JPH01262468A

JPH01262468A - クロマトグラフィー用担体

Info

Publication number: JPH01262468A
Application number: JP63089262A
Authority: JP
Inventors: Susumu Ishiguro; 石黒　進; Ryuji Takahashi; 龍二高橋; Hiroko Yabe; 矢部　浩子
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 1988-04-13
Filing date: 1988-04-13
Publication date: 1989-10-19

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、各種のクロマトグラフィー用充填剤を製造す
るために有用なりロマトグラフィー用担体、および該ク
ロマトグラフィー用担体にイオン交換基を導入したイオ
ン交換クロマトグラフィー用充填剤に関し、特にたんば
く質、オリゴペプチド、核酸およびオリゴヌクレオチド
などの生化学物質の分離１分析に利用することができる
イオン交換クロマトグラフィー用充填剤を製造するだめ
に利用することのできるクロマトグラフィー用担体、お
よび該担体にイオン交換基を導入したイオン交換クロマ
トグラフィー用充填剤に関する。

〔従来の技術〕

イオン交換クロマトグラフィーにより、たんばく質や核
酸などの生化学物質を分離１分析する方法は、従来より
行われている。しかし、従来の方法は、分離１分析に２
０分以上の長時間を要するという難点を有している。近
年、当業界においては、少量の試料全短時間に分離２分
析することが強く要求されてきた。・短時間で試料の分
離１分析を行うには、小さなカラムに粒子径の極めて小
さな粒子を充填することが必要である。従来、イオン交
換クロマトグラフィー用充填剤には、多孔性のポリマー
グルや多孔性のシリカケ゛ルなどが使用されてきた。

しかし、多孔性のポリマーグルは、粒子径を小さくする
と、機械的強度が小さいため、高圧、高流速での使用が
できないという問題があった。

一方、多孔性のシリカゲルは、機械的強度は強いが、弱
アルカリ性の条件下で溶解するという欠点があり、粒子
径を小さくするほど、この傾向が著しくなるという問題
があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、前記従来のイオン交換クロマトグラフ
ィー用充填剤の欠点を克服して、機械的強度にすぐれて
おり、高圧、高流速で使用に耐え、かつ化学的に安定で
弱アルカリ性の条件下で十分安定であり、体積変化のな
い、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤を製造する
ために有用なりロマトグラフィー用担体、および該クロ
マトグラフィー用担体にイオン交換基を導入したイオン
交換クロマトグラフィー用充填剤を提供することである
。

〔課題全解決するための手段〕

本発明によって、上記目的を達成し得るクロマトグラフ
イル用充填剤を製造するために有用なりロマトグラフィ
ー用担体、および該クロマトグラフィー用担体にイオン
交換基を導入したイオン交換クロマトグラフィー用充填
剤が提供される。

すなわち、本発明は、グリシジル基を有する架橋重合体
粒子からなり、該粒子表面のグリシジル基に基づくエポ
キシ基が加水分解によって水酸基に開環変性され、かつ
該粒子内部のグリシ・ゾル基に基づくエポキシ基が自己
架橋されている、平均粒子径が１〜５μｍの範囲内にあ
るクロマトグラフィー用担体に関する。

また、本発明は、グリシ・ゾル基を有する架橋重合体粒
子からなり、該粒子表面のグリシジル基に基づくエポキ
シ基が加水分解によって水酸基に開環変性され、かつ該
粒子内部のグリシジル基に基づくエポキシ基が自己架橋
されている、平均粒子径が１〜５μｍの範囲内にちるク
ロマトグラフィー用担体の前記水酸基に、イオン交換基
が導入されていることを特徴とするイオン交換クロマト
グラフィー用充填剤に関する。

以下、本発明のクロマトグラフィー用担体、および該ク
ロマトグラフィー用担体にイオン交換基を導入したイオ
ン交換クロマトグラフィー用充填剤について説明する。

本発明のクロマトグラフィー用充填剤を製造するために
有用なりロマトグラフイー用担体は、以下に示す工程を
経て合成することができる。

ｌ）グリシジル基金有する架橋重合体粒子の合成。

２）グリシジル基を有する架橋重合体粒子表面のグリシ
ジル基に基づくエポキシ基の水による加水分解。

３）グリシジル基を有する架橋重合体粒子内部のグリシ
ジル基に基づくエポキシ基の自己架橋。

さらに詳しく説明すれば、先づ第一工程のグリシジル基
を有する架橋重合体の製造は（４）不飽和カルデン酸の
グリシジルエステルまたはグリシジルモノビニルエーテ
ルと（Ｂ）架橋剤としての多価アルコールのポリビニル
エステル全常法に従って水性懸濁重合させることによシ
製造することができる。

