JPH0127383B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は電気泳動に関し、特に改良されたポリ
アクリルアミド ゲル電気泳動担体媒質（分散
媒）に関する。

電気泳動は、電場の影響下に電解質分散媒中で
行なわれる荷電粒子の移動に一般に適用される用
語である。荷電粒子の異なる電気性状のため、さ
まざまな部類の荷電粒子は分散媒中を異なる速度
で移動する。同じ電気性状をもつ粒子は、特異的
な同定出来るゾーン中で一緒に移動する。電気泳
動は、酵素や血清、炭化水素、アルブミンやグロ
ブリンを含めた蛋白質等のような複雑な生体物質
の分割と単離に非常に役立つ手法であることがわ
かつている。

〔従来の技術〕

電気泳動を行なうのに、遊離溶液、緩衝液で飽
和させた紙片、アガロースや寒天のようなゲルを
含めた多くの型式の分散媒が使用された。数年前
に、慣用の電気泳動媒体よりはるかに多くのフラ
クシヨンを分割できるポリアクリルアミドゲルが
導入され、急速に広く受け入れられた。一つの典
型的な商業用応用例では、ゲルはアクリルアミド
とＮ，N′−メチレンビスアクリルアミドとの混
合物をその場で重合させることによつて、その場
でつくられる。生ずるゲルは、安定で、強力であ
り、透明であつて、水に全く不溶であり、ほとん
どの化学物質に対して不活性であつて、非イオン
性である。ポリアクリルアミドゲルのもう一つの
利点は、一旦つくられそして電気泳動パターンが
発現されると、水和又は脱水されたいずれの状態
でも無限に保存できることである。二つの単量体
の相対的割合を調節することによつて、ゲル中の
孔径と、従つてそのふるい作用とが調節できる。

ポリアクリルアミドゲルの性状は、アクリルア
ミドの重合可能な組成物の組成を変えることによ
つて、ある程度修飾又は変更できる。例えばＮ，
N′−メチレンビスアクリルアミドは、エチレン
ジアクリレート、Ｎ，N′−（１，２−ジヒドロキ
シエチレン）−ビス−アクリルアミド、Ｎ，N′−
ジアリル酒石酸ジイミド、Ｎ，N′，N″−トリア
リルくえん酸トリアミド、ポリ（エチレングリコ
ール）ジアクリレート200、Ｎ，N′−ビスアクリ
リルシスタミン、及びポリ（エチレングリコー
ル）ジアクリレート400を例とする他の架橋剤で
代替えすることができる。他の方法は、置換アク
リルアミドを使うものである。例えばボシエツテ
イ（Boschetti）への合衆国特許第4189370号で
は、二官能性アリル又はアクリル単量体によるＮ
−メチロールアクリルアミドのラジカル重合によ
つてつくられるゲル重合体が記載されている。ゲ
ルは、血清リポ蛋白の段階的勾配分離を行なう手
段として開発された。COOH基を含有する陰イ
オン性多糖類は、リポ蛋白の移動を促進するため
に添加できる。更に別の方法では、ポリアクリル
アミドはアガロース又は寒天−寒天のような他の
ゲルと混合して使用される。これらの混合ゲルは
ユリエル（Uriel）への合衆国特許第3573604号で
明らかにされている。

〔発明が解決しようとする課題〕

電気泳動技術に決定的な進歩があつたが、ポリ
アクリルアミドゲルに全く問題がないというわけ
ではない。特に厄介な性質は、例えば脱水を受け
る間に支持基材からはがれる傾向が見られること
である。確かに、特殊な乾燥上の注意を守らない
と、ゲル自体はどうしようもないほど縮んでしわ
が寄る。この注意としては、一定の制御された熱
を出せる商用真空乾燥器でゲルを注意ぶかく乾燥
することである。こうした条件下でも、乾燥フイ
ルムのひび割れと収縮が生ずることがある。前記
ユリエルのポリアクリルアミド／アガロース混合
物により、乾燥特性に幾分の改善が見られるが、
但しポリアクリルアミドゲルの組成物が約12％ま
でに限定されることを条件としている。このゲル
水準を越える場合には、収縮とひび割れが再び生
ずる。脱水するのがもつと困難なのは、低分子量
物質を分離するのに使用する制限された孔径を有
する高度に濃縮されたポリアクリルアミドゲル、
即ち50％まで又はそれ以上のものである。

