JPH05507206A - レジオネラ種の検出用ｐｃｒプライマーおよびハイブリダイゼーションアッセイにおける光学的強度の調整方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

レジオネラ種の検出用ＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションアッセイ における光学的強度の調整方法 発明の背景 １、　発明の分野 本発明は、レジオネラ（Ｌｅｇ　ｉ　ｏｎｅ　ｌ　ｌａ）属のゲノムの選択され た標的領域の増幅のための優れた核酸プライマーを提供する。本発明は、この属 の病原型および非病原型の検出を容易にする。本発明はさらに、選択された標的 領域の増幅のために、鋳壓依存性核酸ポリメラーゼ延長反応においてプライマー を使用する方法を提供する。これらのプライマーを使用するキットも提供される 。 本発明はさらに、高緊縮条件下における核酸ハイブリダイゼーションアッセイに おける二重鎖形成の検出のための光学的シグナルの強度を調整する方法を提供す る。 この方法は、固体支持体上への異なる捕獲プローブの配合を包含する。 ２、　情報の開示 レジオネラ種は、病原性および非病原性の両微生物として知られている。その肺 炎型は、肺マクロファージ細胞の細胞内病原体である（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃ ｅａｅ、　Ｃｈｐｔ、９２８０　Ｊ、　ｉｎ　５ｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆＷａｔｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｓ ｔｅｗａｔｅｒ、　Ｃ１ｅｓｃｅｒｉ、　ＧｒｅｅｎｂｅｒｇおよびＴｒｕｓｓ ｅｌｌＪｉ、第１７版、１９８９年刊、９−１４９〜９−Ｉ５３頁；およびＭｕ ｒａｃａ、　Ｐ、　Ｗ、ら、　ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＡｓｐｅｃｔｓ　ｏ ｆ　Ｌｅｇｉｏｎｎａｉｒｅｓ’　Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｗａｔｅｒ Ｗｏｒｋｓ　Ａｓ５ｏｃ、８０　：　７８−８６．　１　９８８）　。 レジオネラの表面抗原は細胞内病原性に必須の要素と考えられてきて、マクロフ ァージ感染能ボテンシエーター、もしくはｍｉｐと呼ばれている（　Ｃ１ａｎｃ ｉｏｔｔｏ、　Ｎ、　Ｐ。 ら、Ａ　Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏ ｄｉｎｇ　ａＳｐｅｃｉｅｓ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　ＰｏｔｅｎｔｉａｔｅｓＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｎｔｒａｃｅｌ ｌｕｌａｒ　ｒｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｉｎｆｅｃｔ。 ｌｎｍｕｎ、５７：１２５５−１２６２．１９８９）。 ５Ｓ　ｒＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＭａｃＤｏｎｎｅｌｌ。 Ｍ、　Ｔ、およびＲ，Ｒ，Ｃｏｌ＊ｅｌｌ（Ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ ｅｑｕｅｎｃｅｏｆ　ｔｈｅ　５　Ｓ　ｒ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　Ｌｅｇｉｏｎｅ ｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｉａ、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　ｌ　５　： 　Ｉ　３３５　。 １９８７）およびＣｈｕｍａｋｏｖ、　Ｋ、　Ｍ、ら（ＩＪｓｅ　ｏｆ　５ＳＲ ｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌ ｙｓｉｓ　ｆｏｒｊｈｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ。 Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ、　Ｖｉｒｕｓｏｌ、８　：　３８ −４０　。 １９８６）によって報告されている。 マクロファージ感染能（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　）蛋白質のヌクレオチドおよ びアミノ酸配列は、Ｅｎｇｌｅｂｅｒｇ、　Ｎ、　Ｃ，ら（ＤＮＡ　５ｅｑｕｅ ｎｃｅ　ｏｆ　ｎ＋ｉｐ、　ａ　Ｌｅｇｉｏｎｅｉｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌ ａＧｅｎｅ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｉｎｆ ｅｃｔｉｖｉｔｙ。 Ｉｎｆｅｃｔ、ｒｍｍｕｎ、５７　：１２６３−１２７０．　１９８９）によっ て報告され、公知である。 レジオネラの標準培養法はこの致死的病原体による危険を的確に評価するには適 当ではない（Ｈｕｓｓｏｎｇ、　Ｄ、　ら。 ＶｉａｂＩｅ　Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　ｎｏｔ　Ｄｅ ｔｅｃｔａｂｌｅ　ｂｙＣｕｌｔｈｕｅ　ｏｎ　Ａｇａｒ　Ｍｅｄｉａ、　Ｂｉ ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５　：　９４７−９５０．１９８７）。 Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　の検出のための核酸プローブ は　Ｇｒｉｍｏｎｔ、　Ｐ、　Ａ、　Ｄ、ら（ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅ　５ｐｅｃｉ ｆｉｃｆｏｒ　Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、　Ｊ、　Ｃｌ １ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、　２１　：４３１−４３７．１９８５）およびＥｎｇｌｅ ｂｅｒｇ、　Ｎ、　Ｃ。 ら（Ａ　Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ−３ｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅ　Ｄｅ ｔｅｃｔｓＯｒｇａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　Ｌｕｎｇ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｈｏｍｏｇｅ ｎａｔｅｓ　ｆｒｏｍＩｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ　！ｎｏｃｕｌａｔｅｄ　Ｍｉ ｃｅ、　ｌ５ｒａｅｌ　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ。 ２２ニア０３−７０５．１．９８６）によって報告されている。 レジオネラ種を検出するためのポリメラーゼチェーン反応増幅方法の使用は、５ ｔａｒｎｂａｃｈ、　Ｍ、　Ｎ、らにより、５ｐｅｃｉｅｓ−３ｐｅｃｉｆｉｃ 　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏ−ｐｈｉｌ ａ　ｉｎ　Ｗａｔｅｒ　ｂｙ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄＨ ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２７ 　：　１２５７−１２６１．１９８９；ＩＪ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０７／４６７．８１ ３Ｎ９９０年１月１日出願）、またＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＬｅｇｉｏｎｅｌ ｌａ　ｉｎ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓａｍｐｌｅｓ　ＵｓｉｎｇＰｏｌ ｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｐ　ＣＲ）　、Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｉｎ、　１９９０年５月、１１〜１２頁に開示されて いる。 発明の要約 本発明は、病原性レジオネラ種を検出するためのアッセイに使用される優れた増 幅プライマーを提供する。記載されるプライマーは、大部分のレジオネラ種こ共 通な独特の５ＳＲＮＡ遺伝子の選択された領域を増幅することができる。他のプ ライマーは、ｍｉｐ遺伝子をもつレジオネラとｍｉｐ遺伝子をもたないレジオネ ラを識別することができる。これらのプライマーにはさらに、類似の熱融解点を 有し、単一の増幅反応混合物中でレジオネラゲノムの２以上の領域を等しく増幅 する利点がある。 とくに、本発明は、レジオネラ種の５ＳＲＮＡ遺伝子およびｍｉｐ遺伝子のサブ 配列を増幅するための多重対の増幅プライマーからなる組成物を提供する。この 場合、各プライマーは、それらの結合部位に関して、それぞれ約８°Ｃ未満の熱 融解点を有する。これらの組成物を用いるレジオネラのゲノム領域の増幅方法も 本明細書に開示される。 本発明はさらに、レジオネラ種からの核酸のサブ配列を増幅するための核酸ポリ メラーゼブライマーを提供する。これらのプライマーは、 （ａ）　３’　−ＣＧＴＡＡＣＣＡＣＧＧＣＴＡＡＡＣＣ−５’　：　Ｓｅｑ、 　ｒＤ　Ｎｏ、　１２：（ｂ）　３’−ＣＧＡＡＡＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＧＡＡ ＡＧＡＣＴＴ−５°；Ｓｅｑ、　ｒＤ　Ｎｏ、　１３；（ｃ）　３’　−ＣＣＧ ＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣＹＡＡＡＣＣＴＴ−５’　；　Ｓｅｑ、　１０　Ｎｏ、　 １４：（ｄ）　３’　−ＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧＹＧＴＡＣＴ−５’ 　；　Ｓｅｑ、　ｒＤ　Ｎｏ、　１５：（ｅ）　３’　−ＣＣＧＣＴＧＡＴＡＴ ＣＧＣＣＡＣＡＣＣＴＴ−５’　；　Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　１８：（ｆ）　 ３−ＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＡＣ−５’　；　Ｓｅｑ、　［Ｄ 　Ｎｏ、　１９および （ｇ）　３’　−ＣＡＡＡＡＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴ−５’　 ：Ｓｅｑ、　ＩＯＮｏ、２０（式中、Ｙはシトシンまたはチミン塩基を示し、塩 基Ｙを有するプライマーはその２つのプライマーの混合物を包含する）からなる 群より選ばれる核酸サブ配列に実質的に結合するプライマーである。 このようなプライマーの例には、　゛ （ａ）　５’　−ＧＣＡＴＴＧＧＴＧＣＣＧＡＴＴＴＧＧ−３’　；　Ｓｅｑ、 　ＩＤ　Ｎｏ、　６；（ｂ）　５’−ＧＣＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴＴ ＣＴＧＡＡ−３’　：Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、７；（Ｃ）　５−ＧＧＣＧＡＣＴ ＡＴＡＧＣＧＲＴＴＴＧＧＡＡ−３’　：　Ｓｅｑ、　１０　Ｎｏ、　１０：（ ｄ）　５’−ＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＴＴＴＣＲＣＡＴＧＡ−３’　：　Ｓｅ ｑ、　１０　Ｎｏ、９；（ｅ）　５−ＧＧＣＧＡＣＴＡＴＡＧＣＧＧＴＧＴＧＧ ＡＡ−３°：　Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、２１；（ｆ）　５’　−ＧＣＧＡＴＧＡＣ ＣＴＡＣＴＴＴＣＧＣＡＴＧ−３’　；　Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　２２：およ び （ｇ）　５−ＧＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＧＡＡ−３’　；Ｓ ｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　２３（式中、Ｒはアデニンまたはグアニン塩基を示し、 塩基Ｒを育するプライマーはその２つのプライマーの混合物である）がある。 本発明はまた、プライマー結合部位によって隣接される非天然オリゴヌクレオチ ドサブ配列からなる内部陽性対照オリゴヌクレオチド配列を提供する。この方法 では、ＩＰＣが標的サブ配列の増幅に使用された同一プライマー対とともに、増 幅を行うことになる。