JPH01266858A - キュベット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野ｊ 本発明は、中に含まれる准体内で反応を行なう（特にこ
れらの反応は注意深い温度調督、限られた量の試料、お
よび急速な液体温度変化を必要とするノキュペットに関
する。

（従来の技術プ 本発明は核酸拡張に使用するキーペットに限られるもの
ではないが、これに関連させて説明する。

核酸拡張Ｉト通常以下θン工程を経て進む（第１図参照
）： ＩＪＤＮＡを拡張する場合、適当な制限酵素を使っ℃完
全なりＮＡ２重らせんを任意に化学的に切り取り℃関心
のある部分を単離する。

２）単離した核酸部分（ここで）ま、ＤＮＡＪおよびヌ
クレオチドの溶液を９２〜９５℃に加熱しそして、例え
ば約１０分以内の間、この温度に保つて２つの核酸スト
ランドを変性させる（すなわち、これらのらせんをとき
１分離し、そして原型を形成する）。

３ノ　次に溶液を５０〜６０℃の帯域に通して冷却して
プライマー核酸ストランドをアニールする、すなわち２
つの原型ストランドのそれぞれにこれを結合させる。こ
れが確実に起こるようにするために、溶液を適当な温度
、例えば約５５℃、で約１５秒間、「培養」帯域に保つ
。

４ノ次に溶液を約７０℃に加熱し、この副産に保っ℃、
存在するヌクレオチドを使い、拡張酵素好ましカス、マ
セルマス・アクアティカス（ｔｈｅｒｍｕＳ　’　ａｑ
ｕａｔ　ｉ　ＣｕＳ　Ｊから単離したポリメラーゼのよ
うな熱に安定な酵素、で原型ストランドに結合したプラ
イマーストランドを拡張させる。

５）完成した新しい対のストランドを再び９２〜９５℃
に約１０〜１５秒間加熱し１：２　この対を分離する。

６ノ　次に適当な数のストランドが得られるまで工程３
Ｊ〜５ノを何回か繰り返す。（詳細は米国特許第４，６
８３．２０２号参照。）　繰り返すほど、多数の核酸（
ここでは、ＤＮＡＪが生成される。

希望の濃度の核酸が最少の時間に得られるのが好ましい
。

キーペットは通常、溶液が前記の温度段階を通過する間
溶液を保持するのに使われろ。キュベツトを速やかに様
々な段階に進めることができるがどうか（まキュベツト
のデザインによる。これをコントロールする鍵となるも
のはキーペットの熱伝達効率である−一すなわち、キュ
ベツト内の溶液全体へまた１ま溶液全体から熱を瞬時に
伝達するキュベツトの能力である。熱源またはシンクか
ら比較的離れている浴液部分は望ましい温度に達するの
により時間がかかるので、配置および溶液自体の熱抵抗
が熱伝達に影響を及ぼす主な要素である。

従来使用されてきた最も素朴で初期のタイプのキュベツ
トは試験管であり、これは、ａツガラスまたはプラスチ
ックのキュベツトの壁が熱エネルギーをよく伝達しない
、およびｂ）円筒状の液体では液体すみずみへの熱伝達
が比較的不十分であるため熱伝導効率が不十分である。

すなわち、液体の熱伝導が低いばかりでな（、円筒状の
成体１マ表面対容積比（すなわち、約１００μｌの注入
に対して約２７＋ｎｃある〕が小さい。

ＤＮＡ拡張におげろ別の問題は１反応の児了後キュベツ
トから液体を簡単に取り出せるようにすることである。

試験管の形はそれが簡単にできる。

しかしながら、キュベツトをよりよい熱伝導効率のもの
に変えると、ｏ、体の移動性が悪（なる。

液体の反応用の最近のキュベツトまた１ま容器についＣ
は１９８４年１月１７日発行の米国特許第、１，４２６
，４５１号および１９７２年９月１２日発行の米国特許
第３．６９１．０１７号に記載されている。前者では、
熱が液体を通るとき、液体を、急速な加熱が行なえる薄
いフィルム状に散布している他は、熱伝導効率を高める
試み゛はほとんどなされ℃いない。金属また１工熱伝導
性の高い材料でできたキュベツトについ℃は何も記載さ
れ℃いない。さらに、上部と下部の壁との間の間隔は１
２５ミクロン以下であり強力な毛管効果をもたらすので
、そのようなキュベツトから液体を取り出すのは難しい
。

もつとも良い状態であっても５強力な毛管吸引力のため
全ての液体は取り出せない。

米国特許第３．６９１，０１７号のキュベツトの場合は
、ＤＮＡ拡張により適した特徴を有する。たとえば、主
要面２３と２４との間隔が約５　ｆｆＪであることによ
って、全ての液体の取り出しがより簡単にでき、そのよ
うな大きな間隔では毛管吸引力はほとんど残っ℃−・な
い。さらに、金属層３８Ａがキュベツトの外側にとりつ
け℃あって加熱装置に接触している。しかしながら、こ
のキュベットハいくつかの理由で熱時定数が小さくない
。理由の１つは、確実に透明にするために表面２３およ
び２４が金属でできておらずむしろ絶縁体でできている
からである。その結果、装置の端の周りとキュベツトの
容積部分３５のみに金属３８Ａを伸ばすことによって、
熱伝達路を長くすることが必要となる。この熱路長さは
主要面２３および２４となる壁の厚さよりはるかに大き
いので、これは０．５１をはるかに越す値となる。実際
は、キュベツトの容積部分だけが金属熱エネルギー伝達
部材と直接接触している。

第２の理由は、さらに電装なことであり、後で詳しく述
べるがこの米国特許第３，６９１，０１７号のキュベツ
トはキュベツトの形状から、液体表面／容積比が小さ（
・ので熱抵抗が高いからである。

本発明の目的は、たとえばＤＮＡの部分の複製化に使用
できる選択された液体が入っ℃いる場合の熱時定数によ
っ℃判定されるような、急速な熱伝達特性を有するキュ
ベツトを提供することである。