従つて、本発明の一つの利点は、電気泳動パタ
ーンを支持するポリアクリルアミドゲルフイルム
の改良された乾燥及び保存法を提供することであ
る。本発明のもう一つの利点は、電気泳動パター
ンを支持する電気泳動ゲルフイルムの形で、改良
された乾燥特性をもつポリアクリルアミドゲル組
成物を提供することである。本発明の更にもう一
つの利点は、ポリアクリルアミドゲルをつくる方
法と電気泳動での用途を提供することである。そ
の他の利点と目的は以下の説明で明らかになろ
う。

〔課題を解決する手段〕

本発明に従つて、上記の利点は、アクリルアミ
ドと多糖類樹脂との共重合から電気泳動ゲルフイ
ルムをつくることによつて実現できる。この樹脂
においては、少なくともヒドロキシル水素のいく
らかは、２〜12個の炭素原子のエチレン不飽和基
で置き換えられている。一般に多糖類樹脂の分子
量範囲は約5000ないし約10⁶ダルトン、好ましく
は約100000ないし約500000ダルトンの範囲内に入
る。エチレン不飽和基とは、触媒の存在下に付加
重合又は共重合を受けるような隔離された炭素−
炭素二重結合を含有する炭化水素基のことであ
る。

本発明の実施に使用されるエチレン不飽和多糖
類樹脂は、ガイスリー（Guiseley）への合衆国特
許第3956273号に記載された修飾されたアガロー
ス及び寒天の調製のような既知合成手順に従つて
得られる。この特許によると、親水性樹脂アガロ
ース及び寒天中のOH基を、エチレン不飽和のも
のを含めたアシル及びアルキル化試薬と反応させ
て、種々の樹脂誘導体を提供する。これらの反応
を実施するには、樹脂を初めに強力なアルカリ水
溶液、すなわち約0.5ないし1.5モルのアルカリ金
属水酸化物中に溶解し、このあとエチレン不飽和
エーテル化又はアシル化試薬を加える。エーテル
化試薬の例はアルケニルハライド、例えば３−ブ
ロモプロペン、３−ブロモ−２−ブテン、４−ブ
ロモ−２−ヘキセン、６−ブロモ−３−ヘプテン
等、更にアリルグリシジルエーテルを包含する。
アシル化剤は塩化アクリロイル、塩化クロトニ
ル、塩化メタクリロイル、３−ブテノイル等を包
含する。反応をアルカリ性水溶液で行うと反応の
間に変色や溶液の色が暗くなりがちで、他の点で
は全く満足ながら変色した生成物を生じるので、
アガロースのアルデヒド末端基を、アルカリ水溶
液に寒天又はアガロースを接触させる前に例えば
還元などで封鎖してアルデヒド基の関与する色形
成反応の起こるのを防ぐことも好ましい。選択さ
れる良好な封鎖剤は硼水素化物、特に水素化硼素
ナトリウムのようなアルカリ金属硼水素化物であ
つて、これがアルデヒド末端基をアルコール（ヒ
ドロキシ）基に還元する。

反応を約70℃ないし100℃以上の高温で実施す
るのが好ましいが、アルデヒド末端基を封鎖しな
い場合に変色を最小限にするためと、比較的揮発
性の試薬を使う時に損失を減らすためには、低目
の温度を使用できる。低目の温度では反応が遅
く、場合によつては選んだ試薬が、アガロースと
の望んでいる程度の反応を達成できる前に水との
反応によつて分解される。