本発明の一実施態様においては、標的はレジオネラ種のｍ ｉｐ遺伝子である。この実施態様においては、ＩＰＣは以下の核酸サブ配列 （ａ）　３’　−ＣＧＴＡＡＣＣＡＣＧＧＣＴＡＡＡＣＣ−５’　；Ｓｅｑ、　 ［Ｄ　Ｎｏ、　１２：および（ｂ）　３’　−ＣＧＡＡＡＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡ ＧＡＡＡＧＡＣＴＴ−５’　；Ｓｅｑ、　ｆＤ　Ｎｏ、　１３；によって隣接さ れる非天然サブ配列からなる。他の実施態様においては、ＩＰＣのプライマー結 合部位は５ＳＲＮＡ遺伝子標的のプライマー結合部位と同一である。 この実施態様においては、プライマー結合部位は、（ｃ）　３’−ＣＣＧＣＴＧ ＡＴＡＴＣＧＣＹＡＡＡＣＣＴＴ−５°；　Ｓｅｑ、（Ｄ　Ｎｏ、１４；および ／または （ｄ）　３’　−ＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧＹＧＴＡＣＴ−５’　；　 Ｓｅｑ、　ＩＤＮｏ、　１５；および／または （ｅ）３°−ＣＣＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＣＡＣＣＴＴ−５’　；　Ｓｅｑ 、　ｒＤ　Ｎｏ、　１８；および／または （ｆ）　３’　−ＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＡＣ−５’　；　Ｓ ｅｑ、　１０　Ｎｏ、　１９；（式中、Ｙはシトシンまたはチミン塩基を示す） からなる。さらに詳しくは、以下の配列 ５’　−ＧＣＡＴＴＧＧＴＧＣＣＧＡＴＴＴＧＧ−３’　；　Ｓｅｑ、　ＩＤ　 Ｎｏ、　６：および５’−ＴＴＣＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣ −３°；Ｓｅｑ、　ｔｏ　Ｎｏ、　１３゜の一方または両者を有する■ＰＣオリ ゴヌクレオチド配列が開示される。 これらの記載プライマーから外れる別のプライマーも想定できることを理解すべ きである。この偏位には、非主要塩基の変化、ビオチン化塩基、塩基同族体、ま たは付加的塩基のプライマー末端への添加が包含される。このような修飾または 変化が、命名されたプライマーについて宣言された結合部位の内部標的領域を増 幅するそのプライマーの能力に実質的に影響しない限り、このような修飾プライ マーは本発明の範囲内に包含されるべきである。 本発明はさらに、上記増幅プライマーを利用する方法を包含する。好ましくはマ ルチプレックスＰＣＲフォーマットにおいてである。とくに、レジオネラ種から の核酸サブ配列を増幅するためのヌクレオチドポリメラーゼを用いる方法が開示 され、この場合ポリメラーゼは、以下の配列 （ａ）　３’　−ＣＧＴＡＡＣＣＡＣＧＧＣＴＡＡＡＣＣ−５’　；　Ｓｅｑ、 　ＩＤ　Ｎｏ、　１２；（ｂ）　３−ＣＧＡＡＡＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＧＡＡＡ ＧＡＣＴＴ−５’　：Ｓｅｑ、　ＬＤ　Ｎｏ、　１３＋（ｃ）　３’−ＣＣＧＣ ＴＧＡＴＡＴＣＧＣＹＡＡＡＣＣＴＴ−５°：　Ｓｅｑ、［Ｄ　Ｎｏ、１４；（ ｄ）　３−ＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧＹＧＴＡＣＴ−５’　；　Ｓｅｑ 、　ＩＤＮｏ、　１５；（ｅ）　３−ＣＣＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＣＡＣＣ ＴＴ−５’　：　Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　１８；（ｆ）　３’−ＣＧＣＴＡＣ ＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＡＣ−５°；　Ｓｅｑ、　ｒＤ　Ｎｏ、　１９＋お よび （ｇ）　３’−ＣＡＡＡＡＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴ−５°；Ｓ ｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、　２０（式中、Ｙはシトシンまたはチミン塩基を示し、塩 基Ｙを存するプライマーはその２つのプライマーの混合物である）からなる群よ り選ばれる核酸サブ配列に実質的に結合する核酸プライマーの延長によってサブ 配列の増幅を開始する。本発明はまた、プライマーは上述の通りであり、内部陽 性対照オリゴヌクレオチド配列が増幅混合物に包含される上記方法を提供する。 本発明は、上述の核酸サブ配列に実質的に結合する核酸を含有するコンパートメ ントからなり、好ましくは上述のプライマーを含有する、レジオネラ種からの核 酸の増幅のためのキットを提供する。これらのキットの別の実施態様においては 、内部陽性対照オリゴヌクレオチド配列も包含される。 開示される本発明の第二の態様は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけ る二重鎖形成の検出に使用される光学的シグナルの強度の調整に関する。このモ デルは、多数の異なる種を有する特定の遺伝子の検出のための核酸ハイブリダイ ゼーションアッセイキットである。 特定の種の検出および識別は、とくに特定の種が医学的に重要であることが知ら れているときには、望ましい場合がある。また、ある風向の大部分の生物種が疾 患に関連していて、その存在を金属の生物で検出することが望ましい場合がある 。さらに、属の生物の検出が、種とは無関係に、一つの陽性光学的応答として得 られることが望ましい。属の生物の検出のために使用される標的核酸配列が風向 の種の間で変動する場合には、通常、ハイブリダイゼーションの緊縮度を低下さ せるか、または多重捕獲プローブの利用が必要である。本発明は、低緊縮条件に 頼るこの問題を回避する。 低緊縮条件は、核酸配列に変動がある多重標的配列の捕獲に適合させるために、 定常的に使用される。緊縮度は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を低 下させるか、または緩衝液の改変のいずれかによって低下させる。緊縮度が低下 され、標的核酸配列が他の属の生物の核酸配列と極めて類似している場合には、 標的属に対する捕獲プローブの特異性は失われる。 多重捕獲プローブが使用され、標的核酸配列の変動に適合するように選択される と、高緊縮条件下の特異性を回復できる。多重プローブの配合は、標的生物群の 存在に対する単一の陽性応答を可能にする。本発明によらないと通常、異なる捕 獲プローブが固体支持体上に個別に固定化される。結果として、アッセイには、 多くの試験サンプル、試験の実施のための長い時間、そしてユーザーによる多く の解釈が要求されることになる。 本発明を利用するこれらのキットにおいては、多重捕獲プローブが互いに配合さ れ、属の生物の様々な種の単一の試験での検出に適合する様式で固定化される。 プローブは配合に適合するように選択される（すなわち、非相補性配列を含有し 、可能な限り類似の融解温度を有するように）。捕獲プローブは、すべての標的 生物について半定量的て等しい感度が望まれる場合の結果の解釈を最小限にする ため、生物の風向の種に等しい強度での結果を生じるように適当な比で配合され る。ハイブリダイゼーション特性により、配合物中の各捕獲プローブの濃度は同 じかまたは同じではない。一連の力価の測定によって、適当な捕獲プローブの配 合比を決定することか可能である。配合比の異なる捕獲プローブ配合物を作成し 、固体支持体上に固定化する。 捕獲プローブは、プローブ配合物のタイトレージタンのための参考に、固体支持 体上に個別に固定化される。 試験される生物の風向の異なる種からの核酸を、捕獲プローブ配合物および個々 のプローブにハイブリダイズさせる。風向の種に対する個々の特異的プローブと 同一の応答を生じるプローブ配合物を、キット中の捕獲プローブ配合物として使 用するために選択する。さらに特定が望ましい場合には、これらの捕獲プローブ はまた、個々に捕獲プローブとして固定化することもできるが、これは必須でも ない。 捕獲プローブの混合物は、それらが類似のハイブリダイゼーション特性を存する ならば、同一遺伝子に対するすべてのプローブを含んでいてもいなくてもよいこ とに留意すべきである。 捕獲プローブの混合物は、所望により、２つ以上の属を捕獲できてもよい。たと えば、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　）やシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　） 属のような、食品に含まれる病原体を検出するキットの開発の場合には、その２ 属のいずれかの病原体の存在を明らかにするように、プローブの混合物を使用で きる。食品検査室ではこれが必要なすべてである場合が多い。さらに同定が必要 な場合には（多分、食中毒の問題で）、同じ捕獲プローブを別個の非配合状態で 使用できる。 さらに詳しくは、本発明は、２種類の捕獲プローブの核酸配列が異なる、第一お よび第二の捕獲プローブを有する核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて 捕獲プローブに結合した検出プローブの光学的濃度を調整する方法を提供する。 この方法は、（ａ）２つの異なる捕獲プローブの配合物を混合し、（ｂ）工程（ ａ）からのプローブの混合物および第一の捕獲プローブを、第一の捕獲プローブ の濃度が両値域で等しくなるように固体支持体上の分離された第一および第二の 領域に固着させ、（Ｃ）工程（ｂ）の捕獲プローブに、検出プローブを、検出プ ローブが一方の捕獲プローブには結合するが他方には結合しない緊縮ハイブリダ イゼーション条件下に結合させ、（ｄ）検出プローブのハイブリダイゼーション を光学的密度によって検出する工程からなり、この場合、工程（ａ）の配合物中 の２つの捕獲プローブの比率を、試験サンプル中に等量の検出プローブか存在す る場合、第一の領域における光学的密度か第一の捕獲プローブを有する第二の領 域における光学的密度と等しくなるように調整される。第二の領域における第二 のプローブの濃度は第一の領域における第二のプローブの濃度と同一ではない。 通常、第二のプローブは第二の領域には存在させない。 検出プローブは、ＰＣＲ増幅生成物のような増幅生成物とすることがてきる。ア ッセイフォーマットには、高緊縮ハイブリダイゼーション条件下に捕獲およびシ グナルプローブの異なる領域に結合する標的核酸の複合体であり、この場合、捕 獲およびシグナルプローブは互いにハイブリダイズしない検出プローブを包含さ せることができる。 さらにこの方法では、既知量の標的核酸に応じて調整された２つの捕獲プローブ の比率を慎重に提供することが好ましい。アッセイの検出範囲は約１０ＸＩＯ− １ｆ〜約１００ＸＩＯ−”　モルの濃度範囲にある。アッセイは、標的核酸濃度 的１０Ｘ１０−１！〜約１００ＸＩＯ−”　−Ｔ−ルにわたって光学的密度の正 の勾配を与えることが望ましい。 上記方法を採用するキットも本発明の一部である。とくに、試験サンプル中の陽 性結果に対して、等しい光学的密度を与える核酸ハイブリダイゼーションキット が意図される。キットには、検出プローブならびに核酸配列の異なる第一および 第二の捕獲プローブを使用する。このキットは、以下の成分、すなわち、（ａ） 第一および第二の捕獲プローブがある濃度で固着された、第一の分離された領域 を有する固体支持体、（ｂ）成分（ａ）に記載の混合物中の第一のプローブの濃 度に等しい濃度で第一の捕獲プローブが固着された第二の分離された領域を有す る固体支持体、および（Ｃ）検出プローブ含有容器、からなる。この場合、成分 （ａ）の混合物中の２つの捕獲プローブの比率は、同一のハイブリダイゼーショ ン条件下、試験サンプル中に等量の検出プローブが存在すれば、成分（ｂ）の固 体支持体の場合に等しい光学的密度を与えるように調整される。第二の領域にお ける第二のプローブの濃度は第一の領域におけるその濃度と同一ではなく、通常 は存在しない。 定義 核酸と固体支持体の関係での「固着」の語は、慣用の手段たとえば共有結合また は静電力結合による核酸の固体支持体への結合または付着を意味する。 「増幅反応混合物」は、標的核酸を増幅させるために用いられる様々な試薬から なる水溶液を意味する。これらには、酵素、緩衝水溶液、塩、標的核酸、および ヌクレオシド三リン酸が包含される。その状況により、混合物は完全または不完 全増幅反応混合物とすることができる。 ［増幅反応系Ｊは、核酸の標的配列のコピーを増幅するための任意のｉｎ　Ｖｉ ｔｒｏ手段を意味する。このような方法には、ＰＣＲ，ＤＮＡリガーゼ、ＱＢ− ＲＮＡＮプレカーゼおよびＲＮＡ転写ベースの増幅系があるが、これらに限定さ れるものではない。これらには様々な増幅試薬か包含される。それらについては 以下に詳細に述べる。 「増幅反応管」は、増幅試薬の保持に適当な容器を意味する。一般的には、使用 される増幅系に阻害または干渉を与えないように、不活性成分で構成される。加 熱と冷却が反復される熱サイクリングを必要とする系では、管はサイクリング過 程に耐え得て、通常サーモサイクラ−のウェルに正確に適合するものでなければ ならない。 「増幅試薬」は、選ばれた増幅操作の実施に用いられる各種緩衝剤、酵素、プラ イマー、慣用および非慣用の両方のヌクレオシド三リン酸、ならびにプローブを 意味する。 通常、標的核酸における「指数関数的」増大を意味する「増幅Ｊの語は、本明細 書では、核酸の選ばれた標的配列の数の直線的および指数関数的増大の両者を記 述するのに用いられる。 