（発明の構成］ 本発明の１つの態様によれば１本発明の目的は、すくな
くとも約３５℃（たとえば約５５〜約９０’Ｃ）の温度
範囲をサイクルさせる液体成分の制御反応用の以下の熱
サイクルキュベツトによっ℃達成される。このキュベツ
トは２つの間隔をおいて離れた向かいあった壁によって
定められた少なくとも１つの液体を入れ℃お（室を有し
、側壁は前記の２つの向かいあった壁に接続しているも
のであっ℃、そして前記の向かいあった壁および前記の
側壁は、注入容量１００〜２００／ｌｔに対し有効温度
調整面対容量比が約６５〜約１３０ｉｎ−１の室をもた
らす大きさであること、および少なくとも１つの前記の
向かいあった壁の熱路長さが約０、３　ＩＩＪ以下およ
び耐熱度が約０．０１℃／フット以下であることを特徴
とするものである。

本発明の別の態様によれば１本発明の目的は。

液体成分の制御反応用の以下のキュベツトによっ℃達成
される。このキュベツトは反応を行なうための第１およ
び第２の液体を入れておく室を有し。

それぞれの室は２つの間隔をおいて離れた向かいあった
壁によって定められ℃おり、そして側壁は前記の２つの
向かいあった壁のそれぞれに接続しており、前記の各室
は液体を入れておく主要面を提供するものであっ℃、前
記の２つの室は、前記室の一方の主要面が他方の室の主
要面上に配置されるようになっ℃いることを特徴とし、
そのため前記主要面が共通面となる前記キュベントの長
さおよび／または幅が、同等のキュベツトと比へ℃小さ
くなるものである。

本発明のさらに別の態様によれば１本発明の目的は、切
り離した１ストランドの核酸とモル過剰のオリゴヌクレ
オチドブライマーとの混合物をプライマーを前記ストラ
ンドに結合させるのに有効な温度で処理し、この結合し
たブライマーおよびストランドを延長酵素の存在下で加
熱してプライマーを延長して補足ストランドを形成し、
この結合補足ストランドおよび前記核酸のストランドを
、これらを２つの原型ストランドに分離する温度で加熱
し、その後前記の各工程をこれらの原型ストランドに繰
り返して多数の拡張ストランドを生成することよりなる
核酸配列を拡張する方法において、さらに以下の各工程
： 選択したオリゴヌクレオチド配列に結合したヌクレオチ
ドの補足配列よりなる検知および捕捉プローブを前記混
合物に加える（前記プローブはさらに、反応して検知信
号を出すことのできる信号部分またはプローブに結合し
たストランドを固定化する捕捉部分のいずれか、または
両方を含んでいる）工程； 前記プローブを前記拡張ストランドと反応させてプロー
ブを拡張ストランドに結合する工程；結合したプローブ
およびストランドを曾む混合物を分離手段に移丁工程； そして、この混合物を、そのような捕捉部分とは結合す
るがそのような捕捉部分の無いストランドは通過させる
物質を含有するフィルターに通すことによって、捕捉プ
ローブを有するストランドをそのようなプローブの無い
ストランドから分離する工程 よりなる上記の方法によって達成される。

本発明は以後、好ましくは、ＤＮＡストランドの複製化
に特に有用な少なくとも３５℃の範囲に渡る温度サイク
ルについて述べる。さらに、これは、その中で反応が行
なわれろキュベツトの加熱および冷却を繰り返し行なう
必要のある液体成分および試薬のどのような種類の反応
にも有用である。

「上」および「下」のような配置方向は、七のように使
用するのが好ましいキュベツトに関して用いる。

まず第２〜４図につい℃述べる。本発明によって作った
キエベヅト３０は距離ｔ１の間隔で離れた２つの向かい
あった壁３４および３６により℃定められた液体を入れ
る室３２（第４図〕よりなる。そのような間隔は室３２
の向かいありた端４２および４４で接合する側壁３８お
よび４０によっ℃得られる（第３図）。最も好ましいの
は。

側壁３８および４０の形が徐々にへこんでいく形のもの
であり、そのためこれらの壁は端４２で約９０°の角度
アルファにて分かれ、端４２および４４の中途の地点か
ら再び約９０°の角度で１点に集まるように近づき始め
る。距離は（第４図月ま。

側壁３８および４０の形のありかたを考えた場合、液体
を取り除いたときキュベツトに留まる液体の量が最少と
なるような距離を選ぶ。すなわち１毛管状の間隔が液体
の除去を妨げることはよく知られていることである。従
って１間隔が接近している壁３４および３６０間の液体
の厚さは毛管状の間隔ではないのが、すなわち間隔≧０
．５藷、最も好ましくは０．５〜２．５であるのが好ま
しい。さらに正確に？工、ｉ体容器が特定の形に定めら
れている場合、容器が毛管吸引力のような悪影響を及ぼ
すファクターに対抗して容器を空にする能力）エキャピ
ラリーーナンバーＣで表すことができる。その式１工Ｃ
＝μ・Ｖ／ｒである。式中、μは粘度であり、水溶液の
場合これは約０．０１ポアズである。

ｒは表面張力であり、水溶液の場合これ（１約７０ダイ
ン／ｃｍである。ｖ１工速度（ｃｍ　／秒〕であり。

空にする全容積を出口の通過面積で割りそして空にする
のに許容される時間で割ることによっ℃決定される。従
って、速度ファクターについ工熟考する必要がある。空
にする容積は２００〜１００μｌである。許容時間は１
〜１０秒である。従って、■は最高の２００／Ａ・１か
ら最低の１００／Ａ・１０である。本発明の目的の場合
、Ａは約５．２Ｘ１０　　ｃｍ　、出口の通過面積は６
０と仮定する。従って、■は約３．８５〜３８．５α／
秒である。

つまり、このキュペントのキャピラリー・ナンバ−は約
ｏ、ｏｏｏｓ〜約０００６である。しかしながら、非毛
管状間隔だけかそのような速度で空にすることができる
ので、これに非毛管状間隔を組み込まなければならない
。

