｉ６ （凍結乾燥品）・４−
の蒸留水で溶かして使用（３ｍ Ｍ水溶液）。
ｄ）ｄ ） Ｓ −２３（ｉ６ （凍結乾燥品）・４−
の蒸留水で溶かして使用（３ｍ Ｍ水溶液）。
上記の構成成分によるキットに、例えば、血漿希釈用緩
衝液５０＋ｄ （５０ｍＭ ）リス塩ｔｌ （ｐＨ８，
０）−０，１Ｍ塩化ナトリウム−１ｍＭ塩化カルシウム
−〇、１％ｎ５Ａ−０，１ｗ／ｄＳＢＴ Ｉ）や反応停
止剤２ｌ−（２％クエン酸１容Ｙ＆、）などを力■えて
もよい。
衝液５０＋ｄ （５０ｍＭ ）リス塩ｔｌ （ｐＨ８，
０）−０，１Ｍ塩化ナトリウム−１ｍＭ塩化カルシウム
−〇、１％ｎ５Ａ−０，１ｗ／ｄＳＢＴ Ｉ）や反応停
止剤２ｌ−（２％クエン酸１容Ｙ＆、）などを力■えて
もよい。
〜測定操作〜
■被検血漿を血漿希釈用緩衝液で２１倍に希釈する。
この液を５６℃５分間インキユヘートし、生成したフィ
ブリンを遠心して除去した後、２００ｐｆを分取する。
ブリンを遠心して除去した後、２００ｐｆを分取する。
■トロンビンートロンボモジュリン？１ 合体ｆＪ 液
ヲ１００ｔｐｌ加え、３７℃で３０分間インキュベート
する。
ヲ１００ｔｐｌ加え、３７℃で３０分間インキュベート
する。
■アンチトロンビン■−ヘパリンー化合物ｌの混合溶液
１００μｌを加え、３７℃で５分間インキユヘートする
。
１００μｌを加え、３７℃で５分間インキユヘートする
。
■Ｓ−２３６６溶液１００μｌを加え、３７℃で３０分
間インキュベートする。
間インキュベートする。
０２％クエン酸溶液５００Ｉ１１を加え、４０５ｒｎに
おける吸光度を測定する。
おける吸光度を測定する。
以上の本実施例によれば、前記１セツトのキットで４０
検体を測定できるが、ｌバイアル当りの成分含有看や血
漿の希釈率などを変えたり、系全体のスケールを適宜変
化させることにより、目的に適した種々のキットを作成
することが可能である。
検体を測定できるが、ｌバイアル当りの成分含有看や血
漿の希釈率などを変えたり、系全体のスケールを適宜変
化させることにより、目的に適した種々のキットを作成
することが可能である。
〜検ＦＩｔ線〜
種々の希釈率の正常ヒトプール血漿を用いて作成した検
量線を第１図に示した。
量線を第１図に示した。
第１図より明らかなように、検量線はＯから１００％の
範囲で良好な直線性を示しており、本発明キ。
範囲で良好な直線性を示しており、本発明キ。
トによるＰＣ活性測定は優れた定量性を有するものであ
る。
る。
次に、本発明キットについて種々の条件を検討した結果
を示す。尚、基本となる操作方法は前述の実施例の方法
に従って行った。
を示す。尚、基本となる操作方法は前述の実施例の方法
に従って行った。
＋１１血漿の希釈率
ＰＣインヒビターの影響と血漿の希釈率を調べた結果、
本発明キットによる測定法では約１０倍以上に血漿を希
釈することによって、希釈率とＰＣ活性の間に直線的な
関係が得られた。これより低い希釈率になるに従ってＰ
Ｃインヒビターの作用がより発現してくるため、ＰＣ活
性が抑えられ°Ｃゆき直線関係よりずれが生じてくる。
本発明キットによる測定法では約１０倍以上に血漿を希
釈することによって、希釈率とＰＣ活性の間に直線的な
関係が得られた。これより低い希釈率になるに従ってＰ
Ｃインヒビターの作用がより発現してくるため、ＰＣ活
性が抑えられ°Ｃゆき直線関係よりずれが生じてくる。
従って、本発明実施例においては血漿を１０倍以上に希
釈して使用するのが好ましい。
釈して使用するのが好ましい。
＋２１Ｃａ”イオン濃度
ＰＣ活性化時のＣａ”イオンの至ｉｆ！ ９２度を検討
した結果、血漿希釈用緩衝液中のＣａ ”イオン濃度は
０．１乃至４ｍＭが至適濃度であり、０．５乃至２．５
ｍＭがより好ましい。
した結果、血漿希釈用緩衝液中のＣａ ”イオン濃度は
０．１乃至４ｍＭが至適濃度であり、０．５乃至２．５
ｍＭがより好ましい。
（３）トロンビン添加量
本実施例の反応系においてはＩＵ以上のトロンビンを添
加することによってＰＣをほぼ１００％活性化すること
ができた。ＰＣ活性化後に加えるアンチトロンビン■−
ヘパリン量をなるべく少なくするために、本実施例キッ
トではトロンビン添加量をＩＵとしている。
加することによってＰＣをほぼ１００％活性化すること
ができた。ＰＣ活性化後に加えるアンチトロンビン■−
ヘパリン量をなるべく少なくするために、本実施例キッ