「実質的に結合する」の語は、オリゴヌクレオチド間の相補性ハイブリダイゼー ションを意味し、ＰＣＲポリメラーゼの所望のブライミングを達成するため、ハ イブリダイゼーション培地の緊縮度を低下させることにより順応できる小さなミ スマツチは許容される。 「ビオチン化Ｊは、検出アッセイにおいてストレプトアビジンと反応させる目的 でオリゴヌクレオチドの５′末端に共有結合されたビオチン残基を意味する。 核酸に関連して使用される「結合した」の語は、相補性塩基のベアリングによる 核酸のハイブリダイゼーションを意味する。 「捕獲プローブｊは、固体支持体に結合し、直接または標的核酸を介して間接的 に検出プローブにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを意味する。捕獲プ ローブは、共有結合および静電力結合を包含する様々な既知の手段によって固体 支持体に結合できる。 「濃度」は、与えられた量の容量または空間におけイ物質のモル量を指す。 ［検出プローブＪは、捕獲プローブに結合する核酸苓意味する。検出プローブは 、その配列に導入された放奎性同位元素によって直接検出できるか、またはビオ チ〉で間接的に標識され、ついでストレプトアビジン／酵津複合体が結合される 。検出プローブはまた、三元または四元サンドイッチハイブリダイゼーションア ッセイの標的核酸／シグナルプローブ複合体を包含する意味の場合もある。この ような系は通常、捕獲プローブに結合する標的核酸を必要とし、ついでシグナル プローブが標的核酸に結合する。 「分離されたＪの語は、固体支持体に固着された捕獲核酸の領域が境界をもっこ とを意味し、これにより捕獲核酸の他の領域間での識別を可能にする分離および 同定が与えられる。 「高緊縮ハイブリダイゼーション条件］とは、各相補性塩基に！ミスマツチ塩基 対までのミスマツチがあるＬＯ〜３０塩基の間のオリゴヌクレオチドのハイブリ ダイゼーション率に検知可能な差を提供する与えられたハイブリダイゼーション 培地の温度、溶質濃度および極性を意味する。ハイブリダイゼーション率の差は 、与えられたアッセイの検知系を用いて識別される。 は、標的核酸の増幅に使用されるのと同じプライマー対る　で増幅する組換えま たは合成オリゴヌクレオチドを意味する。ＩＰＣオリゴヌクレオチド配列は、試 験されたすを　ンブルに標的核酸を含まなかった場合、増幅過程が起二け　って いたことがユーザーによって確認されるように用いン　られる。これらのオリゴ ヌクレオチドは、増幅過程に用軒　いられた増幅プライマーの結合部位に相補性 の配列によよ　って、一方または両方の末端が隣接されている。内部標贋　的サ ブ配列は、増幅プライマーの結合部位に隣接して天１　然には見出されない異種 配列である。したがって、内部５　対照オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸が 存在した場曵　合には、増幅反応が標的核酸を増幅したことを確立するため、増 幅プライマーの鋳型として働く。ＩＰＣオリゴ１　ヌクレオチド配列は一本鎖ま たは二本鎖ヌクレオチドと１　して供給される。−木繊の場合、非直線的増幅を 促進するために、ＩＰＣの５′末端は対の他のプライマーと塩基同一性をもたな ければならないことは熟練者には明ら１　かであろう。　・ ｒレジオネタ種Ｊには、Ｌｅｇｉｏｎｅｌ　１ａｃｅａｅ科のメンバーを包含す る。それは、２２種以上から構成される一属科である。原核生物の分類学は静止 状態にはなく、別の種が加えられるかもしれないし、またこれらの種が将来別の 科もしくは属に取り込まれる可能性もあることを認識すべきである。 「核酸」は−木繊または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはりボヌクレ オチドポリマーを意味し、とくに限定がなければ天然に存在するヌクレオチドと 類似の様式で機能できる天然ヌクレオチドの既知類似体が包含される。 「ヌクレオチドポリメラーゼ」はヌクレオシド三リン酸前駆体からｐＮＡまたは ＲＮＡの合成を触媒できる酵素を意味する。本発明の増幅反応においては、ポリ メラーゼは鋳型依存性で、通常、形成されたポリマーの３′末端から延長する。 ポリメラーゼは、米国特許第４，８８９．８１９号、およびｌ９８８年１月１２ 日に出願され現在は放棄された米国特許出願第７／１４３，１４１号に記載され ているように、熱安定性であることがとくに望ましい。 「光学的密度の正の勾配Ｊとは、検出プローブの存在量の増大に伴って増大する 光学的密度の応答を意味する。 本明細書に記載のアッセイにおいては、検出プローブの増加が顕著に観察てきる 動的範囲の濃度がある。この範囲未満では、光学的密度はほとんどまたはまった く認められず、この範囲を越えるとサンプル中の検出プローブか増加しても光学 的密度の増大はみられない。 「プライマー」または「核酸ポリメラーゼブライマーＪは、核酸鎖に相補性のプ ライマー延長生成物の合成が開始される条件下、すなわち適当な緩衝液中、適当 な温度で、４種の異なるヌクレオチド三リン酸およびポリメリゼーション試薬（ すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下において、ＤＮＡ合 成の開始点として作用できる、天然または合成オリゴヌクレオチドを意味する。 プライマーは、好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、増幅に際し 最大の効率を示すためには一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。二本鎖の場 合、プライマーは、延長生成物の調製に使用する前に、まず処理してその二本鎖 を分離する。プライマーの正確な長さは多くの因子に依存するが、通常、１５〜 ２５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般的に、鋳型と十分安 定なバイブリド複合体を形成するためには、低い温度が要求される。プライマー は鋳型の正確な配列を反映するものである必要はないが、鋳型とハイブリダイズ するのに十分な相補性をもたなければならない。プライマーに挿入される非相補 性配列の例には、制限酵素認識部位をコードする配列がある。（米国特許第４． ８００．１５９号参照）。 プライマーは、所望により、分光光学的に、光化学的に、生化学的に、免疫化学 的に、または化学的手段で検出可能な標識を挿入することによって、標識できる 。有用な標識には、たとえば、ｓｔｐ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（通常 ＥＬＩＳＡに使用されるような）、ビオチン、または抗血清もしくはモノクロー ナル抗体が利用できるハブテンもしくは蛋白質が包含される。 「配合物中の２つの捕獲プローブの比率］とは、それらのプローブの相対濃度（ すなわち、１：Ｉまたは２：ｌ）を意味する。 ｒシグナルグローブノとは、検出可能な標識からなるオリゴヌクレオチドである 。この語は一般的に、三元または四元サンドイッチアッセイフォーマットにおい て、標的核酸と捕獲プローブを区別するために用いられる。 標識は検出プローブについて記録した任意のレポーターまたはシグナル系とする ことができる。 「固体支持体」は、その上に捕獲核酸を固着できる基質を提供する任意の不溶性 物質を意味する。この種の基質には、ナイロン、アミノまたはカルボキシ活性化 プラスチック、ガラス、セルロース等が包含される。 「サブ配列ノとは、核酸の長い配列の部分からなる核酸配列を意味する。 ［標的領域Ｊとは、通常、多形ＤＮＡ配列を含有する、分析すべき核酸の領域を 意味する。 「標的核酸」とは、シグナルプローブと複合体を形成して検出プローブを与える 核酸を意味する。このような核酸は通常、標的核酸か捕獲プローブに結合し、シ グナルグローブが標的核酸に結合するサンドイッチアッセイフォーマットに使用 される。 「試験サンプル」とは、検出プローブを含有する水性ハイブリダイゼーション培 地を意味する。 「均等密度」とは、肉眼による光学的記録またはデンシトメーターもしくは比色 計のような分析装置によって、等しい密度を意味する。 「光学的密度」とは、相補性オリゴヌクレオチドの間での二本鎖の存在または不 存在を測定するために使用される標識系によって産生されるシグナルまたは検出 生成物の相対的強度を意味する。標識系の選択にはとくに制限はない。この系は 直接または間接のいずれの系でもよく、放射能、蛍光、ルミネッセンスまたは色 素によるものとすることができる。密度は、撮影、分析装置または肉眼によって 測定される。酵素発色標識系が好ましい。 詳細な説明 緒言： レジオネラ種からの核酸を増幅するためにＰＣＲを用いるこれらの種の検出には 多重工程を要する。これらの工程には、存在する生物を検出に適当な程度に単離 および／または濃縮する適当なサンプリング操作、核酸を放出させるための細胞 の溶解方法、標的核酸配列を増幅するために適当な操作、ならびに増幅された配 列を検出する手段が包含される。この方法論の一般的記載は、Ａｔ１ａｓ、　Ｒ ，Ｍ、およびＢｅｊ、　Ａ、　Ｋ、：　ＤｅｔｅｃｔｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａｌ 　Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｉｎ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｔ　Ｗａｔｅｒ　Ｓａ ｍｐｌｅｓｂｙ　Ｕｓｊｎｇ　Ｐ　ＣＲａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｂｅｓ　ｉｎ 　Ｐ　ＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｉｎｎ１ｓら編、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、Ｉｎｃ、　１９９０刊、３９９−４０６頁にみられる。 標的核酸サブ配列を効果的に増幅するためには、ＰＣＲはポリメラーゼ延長を開 始するプライマーを要する。プライマーの選択は本発明の重要な態様をなし、本 明細書に開示される特定のプライマーは、レジオネラ種の検出に適当に機能する とされてきた他のプライマーに伴う様々な問題を解決する。このような問題には 、ゲノム内のヘアピンターンへのプライマーの結合、プライマー自体内の不適当 な内部二次構造、標的領域および非標的領域の両者へのプライマーの非特異的結 合、プライマーかすべて同じ温度で効率的に結合せず、比較的短い増幅生成物が 保持される、不均一な熱融解点か関係する。 本発明の５ＳＲＮＡ遺伝子増幅プライマーは多数のレジオネラ属種を増幅するこ とができる（表１参照）。これらは、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ口ａＳ ）やフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ）属からの近縁種を 増幅しない利点がある。ｎｉｐミルプライマーＬ、　ｐｎｅｕｉ＋ｏｐｈｉｌａ 。 Ｌ、　ｈａｃｋｅＬｉａｅ　およびり、　５ａｉｎｔｈｅｌｅｎｓｉの株のｍｉ ｐ遺伝子を増幅する能力において特異的である。 サンプリング系： レジオネラは温水環境に生存する。病原性レジオネラのヒト感染は、空調システ ムにみられるような新鮮な温水や住宅向けの上水への霧状暴露が関係することが 多い。 サンプリングの目的では、疑わしい水を集めて、低速度遠心分離（たとえば、１ ０，０００Ｘｇ、１５分）に付すかまたは濾過し、レジオネラを濃縮または収集 する。 レジオネラは約０．４５μｍの孔部を有するフィルターによって捕捉される。物 理的な屑がその後の濾過または増幅を妨害する場合には、前濾過工程が有用とな る。前濾過は本発明の必須の特徴ではない。この場合のフィルターは一般的に、 レジオネラは自由に通過させる孔部および組成を存する。水収集の物理的手段は よく知られていて、滅菌ガラスバイアル、シリンジ一式、および水の保存に適当 な他の不活性容器が包含される。 サンプル調製： 比較的きれいな水サンプルは、増幅に先立って標的核酸の単離または精製を行う ことなく、直接アッセイできる。大量の水サンプルは、微生物集団を濃縮するた めに濾過してもよい。濾過操作およびフィルターについては、本技術分野の熟練 者にはよく知られている。たとえば、５ｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏ ｒ　ｔｈｅ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗａｔｅｒ　ａｎｄＷａｓｔｅｗ ａｔｅｒ、１７版、９−１４頁＋　Ａｍｅｒ、　Ｐｕｂｌ、　ＨｅａｌｔｈＡｓ ｓｏｃ、、　１０１５　１５ｔｈ　Ｓｔ、　Ｎ、　Ｗ、、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ ｎ、　Ｄ。 Ｃ，２０００５が参考になる。好ましいフィルターは、レジオネラの細胞は捕捉 するが、無関係の核酸は通過させる孔部を有する。孔部サイズが０．２μＭまた は０．５μＭのＦｌｕｏｒｏｐｏｒｅ　Ｆ　Ｇ　Ｌ　Ｐ　００１３（Ｍｉｌｉｐ ｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＤ）　、またはＤｕｒｏｐｏｒｅＨ ＶＬＰのようなテフロン膜は、本発明に有用である。 