壁３４および３６は液体と接触する主要面となる。その
ため、厚さを間隔ｔ１と考えた場合、それらの表面積を
、呈３２の表面対容積比が高速度の熱エネルギー伝達に
最も適するように選択する。

非常に好ましい例は、６壁３４および３６の露出表面積
が２．４ｍ　（０，３７１ｎ２）であり、０．３６　ｃ
ｍ２の接触面積で側壁の面と接触している場合である。

したかって、表面対容積比が、注入容積２００〜１００
μｊに対し、それぞれ約６５−１３０ｉｎ−１であるの
が最も好ましい。

液体表面積対容稍比がそのように大きいと、急速な熱エ
ネルギー伝達とは別の利点がもたらされる。これはまた
、一定の容積に対して、より広い表面積が塗布試薬に提
供されることを意味する。

このこと（ま、早すぎる混合、すなわち、液体を呈に圧
入する前の混合、を防ぐために表面上の離れた位置に塗
布しなげればならない試薬の場合、特に軍装なことであ
る。また、液体を入れると、これらの試薬はより効果的
に溶解される。

従って、任意に、１つ以上の試薬ｒＶ１５０を、１層以
上が、室３２に挿入する液体試料との反応に加わるよう
にする形で壁３６（第４図）の内面に塗布することがで
きる。従っ℃「試薬」とは、液体試料と物理的かつ化学
的に互いに作用し合う物質である。そのような試薬層は
噴霧乾燥によるような従来法で塗布することができる。

そのような試薬にはポリメラーゼ酵素、塩、緩衝剤およ
び安定剤がある。塗布層にはまた複製化に必要なプライ
マー・ベアーおよびジヌクレオチドも含まれる。

液体出入口６０は端４２に隣接する壁３６に形成される
。この出入口は上部６２および下部６４を有し、上部を
室３２に接続している。好ましくは、少なくとも上部６
２は円錐形であり、その傾斜は種々の円錐ピペットＰ（
第２図）が合うようになっ℃いる。

反対の端４４には、米国特許第４．４２６．４５１号に
記載のように空気抜き７０が設けろｔ′１．”Ｃいる。

最も好ましくは、空気抜き７０は通路７２ｖＣ延び（第
３図り、端４２の隣接点に戻り、出入口６゜に隣接する
開ロア４で終わる。

単一の密封機構で出入口６０および空気抜き開ロア４を
共にシールするには、高（した円筒状ボス８０でこれら
を囲む。どのような密封機構（たとえば栓８２．第１０
図］もボス８０に対して有用である。そり）ような栓に
は、ボスの雌ねじ（図示さね℃いない）に合う雄ねじ８
４があっ℃もよく、あるいはボス８０内への押し込み式
にしてもよい。

最も好ましいのは、壁３４以外の装置の壁を例えばポリ
カーボネートプラスチックのようなあまり湿潤性でない
材料から作ることである。

本発明の１つの態様では、壁３６の反対側σ）壁３４は
、熱エネルギー伝達が高速となる予め決めらねた熱路長
さおよび熱抵抗を有するように作る最も好ましいのは、
そのような路の長さ（第５図のｔ２Ｊが約０．３　ａｍ
以下であり、熱抵抗が約０．０１℃／ワツト以下である
。このような性質は、厚さ約０．１５ｍのアルミニウム
のような金属から壁３４を作ることによって簡単に得ら
れる。そのようなアルミニウムは、厚さＸ・１／（熱伝
導率Ｋ・表面積ＡＪとして計算して、約０．００３℃／
ワットの熱抵抗を有する。（これらの（ＩＬは、約０，
２４℃の熱抵抗を有する同じ厚さの普通のガラスと対照
的である。ノ 壁３４は側壁３８および４０にどのような適当な手段で
固定してもよい。そのような１つの手段は、例えば一般
的な高温硬化接着剤よりなるプライマーの層９０（ｋ５
図ノ、それに続（一般的なポリエステル接着剤の層９２
である。場合によっては１層９０および９２は壁３４の
表面領域−面に延ばす必要はない。というのは、このよ
うに−面に延ばすと壁３４の熱抵抗が高まり、室内での
前述の反応が妨げられる場合があるからである。

他方、反応によっては存在する金属イオンが同じように
悪影響を及ぼすことがあり、このような反応の場合、接
着剤を壁３４０表面積全体に塗布する。

第２〜４図の上記のようなキュベツトでは、そこに含ま
れる液体の熱時定数タウ（τ）が約１０秒以下となるこ
とがわかった。最も好ましいのは、τが３〜８秒のもの
である。すなわち、水を入れたそのようなキュベツトを
壁３４の外側にそって加熱し、その温度をＹ点（第４図
）で測定すること、熱応答曲線が２８℃〜最終温度１０
３℃に生じる（第６図）。中の液体が７６℃〔初期温度
２８０Ｃ，プラス差（１０３，９−２８〕の６３％〕と
なるのにかかる時間がタウのおおよその値である。

（おおよその）この値はよく知られた以下の熱応答式か
ら得られる： ｆｉ＋　　温度Ｔ（ｔ）＝最終温度子（初期温度−最終
温度）・ｅ−ｔ／Ｔ 従っ℃、式中の時間間隔ｔがタウに等しい場合、ｅ’−
”　＝　ｅ−１：：０．３７となる。このような場合。

Ｔ（ｔＪ’（ｔ＝タウでのハエ初期温度に（最終温度−
初期温度］の６３％を加えたものに等しい温度である。

（第６図のデータの階段の形は記録計によるものである
。） 従って、上記キュベツトの液体のタウは約３．５秒であ
る（第６図の応答曲線が上の式ｆｉ＋に従い、近似値に
十分に近ずけたと仮定する）。

層９０および９２の接着剤を壁３４の表面全体に広げる
と、タウは７〜８秒にも増加する。

タウが約３．５秒の値では、同じキュベツトの熱応答曲
線が第１図の説明に従っ又加えられる条件下で予想され
る。第７図は大体におい′ＣＸ印の付いた第１図の最終
部分のみに対するそのような応答曲線であり、階段部分
「ＡＪｊＸタウ３秒の場合のオープンまたは培養器温度
であり、曲線ｒＢＪは同様の場合の液体内容物の温度で
ある。（しかしながら、この実施例では、培養温度は５
５℃の代わりに３７℃を選んだ。