囚成分の不飽和カルデン酸のグリシジルエステルとして
は、グリシノルアクリレート、グリシシルメタクリレー
ト等が用いられる。また、（４）成分のグリシジルモノ
ビニルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、
メタアリルグリシジルエーテル等が用いられる。

一方、架橋剤としての（Ｂ）成分の多価アルコールのポ
リビニルエステルとしては、エチレングリコールジアク
リレート、エチレングリコールジメタクリレート、プロ
ピレングリコールジアクリレート、プロピレングリコー
ルジメタクリレート、グリセリンジアクリレート、グリ
セリンジアクリレート、グリセリントリアクリレート、
グリセリントリメタクリレート、Ｋンタエリスリトール
ジアクリレート、ペンタエリスリトールジメタクリレー
ト、ペンタエリスリトールト・リメタアクリレート、ン
ルビトールノメタクリレート、ンルビトールトリメタク
リレート等をあげることができる。

なお、本発明においては、（４）成分を主成分とし、こ
れと共重合し得る他の単量体全適宜併用することは何ら
差し支えない。

（Ｂ）　成分の多価アルコールの１９リビニルエステル
は、全重合性単量体の１〜３０モルチの範囲内、好まし
くは５〜２０モルチの範囲内になるように使用される。

（Ｂ）成分の割合が多くなると架橋重合体粒子表面のグ
リシジル基の量が少くなるので好し、くない。

１合に際して用いられる開始剤は、通常の懸濁重合に用
いられる一般的なラジカル重合開始剤でよく、例えば２
，２′−アゾビスイソブチロニトリル、２．２′−アゾ
ビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系
の開始剤や過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル等の過
酸化物系の開始剤を用いることができる。

懸濁重合を行うに際しては、水相にポリビニルアルコー
ル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の分散安
定剤を加えておくことが好ましく、また囚成分および（
Ｂ）成分等の１合性単量体が重合分散媒の水へ舒解する
のを防止するため、水に塩化ナトリウム、硫酸ナトリウ
ム、塩化カルシウム等の塩類を溶解させておいてもよい
。

水層の量は、有機層の量とほぼ同容量以上から約１０倍
容量までの量が使用される。架橋重合体粒子の粒子径は
、単量体を水相に分散する際の攪拌速度でコントロール
することができ、単量体は０．５〜５μｍの油滴に分散
することが好ましい。

重合反応は、通常５０〜９０℃で３〜１６時間行なわれ
る。重合終了後架橋重合体粒子は、濾過、水洗し、さら
に有機溶媒で洗浄する。このよう圧して得られたグリシ
ジル基を有する架橋重合体粒子は、実質的に非多孔性で
あり、１〜５μｍ、好ましくは２〜４μｍの粒子径に分
級される。分級は常法により風力分級や有機溶媒中で数
回デカンテーションすることによシ行うことができる。

第二工程は、第一工程で得られたグリシジル基を有する
架橋重合体粒子に、水に難溶性の有機溶媒を含浸させた
後、この粒子を分散剤および鉱酸を含む水溶液中に懸濁
させ、５０〜９０℃で１〜５時間加熱することにより、
架橋重合体粒子の表面のグリシジル基に基づくエポキシ
基を加水分解して水酸基に開環変性する。架橋重合体粒
子に含浸させる有機溶媒としては、トルエン、キシレン
、クロルベンゼン、ノンラフインなどが、Ｓけられる。

また、触媒の鉱酸としては、塩酸、硫酸などがあげられ
る。鉱酸の濃度は、０．０５〜０．５規定が好筐しい。

分散剤としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルア
ルコールなどがあげられる。分散剤の濃度は０．５〜１
０重量％が好ましい。

第三工程として架橋重合体粒子内部のグリシジル基に基
づくエポキシ基を自己架橋させ、架橋重合体粒子の機械
的強度全増強する。自己架橋は、グリシジル基に基づく
エポキシ基と反応しない有機溶媒中で第二工程で製造し
た表面に水酸基を有する架橋重合体粒子を常法により、
三フフ化ホウ累エーテラート全触媒として、２０℃〜８
０℃で１〜５時間加熱することよシ行われる。この際に
用いられる有機溶媒としては、トルエン、キシレン、ジ
オキサン、ｎ−パラフィンなどがあげられる。