水サンプルまたは濾過濃縮サンプルは、疑われる生物から標的核酸を放出させる の十分な条件に付す。機械的溶解が好ましい。機械的溶解は超音波処理、煮沸ま たは多重凍結／解凍サイクルによって達成できる。Ｃｈｅｌｅｘ’樹脂の存在下 におけるサンプルの煮沸が好ましい。細胞を破壊させる化学的手段も使用可能で 、リゾチーム、浸透圧ショック、プロテアーゼに処理、および界面活性剤のよう な標準的溶解手段が包含される。ＰＣＲ過程に対する悪影響の可能性かあること から、化学的方法はあまり好ましくない（すなわち、Ｔａｑポリメラーゼの阻害 ）。 サンプルは、ＰＣＲ反応混合物の成分に干渉する可能性があるプロテアーゼおよ びヌクレアーゼを変性するために加熱する。サンプルを８５℃に約５分間加熱す れば一般に十分である。別法として、化学的ヌクレアーゼおよびプロテアーゼイ ンヒビターも使用できる。 サンプルが、レジオネラによる感染が疑われる患者からのサンプルのように複雑 な混合物である場合には、最初のサンプルから核酸を単離することが好ましい。 生物学的サンプルから核酸を抽出するには、様々な技術が本技術分野で知られて いる。たとえばｌｉｇｕｃｈｉ、“Ｓｉｍｐｌｅａｎｄ　Ｒａｐｉｄ　Ｐｒｅｐ ａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｐ　ＣＲ″ｉｎＰ　ＣＲＴｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４章、　Ｅｒｌｉｃｈ編（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ 刊、１９８９　）　；　Ｍａｎｉａｔｉｓら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｔｏｎ ｉｎｇ　：　Ａしａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｔ＋ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２　） 　；　Ｈａｇｅｌｂｅｒｇおよび５ｙｋｅｓ。 Ｎａｔｕｒｅ３４２：４８５，１９８９；またはＡｒｒａｎｄ。 Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｐｒｏｂｅｓ　ｉ ｎ　ＮｕｃｌｅｉｃＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ ｐｐｒｏａｃｈ、Ｈａｍｅｓ　＆Ｈｉｇｇｉｎｓ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１８ −３０頁、１９８５がル、フェノール／クロロホルムまたはグアニジニウム塩と の接触ついでアルコールによる沈殿を包含する。ゲノムＤＮＡは全核酸抽出物か ら、さらにアルコール沈殿を行う前にＲＮアーゼを使用して得られる。 ＰＣＲ操作： ＰＣＲ法は本技術分野ではよく知られているしく米国特許第４．６８３，１９５ 号および４．６８３；　２０２号参照。これらの記載は参考として本明細書に導 入する）、多くの製造業者、たとえばＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒまたはＰｅｒｋ ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓが、ＰＣＲ試薬を販売 し、ＰＣＲプロトコールを刊行しているが、ＰＣＲ法に馴染みのない者にも本発 明を明快にし、完全に理解して貰うため、以下に一般的なＰＣＲ情報の一部を提 供する。 ＰＣＲ法の開始に際しては、サンプル中の標的核酸を変性する（サンプル核酸は 二本鎖と仮定して）。変性は通常、サンプルの加熱によって達成される。これは 、化学的変性ではポリメラーゼ活性が阻害されるからである。 鎖が分離されたならば、ＰＣＨの次の工程は、分離された鎖と、標的領域または サブ配列が側部に配置されるプライマーとのハイブリダイゼーションである。プ ライマーはついで延長されて標的鎖の相補性コピーが形成され、変性、ハイブリ ダイゼーション、および延長のサイクルが、所望量の増幅核酸を得るのに必要な 回数、反復される。 ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存性延長は、適当な塩、金属陽イオン、およ びｐＨ緩衝系からなる反応培体中、適当量の４種のデオキシリボヌクレオチド三 リン酸（ｄＡ、ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下、重合化剤 によって触媒される。適当な重合化剤は鋳型依存性ＤＮＡ合成を触媒することが 知られている酵素である。たとえば鋳型がＲＮＡであれば、ＲＮＡを相補性ＤＮ Ａ　（ｃＤＮＡ）配列に変換する適当な重合化剤には、逆転写酵素（ＲＴ）たと えばニワトリ骨髄芽球症ウィルスＲＴがある。増幅の標的がＤＮＡである場合は 、適当なポリメラーゼには、たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはその フレノウフラグメント、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ　ａｑ ｕａｔｉｃｕｓ　から単離されＰＥＣｒから市販されている熱安定性ＤＮＡポリ メラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼかある。この最後の酵素、ＴａｑＤＮＡポリメラ ーゼは、核酸の増幅および配列決定に広く使用されている。ＤＮＡポリメラーゼ を使用する反応条件は本技術分野でよく知られていて、たとえば、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｎ＋ｏｌｏｇｙの論文、および止揚のＭａｎｉａｔｉＳら、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ　Ｍａｎ ｕａｌ　に記載されている。 ＰＣＲ過程では、鎖の分離、プライマーのアニーリングおよび延長は平衡状態で 起こるので、温度は極めて注意深く調節される。温度の制御は通常、サーモサイ クラ−によって発生させる乾燥熱を用いて達成される。 ＰＣＲ法の好ましい実施態様においては、反応は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵 素たとえばＴａｑＤＮＡポリメラーゼによって触媒され、高温で行われる。好ま しい温度は、酵素が熱安定性である温度で、核酸が一本鎖と二本鎖の平衡状態に あって、十分なプライマーが鋳型の鎖にアニーリングし、適当な速度でのポリメ ラゼーシヨンが可能な温度である。鎖の分離は、反応混合物を、二本鎖の変性は 起こるがポリメラーゼの不可逆的変性は起こらない十分高い温度に十分な時間、 加熱することによって達成される。 ＰＣＲ法は、各工程後に新しい試薬を添加する段階的様式で実施することができ 、また、与えられた数の工程ののちに、すべての試薬を添加する様式でも実施で きる。 たとえば、鎖の分離が熱で誘発され、ポリメラーゼが熱感受性である場合には、 ポリメラーゼは鎖の分離の各ラウンド後ごとに添加しなければならない。しかし ながら、変性にたとえばヘリカーゼが用いられる場合、また延長に熱安定性ポリ メラーゼが用いられる場合には、すべての試薬が最初に添加されてもよく、また 、試薬のモル比が反応に重要であれば、試薬は合成反応によって減った分だけ周 期的に補給してもよい。 本技術分野の熟練者には明らかなように、ＰＣＲ過程は、熱安定性酵素を用い、 自動化過程で行われるのが最も通常である。この過程では、反応混合物は、変性 工程、ブライマーアニーリング工程、および延長工程を通して循環される。熱安 定性酵素の使用にとくに適合した装置、ＤＮＡサーモサイクラ−はさらに詳細に 、欧州特許第２３６，０６９号および米国特許第４，８８９，８１９号に開示さ れている。ＤＮＡサーモサイクラ−は、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒまたはＰｅｒ ｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｐ　Ｅ　ＣＩ　） 　、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　Ｃｏｎｎ、から市販されテイル。 ＰＣＲ反応を行う好ましい様式はマルチプレックス様式である。マルチプレック ス様式とは、２セット以上のＰＣＲプライマー対を使用して異なる標的領域の同 時増幅を包含する方法である。マルチプレックス操作は、類似の熱融解点を有す るプライマー対について設計されることが好ましい。すべての対は互いに８℃以 内のＴｍを有し、平均Ｔｍは４５および約７０℃の闇にあることが好ましく、と くに平均Ｔｍは６０℃および７０℃の間にあることが好ましい。 レジオネラ特異的プライマーの選択： 本発明のプライマーを、表２に示す。レジオネラ種の５ＳｒＲＮＡの増幅に有効 なプライマー対はプライマーの縮重混合物である。この混合物は、レジオネラの ５ＳｒＲＮＡからの標的ＤＮＡのみを確実に増幅する点で価値がある。比較によ り、また経験的分析から、５ＳｒＲＮＡに対する左および右プライマーは重要な 病原性型を含めて少なくとも５種のレジオネラをカバーすることが決定された。 これらには、Ｌ、　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、分離Ｂｌｏｏｍｔｎｇｔｏｎ、　 Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ　−１、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ　−１およびＴｏｇｕｓ 　−１、Ｌ、　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ｆｒａｓｅｒｉ（Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ 　）。 Ｌ、　ｂａｚｅｍａｎｉｉおよびり、　ｄｕｍｏｆｆｉｉ、　Ｌ、　ｊｏｒｄａ ｎｉｓ、　Ｌ。 ｇｏｒｍａｎｉｉ、　Ｌ、　Ｉｏｎｇｂｅａｃｈａｅか包含され、これらは水サ ンプル中に共通に存在する細菌すなわちＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｇｅ ｎｓｅ、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓおよびａｅｒｏｇ ｅｎｅｓ。 Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ、ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ ｉのＤＮＡとは反応しない。表１は、開示された５ＳＲＮＡプライマーを用いて 検出できるレジオネラ種の一覧表である。これらのプライマーは、適合する約６ ５℃のＴｍを有し、比較的低い二次構造を有する標的配列の領域に結合する。 ｍｉｐ遺伝子に対する左および右プライマーは、病原性に特異的で大部分の他の レジオネラ種からし。 ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ種を同定できる遺伝子の領域の増幅に向けられる。これ らのプライマーはいずれも、約６５℃のＴｍを有し、ヘアピンのような二次構造 を形成する傾向のほとんどないレジオネラゲノムの高度に保存された領域に結合 する。 表１１Ｔ８２およびＰＴ８０で増幅される標的５Ｓ　ＲＮＡ遺伝子を有するレジ オネラ種゛ １、　Ｌｅｇｉｏｎｅユｌａ　ｙｘｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ　５Ｇ４２、　Ｌ、　 ｐｎｅｔＭｒｌｏｐｈｉｌｉａ　５Ｇ３３、　Ｊ、−ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　 ５Ｇｘ１４、　Ｌ、　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　５Ｇ６５、　Ｌ、　ｐｎｅｕｒ ｒｔｙｐｈｉｌａ　！３Ｇ７６、　Ｌ、　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　５ＧＩＯ７ −ＪＪ、　ｌｏｎｇｂｅａｃｈａｅ　５Ｇ１１３−　１　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌ ａ　５Ｇ２５１　Ｌ、ｈａｃｋｅｌｉＥｌｅ　ＳＧ１゜１０、Ｌ、　ｐｎｅｔｍ ｐｈｉｌｉａ　５Ｇ１１１　Ｌ、ｆｅｅｌｅｉｉ　５Ｇ２ １２、Ｌ、　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　５Ｇ９１３、Ｌ、　ｅｒｙｔｈｒａ １ｉ　ｒ、、　ｊｏ肛如ｉｓ ユ５．　Ｌ、ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　ＳＧ’３−５１６、　Ｉ　ｔｕｃｓｏｎ ｅｎｓ：ｉｓ１フ、　ｘ、、ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　５Ｇ１２１Ｂ、Ｌ、ｄｕ ｍｏｆｆｉｉ １９、　Ｌ、ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　５Ｇ８２０、Ｌ、　ｊａｍｅｓｔｏｗｎ ｉｅｎｓｉｓ２１　ｘＪ、　ＩｒｐｉｒｉｔｅｎｌｉｉＢ２２、　Ｌ、５ａｉｎ ｔｈｅｌｅｎｓｉ　５Ｇ１２３、Ｌ、ｍｃｅａｃｈｅｒｎｉｉ ２４゜　Ｌ、ｍｏｒａｖｉｃａ ２５、Ｌ、　ｑｕｉｎｌｉｍｎｉｉ ２６、Ｌ、ｃｉｘｘｃｉｒｕｍｔｉｅｎｉｓｉｇ２７、Ｌ、ｂｏｚａｍｎｉｉ　 ５ＧＩ ２Ｌ　Ｌ、ｆＭＬｒｉＭｉｅ１ＭＩｉｌ１２９、Ｌ、ｆｅｅｌｅｉｉ　！