比較実施例としての米国特許第３．６９１，０１７号に
記載のキュベツトは以下の性質を有する。その全体の厚
さは５／１６”すなわち０．３１”である（第８欄、４
２〜４４行〕。液体が占めろスペースは５１の厚さであ
る（第８欄、４４行）。窓はｌｈｎ×μ″（４５行）で
ある。そのため１平方インチの単位面積の液体の容積は
約０．１９７ｉｎ３であると推測され、そしてキュベツ
トが接触しているその表［１０積は約２．７９　ｉｎ２
であると推測される。このことから、精々僅か約１４．
２１ｎ−１の表面／容積比となる。同じ容積の球は８．
３のＳ／Ｖ比であり、このキュベツトは最も悪そうな形
（球〕よりもＳ／■比が僅かに良いだけである。さらに
、発熱体は外部からキュベツトの中に延びたアルミニウ
ムのフォイルであり、従って熱路長さはＩＵをがなり超
える。これらのことから、そのようなキュベヴト内の水
の熱時定数タウは明らかに１０秒よりかなり犬であるこ
とが分かる。キュベツトを接着剤を使って取り付ける必
要はない。接着剤を使わない具体例を第８図に示す。こ
こでは、前記具体例で使用されたものと類似の部品に（
ま文字「ａ」を添えた参照番号を付けている。従って、
キュペラ）３０ａは側壁（，４０ａのみを図示）と共に
室３２ａを定める２つの向かい合った壁３４ａおよび３
５ａよりなる。液体出入口６０ａおよび空気抜き７０ａ
も前記具体例と同様に設けられており、壁３４ａは前記
と同じ性質を持つ。しかしなから、この具体例では壁３
４ａと側壁４０ａとの間のどこにも接着剤を使用し′″
Ｃ（・ない。そのかわりに、室３２ａの周りの端金部に
エラストマーのガスケットシール１００または他の適当
な７ｊスケツト材が壁３４ａと側壁との間にある。さら
に、プラスチックは０のバンプが側壁から側壁３４ａ（
７）適当な開口を通って延びている。そこでバンプは０
を熱または圧力によってアプセットして壁３４ａを適所
にびょう締めする。任意に、ガスケットシール１００を
そのようなバンプの周りに延ばしてもよい。出入口およ
び空気抜きを封じ、キュベツトを加熱すると、室３２お
よび３２ａ内で圧力が高まる。従って、反応容器壁３４
と培養器との間の緊密な接触を保つために、熱伝導性を
以外のキュベツトの１部が変形して圧力の増加に適応す
るのが好ましい。さらに、別の壁が変形すると熱伝導性
壁を適所に保持するシール上の歪みが減少する。

そのような具体例は、　Ｈｅ１ｆ’ｅｒ等の「非屈曲回
熱伝導性壁を有するキーベット」と題する１９８７年は
月２３日付けの共有所有の出願番号第１２３．７５２号
に記載のような第９図のものである。

前記のものと類似の部品には文字＋１）Ｊを添えた参照
番号が付いている。

従って、キュベツト３ｏｂｔｚ側壁４０ｂ（１つのみ図
示）と共に１間隔ｔ１を有する室３２ｂを定める向かい
合った壁３４ｂおよび３６ｂからなる。これらおよび出
入口６０ｂおよび空気抜き７０ｂは前記具体例における
と同様に作られている。しかしながら、ｇａ４ｂが加圧
下で確実に変形しないようにするために、壁３６ｔＩ壁
３４ｂより小さい曲げ強さを有するように作られ℃いる
。

詳しくは、以下のようにするのか好ましい：壁３４ｂが
厚さ約０．１５ｆｆＪのアルミニウムからなる場合、曲
げ中心でのその曲げ強さＫは以下のようにして判定され
る： 撓みＸはよ（知らｊた以下の式で判定される：（２）　
Ｘ＝乙Ｐ己２　／　Ｅ　ｔ３ 〔式中、Ｐ−今加荷重、Ｅニブレートの弾性率、ｔ＝ニ
ブレート厚さ、そし′Ｃａは実験係数（通常約０．０１
５である〕〕 整理し直すと、 （３１Ｐ　／　Ｘ　＝　Ｅｔ３／αａ２Ｐ／ＸはＫに等
しいＦ／Ｘに類似しているので。

（４１Ｋ＝Ｅｔ３／α７！Ｌ２ このことがらＫＨｚ約６．はＸ１０６ダイン／　ｍｙｘ
と計算できる。これよりも曲げ強さが小さい壁３６ｂの
場合は、同様に計算して約８．３ＸｌＯダイン／Ｕの曲
げ強さを持つ約０．３　ｙの厚さ（アルミニウムのｇａ
４ｂの２倍の厚さｔ３Ｊのポリエチレンまた’＋Ｓポリ
プロピレンの層よりもっばらなる必要がある。そのよう
な構造では、室３２ｂ内に圧が生じるにつれて、壁３６
１）は上にドーム状にふ（らみ、壁３４ｂを発熱体に対
して平らな状態にしておく（ｒＥＪとして疑似模型で示
す〕。使用の際、上記のキュベツトを４４（第３図Ｊの
ところあたりまで満たす。これ警工反応のための好まし
い試料を含む液体１例えば拡張を行な５ＤＮＡ配列の溶
液、で約９０％満たてことになる。次にこの装置を適当
な培養器に入れ１反応に必要な段階をサイクルさせる。

本発明の別の態様では、可動バルブを配置してキュベン
ト内の室への入り口を選択的に開閉する。

前に記載したものと類似の部品には、識別文字ＦＣ」を
添えた同じ参照査号を付けた。

従って、第は〜１４図において、室３２Ｃの端４２Ｃ，
は高くしたボス８０Ｃ内に互いに隣接しＣ＠り付けられ
た液体出入口６００および空気抜き通路７２Ｃを有する
（第は図〕。上部６２０は前の具体例と同様に円錐形で
あり、ピベウトＰと合わせられる（第１２図）。