反応終了後、混合物を50〜60℃（高目の温度の
場合）に冷却し、アルカリを酸で中和するか、又
は透析その他の慣用手順によつて除去し、生成物
を慣用手順によつて精製する。例えば溶液を冷却
によつてゲル化し、凍結、解凍させ、次に洗浄、
乾燥するか、又はメタノール、エタノール、プロ
パノール、アセトン等のような、生成物にとつて
非溶媒の水と混ざる有機液体との混合によつて、
生成物を反応溶液から沈殿させ、このあと沈殿物
をろ過し、非溶媒で洗い、乾燥させる。

これらの調製は、特にアシル化用にはＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド、ピリジン等のような有機
溶媒中でも実施できる。これらの条件下に、アル
デヒド末端基の封鎖は、普通には不要であり、反
応中に変色はほとんど又は全く起きない。そのほ
か、所望により、アシルハライド類の代わりに酸
無水物をアシル化用に使用できる。

使用されるアルケニル化剤又はアシル化剤の正
確な量は、反応条件と望んでいる置換度（D.S.）
によつて変わる。水がある時に試薬がある程度の
水と反応する傾向があるため、理論的に必要な量
より大過剰が普通には用いられる。

エチレン不飽和誘導体に転化できる、本発明の
実施に適したその他の多糖類樹脂の例は、デキス
トラン、シトサン、カラジーナン、アルギン、フ
アーセララン、ラミナロン、イナゴ豆ゴム、グワ
−ゴム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ナト
リウムカルボキシメチルセルロース等を包含す
る。概して、上記のようにエーテル化又はアシル
化できる遊離ヒドロキシル基をもつ任意の多糖類
樹脂が、本明細書の電気泳動用組成物をつくるの
に適した候補である。電気的に中性の媒体を求め
ている場合は、−COOH及び−HSO₄ラジカルの
ようなイオン基を含まない多糖類樹脂を選択すべ
きである。

本発明の電気泳動組成物は、架橋されたポリア
クリルアミドゲルマトリツクスを形成する既知手
順に一般的に従つてつくられる。従つて本明細書
のエチレン不飽和多糖類樹脂とアクリルアミドと
の混合物は、Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエ
チレンジアミン（TEMED）のような重合触媒
と、過硫酸アンモニウム、硫酸アンモニウムのよ
うな開始剤を含有する緩衝液に溶解される。次に
その必要量が、ゲルの接着を促進する活性化表面
をもつポリエステルフイルムのような適当な支持
シートを備えた成形用カセツトに移される。重合
が完成したら、ゲル被覆は電気泳動用分離を実施
するのに用いられ、次に通常の方法で処理され
る。収縮やひび割れの形跡なく、そして優れた電
気泳動パターンを保存しつつ出来たゲルを炉内で
直接乾燥出来る。

一般的に言つて、重合混合物中のアクリルアミ
ドの量は、エチレン不飽和多糖類樹脂の量をかな
り上回つている。しかし、不飽和樹脂に対するア
クリルアミドの比は、分子量のわりに高率の不飽
和を含有するこれまでの簡単な架橋剤、例えば
Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド又はメチ
レンビスアクリレートの場合より普通には低い。
エチレン不飽和樹脂が高い置換度（D.S.）をもつ
場合には、すなわち多くのヒドロキシル水素が不
飽和基と置換されている場合には、低い置換度の
同じ樹脂標本より少な目の量が用いられよう。た
くさんのヒドロキシル位置をもつ多糖類は、ヒド
ロキシルの少ない高度に置換された樹脂より、比
較的低い置換度で高率の不飽和を含有しうる。樹
脂の置換度がどのようであろうと、満足な重合混
合物は、アクリルアミド／ビスアクリルアミドの
比を調整することによつて慣用のポリアクリルア
ミドゲルの孔径を調節するのと同様に、樹脂に対
するアクリルアミドの比を調整することによつて
通常処方される。普通は、アクリルアミドのエチ
レン不飽和多糖類誘導体に対する重量比が、約15
対１だと、ひび割れや収縮が起きずに脱水できる
電気泳動ゲルが得られる。