９Ｇ１ ３０、Ｊ、、戸ｉｘｉ已ｕｚｉｚ ３１　Ｌ、ｆｅｅｌｅｉｉ　５Ｇ１ ３２、ｘａ、ｚａｎｔｔｃｒｕｃｉｚ ３３、ｌ　ｐｎｅ画卯厄１ａ　５Ｇ５ ３４、Ｌ、　ｂｉｒｘｄｎｇｈａｓｅｎｓｉｚ３５、Ｌ、ｃｈｅｒｒｉｉ ３Ｇ−Ｌ、ｂｏｍｍｎｎｉｉ　５Ｇ２ ３７、Ｌ、ｍ１ｃｄａｄｅｉ ３Ｂ、ｘａ、Ｈｏａ）ｃｒｉｄｇｅｎｓｉｓ３９、Ｌ、ｇｒａｔｉｍ＆ ４０、　Ｌ−ｐｎｅｕｒｒｔｙｐｈｉｌａ　ｇＧ１４４Ｌ　Ｌ、ａｎｉｓａ ４２、Ｌ、　ｙｘｅｕｘｒｃｙｐｈｔｘａ　５Ｇ１３４３、Ｌ−ｇｏｒ＆ＬｒＬ ｉ１ ４４、Ｌ、ｗａｄｓｏｒｔｈｉｉ ４５、Ｌ、１ｏｎｒｊｂｅａｃｈａｅ　５Ｇ２４６、Ｌ、５ａｉｎｔｈｅｌｅｎ ｓｉ　ＳＧ２増幅生成物の検出： ＰＣＲ生成物の検出は、エチジウムプロミド染色によるゲルの直接可視化または 特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いる間接手段によって行うこと ができる。これらの方法は熟練者にはよく知られていて、これらの技術の一般的 総説には、たとえば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）１ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ 、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＨａｍｅｓおよびＨ７ｇｇ ｉｎｓ　ＩＮ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，、ｌ　９ ８５がある。 ＰＣＲ生成物の検出がサザンプロットのようにハイブリダイゼーションによる場 合は、増幅領域のサブ配列に特異的に相補性の核酸プローブが使用される。この ようなプローブは、増幅されたセグメントの配列から容易に得られる。プローブ は、プライマー配列とプローブ配列の重複を避けるため、プライマー結合サブ配 列の間に位置するＤＮＡ配列にハイブリダイズするのが好ましい。 レジオネラ種の５ＳｒＲＮＡプライマーおよびｍｉｐ遺伝子に対する好ましいプ ローブ（捕獲プローブ）を表２に示す。 アッセイフォーマットによっては、標識プローブに増幅生成物を検出する機能を もたさせることか有用である。 プローブは本技術分野で知られている任意の方法で標識できる。放射能および酵 素標識が好ましい。適当な基質の存在下に着色生成物を生成する酵素標識がとく に好ましい。たとえば西洋ワサビベルオギシダーゼおよびアルカリホスファター ゼが用いられる。発色は既知の様々の基質を使用して様々な方法で実施できる。 西洋ワサビペルオキシダーゼの場合の好ましい方法には、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ 。 ３：１（８）：１３６８−１３７１　（１９８７）に記載されているような、テ トラメチルベンチジン（ＴＭＢ）の使用が包含される。別の検出システムとして は、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されている増強化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）検 出キットがある。このキットは、製造業者の指示書に従って使用される。 増幅された各オリゴヌクレオチドの電気泳動条件および検出手段はよく知られて いる通りで、本発明のとくに限定される態様ではない。熟練者によって受け入れ られる任意の手段が本発明に適用できる。 増幅生成物の検出のさらに別の様式は、膜ストリップ上でのサンドイッチハイブ リダイゼーションによるものである。典型的な配置では、ストリップはナイロン 製とし、分離されたスポットにオリゴヌクレオチド捕獲プローブが共有結合され る。 オリゴヌクレオチド捕獲プローブをナイロンに結合させるためには、約１００塩 基のオリゴチミジル酸でまずティリングを行う。ティリングはターミナルトラン スフェラーゼ、たとえばウシ胸腺ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ エラーゼを用いて行うことができ、またポリチミジンオリゴヌクレオチドをプロ ーブとともに化学的に合成できる。ティリングされたオリゴヌクレオチドをナイ ロンストリップ上にスポットする。ストリップを一夜乾燥し、紫外線照射に暴露 する。ストリップはついでハイブリダイゼーションアッセイを行うまで保存する 。その他の詳細は、係属中の一緒に譲渡された１９８９年５月４日出願の米国特 許出願一連番帰環３４７゜４９５号に記載されている。この記載は参考として本 明細書に導入する）。 捕獲プローブは、表２および表３に記載したように、レジオネラのゲノムの増幅 生成物に結合できる。増幅生成物は捕獲プローブへのハイブリダイゼーションを 介して膜に結合される。増幅生成物はついて酵素活性によって検出される。増幅 生成物の検出に好ましい手段は、増幅生成物がストレプトアビジン西洋ワサビペ ルオキシダーゼ複合体を結合できるように、各プライマーをビオチン化するもの である。ついで複合体を市販の基質を用いて発色させることにより、増幅生成物 の検出が可能になる。プライマー対はＬｅｖｅｎｓｏｎ　Ｃ，＆Ｃ，Ｃｈａｎｇ 。 Ｎｏｎ１ｓｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ　Ｌａｂｅｌｅｄ　Ｐｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　Ｐ ｒｉｍｅｒｓ　ｉｎＰ　ＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌ、Ｉｎｎ１ｓら編、Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ。 １．９９０．９９−１１２頁に記載の操作を用いてビオチン化できる。別法とし て、直接ビオチン化するホスホラミダイト連鎖を用いる合成も、Ｇｌｅｎｎ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈからの試薬を使用して実施できる。 キット： 本発明のプライマーは、環境内のレジオネラ種を検出するためのキットに具現で きる。このようなキットには多様な成分が包含される。キットにはＬｉｇｉｏｎ ｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　Ｄ　Ｎ　Ａ　、好ましくはＢｌｏｏｍｉｎｇ ｔｏｎ単離体のような既知の病原性型が包含される。このＤＮＡは陽性対照とし て使用される。バルクのポリメラーゼチェーン反応ミックスには、至適濃度のＡ ｍｐｌｉｔａｑ”　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ、ＰＥＣＩから入手できる熱抵抗性 核酸ポリメラーゼ、全５ＳｒＲＮＡプライマー、ｍｉｐミルプライマーＮＴＰ　 （好ましくはｄＴＴＰに代えてｄＵＴＰ）　、および緩衝塩を含有させる。内部 陽性対照配列（ＮＰＣ）は、ＰＣＲ操作が適切に機能していることを確認するた めに包含させる。ＩＰＣはレジオネラ標的核酸が存在するかどうかには無関係に 、陽性対照として働く増幅可能な標的からなる。好ましい実施態様においては、 ＩＰＣはヒトＨＬＡ　ＤＱα遺伝子の部分から選ばれる非天然配列からなる。こ の遺伝子配列は、ｍｉｐまたは５ＳＲＮＡ遺伝子のいずれかの配列を増幅するた めに使用される上流および下流プライマーに相補性の配列によって隣接される。 ヒトＨＬＡ　ＤＱαは水サンプル中には比較的希で、サンプル中に検出可能なレ ベルで存在することは全くない配列である。好ましいＩＰＣの配列を表３に示す 。ＩＰＣは二本鎖でも一本鎖でもよ（、増幅反応混合物中または別個の容器中に 保存される。通常、ＩＰＣは増幅反応混合物に百方から子方コピー添加される。 サンプル中に存在するレジオネラの定量には、少量のＩＰＣ，たとえば１００〜 １００，０００コピー使用できる。２５ｍＭのＭｇＣ１！溶液を、Ｔａｑポリメ ラーゼの活性化により反応を開始させるために包含させる。 キットにはまた、増幅生成物を検出するための手段が包含される。任意の標準的 手段、たとえばハイブリダイゼーションドツトプロット、アガロース、またはア クリルアミドゲル電気泳動を使用できるが、好ましい方法は、増幅された標的に 特異的に結合する捕獲オリゴヌクレオチドを存するディツプスティックを使用す る。ディツプスティックは標的を捕獲し、非同位元素検出系によって検出される 。たとえば、プライマーは延長前にビオチン化し、西洋ワサビペルオキシダーゼ ／ストレプトアビジン複合体を用いて酵素を増幅された標的の捕獲部位に特異的 に結合させる。適当な基質／緩衝液の組み合わせは１００ｍＭクエン酸ナトリウ ムｐＨ５，０中３．３’、５゜５′−テトラメチルベンチジン（ＴＢＭ）である 。 核酸ハイブリダイゼーションアッセイの光学的密度の調節： 市販用のキットの開発には、検出系の光学的密度を調節することが好ましい。光 学的密度はユーザーに陽性または陰性の結果を伝え、市販キットの重要な特徴で ある。 本発明の目的は、このようなアッセイに均一な調節可能な光学的密度を提供する ことにある。 基本的な問題点は、緊縮ハイブリダイゼーション条件を用いる場合、明瞭な陽性 ／陰性シグナルの提供を所望することから起こる。特定の群とそのすべてではな い群との間を識別することを試みる核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、固 体支持体の一部位に、個々にはその群を表示するすべての異なる検出プローブは 捕獲できない捕獲プローブの混合物を配置することによって有効になる。このよ うなアッセイでは、固体支持体上の一部位に混合物を、他の部位にはその異なる 捕獲プローブのすべてではない捕獲プローブを固着させる。 本発明によらないと、ある群とそのすべてではない群との間の同定および識別を 試みる核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、アッセイサンプルが全群、ある サブグループまたは種々のサブグループを表示する同じ濃度の検出プローブを含 有する場合、均一な検出密度を与えない。光学的密度に差を生じる理由は、アッ セイを構成する様々な核酸の熱融解温度（Ｔｍ）の差によるものである。この問 題は、メンバー間の特徴が、比較的わずかな塩基の差異、たとえば３０塩基領域 中１〜５塩基の差を有するオリゴヌクレオチド間の識別によって可能な群の場合 、とくに重大である。このような場合には緊縮ハイブリダイゼーション条件が要 求され、したがって、他の場合には問題にならない熱融解温度の差が、等濃度の 検出プローブが存在する場合の陽性結果の光学的密度の重大な差を生じることに なる。 簡略に述べれば、この方法は核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて捕獲 プローブに結合する検出プローブの光学的密度を調節する方法を提供する。この アッセイでは通常、２種または３種以上の異なる捕獲プローブを固体支持体に固 着させる。 固体支持体上の一部位においては、捕獲プローブは経験的に決定された比率で混 合される。そのすべてではない捕獲プローブを含有する第二の部位も、捕獲プロ ーブの濃度が混合物中に存在するその捕獲プローブの濃度とほぼ等しくなるよう に調製される。この比率は、与えられたハイブリダイゼーション条件および与え られた検出プローブ濃度で、２つの部位間に均質な強度の光学的密度を与えるよ うに設計される。最終目的は、緊縮条件下、捕獲プローブ間のＴｍが異なってい てもこれらの部位でラベルの均質な密度または検出プローブの均質な濃度を与え ることである。 本発明の理解を助けるために、一般的なモデルで説明する。モデルは、属Ａにお ける２つの病原性種を検出し、両種を個別に検出する核酸ハイブリダイゼーショ ンアッセイキットとする。標的核酸は５ＳリポソームＲＮＡとする。この領域で のこの２種の差は、一方がアデノシン：チミン対でなくグアノシン：シドシン対 をもつ点である。すなわち、両種のＴｍは、過剰のＧ：ｃ対をもつ種で他の種に 比べて高い。 アッセイはここではレジオネラのアッセイとして説明する。捕獲プローブの群を まず固体支持体に固着させ、検出プローブとしてはビオチン／ストレプトアビジ ン結合酵素標識を有するＰＣＲ増幅生成物を使用する。固体支持体上の捕獲プロ ーブの配列は次の３つ、すなわち（１）属のメンバーの一方もしくは両者を同定 するまたはいずれも同定しない種付異的捕獲プローブのＩＩＩ混合物を含有する 第一の部位、（２）種Ｉに特異的な捕獲プローブのみを含有する第二の部位、お よび（３）種２に特異的な捕獲プローブのみを含有する第三の部位である。 部位ｌの混合物がＩＩＩ混合物であるとして、試験サンプル中への与えられた濃 度のプローブに対して、部位Ｉにハイブリダイズする検出プローブの密度は、密 度Ｘ＋Ｙとなり、Ｘ′およびＹ′はサンプル中の種１および２に特異的な検出プ ローブの相対的な割合とする。