しかしながら、この具体例では、円錐形のかみ合い開口
１２２内に取り付けた回転可能部１２０よりなるバルブ
が設けられ℃いる（第１２図）。

回転可能ｍ　１２０は円錐形の外表面１２３を有する。

バルブは、好ましくは一ロ６０Ｃ内に同中心的に配置さ
れた１回転軸を有する。ハンドル１２６によってバルブ
を手動または自動回転させる。出入口６０Ｃならびに空
気抜きロア４０’ｔ’Ｌ可動バルブ部１２０内に取り付
ける（第はおよび１３図）。

開口６０Ｇおよび開ロア４Ｃを室３２０に選択的に接続
するには、回転部１２０に２つの路を作る。路１３０は
開口６０Ｃから外表面１２３に延び（第１２図）、そこ
でその表面の角度シータに開く（第は図）。路１３２は
開ロア４Ｃから面１２３上の出口１３４に延びる（第１
４図」。第３２０および通路７２Ｃにそれぞれ関連する
路１３０および１３２の高さは、回転部１２０が第１３
図に示す位置に回転すると、路か室または通路に通じる
ようになっている。さらに必要ならば、路１３０に生じ
た出入口の角度シータにより、部分１２０を出入口６０
Ｃのみが室３２Ｇに通じる位置（図示せず）に回転させ
ることもできる。

テール部分１４０は回転可能部１２０を適所に垂直に保
持し、溝１４４に掛かる（第１２図）。

出入口および空気抜きバルブは回転するようにする必要
はない。移動可能なバルブも有用である。

前に記載したものと類似の部品には、識別のために「ｄ
」を添えた同じ参照番号を付けた。従って、第１５図で
は、出入口６０ｄおよび空気抜きロア４ｄの両方を組み
込むようにパルプ部１２０ｄが端４２ｄ配置されている
。しかしながら、前の具体例とは異なり１部分１２０ｄ
は垂直に移動可能なように取り付けられ℃おり、テール
部分１４０ｄは回転しない溝１４４ｄに垂直に掛かっ℃
いる。

通常、スプリング１５０は、高くして路１３０（１およ
び１３４ｄが室３２ｄおよび空気抜き通路７２ｄに対し
てそれぞれ一直線にならないように５部分１２０ｄにか
たよらせる。こうすることによって、至３２ｄｊ’工外
の環境から遮断される。室に入れるには、使用者は、例
えば出入口６０ｄにピペットＰを合わせ、スプリングを
押すことによつ℃、部分１２０ｄを下に押し下げるだけ
でよい。

この具体例では、空気抜きロア４ｄは外表面１２３ｄに
形成した溝であり、これによつは部分１２０ｄを、室３
２ｄが出入口６０ｄとも通じるのに十分な距離押し下げ
ると、通路７２ｄのガス抜きができるようになっている
。

ある反応では、第１室での適当な滞留時間の後液体を第
２室に移動するのが好ましい。例えば、ＤＮＡプローブ
試験では、ＤＮＡプローブを拡張する目標配列に結合す
る単一の新しい熱サイクルを加える必要がある。上記の
ＤＮＡ拡張温度サイクルに絖い−Ｃ，ＤＮＡを有する液
体培地を拡張する目標配列に特定なりＮＡプローブと接
触させる。

そのようなプローブは反応容器の壁土に、さらに詳しく
は、第１６〜１７図に示すような第２のＤＮＡプローブ
の入った室の壁に塗布してもよい。

前に記載したものと類似の部品には、識別のために「ｅ
」を添えた同じ参照番号を付けた。

従って、キュベツト３０ｅは２つの向かい合った壁３４
ｅおよび３６ｅの間に配置された室３２ｅよりなり（第
１７図〕、主要面および側壁３８ｅおよび４０ｅを有し
く第１６図ノ、これら（ま全℃前記具体例と大体類似し
ており、そして出入口６０ｅ、空気抜き７０ｅおよび空
気抜きロア４ｅがある。しかしながら、前記具体例と異
なり、金属壁３４ｅが室３２６の下ではなく上にあり（
第１７図〕、そのため熱はキュベツト３０ｅの上から下
方へ供給される。（図示されていないフィルター膜を７
０１Ｂに任意においてもよい。）　壁３４ｅおよび３６
８のこの配置は、室３２ｅの下に配置された第２室１６
０が設けられているためである。すなわち、各２室は、
液体を収納する主要面を有し、そして主要表面部の背中
合わせの壁が一般に平らでありかつそれぞれに共通面で
あるため、好ましくは一般に平らな形状をしている。従
っ℃。

室３２８の主要収納面１工室１６０の主要収納面の上に
配置され℃いる。

第１７図で明らかなように、ｍ１６０は実際１ま壁３６
ｅである背中合わせの主要表面壁を有する。

反対側の壁１６４は、壁３４６と実質的に同じように作
られ℃おり、熱エネルギー伝達する壁である。側壁１６
６および１６８（第１６図）は、室１６０が室３２ｅｉ
に対して約４５°回転している他は、室３２ｅ）の場合
と同様に室１６０を形づくり。

そのため下記のその空気抜きは出入口６０ｅの下部６４
８とぶつからない。

空気抜きおよび通路１７０を室１６０に取り付げる（第
１６図）。前記具体例の空気抜きの空気抜き通路と同様
に作る。あるいは、図示していな　　−いが、第１６図
に示すようにｕ３２ｅを通して回収することなく、室１
６０から液体を直接取り出せるように空気抜きロア４ｅ
を作っ℃もよい。

使用の際、空気圧を出入口を通して室３２ｅに注入する
かまたは例えば任意にキュベヴト内の後続の反応用の試
薬を含む溶液を注入することによっ℃、あるいは室１６
０を真空にすることによって、室３２６内の液体を第１
７図の矢印のように室１６０へ流す。