ここで以下の実施例を参照する。

誘導体化ポリオールの合成 調製例 １ アリルグリシジルアガロース アガロース10ｇを沸とう水490mlに溶解する。
溶液を80℃に保ち、たえずかきまぜながら14M水
酸化ナトリウム中の4.4M水酸化硼素ナトリウム
10mlを加える。10分後、10％水酸化ナトリウム溶
液100mlを加え、続いてアリルグリシジルエーテ
ル25mlを15分にわたつて滴加する。１時間後、ア
リルグリシジルエーテルの追加25mlを前と同様に
加え、更に１時間反応させる。反応混合物を60℃
に冷却し、次にフエノールフタレインで指示され
るとおりに4M酢酸の添加によつて中和する。溶
液を３倍量のイソプロパノールに徐々に加える
と、白色沈殿物が生じ、これをダクロン布に通し
てろ過することによつて回収する。60％イソプロ
パノール２中で２回洗浄後、沈殿物を60℃で一
夜炉乾燥し、微粉末へ粉砕する。誘導体化アガロ
ースは、その初期ゲル化温度（42℃）が16℃に低
下していた。

調製例 ２ アリルグリシジルデキストラン デキストラン（分子量〜250000）50ｇを水500
mlに溶解し、一定水浴中で80℃に加熱する。溶液
を80℃に保ち、たえずかきまぜながら14M水酸化
ナトリウム中の4.4M水素化硼素ナトリウム15ml
を加える。10分後、25％水酸化ナトリウム溶液
100mlを加え、続いてアリルグリシジルエーテル
50mlを30分間にわたり滴加する。２時間後、アリ
ルグリシジルエーテルの追加25mlを加え、反応を
更に２時間続ける。反応混合物を60℃に冷却し、
次にフエノールフタレインで指示されるとおりに
4M酢酸添加によつて中和する。溶液を３倍量の
イソプロパノールに徐々に加えると白色ゲル状沈
殿物が生ずる。これを０℃に冷却し、アルコール
を傾斜して除く。凝固した沈殿物を60℃で水500
mlに再溶解し、再び３倍量のイソプロパノールに
加え、０℃に冷却する。固化した沈殿物を傾斜後
に回収し、60℃で一夜炉乾燥し、微粉末まで粉砕
する。