問題、は、Ｘ′およびＹ′の濃度がサンプル中で は互いに等しく始まる場合、Ｘは必ずしもＹと等しく始まらないことである。こ れは、高緊縮ハイブリダイゼーション条件、捕獲プローブに結合する水性サンプ ル中の検出プローブの数がそれらの各熱融解点に応じて異なるからである。 一つの解決は、高いＴｍを有する捕獲プローブを、低いＴｍを有する捕獲プロー ブに合わせて希釈することである。たとえば、上記一般的モデルにおいては、種 ｌおよび２に対する捕獲プローブの混合物がｌ：ｌ、２：、１゜１：２，３：１ および１：３に希釈されることを示唆する。一つのプローブのみを含む他の部位 も同様に希釈されることになる。与えられた濃度における検出プローブの標準溶 液をついで種々の希釈液とともに使用して、与えられたハイブリダイゼーション 溶液および検出／標識系に対するこのシステムの光学的密度のラフな評価が達成 される。 さらに定常的なタイトレージョンにより、検出システムからの結果の光学的密度 が、個々のオリゴヌクレオチドのＴｍとは無関係に、検出プローブの与えられた 濃度に等しくなる、高緊縮ハイブリダイゼーション条件を用いたマルチプルドツ ト核酸ハイブリダイゼーションシステムの達成が可能である。このようなシステ ムでは、与えられた比率で固体支持体に固着された捕獲プローブ混合物と、他の 固体支持体または同じ固体支持体の他の領域に固着されたある濃度の個々の捕獲 プローブを有し、この場合、個々の捕獲プローブは混合物中におけるそれらの濃 度と等しいまたはほぼ等しい濃度で固体支持体上に存在させる。本発明はさらに 、プローブ混合物か３種以上のもっと複雑な混合物であり、個々のプローブはそ の全群ではない多重捕獲プローブである場合にも同様に適当可能であることを理 解すべきである。 好ましいアッセイフォーマットにおいては、検出プローブは、生物体の選ばれた 標的領域の増幅にＰＣＲが用いられた場合の増幅生成物である。ＰＣＲ過程では 、検出プローブとして働くビオチン化増幅生成物が生成する。 これらのアッセイでは、与えられたサンプル中に最初のコピーの標準数を使用し 、それに応じてアッセイの感度を調整する。たとえば、取締当局が１００細胞／ １の検出レベルを要求し、各細胞が標的領域１０コピーを有するとすると、アッ セイは１１のサンプルを集めて収集細胞から核酸を抽出するように設計される。 ついで、１０００の標的が効率９５％で３０ラウンドのＰＣＲで増幅され、５Ｘ １０”のコピーが生成する。この数はアボガドロ数を用いて、モルに変換される 。 ５Ｘ１０”コピーのサンプルは最小の許容感度である。 サンプルはついで、その濃度で許容される光学的密度を生じる条件を決定するた めの、その群中の他の細胞（類似の濃度での）に対する標準として使用される。 この過程でアッセイの動的範囲が決定される。動的範囲とは、その後に光学的密 度が検出可能で、検出ブロー　−ブの濃度の増加に直接応答する検出プローブの 濃度である。動的範囲は経験的に決定される。所望の動的範囲を与える許容され るハイブリダイゼーション条件および標識システムを構築するのは、単純な定常 的タイトレージョンの問題である。ＴＭＢを使用する本発明に記載の比色系では 、好ましい動的範囲はｌ０ＸＩＯ−”〜１００ＸＩＱ＋””モルである。 本発明は核酸ハイブリダイゼーションの分野に広く応用できる。核酸を固体支持 体、ハイブリダイズされた検出核酸、単離、選択および増幅プローブに固着する 手段、ならびに３種もしくは４種以上のオリゴヌクレオチドのサンドイッチアッ セイおよび２種のオリゴヌクレオチドの二元アッセイを含むアッセイのフォーマ ットの作成手段は本技術分野においてはよく知られている。これらの特徴は本発 明の必須な構成要素ではない。基本的技術の総説には、米国特許第５，０１５， ５６９号および第４゜８８６．７４１号がある。この技術の入門書にはＮｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｔｏｎ、　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａＬ　 Ａｐｐｒｏａｃｈ。 Ｈａ、ｍｅｓ、　Ｂ、　Ｄ、およびＨｉｇｇｉｎｓ、　Ｓ、　Ｊ、纒、Ｉ　ＬＲ Ｐｒｅｓｓ。 １９８７がある。これらの３つの文献は参考として本明ｍ＊に導入する。 レジオネラ試験キットの開発のための配合捕獲プローブの使用例は以下の実施例 の項に記載する。５ＳｒＲＮＡ遺伝子の標的配列が使用された。レジオネラ風向 の生物についての５ＳｒＲＮＡ核酸配列は他の属（すなわち、シュードモナスお よびビブリオ）のそれにきわめて類似している。レジオネラ風向での標的核酸配 列はすべての種で同一ではない。レジオネラ属の大部分の生物を１回の検出試験 で検出するため、２つの算獲プローブを配合した。 これらの２つの捕獲プローブは１８塩基長で、１塩基だけが異なっている。すな わち、一方のプローブは「Ｇ」塩基を、他方はｒＡＪ塩基を有する。これらの２ つのプローブはそれぞれ約６０および５８℃のＴｍを示す。これらの捕獲核酸プ ローブの適切な比を選択するためにタイトレージョンを行い、この場合１：１で あることが明らかにされた。これらのプローブのｌ：ｌ混合物を作成し、この混 合物を膜上に固定化した。この混合捕獲プローブはレジオネラ種の検出に使用さ れる。この混合物は、大部分のレジオネラ種の検出を可能にする。これらのプロ ーブの一方のみを単独で使用すれば、緊縮条件下ではレジオネラ種の部分しか検 出できないであろうと考えられる。緊縮をゆるめた条件下では、類似の５ＳｒＲ ＮＡ配列を存する非しジオネラ生物、たとえばシュードモナス属の生物も検出さ れ、偽陽性の結果を生じるものと思われる。 本発明には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書の開示に 様々な置換および改変が可能なことは、本技術分野の熟練者には明白であろう。 以下の実施例は例示の目的で提供されるものであって、いかなる意味においても 本発明を限定するものではない。 例 Ａ、サンプルＤＮＡの単離 水サンプル１００〜５００ｍＭをまず、２５ｍｍ。 ０．４５μ孔径のフィルター（ＭｉｌＨｐｏｒｅ製のＤｕｒａｐｏｒｅ）を通し て濾過する。フィルターをＤＮＡ抽出試薬（２０％　Ｃｈｅｌｅｘ”樹脂１０　 ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１。 ０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）２ｍＭを含存する管に移し、フィルター表 面から生物がなくなるまで旋回させる。 サンプルを沸騰水浴中に入れ、熱ブロツク中９９°Ｃに１０分間加熱して生物を 溶解させる。 Ｂ、レジオネラゲノムのＰＣＲ増幅 上述のように、好ましいＰＣＲ操作はＰＣＲ混合物中でｍｉｐおよび５ＳｒＲＮ Ａ標的領域の両者を同時に増幅させるマルチプレックス反応である。上記試験溶 液からのサンプル２０μｌを取り、以下の試薬、ＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ　ＫＣ Ｉ、　５０ｍＭ　Ｔｒｆｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，９）；４単位のＴａｑＤＮＡポ リメラーゼ（ＰＥＣＩから）、０．３５ｍＭのｄＮＴＰおよび各プライマー０． ５μＭを含存する増幅反応ミックス６５μｍに添加する。プライマーは表２に示 す。反応混合物に内部陽性対照（ＩＰＣ）３００コピーを加える。ＩＰＣ配列は 表３に示す。ＰＴ７０を越えて延長する配列は増幅されず、削除される。 レジオネラ属の標的５ＳｒＲＮＡ遺伝子サブ配列およびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ　 ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａのｍｉｐ遺伝子の標的配列は以下のＰＣＲ操作を用いて 増幅される。 表２．レジオネラ種の　および検出用プライマーおよびプローブ左ｓｔｐプライ マー：Ｆｒ８９：Ｇ（ス　；Ｓ凶、１０恥、６右ｌ１１ｐプ７ｆ’？−：ＰＴ７ ０’：　：　Ｓｇ　ｌ０Ｎｏ、７右ａ＋ｉｐプライマー：ＰＴ１８１　：Ｇｒｆ ＴｒＧｃｃｘＴＣＡＡＡ’ｒＣ’ｒ’ｘＴｉ■１；　ＳｅＱ、ＩＱ　Ｎｏ、２３ 左５８ｒＲＮＡプライマー：ＰＴ８２：αａＴｈＧｃＧＭτｍＪ１；　Ｓｅａ　 Ｉ０而、１０左５３ｒＲＮＡプライマー：ＰＴｔＦ！Ｊ：　ｃｘ；ｃａｐｃｒｘ ｍαを九π（６）頃；シ（Ｌｌｌ？ＮＯ，２？右５Ｓ　ｒＲＮＡプライマー：Ｐ ｒＢ６：　αｎＮｎビワ１＝丁に肛ＭＧＡ；　５ｅｃＬ　１口Ｎ０．９右５Ｓ　 ｒＲＮＡプライマー：ＰＴ１５７：　ｃｃｃａ　ＴＧ；　Ｓｅｑ、　１０　Ｎｏ 、　２２ｓｉｐ捕獲プローブ：ＰＴ５６：　ｎ℃ｆｆαＱ’ｒｒｕＣＡＴＣｒ； 　ＳｅＱ、　ｌ［ｌ　Ｎｏ、　４Ｉｌ１１ｐ捕獲プローブ：ＰＴ６７：ＮＤ工Ｍ ＤＣｃｍπＮＷ送国；Ｓｅａ、　Ｉｌｌ　Ｎｏ、　５５３ｒＲＮＡ捕獲プローブ ：ＰＴ７７：ｃｃｃｃｃｃ＋＋ａｍ）Ｇ可式論；　Ｓｇ　ＩＩ）　Ｎｏ、　８５ ＳｒＲＮＡ捕獲プローブ：ＰＴｌ　００　：　Ｏ’ｒｃｒｃＧＡＡロロＷＭＳｍ Ｎ１Ｃ；　Ｓｅａ、　ｌ０馳、１７５Ｓ　ｒＲＮＡ捕獲ブＯ−ブ：Ｐτ７２５： 　ａａ；ｃｃｍｒａｍｒｘｒａ；　ｋ　１０　Ｎｏ、　２４溶液は７５μｍの軽 鉱油（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ。 Ｌｏｕｉｓ、　Ｍ　Ｏ）で覆い、２５ｍＭのＭｇＣＬ　１５μｌを加え、Ｐｅｒ ｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡサーモサイクラ−を用い、可能な限り 急速な温度変化を１秒にセットして、溶液を以下の熱プロフィールに付す。 １秒で９５℃に ９５℃に１分。 ３０サイクル： １秒で９５℃に ９５℃に１分。 １秒で６３℃に ６３°Ｃに１．５分。 ついで７２℃に７分、ついで停止または６℃に保持。 表３、内部陽性対照配列（ｌ　ＰＣ）　ＰＴ７４および捕獲プローブ陽性対照− ＤＱａ１ ５’−ｍテＣｊＬＧＣＡＡＡＴＴＺ’ＧＧＡＧ−３’　；　５ｅｑ、　ＩＤ　Ｎ ｏ、　１６陰性対照−ＤＱａ　Ｌ２．１．３．４ ５’　−（ａπλ℃紹）℃ｎ■…刀−３’　；　Ｓｅｑ、　ｘＤＮｏ−１７ＰＣ Ｒ反応混合物１０μｍおよび負荷ゲル２μｍを混合し、３．０％Ｎｕｓｉｅｖｅ １１および１％　Ｓｅａｋｅｍ’印のアガロースゲル（Ｅ　Ｍ　ＣＣｏｒｐ、　 、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　Ｍ　Ｅ　）の各レーンに、ＴＢＥｔ気泳動緩衝液（８ ９ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１゜８９ｍＭホウ酸ナトリウムおよび１　ｍＭ　Ｅ　Ｄ 　Ｔ　Ａ　、　ｐＨ８，２）を用いて適用する。負荷緩衝液は、２５０　ｍｇ／ ｍｌ　Ｆｉｅｏｌ　４００．　０．　２５Ｂ／ｍｌブロモフェノールブルーとす る。ゲルは長さ２０ｃｍ、輻１２．５ｃｍとする。 約２時間１５０ボルトで水平に移動させる。ついでゲルの内容を、エチジウムプ ロミド染色後紫外線下に観察する。 このアッセイの感度は、サンプル１０μＩあたり標的領域１００コピーの検出を 可能にする。プライマーＰＴ８９、ＰＴ７０およびＰＴ１８１を用いて、増幅ｍ ｉｐ領域は約１６８ｂｐであり、増幅５ＳｒＲＮＡ領域は約１：Ｉｏｂｐである 。上記条件下に、増幅生成物の量はほぼ等しい。 別法として、増幅生成物は表２および３に１例示した捕獲プローブを用いてナイ ロン膜上に捕獲させる。プローブＰＴＩ２５およびＰＴ１２７の混合物は、レジ オネラの未知株について試験すると、優れたハイブリダイゼーション結果を与え る。プローブはＰａ１ｌ　Ｂｉｏｄｙｎｅ−Ｂナイロン膜（Ｐａｕｌｉ　Ｂｉｏ ｓｕｐｐｏｒｔ　Ｄｉｖ、、　Ｅａｓｔ　Ｈｉｌｌｓ。 ＮＹ）に結合させる。 好ましい実施態様においては、ＰＴ８２およびＰｒＢ６を含有する混合物が増幅 される。ＰＴ１５９およびＰＴ１５７の除去はり、　５ｐｉｒｉｔｅｎｓｉｓ、 　５ａｉｎｔｈｅｌｅｎｓｉ（ＳＧＩおよび５Ｇ２）、およびｑｕｉｎｌｉｖａ ｎｔｉに対するアッセイの特異性はわずかに低下させる。しかしながら、このア ッセイでは、シュウトモナス種からのｒＲＮＡの望ましくない増幅は実質的に低 下する。さらに詳しくは、非特異的交差反応は低下し、レジオネラ種標的核酸の １００コピーは交差反応シュウトモナス特異的標的１０’〜１０７に等しくなる 。 捕獲プローブは任意ｉ：　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ。 Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉからのｐ−〔２−ヒドロキシ−１−ナフチルア ゾ〕−ベンゼンスルホン酸、オレンジ−１１染料（公認）と結合される。この染 料は、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１０，０に調整した５０ｍＭ３−（シクロ へキシルアミノコ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）に０．０１％に希釈す る。ナイロン膜は、５ＳＲＮＡに対する捕獲プローブＰＴ１２５およびＰＴ１２ ７、ｍｉｐ遺伝子に対するＰＴ５５、ならびに表３に記載の陽性および陰性対照 プローブの組み合わせを有するストリップに切断する。膜の分離されたスポット に各プローブ４ピコモルが結合される。ついで膜を、０．