あるいは、２つの室を、４５°食い違わせないで、正確
にならべて側壁を互いに重ねてもよい。この具体例は第
１８図に示してある。前に記載のものと類似の部品は識
別文字ｒｆＪを添えた同じ参照番号を付けた。

従って、キュペｙト３０ｆは、熱伝達壁ではない共通壁
３６ｆを共有する上および下の室３２ｆ゛および１６０
ｆからなる。空気抜き７０ｆは液体を室３２ｆから１６
ｏｆへ供給し、壁３４ｆおよび１６４ｆｋ−１必要とさ
れる急速な熱エネルギー伝達を行なう。しかしながら、
前記具体例とは異な’）、　ｆｌｌ［ｔＣＣａ２２　ｆ
）４　Ｏｆ、Ｎ’ｉ室１６０　ｆノ側壁（壁１６６ｆＪ
と並列している。これは、液体を室３２ｆに納める主要
面内に出入口６０ｆがすっかり入るように、ボス８０ｆ
を９０°回転させることによっ℃可能である。そのよう
なキュベツトでは、空気抜き１７０ｆおよびその開ロア
４ｆは液体を室１６０ｆ内に納める主要面内に取り付け
る。

第１６〜１８図の２つの各具体例では、液体を納める２
つの主要面が共通面であるならば、キュベツトの長さま
たは幅は第２図のキュベツトのそれ以上にはならないと
いう利点が得られる。２つの室を垂直に積み重ねて３次
元の流れにすることかできるため、垂直の厚さが少し増
えるだけである。

さらに別の有用な形は第２０および２１図に示すもので
あり、ここでは液体を納める第３の室が前記の第２の室
に通じ℃おり、液体透過性膜が第３室を第２室から隔離
および分離している。前に記載したものと類似の部品に
は、識別のために「ｇ」を添えた同じ参照番号を付けた
。

従って、キュベツト３０ｇ１！、、向かい合った壁３４
ｇおよび３６ｇ（この壁３４ｇは金属性であろＪ１側壁
３８ｇおよび４０ｇ（第２１図］そして出入口６０ｇを
有する第１室３２ｇよりなる。

室３２ｇは５第１６図の具体例におけるように、通路ま
たは空気抜き７０ｇを経℃、室３２ｇが占める構造の主
要面に並行な栴造主要面に配置された第２室１６０ｇに
つながる。しかしながら、この具体例では、室１６０ｇ
は室３２ｇの下ではなく上にある。室１６０ｇは向かい
合った壁１６２ｇおよび１３６によっ℃一部定められ℃
おり、壁１３６は第９図の具体例の壁３６ｂの場合のよ
うに好ましくはびょう締めさねた、好ましくは透明な壁
である。壁１３６も引掻きかう壁１３６の外面を保護す
るために表面１３７の下σ）凹所にはめ込むのが好まし
い。室１６０ｇも、室１６０ｇに面している上面３０２
を有する液体透過性膜３００によって定められている。

膜の下の面３０４は室１６０ｇとは反対向きになっ℃い
る。この膜に有用な材料にはキャストした、織った。ま
たは電子光学的に機械加工した微細濾過膜がある。側壁
１６６ｇおよび１６８ｇ（第２１図）により室が完成す
る。

第３呈３１０は膜３００を経℃室１６０ｇにつながっ℃
おり、そのため室３１旧工膜によっ℃他の２つの室と隔
離および分離されている。好ましくは、室３１０は壁３
６ｇと１６２ｇとの間に取り付けられたブロック内に形
成さｔ１℃おり（第２０図）、そのため室１６０ｇ、３
１０および３２ｇの３室は垂直に下方へ順に積み重なっ
℃いる。空気抜き通路１７０ｇは、前記具体例のように
、室３１０からボス８０ｇ内に取り付けられた空気抜き
ロア４ｇへつながる。さらに、一般に通路１７０ｇの上
の位置に、空気透過性ではあるが液体不透過性の栓を持
つ空気抜き（図示せず）が室１６０ｇからボスｓｏｇへ
延び℃いる。

最も好ましいのは、室を満たし、好ましくは膜３００の
下面３０４に接するように液体吸収性材料３２０を室３
１０内に配置ものである。

キュペラ）３０ｇは、キュベツト内で拡張した特定の核
酸配列１例えばＤＮＡのそれ、を捕捉し、識別するのに
使用するのが好ましい。このためには１面３０２にＤＮ
Ａストランドに結合しうろ蛋白質物質を捕らえる手段が
あるのが好ましい。そのような捕捉蛋白負は一般的なも
０）であり、選択したＤＮＡ配列に結合するヌクレオチ
ドの補足配列よりなるものであり、配列は膜に結合する
適轟な手段で付く。例えば、一般的に行なわれ℃いろよ
うに、そのような結合手段は一対のアビジンおよびビオ
チンのうちの１つでよい。一対の他方は面３０２に結合
させる。

キュペラ）３０ｇの使用法は以上のことから明らかであ
ろう。概して以下の通りである：室３２ｇは、予めつ（
ら４た、ＤＮＡ拡張に８装な試薬のほとんどまたは全部
を含む。ＤＮＡ含有液体はビペヅ）Ｐによって注入して
室３２ｇを部分的にのみ満た丁。蓋Ｃは回して締めるか
あろい警工他の方法で取り付ける。変性、培養および複
製化は他の具体例と同様に進める。その後、ピペットを
再び使って室３２ｇへ上記の捕捉プローブおよび検知プ
ローブも注入する。そのような検知プローブも従来のも
のであり、蛋白質および補足ヌクレオチドからなり、こ
れは捕捉プローブが付く端と（速成対の端の選択された
ＤＮＡストランドに付く。検知プローブにはまた。ロイ
コ染料と反応して検知信号（例えば色の変化〕を生じる
ことができる適当な信号発生部分、例えば西洋わさびペ
ルオキシダーゼ、が含まれる。２つの異なるプローブを
反対の３′および５′末端に付ける方法は公知である。