以上のごとくして得られる表面に水酸基ケ有し、かつ内
部のグリシジル基に基づくエポキシ基が自己架橋してい
る架橋重合体粒子は、平均粒子径が１〜５μｍの範囲内
であって、水酸基にイオン交換基金容易に導入すること
が可能であり、従ってイオン交換クロマトグラフィー用
充填剤全製造するだめのクロマトグラフィー用担体とし
て極めて有用なものである。

架橋重合体粒子の平均粒子径が１μｍ未満では、カラム
に充填した場合、カラム圧が高くなり、溶離液が流れ難
くなる。一方、架橋重合体粒子の平均粒子径が５μｍを
越える場合は、表面積が小さくなり、架橋重合体粒子の
表面に導入されるイオン交換基の量が少なくなる。

次に、上記クロマトグラフィー用担体の水酸基に、イオ
ン交換基を導入する方法について説明する１、水酸基に導入されるイオン交換基としては、（イ）スル
ホン基、（ロ）カルボキシル基、ＣＪジエチルアミンエ
チル基、に）第四級アンモニウム基などがあげられる。

イオン交換容量は、５０〜５００Ｍ当量／９が好ましい
。

スルホン基の導入は、第三工程で製造した表面に水酸基
を有する架橋重合体粒子を有機溶媒中でアルカリ金属の
水酸化物を触媒とし、グロノソンスルトンまたは１，４
−ブタンスルトンと反応させることにより行われる、反
応温度および反応時間は、通常室温〜１００℃で２〜２
４時間である。

カルボキシル基の導入は、第三工程で製造した表面に水
酸基金有する架橋重合体粒子にモノクロル酢酸やモノブ
ロム酢酸等の７・ログン化酢酸、またはモノクロル酢酸
ナトリウム、モノクロル酢酸カリウム等のハロゲン化酢
酸塩を水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムの存在下
で反応させることによって行われる。

ジエチルアミンエチル基の導入は、第三工程で製造した
表面に水酸基を有する架橋重合体粒子をアルカリ金属の
水酸化物の水溶液中で塩酸β−・ノエチルアミノエチル
クロライドと反応させることにより行うことができる。

反応温度は、室温〜８０℃で、反応時間は１〜８時間が
好ましい。アルカリ金属の水酸化物の水溶液の濃度は、
５〜４０重量％が好ましい。

第四級アンモニウム基は、ジエチルアミノエチル基を導
入した架橋重合体粒子を有機溶媒中でハロダン化メチル
またはハロゲン化エチルと反応させることにより導入さ
れる。

かくして得られるイオン交換クロマトグラフィー用充填
剤は、平均粒子径が１〜５μｍの範囲内の実質的に非多
孔性の架橋重合体粒子からな）、架橋重合体粒子の表面
にはイオン交換基が導入されておシ、架橋重合体粒子の
内部は密に架橋されている二重構造からなっている。

従来の技術では、担体の表面積を増加させるために多孔
性担体が用いられていた。本発明は、担体の粒子径’ｚ
１〜５μｍと小さくすることによって担体の表面積音大
きくし、担体の機械的強度金玉げるため、担体の内部は
架橋密度を高くし、担体の表面のみ架橋密度を低くし、
担体の水酸基を残し、その水酸基にイオン交換基を導入
してイオン又換樹り旨とするものでちる。

本発明によるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は
、平均粒子径が１〜５μｍの範囲内であり、従来のイオ
ン交換クロマトグラフィー用充填剤。

すなわち多孔性の担体にイオン交換基金導入したものと
は異り、実質上非多孔性で担体内部が高度に架橋されて
いるので、機械的強度も強く、１〜５　ｌｚｍという小
さな粒子径の担体も使用できる特徴がちる。

〔実施例〕

ダン、下、実施例？あげて本発明をさらに詳細に説明す
る。

実施例１（１）　　グリシジル基を有する架橋重合体粒子の合成
グリシジルメタクリレ−）　３２４．１工チレングリコ
ールジメタクリレート３６ｇおよびアゾビスイソブチロ
ニトリル１４，９’（Ｈ混合し、ポリビニルアルコール
９６ｇを溶解した２、４１の水中に加えた。この混合物
を高速攪拌し、油滴の粒子径を０．５〜５μｍに調節し
た後、６０℃に加温し、１０時間保った。次に、反応生
成物を室温で冷却し、水で希釈した。生成した架橋重合
体粒子を遠心分離し、また水中に懸濁し遠心分離を行っ
た。この操作を３回繰り返した後、架橋重合体粒子をア
セトン中に懸濁し、グラスフィルターで濾過し、さらに
グラスフィルター上からアセトンで洗浄を行った。この
架橋重合体粒子を自然乾燥し、次いで１０℃で８時間真
空乾燥した後、常法により風力分級し、２〜４μｍの粒
子径の架橋重合体粒子１１０Ｉを得た。