５％５ＤＳ（ｗ／ｖ　 ）　、５　Ｘ　ＳＳＰ　Ｅ　（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ ｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａ［ｌＯｉ”ａｔＯｒｙＰｒｅｓｓ、　１９８８に従って 調製される２０×標準食塩リン酸ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７，４から希釈する）およ び０．０３％デキストラン硫酸の混合物で洗浄する。 増幅サンプルに変性溶液（１，２Ｎ　ＮａＯＨ。 ０、ＩＩＭ　ＥＤＴＡ）５０μｍを加える。変性サンプルｃ７）５０μｍサンプ ルを、５ＸＳＳＰＥ中０，５％ｗ／ｖＳＤＳからなるハイブリダイゼーション溶 液的３ｎ＋３に加える。捕獲プローブが結合されたナイロン膜をそれぞれ、３ｍ ｌのハイブリダイゼーション溶液に、穏やかに回転しながら水浴中５０〜５５° Ｃで２０分間暴露する。 ハイブリダイゼーション溶液を膜から傾瀉し、膜に結合したビオチン化増幅標識 を、ストレプトアビジンを介して西洋ワサビペルオキシダーゼに連結させる。酵 素は、０．１０％　ＳＤＳおよび市販ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキ シダーゼ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ　ＩＥｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ製のＡｍｐｌｉＴｙＰ ｅ　ＫｉｔＴ＆ｌ　Ｄ　Ｑ　ａ　Ｄ　Ｎ　Ａタイピンクキット）を含有する２、 ５ＸＳＳＰＥ　３ｍｌに膜を取り、５０〜５５℃の水浴中、穏やかに回転しなが ら２０分間インキュベートして付着させる。ナイロン膜を、０．１％ＳＤＳ含有 ２．５ＸＳＳＰＥの過剰を洗浄緩衝液として用い、５０〜５５℃で穏やかに回転 して１２分間、１回洗浄し、最後に０．１％ＳＤＳ含有２．５ＸＳＳＰＥ中、つ いで再度０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５，Ｑ中、室温で５分間振盪して洗 浄する。 発色は３．３’、５．５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を用いて行う。 エタノール中２ｍｇ／ｍｌのＴＭＢ保存溶液０．２５ｍ１を５ｍｌの０．５Ｍク エン酸ナトリウム、ｐＨ５，０および１μｌの過酸化水素標準溶液に希釈する。 この溶液の存在下、膜を、室温、暗所で、３０分間インキュベートする。ついで 膜を水２０ｍＪ中、室温で２回すすぎ、結果を記録する。

【配列表】

配列番号（Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ、）　：　１配列の長さ：１５０ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 ＧＣ＾ＴＴＣｍＧＣＣＱ＾ｆｆ〒ＧＧＧＧ　入＾Ｇ？〒テＧ＾ＴＧ　Ｇ＾Ｇ＾Ｔ ＧＡＧＧ＾　Ｇ丁丁ＣテＡＣＧ丁Ｇ　ＧＡｃｃ丁ＧＧＡＧＡ@６０ にＧＡＡ（Ｘ；ＡＧＡＣＴｍ　ＴＧＧＣＣＴＧ入Ｇ丁　ＴＣ＾Ｇｃλ入＾ｉテ　 ｍ＾ＧＧ’ｒＴ？？　ＧＴ’ｊＯＧｋＡＡ０　１２０ＡＴＴＩＴｊＡＴＧＧＣＡ ＡＡＸ着ＡＣｒ　ＧＣＴＧＡＡＴＴＣＡ　１５０配列番号（Ｓｅｑ、　Ｉ　Ｄ　 Ｎｏ、）　：　２配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：　ＤＮＡ　（プローブ） 配列 ＣＡＡＧＧＣＡＴＡＧ　ＡＴＧＴＴＡＡＴＣＣＧＧ　２２配列番号（Ｓｅｑ、　 Ｔ　Ｄ　Ｎｏ、）　：　３配列の長さ＝２５ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プローブ） 配列 ＣＡＴＡＧＣＧＴＣＴ　ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＴ　ＴＡＧＣＣ２５配列番号（Ｓｅ ｑ、　ｒ　Ｄ　Ｎｏ、）　：　４配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プローブ） 配列 ＴＴＧＣＴＴＣＣＧＧ　ＡＴＴＡＡＣＡＴＣＴ　２０配列番号（Ｓｅｑ、　Ｉ　 Ｄ　Ｎｏ、）　：　５配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ＜プローブ） 配列 ＡＡＣＣＧＡＡＣＡＧ　ＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧ　ＡＣＧ　２３配列番号（Ｓｅｑ 、　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、）　＋　６配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プライマー） 配列 ＧＣＡＴＴＧＧＴＧＣＣＧＡＴＴＴＧＧ配列番号（Ｓｅｑ、　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、） 　：　７配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プライマー） 配列 ＧＣＴＴＴＧＣＣＡＴ　ＣＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴＧＡＡ配列番号（Ｓｅｑ、　Ｉ 　Ｄ　Ｎｏ、）　：　８配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プローブ） 配列 ＣＧＣＧＣＣＡＡＴＧ　ＡＴＡＧＴＧＴＧＡ配列番号（Ｓｅｑ、　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ 、）　：　９配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プライマー） 配列 ＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴ　ＡＣＴＴＴＣＲＣＡＴ　Ｇ、Ａ　２２１８　配列番号（ Ｓｅｑ、　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、）　：　１０配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プライマー） 配列 ＧＧＣＧＡＣＴＡＴＡ　ＧＣＧＲＴＴＴＧＧＡ　Ａ　２１２４　配列番号（Ｓｅ ｑ、　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、）　：　１１配列の長さ＝２３ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ブローブン 配列 ＣＡＴＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＧＡ　ＡＡＣ２３１９配列番号（Ｓｅｑ 、　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、）　：　１２配列の長さ＝１８ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー二車鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プライマー） 配列 ＴＴＣＣＡＣＡＣＣＧ　ＧＴＡＴＡＧＴＣＧＣＣ配列番号（Ｓｅｑ、　Ｉ　Ｄ　 Ｎｏ、）　：　１９配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プライマー） 配列 ＣＡＴＧＣＧＡＡＡＧ　ＴＡＧＧＴＣＡＴＣＧ　Ｃ配列番号（Ｓｅｑ、　Ｉ　Ｄ 　Ｎｏ、）　：　２０配列の長さ＝２４ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ、（プライマー） 配列 ＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡ　ＴＴＴＧＡＴＧＧＣＡ　ＡＡＡＣ配列番号（Ｓｅｑ、　 Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、）　：　２１配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類、ＤＮＡ（プライマー） 配列 ”’　ＧＧＣＧＡＣＴＡＴＡ　ＧＣＧＧＴＧＴＧＧＡ　Ａ　２１配列番号（Ｓｅ ｑ、　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、）　：　２２配列の長さ＝２１ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー；直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プライマー） 配列 ２１ＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴ　ＡＣＴＴＴＣＧＣＡＴ　Ｇ　２１配列番号（Ｓｅｑ 、　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、）　：　２３配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プライマー） 配列 ”４ＧＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴ　ＧＡＡ　２３配列番号（Ｓ ｅｑ、　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、）　：　２４配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（プローブ） 手続補正書（睦）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．レジオネラ種からの核酸のサブ配列を増幅するための核酸ポリメラーゼプラ イマーにおいて、プライマーは以下の配列 （ａ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１２；（ｂ）【配列がありま す】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１３；（ｃ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　 Ｎｏ．１４；（ｄ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１５；（ｅ）【 配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１８；（ｆ）【配列があります】　Ｓ ｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１９；および （ｇ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．２０；（式中、Ｙはシトシン またはチミン塩基を示し、塩基Ｙを有するプライマーは２種のプライマーの混合 物を包含する）からなる群より選ばれる核酸サブ配列に実質的に結合するプライ マー ２．プライマーは以下の配列 （ｅ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１８；（ｆ）【配列がありま す】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１９；および （ｇ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．２０；からなる群より選ばれ る核酸サブ配列に実質的に結合する「請求項１」記載の核酸ポリメラーゼプライ マー３．核酸サブ配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１２；に実質的に結合する「請求項 １」記載の核酸ポリメラーゼプライマー ４．核酸サブ配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１３；に実質的に結合する「請求項 １」記載の核酸ポリメラーゼプライマー ５．核酸サブ配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１４；に実質的に結合する「請求項 １」記載の核酸ポリメラーゼプライマー ６．核酸サブ配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１５；に実質的に結合する「請求項 １」記載の核酸ポリメラーゼプライマー ７．核酸サブ配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１８；に実質的に結合する「請求項 １」記載の核酸ポリメラーゼプライマー ８．核酸サブ配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１９；に実質的に結合する「請求項 １」記載の核酸ポリメラーゼプライマー ９．核酸サブ配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．２０；に実質的に結合する「請求項 １」記載の核酸ポリメラーゼプライマー １０．