実施例 １ ポリアクリルアミド／アリルグリシジルアガロ
ースゲルを使用する電気泳動 30％（重量／容量）アクリルアミド溶液を蒸留
水でつくつた。アリルグリシジルアガロース２ｇ
を沸とうするまで加熱し、次に室温まで冷却する
ことによつて最終容量50mlの蒸留水中に溶解す
る。1.5Mトリス−HCl（PH8.8）、0.4％ドデシル硫
酸ナトリウム、0.1％テトラメチルエチレンジア
ミンからなる溶液50mlをアリルグリシジルアガロ
ース溶液に加えると、誘導体化アガロースの２％
（Ｗ／Ｖ）溶液を生ずる。最後に、30％アクリル
アミド溶液10mlを２％アリルグリシジルアガロー
ス溶液と過硫酸アンモニウム14mgとを一緒にした
もの10mlに加える。次にこのアクリルアミド／ア
リルグリシジルアガロース溶液を共重合体ゲル形
成用の流延装置に入れる。流延装置は、アクエボ
−グ・マシン・アンド・リベア・シヨツプ（ニユ
ーヨーク州ロングアイランド、アクエボーグ）か
ら供給された長方形ガラス板（15.9cm×14cm）及
び切込み付きガラス板からなるものであつた。ア
ガロースの薄層で被覆したポリエステルフイルム
（ゲルボンド PAG）１枚を、親水性の側が外向
きになるように長方形ガラス板の上に置いた。厚
さ1.2mmのプラスチツク・スペーサー３個を、ガ
ラスに支持されたプラスチツクの端にＵ字形に置
き、切込み付きガラス板をスペーサー上に置き、
ばねクランプ６個でその場に固定した。アクリル
アミド／アリルグリシジルアガロース溶液の重合
とゲル形成後、前のゲルの上に３％アクリルアミ
ド、2.6％Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド、
0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、0.025％テトラメ
チルエチレンジアミン及び過硫酸アンモニウムを
含有する0.125Mトリス−HCl（PH6.8）溶液10mlを
成層させることによつて積重ねゲルをつくつた。
テフロンのコーム（coomb）を使用して試料用
スロツトをつくり、積重ねゲルの重合後、アクエ
ボーク・マシン・アンド・リペア・シヨツプ製の
電気泳動室へガラス・カセツトを入れる。分子量
17000ないし200000ダルトンの範囲の蛋白質試料
を、２％ドデシル硫酸ナトリウム、10％グリセロ
ール、５％２−メルカプトエタノール及び0.001
％ブロモフエノールブルー含有の0.625Mトリス
−HCl（PH6.8）中で、ml当り１mgの濃度に調製し
た。試料溜めに5μずつの試料を加えた。上下
の貯槽は0.025Mトリス、0.192Mグリシン及び0.1
％ドデシル硫酸ナトリウム（PH8.3）を含有した。
電気泳動を25ｍAmpsで2.5時間実施した。ポリア
クリルアミド／アリルグリシジルアガロースゲル
を、ゲルボンド PAGプラスチツク支持体に固
く結びついたガラス板の間から除いた。これを25
％イソプロパノール、10％酢酸中の0.05％クーマ
ツシー・ブリリアント・ブルーＲからなる染色液
中に一夜入れた。ゲルを45％メタノール、45％酢
酸の溶液中で８時間徐染し、次に７％酢酸、５％
グリセロールの溶液に更に２時間入れた。このあ
と、蛋白質帯は見えるようになり柔軟な乾燥フイ
ルムが形成されるまでゲルを直接に炉に65℃に入
れた。この乾燥ゲルは収縮も歪みもせずに明確な
蛋白質帯のパターンを保ち、永久記録として実験
ノート中に保たれた。

実施例 ２ ポリアクリルアミド／アリルグリシジルデキス
トランを使用する電気泳動 実施例１に記載のとおりに電気泳動を行なう
が、但しポリアクリルアミド／アリルグリシジル
アガロースゲルをポリアクリルアミド／アリルグ
リシジルデキストランゲルで置き代える。このゲ
ルは15％アクリルアミド、0.375Mトリス−HCl
（PH8.8）中の（調製例２からの）５％アリルグリ
シジルデキストラン、0.1％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、0.025％テトラメチルエチレンジアミン及
び過硫酸アンモニウムからなつていた。電気泳
動、染色、徐染後、65℃で直接の炉乾燥によつて
ゲルボンド PAG支持体上の薄いフイルムまで
ゲルを乾燥した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくともヒドロキシル水素のいくらかは共
   重合体を形成するために触媒の存在下にアクリル
   アミドと共重合できる２〜12個の炭素原子のエチ
   レン不飽和基で置き換えられている、分子量5000
   ないし10⁶ダルトンを有する多糖類樹脂と、 アクリルアミドとからなる共重合体により特徴
   付けられる電気泳動用ゲル組成物。 ２ エチレン不飽和基が脂肪族炭化水素及びアシ
   ル基からなる群から選ばれることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項の組成物。 ３ 多糖類がアガロースであることを特徴とす
   る、特許請求の範囲第１項の組成物。 ４ 多糖類がデキストランであることを特徴とす
   る、特許請求の範囲第１項の組成物。 ５ 共重合体がアクリルアミドとアリルグリシジ
   ルアガロースとの共重合体であることを特徴とす
   る、特許請求の範囲第１項の電気泳動ゲル組成
   物。 ６ 共重合体がアクリルアミドとアリルグリシジ
   ルデキストランとの共重合体であることを特徴と
   する、特許請求の範囲第１項の電気泳動ゲル組成
   物。