（２）架橋重合体粒子表面のグリシジル基に基づくエポ
キシ基の水による加水分解前記（１）で得られた架橋重合体粒子ｌｏｇにキシレン
３０ｇを加え、架橋重合体粒子にキシレン全含浸させた
。次にポリビニルアルコール４ｇと濃硫酸１．４７９を
水１００−に溶解した水溶液中に、キシレン全含浸させ
た架橋重合体粒子内部え、激しく攪拌した。この懸濁波
音８０℃に加温し、１時間保った。反応換金水で希釈し
、遠心分ｉｉｉ′ｌＩ金行った。沈殿した架橋重合体粒
子をグラスフィルター上に移し、水で洗浄し、次にアセ
トンで洗浄した。この架橋重合体粒子を室温で自然乾燥
し、さらに４０℃で８時間真空乾燥した。得られた架橋
重合体粒子の表面の水酸基量は、０．６　ｍＭ／、！９
であった。

（３）　　表面に水酸基を有する架橋重合体粒子内部の
グリシジル基に基づくエポキシ基の自己架橋前記（２）
で得られた表面に水酸基金性する架橋重合体粒子１０９
全ソオキサン５０ゴ中に懸濁し。

三フフ化ホウ素エーテラート（５５％）０．５ｍｉ加え
６０℃で８時間加温した。次に、反応換金グラスフィル
ターで濾過し、アセトンで洗浄した後、室温で自然乾燥
した。

（４）　　スルホン基の導入前記（３）で得られた表面に水酸基を有し、かつ内部の
グリシジル基に基づくエポキシ基が自己架橋した架橋重
合体粒子２ｇ’ｔｌＯｍＺのツメチルスルホキサイド中
に懸濁し、これにプロ・Ｐンスルトン０．５９および１
０％水酸化ナトリウム１．２．９　′に加え、攪拌しな
がら３０℃で６時間保った。次に得られた反応物を水洗
した。

反応物の１部をとり、中和滴定によりスルホン基の定量
を行った結果、０．１５　ｍｍｏｌ／／ｇ（ｄｒｙ　ｇ
ｅｌ　）のスルホン基が認められた。

（５）　　カルボキシル基の導入前記（３）で得られた表面に水酸基を有し、かつ内部の
グリシジル基に基づくエポキシ基が自己架橋した架橋重
合体粒子２ｇを水９−中に懸濁し、これにモノクロル酢
酸ナトリウム３．５ｇ、ヨウ化カリウム２，９．５０％
水酸化ナトリウム６９　’、１加え。

攪拌しながら６０℃で３時間保った。次に反応物を水洗
した。反応物を１部と９．０．１規定水酸化ナトリウム
水溶ｒＬ金用いて中和滴定を行い、カルボキシル基の定
量全行った。その結果０．２　ｍｍｏｌ／９（ｄｒｙ　
ｇｅｔ　）のカルボキシル基が認められた。

（６）　　ジエチルアミンエチル基の導入前記（３）で
得られた表面に水酸基？有し、かつ内部のグリシジル基
に基づくエポキシ基が自己架橋した架橋重合体粒子２．
９全２０％水酸化ナトリウム１２ｙ中に懸濁し、塩酸β
−ソエチルアミノエチルクロライド１ｇを加え、攪拌し
ながら６０℃で３時間保った。次に反応物音水で洗浄し
た。

反応物を１部とり、０．１規定塩酸水溶液全用いて中和
滴定を行った結果、０．２５　ｍｍｏｌ／′！ｊ（ｄｒ
ｙｇｅｌ　）のジエチルアミノエチル基が認められた。

応用例工実施例１〜（４）で得られた陽イオン交換樹脂をステン
レスカラム（内径４．６　ｍ　Ｘ長さ３５聾）に充填し
、溶離液囚として２０ｍＭリン酸緩衝液Ｃｐ＋４７．０
）全用い、溶離液（Ｂ）として２０　ｍＭ　！Ｊン酸緩
衝液＋０．５Ｍ塩化ナトリウム（饅７．０）を用い、流
速Ｌ５−／ｍｉｎ　　で溶離液囚から溶離液（Ｂ）に１
０分間のリニアグラツエン）を行い、■ミオグロビン、
■リボヌクレアーゼＡ、■チトクロームＣ１■リゾチー
ムの混合物を分析したところ、第１図に示すように４つ
のたんばく質を５分以内に分離することができた。