トではトロンビン添加量をＩＵとしている。
（４）トロンボモジュリン添加量
トロンボモジュリンの添加量を種々変えて行った結果、
本実施例においては０．０４ｎｍｏｌ以、トの添加量で
ＰＣの活性化が十分になされ、０．０６乃至０．１６ｎ
ｍｏｌで行うのが好ましい。
本実施例においては０．０４ｎｍｏｌ以、トの添加量で
ＰＣの活性化が十分になされ、０．０６乃至０．１６ｎ
ｍｏｌで行うのが好ましい。
（５）化合物ｌ添加量
本実施例キットの化合物１含有混合溶液中の化合物１の
ｌ；度を種々変えて検討した結果、混合溶液中の化合物
ｌの濃度が約７５ｎ／−以上で、合成１！Ｓ？Ｔｓ−２
３６６に作用するＰＣａ以外の妨害物質をほとんど影響
がないまでに阻害することができた。
ｌ；度を種々変えて検討した結果、混合溶液中の化合物
ｌの濃度が約７５ｎ／−以上で、合成１！Ｓ？Ｔｓ−２
３６６に作用するＰＣａ以外の妨害物質をほとんど影響
がないまでに阻害することができた。
又、分離精製したＰＣを用いて化合物ｌのＰ Ｃａに対
する阻害作用を調べた結果、該混合溶液中１５０躍／一
以上ではＰＣ活性が阻害されてくるため、本実施例にお
いてはそれ以下の濃度で用いるのが好ましい。
する阻害作用を調べた結果、該混合溶液中１５０躍／一
以上ではＰＣ活性が阻害されてくるため、本実施例にお
いてはそれ以下の濃度で用いるのが好ましい。
上記化合物ｌの代わりに化合物２を用いて行った結果、
化合物ｌと同じ濃度の溶液を用いて本発明を実施できた
。又、化合物３の場合は、溶ン夜の濃度が約２５犀／−
で、妨害物質の活性をほぼ抑えることが可能であった。
化合物ｌと同じ濃度の溶液を用いて本発明を実施できた
。又、化合物３の場合は、溶ン夜の濃度が約２５犀／−
で、妨害物質の活性をほぼ抑えることが可能であった。
（作用）
本発明ＰＣ活性測定用キットを用いた方法と免疫学的方
法ＣＥＩＡ法： Ｊ、 Ｃ，Ｇｉｄｄｉｎｇｓ ｅｔ
ａｌ＋ Ｂｒ１ｔ。
法ＣＥＩＡ法： Ｊ、 Ｃ，Ｇｉｄｄｉｎｇｓ ｅｔ
ａｌ＋ Ｂｒ１ｔ。
Ｊ、 ＩＩａｅｍａＬｏｌ、、 ５２．４９５−５０２
（１９８２））を用いて、健常人、肝疾患患者及びＤ
ＩＣ，患者の血漿中のｐｃ活性及びｐｃ抗原量を測定し
て比較した結果を第２図に示す。
（１９８２））を用いて、健常人、肝疾患患者及びＤ
ＩＣ，患者の血漿中のｐｃ活性及びｐｃ抗原量を測定し
て比較した結果を第２図に示す。
尚、本発明キットを用いて測定されたＰＣ活性は第１図
の検量線を用いて求めて百分率で表した。
の検量線を用いて求めて百分率で表した。
第２図より、本発明キットを用いて測定されたＰＣ活性
と免疫学的方法により定量されたｐｃ抗原量の間には、
良好な相関関係があることが明らかに示される。又、こ
の相関性は健常人だけでなく、血漿ｐｃ含量が低いとさ
れる肝疾、患患者やＤＩＣ患者の場合にも良く適合して
いる。
と免疫学的方法により定量されたｐｃ抗原量の間には、
良好な相関関係があることが明らかに示される。又、こ
の相関性は健常人だけでなく、血漿ｐｃ含量が低いとさ
れる肝疾、患患者やＤＩＣ患者の場合にも良く適合して
いる。
（効果）
本発明ＰＣ活性測定用キットを使用することにより、従
来の酵素学的活性測定法では必須であり、非常に手間の
かかるＰＣの分離精製という前処理をすることなく、血
漿そのものを用いてＰＣ活性の測定□ を行うことが
可能となった。
来の酵素学的活性測定法では必須であり、非常に手間の
かかるＰＣの分離精製という前処理をすることなく、血
漿そのものを用いてＰＣ活性の測定□ を行うことが
可能となった。
上述の試験結果より明らかなように、本発明キットは、
ｌＯμｌ以下の微量の血漿を試料として用い、短時間の
操作により該血り【中のｐｃを定量することができ、操
作も非常に簡単なものである。又、免疫学的方法による
ＰＣＣ晴晴キットの比較試験において、本発明キットを
用いて測定されたＰＣ活性はＰＣ抗原星と良好な相関関
係を有し、本発明キットが非常に定臂性に優れ°ζいる
ことが明らかである。
ｌＯμｌ以下の微量の血漿を試料として用い、短時間の
操作により該血り【中のｐｃを定量することができ、操
作も非常に簡単なものである。又、免疫学的方法による
ＰＣＣ晴晴キットの比較試験において、本発明キットを
用いて測定されたＰＣ活性はＰＣ抗原星と良好な相関関
係を有し、本発明キットが非常に定臂性に優れ°ζいる
ことが明らかである。