以下の配列 （ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】 （ｄ）【配列があります】 （ｅ）【配列があります】 （ｆ）【配列があります】 および （ｇ）【配列があります】 （式中、Ｒはアデニンまたはグアニン塩基であり、Ｒを有するプライマーは２つ のプライマーの混合物である）からなる群より選ばれる「請求項１」記載の核酸 ポリメラーゼプライマー １１．以下の配列 【配列があります】 および 【配列があります】 からなる群より選ばれる「請求項１０」記載の核酸ポリメラーゼプライマー １２．プライマーはその５′末端でビオチン化されている「請求項１０」記載の 核酸ポリメラーゼプライマー１３．以下の配列 【配列があります】 からなる「請求項１０」記載の核酸ポリメラーゼプライマー １４．以下の配列 【配列があります】 からなる「請求項１０」記載の核酸ポリメラーゼプライマー １５．以下の配列 【配列があります】 からなる「請求項１０」記載の核酸ポリメラーゼプライマー １６．以下の配列 【配列があります】 からなる「請求項１０」記載の核酸ポリメラーゼプライマー １７．以下の配列 【配列があります】 からなる「請求項１０」記載の核酸ポリメラーゼプライマー １８．以下の配列 【配列があります】 からなる「請求項１０」記載の核酸ポリメラーゼプライマー １９．以下の配列 【配列があります】 からなる「請求項１０」記載の核酸ポリメラーゼプライマー ２０．プライマーはその５′末端でビオチン化されている「請求項１８」記載の 核酸ポリメラーゼプライマー２１．プライマーはその５′末端でビオチン化され ている「請求項１９」記載の核酸ポリメラーゼプライマー２２．以下の配列 （ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】 （ｄ）【配列があります】 （ｅ）【配列があります】 （ｆ）【配列があります】 および （ｇ）【配列があります】 （Ｙはシトシンまたはチミン塩基である）からなる群より選ばれる核酸サブ配列 によって隣接される非天然オリゴヌクレオチドサブ配列からなる内部陽性対照オ リゴヌクレオチド配列 ２３．以下の配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１２；　及び【配列があります】　 Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１３からなる群より選ばれる核酸サブ配列からなる「請求 項２２」記載のオリゴヌクレオチド配列 ２４．以下の配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１４；及び【配列があります】　Ｓ ｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１５（式中、Ｙはシトシンまたはチミン塩基を示す）からな る群より選ばれる核酸サブ配列からなる「請求項２２」記載のオリゴヌクレオチ ド配列 ２５．以下の配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１８；【配列があります】　Ｓｅｑ ．ＩＤ　Ｎｏ．１９；および【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．２０か らなる群より選ばれる核酸サブ配列からなる「請求項２２」記載のオリゴヌクレ オチド配列 ２６．以下の核酸サブ配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．６からなる「請求項２２」記載のオ リゴヌクレオチド配列２７．以下の核酸サブ配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１３からなる「請求項２２」記載の オリゴヌクレオチド配列２８．以下の核酸サブ配列 【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．３；【配列があります】　Ｓｅｑ． ＩＤ　Ｎｏ．２４；【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．２５；またはそ れらの混合物からなるオリゴヌクレオチド捕獲プローブ ２９．以下の配列 （ａ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１２；（ｂ）【配列がありま す】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１３；（ｃ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　 Ｎｏ．１４；（ｄ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１５；（ｅ）【 配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１８；（ｆ）【配列があります】　Ｓ ｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１９；および （ｇ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．２０；（式中、Ｙはシトシン またはチミン塩基を示し、塩基Ｙを有するプライマーは２つのプライマーの混合 物である）からなる群より選ばれる核酸サブ配列に実質的に結合する核酸プライ マーの延長によりポリメラーゼが配列増幅を開始する、レジオネラ種からの核酸 サブ配列の増幅のためのヌクレオチドポリメラーゼの使用方法３０．プライマー は、以下の配列 （ａ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．６；（ｂ）【配列があります 】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．７；（ｃ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ ．１０；（ｄ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．９；（ｅ）【配列が あります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．２１；（ｆ）【配列があります】　Ｓｅｑ． ＩＤ　Ｎｏ．２２；および （ｇ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．２３；からなる群より選ばれ る「請求項２２」記載の方法３１．レジオネラ種からの核酸サブ配列とともに、 さらにレジオネラ種の配列の増幅に使用されるプライマーの少なくとも１種に相 補性の上流および下流配列によって隣接された内部陽性対照オリゴヌクレオチド 配列を共増幅することからなる「請求項２２」記載の方法３２．以下の配列 （ａ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１２；（ｂ）【配列がありま す】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１３；（ｃ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　 Ｎｏ．１４；（ｄ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１５；（ｅ）【 配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１８；（ｆ）【配列があります】　Ｓ ｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．１９；および （ｇ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．２０；（式中、Ｙはシトシン またはチミン塩基を示し、塩基Ｙを有するプライマーは２つのプライマーの混合 物である）からなる群より選ばれる核酸サブ配列に実質的に結合する核酸を含有 するコンパートメントからなる、レジオネラ種からの核酸の増幅用キット ３３．核酸は、以下の配列 （ａ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．６；（ｂ）【配列があります 】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．７；（ｃ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ ．１０；（ｄ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．９；（ｅ）【配列が あります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．２１；（ｆ）【配列があります】　Ｓｅｑ． ＩＤ　Ｎｏ．２２；および （ｇ）【配列があります】　Ｓｅｑ．ＩＤ　Ｎｏ．２３；（式中、Ｒはアデニン またはグアニン塩基であり、Ｒを有するプライマーは２つのプライマーの混合物 である）からなる群より選ばれる「請求項３２」記載のキット３４．さらにレジ オネラ種の配列の増幅に使用されるプライマーに相補性の上流および下流配列に よって隣接された内部陽性対照オリゴヌクレオチド配列を含有する「請求項３１ 」記載のキット ３５．核酸配列の異なる第一および第二の２つの捕獲プローブを含む核酸ハイブ リダイゼーションアッセイにおいて、捕獲プローブに結合する検出プローブの光 学的密度を調整する方法であって、（ａ）２つの捕獲プローブの配合物を混合し 、（ｂ）工程（ａ）からのプローブの混合物を固体支持体上の分離された第一の 領域に、第一の捕獲プローブを固体支持体上の分離された第二の領域に固着させ 、この場合、第一の捕獲プローブの濃度は両領域で等しく、第二の捕獲プローブ の第二の領域における濃度は第一の領域における第二の捕獲プローブの濃度とは 異なり、（ｃ）工程（ｂ）の捕獲プローブに、検出プローブを、検出プローブが 一方の捕獲プローブには結合するが他方には結合しない高緊縮ハイブリダイゼー ション条件下に結合させ、（ｄ）検出プローブのハイブリダイゼーションを光学 的密度によって検出する工程からなり、この場合、第一の領域に固着される２つ の捕獲プローブの比率は、検出プローブが等量存在し、工程（ｃ）のハイブリダ イゼーション条件下に結合可能なときには、第二の領域のそれに等しい光字的密 度を与えるように調整される方法 ３６．検出プローブは増幅生成物である「請求項３５」記載の方法 ３７．検出プローブはポリメラーゼチェーン反応増幅生成物である「請求項３６ 」記載の方法３８．検出プローブは、互いにハイプリダイズしない捕獲およびシ グナルプローブの異なる領域に高緊縮ハイブリダイゼーション条件下に結合する 標的核酸の複合体である「請求項３５」記載の方法 ３９．標的核酸は増幅生成物である「請求項３８」記載の方法 ４０．標的核酸はポリメラーゼチェーン反応増幅生成物である「請求項３９」記 載の方法 ４１．工程（ａ）の配合物における２つの捕獲プローブの比率は標的核酸の既知 量に従って調整される「請求項３５」記載の方法 ４２．捕獲プローブについての検出範囲は約１０×１０−１２〜約１００×１０ −９モルの濃度範囲内であ「請求項３５」記載の方法 ４３．アッセイは、標的核酸濃度約１０×１０−１２〜約１００×１０−９モル にわたって光学的密度の正の勾配を与える「請求項３６」記載の方法 ４４．検出プローブならびに核酸配列の異なる第一および第二の捕獲プローブを 使用し、試験サンプル中の陽性結果に対して等しい光学的密度を与える核酸ハイ ブリダイゼーションキットにおいて、以下の成分、すなわち、（ａ）第一および 第二の捕獲プローブがある濃度で固着された、第一の分離された領域を有する固 体支持体、（ｂ）第一の捕獲プローブは、成分（ａ）の第一の領域における第一 のプローブの濃度に等しい濃度で、第二のプローブは第一の領域における第二の プローブの濃度と等しくない濃度で固着された第二の分離された領域を有する固 体支持体、および（ｃ）検出プローブを含有する容器からなり、成分（ａ）の混 合物中の２つの捕獲プローブの比率は、試験サンプル中に等量の検出プローブが 存在すれば、同一の高緊縮ハイブリダイゼーション条件下に成分（ｂ）の固体支 持体のそれに等しい光学的密度を与えるように調整されたキット ４５．さらに、検出プローブを増幅するための増幅プライマーを含有する容器か らなる「請求項４４」記載のキット ４６．さらに、ＤＮＡポリメラーゼを含有する容器からなる「請求項４５」記載 のキット ４７．検出プローブは、互いにハイブリダイズしない捕獲およびシグナルプロー ブの異なる領域に結合する標的核酸からなる「請求項４４」記載のキット４８． さらに、標的核酸を増幅するためのＤＮＡポリメラーゼを含有する容器からなる 「請求項４７」記載のキット ４９．成分（ａ）の配合における２つの捕獲プローブの比率は、既知量の検出プ ローブが両プローブに結合した場合、均質な密度を与えるように調整する「請求 項４４」記載のキット ５０．検出プローブについての検出範囲は約１０×１０−１２〜約１００×１０ −９モルの濃度範囲内である「請求項４４」記載のキット ５１．アッセイは、検出プローブについて濃度約１０×１０−１２〜約１００× １０−９モルにわたって光学的密度の正の勾配を与える「請求項５０」記載のキ ット発明の詳細な説明