応用例２実施例１−（６）で得られた陰イオン交換樹脂をステン
レスカラム（内径４．６×長さ３５簡）に充填し、溶離
液（４）として２０ｍＭピにラノン（ｐＨ６，０）を用
い、溶離ｉ　（Ｂ）として２０　ｍＭビにジノン＋０５
Ｍ塩化ナトリウム（ｄ（６，０）を用い、流速１．５ｍ
＋＞ｍｉｎで溶離液（イ）から溶離液（Ｂ）に１０分間
のリニアグラジェントを行い、■コナルブミン、■トラ
ンスフェリン、■オボアルブミン、■トリゾンンインヒ
ビターの混合物を分析したところ、第２図ンζ示すよう
に・１つのたんばく質を６分以内に分離することができ
た。

応用例３応用例２で使用したカラムを溶離液囚として２５　ｍＭ
リン酸緩衝液＋０．２　Ｍ塩化ナトリウム（、Ｉ（６，
０）−ｉ用い、溶離液（Ｂ）として２５ｍＭリン酸”−
’＜　Ｊ液＋ＩＭ塩化ナトリウム（ＰＨ６，０）を用い
、流逮１５ゴ／・’ｍｉｎで溶離液・囚から溶離液（匂
に３０分間のリニアグラジェントを行い、オリゴアゾニ
ール酸の分離を行った。第３図に示すようにオリゴアゾ
ニール酸のオリゴマーを分離することができた。

〔発明の効果〕

本発明のクロマトグラフィー用担体は１機械的強度にす
ぐれており、かつ化学的に安定で弱アルカリ性の条件下
で十分安定であって、体積変化もないのでイオン交換ク
ロマトグラフィー用充填剤を製造するための担体として
極めて有用なものである。

また、本発明により得られるイオン交換クロマトグラフ
ィー用充填剤は、従来のイオン交換クロマトグラフィー
用充填剤に比較して以下のような利点全有している。

１）機械的強度が太きく、１〜５μｍの小さな粒子径を
有しているため、高速液体クロマトグラフィー用充填剤
に使用した場合、高性能な分離ができる。

２）架橋重合体粒子内部の架橋度が高いため、膨潤度が
小さく、高い塩濃度で使用できる。

３）実質的に非多孔性のため、イオン交換クロマトグラ
フィー用充填剤の表面のみで分離が行われ、試料ピーク
の拡散による広がシを少くできる。

４）広い一範囲で安定であシ１例えばシリカゲルを担体
とする充填剤では適用できないアルカリ条件下でも安定
に使用できる。

【図面の簡単な説明】第１図は実施例１−（４）で得られた陽イ万ン交換樹脂
を用いて、たんばく質混合物のイオン交換クロマトグラ
フィーを行ったとき得られたクロマトグラムである。図中■はミオグロビン、■はりボヌクレアーゼーＡ、■
はチトクロームＣ１■はりゾチームの各ピークを示す。第２図は、実施例１−（６）で得られた陰イオン交換樹
脂を用いて、たんばく質混合物のイオン交換クロマトグ
ラフィーを行ったとき得られたクロマトグラムである。図中■はコナルブミン、■はトランスフェリン、■はオ
ヂアルブミン、・■はンイビーントリグシンインヒビタ
ーの各ピークを示す。第３図は実施例１−（６）で得られた陰イオン交換樹脂
を用いて、オリゴアゾニール酸のオリゴマーを分離した
クロマトグラムを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）グリシジル基を有する架橋重合体粒子からなり、
該粒子表面のグリシジル基に基づくエポキシ基が加水分
解によって水酸基に開環変性され、かつ該粒子内部のグ
リシジル基に基づくエポキシ基が自己架橋されている、
平均粒子径が１〜５μｍの範囲内にあるクロマトグラフ
ィー用担体。
（２）グリシジル基を有する架橋重合体粒子からなり、
該粒子表面のグリシジル基に基づくエポキシ基が加水分
解によって水酸基に開環変性され、かつ該粒子内部のグ
リシジル基に基づくエポキシ基が自己架橋されている、
平均粒子径が１〜５μｍの範囲内にあるクロマトグラフ
ィー用担体の前記水酸基に、イオン交換基が導入されて
いることを特徴とするイオン交換クロマトグラフィー用
充填剤。