例えば、「核酸仙究」の第１５巻、ｐ５３０５（１９８
７）の１チオールの特定プローブを合成オリゴデオキシ
リボヌクレオチドの３′末端に付ける効果的な方法」で
は、３′末端に付けろ有用な方法が論じられ℃いる。５
′末端へ付けることを論じ℃いる文献は多数あり、以下
はその代表にすぎな（：「分析生化学」の第１６４巻、
ｐ３３６（１９８７〕の「５末端官能基の導入」。３′
または５′末端のいずれかが２つのプローブのうちの１
つを付けるのに使われ、他の末端が２つのプローブのう
ちの他方をつげるのに使われることは明らかであろう。

あるいは、検知プローブおよび固定化プローブが前記「
分析生化学」の教示する方法を使つ℃正に５′末端に付
は得るものである。

両方のプローブ並びに拡張ＤＮＡを入れたキコペットを
撹拌して混合を促す。

その後、２つのプローブをＤＮＡの別のストランドに付
けろために第１図に示すサイクル部分「ｘ」を繰り返す
。

この工程の後、まだ室３２　ｇＫある液体を通路７９ｇ
を経て室１６０ｇに押し上げろ。この押し出しはピペッ
トによりさらに液体または空気を注入することによっで
あるいｔエガス抜きロア４ｇで真空にすることによって
達成される。液体な使う場合、中性溶液（活性成分を含
まない）な使用する。液体は、好ましくはガス抜きロア
４ｇを蓋Ｃで閉じることにより、室１６０ｇ内で培養す
る。

その後、液体全部を膜３００を通って吸収Ｈ３２０中に
引く。これを工、さらに注入されろ空気のパルスにより
、あるいは７４ｇから部分真空にすることによっ″ＣＣ
ａ２Ｏ３通る液体の自然な流れを促すことにより、ある
いは吸収剤Ｈ料３２０の毛管吸引力により行なわれる。

この時点で、捕捉および検知プローブ２ユ、サイクルの
Ｘ＄の反仮部の結果とし一’ＣＤＮＡストランドに結合
し、捕捉プローブは膜の而３０２によって捕らえられろ
。

捕捉プローブのないＤＮＡストランド１お膜３００を通
り材料３２０によっ℃吸収されろ。

最終段階は室３２ｇおよび１６０ｇに注入することであ
り、液体は１面３０２上に捕捉されたＤＮ　Ａストラン
ドから突き出℃いる検知プローブと反応しうるロイコ染
料また１工他の物負を含有している。有用なロイコ染料
には米国特許第４．０８９．７４７号に示されているも
のがあり、好ましくはポリ（ビニルピロリドンノのよ５
なザ定化ポリマーと組合せる。この染料の好ましい例は
２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニルＪ
−４，５−ビス（４−メトキシフェニルノイミダゾール
である。と（・うの１工、この化合物は西洋わさびベル
オキシダー９１モル当たり約１０００の染料分子を提供
するからである。

これとは別に、やはり従来から使われて（・る、ビーズ
に結合した捕捉プローブを使用してもよい。

ビーズは膜３００の細孔を通過しない程の大きさの直径
を持つビーズを選ぶ。

本発明のキュベツトを望ましい加熱および冷却段階にサ
イクルさせるどのような適当な培養器も有用である。培
養器が第１図に示″ｆ温度をサイクルする段階を提供す
ることが最も好ましい。これを行なう従来の培養器２０
　（Ｎｊｋ　１９図に示すステーションを有するもので
ある。予備培養ステーション２０２は温度を約９５℃に
定める加熱手段を有する。ここから、キュベツトを従来
の押し出し手段で一定温度のステーションのリング２１
０上に押し出す。その最初のステーション２１２は５５
℃に保たれ℃いる。このステーションからキュベツトを
ステーション２１４に動かし、ここで７０’Ｃに加熱す
イ）１．この温度にある時間保つ。従っ”Ｃｂステーシ
ョン２１６もその温度である。次に、９５℃に保たれ℃
いる短時間変性ステーシコン２１８で新しく複製化した
Ｄ　Ｎ　Ａを変性する。

ステーション２２０〜２３４はステーション２１２〜２
１８でｆでに行なわねたサイクルをさらに２回嫁り返″
ｆ′ｊ、うけである。

ステーション２３４の後、拡張かすべて終了したら、従
来の移動装置（囚示せず）でキュペットをリング２１０
から次の工程に移−ｆ。（Ｉｆ、体のキュベツトへの注
入および液体のそこからの取り出しＹまラインから離ｔ
１′ｖ：、すなわち、培養器２００の外１則、で行なわ
才１ろ。）さらに拡張が必要なら。

特定のキュペクトを培養器内でさらにサイクルさせる。

（発明の効果） 本発明のη°益な技術的効果は、キーベットおよびそσ
：＋ｐ２ｉ、体内容物へσ〕また（工それらからの熱エ
ネルギーの伝達を急速に行なって、希望する反応に必要
な多数の温度変化を液体に加える、二とができることで
ある。その結果、サイクルを必要な回数繰り返すことか
これまでよりも短時間で可能である。

本発明に関する有益な技術的効果１工、加熱と冷却を何
回も繰り返す必要のある多段階サイクルによるＤＮＡス
トランドの急速熱処理を行なうことのできるキュベツト
を提供することである。