このように、従来のｌ） Ｃ活性測定用キットに比べ、
本発明キットは非常に前便、正確かつ迅速なものであり
、特に多量の試料を処理するのに有用である。
本発明キットは非常に前便、正確かつ迅速なものであり
、特に多量の試料を処理するのに有用である。
従って、本発明キットはｐｃ欠ＩＩ症、ＤＥＣ１肝疾患
などの診断やこれら疾患の早期発見する上で、また第■
因子製剤等の各種血）＆凝固製剤の品質チエツクのため
に非常に有用性の高いものである。
などの診断やこれら疾患の早期発見する上で、また第■
因子製剤等の各種血）＆凝固製剤の品質チエツクのため
に非常に有用性の高いものである。
第１図は本発明実施例に従って作成した検鼠線であり、
第２図は本発明ｐｃ活性測定用キットと免疫学的方法（
ＥＩＡ法）によるＰＣ定量用キットとの相関性を調べた
結果である。 代理人（ｆ１８９１）弁理士村山佐武部第１図 ＰＣ濃度
第２図は本発明ｐｃ活性測定用キットと免疫学的方法（
ＥＩＡ法）によるＰＣ定量用キットとの相関性を調べた
結果である。 代理人（ｆ１８９１）弁理士村山佐武部第１図 ＰＣ濃度
Claims (4)
- （１）下記成分より構成されるプロテインＣ活性測定用
キット。 ａ）プロテインＣ活性化物質 ｂ）アンチトロンビンIII ｃ）低分子量トロンビン阻害剤 ｄ）合成ペプチド基質 - （２）血漿希釈用緩衝液及び／又は反応停止剤を構成成
分として加えた特許請求の範囲第１項記載のプロテイン
Ｃ活性測定用キット。 - （３）プロテインＣ活性化物質がトロンビン−トロンボ
モジュリン複合体である特許請求の範囲第２項記載のプ
ロテインＣ活性測定用キット。 - （４）アンチトロンビンIIIにヘパリンが添加されてい
る特許請求の範囲第３項記載のプロテインＣ活性測定用
キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23449187A JP2683900B2 (ja) | 1987-02-18 | 1987-09-17 | プロテインｃ活性測定用キット |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-36739 | 1987-02-18 | ||
| JP3673987 | 1987-02-18 | ||
| JP23449187A JP2683900B2 (ja) | 1987-02-18 | 1987-09-17 | プロテインｃ活性測定用キット |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS642600A JPS642600A (en) | 1989-01-06 |
| JPH012600A true JPH012600A (ja) | 1989-01-06 |
| JP2683900B2 JP2683900B2 (ja) | 1997-12-03 |
Family
ID=26375828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23449187A Expired - Lifetime JP2683900B2 (ja) | 1987-02-18 | 1987-09-17 | プロテインｃ活性測定用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2683900B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2689640B1 (fr) * | 1992-04-06 | 1997-08-08 | Bio Merieux | Procede pour la determination d'une activite proteine c et/ou proteine s dans un echantillon plasmatique. |
| JP7435289B2 (ja) | 2020-06-16 | 2024-02-21 | スズキ株式会社 | 車両用動力伝達装置 |
-
1987
- 1987-09-17 JP JP23449187A patent/JP2683900B2/ja not_active Expired - Lifetime
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