本発明に関する別の有益な技術的効果は、そのようなキ
ュベツトおよびその液体の熱時定数か小さ（、液体を加
熱または冷却−ｆる遅れか全くなし・ことである。

本発明の別の有益な技術的効果は、そのようなキュベツ
トではまた１反応か終われば、全部の液体内容物を比較
的容易にとりだすことができることである。

本発明のさらに別の有益な技術的効果は、そのようなキ
ュベツトが最小の長さと幅を持つ２つの室を有すること
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＤＮＡの複製化を行なうキュベツトの一般的
な温度変化をプロットしたグラフである。 第２図は、本発明も・二より製造したキュベツトの等角
投影図である。 第３図は、第２図のキュベツトの平面図である。 第４図は、第３図のラインＩＶ　−ＩＶ　Ｋ添った断面
図である。 第５図は、第４図のＩＶＪとあるキ、ベットの囲んだ部
分の拡大断面図である。 第６図は５そのようなキュベツトθ〕熱時定数を得るだ
めのキュベツトの実際の時間−温度応答のプロットであ
る。 第７図は、第６図に照らして、そのようなキュベツトが
有するでりろ５加熱応答曲線のプロントである。 第８および９図（ま、第４図と同様な断面図であるが、
２つの異なる具体例を示Ｔものである。 第１０図）土、第４図と同様な断片的な断面図であり、
ピペットおよびシールのキュベツトとの相互関係を示す
ものである。 第は図は、特にバルブ機構の、別の具体例の断片的な平
面図である。 第１２図（′ｉ、第１第はコσイン■−Ｘｌｌに添った
断面図である。 第１３図は、第は図と同様な断片的な平面図であるが、
バルブか約４５℃回転しているものである。 第１４図は、第１２図と同様な断面図であるが。 パルプが第１３図のように回転したものであり。 第１３図σ）ラインＸＩＶ−匁■　に添っ１得たもθ〕
である。 第１５図は、第１２図と同様な断面図であるか、また別
の具体例である。 第１６図は１本発明の部分的に取り壊した別の具体例の
平面図である。 第１７図は、第１６図のラインＸＶＩＩ−ＸνＩＩに添
った断面図である。 第１８図は、第１７図と同様な断面図であるが、また別
の具体例を説明するものである。 第１９図は、キュベツトをＤＮＡ処理温度にサイクルさ
せるのに有用な培養装置の略図である。 第２０図１耘　また別の具体例の第１７図と＋＝Ｊ　Ｉ
な断面図である。 第２１図は、第２０図のラインＸＸＩ　−ＸＸ１　Ｋ添
った断面図である。 図中、数字は次の意味を持つ： ３０．３０ａ　、３０ｂ　、３０８．３Ｏｆ、３０ｇ−
＃　：Ｌベヴト、　　３２．３２ａ、３２ｂ、３２０．
３２（１，３２ｅ、３２ｆ、３２ｇ−・・室。 ３４．３４ａ、３４ｂ、３４８またｊ’ｊ−１６４゜３
４ｆまたは１６４ｆ、３４ｇ・・・間隔をおいて離れた
２つの向かい合った壁のうちの１つ、および熱伝導性の
壁、　　　３６．３６ａ、３６ｂ、３６ｅ！。 ３６ｆ、３６ｇ・・°間隔をおい℃離れた向かい合った
もう一方の壁、　　　１６０．１６Ｏｆ、１６０ｇ・・
・３２ｅ１．３２ｆ、および３２ｇと共に一対の室を形
成する第２の室、　　２００・・・本発明のキュベツト
と共に使う培養器、　　３００・・・核酸配列を拡（外
４名〕 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、Ｉ ＦＩＧ、　２ ．４０ ｒｆ”ｃｌ 藺　闇　（祢ン ＦｆＧ、７ ＦＩＧ、　１８ ＦＩＧ、　１３ ＦＩＧ、　１７ ＦＩＧ、　１９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも約３５℃の温度範囲をサイクルさせる液
   体成分の制御反応用の熱サイクルキュベットにおいて、
   前記キュベットは２つの間隔をおいて離れた向かいあっ
   た壁によって定められた少なくとも１つの液体を入れる
   室を有し、側壁は前記の２つの向かいあった壁に接続し
   ているものであり、 前記の向かいあった壁および前記の側壁は、注入容量１
   ００〜２００μｌに対し有効温度調整面対容量比が約６
   ５〜約１３０ｉｎ＾−＾１の室をもたらす大きさである
   こと、 および前記の向かいあった壁の少なくとも１つの熱路長
   さが約０．３ｍｍ以下および熱抵抗が約０．０１℃／ワ
   ット以下であること を特徴とする上記のキュベット。 ２、液体成分の制御反応用キュベットにおいて、前記キ
   ュベットは反応を行なうための第１および第２の液体を
   入れる室を有し、それぞれの室は２つの間隔をおいて離
   れた向かいあった壁によって定められており、そして側
   壁は前記の２つの向かいあった壁のそれぞれに接続して
   おり、前記の各室は液体を入れておく主要面を提供する
   ものであって、 前記の２つ室は、前記室の一方の主要面が他方の室の主
   要面上に配置されるようになつていることを特徴とし、 そのため前記主要面が共通面となる前記キュベットの長
   さおよび／または幅が、同等のキュベットと比べて小さ
   くなる、前記のキュベット。 ３、１ストランドの核酸とモル過剰のオリゴヌクレオチ
   ドプライマーとの混合物をプライマーを前記ストランド
   に結合させるのに有効な温度で処理し、この結合したプ
   ライマーおよびストランドを延長酵素の存在下で加熱し
   てプライマーを延長して補足ストランドを形成し、この
   結合補足ストランドおよび前記核酸のストランドを、こ
   れらを２つの原型ストランドに分離する温度で加熱し、
   その波前記の各工程をこれらの原型ストランドに繰り返
   して多数の拡張ストランドを生成することよりなる核酸
   配列を拡張する方法において、さらに以下の各工程； 選択したオリゴヌクレオチド配列に結合したヌクレオチ
   ドの補足配列よりなる検知および捕捉プローブを前記混
   合物に加える（これらのプローブはさらに、反応して検
   知信号を出すことのできる信号部分またはプローブに結
   合したストランドを固定化する捕捉部分のいずれか、ま
   たは両方を含んでいる）工程； 前記プローブを前記拡張ストランドと反応させてプロー
   ブを拡張ストランドに結合させる工程；結合したプロー
   ブおよびストランドを含む混合物を分離手段に移す工程
   ； そして、この混合物を、そのような捕捉部分とは結合す
   るがそのような捕捉部分の無いストランドは通過させる
   物質を含有するフィルターに通すことによって、捕捉プ
   ローブを有するストランドをそのようなプローブの無い
   ストランドから分離する工程 よりなる上記の方法。