JPH01274066A - 酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はマイクロプレートを用いた酵素免疫測定法にお
いて、マイクロプレートのウェル（穴）に、抗原または
抗体を固定し中央部が空洞となっている膜を挿入し、そ
れを取り出すことなく光学装置によって検体濃度を測定
する方法に関する。

酵素免疫測定、蛍光免疫測定及び発光免疫測定等の免疫
学的な分析方法において、不溶坦体としてポリスチレン
ボール、ガラスピーズ、ろ紙またはニトロセルロース等
に抗原または抗体を共役結合または非化学的に同定し測
定する方法がある。

その際１反応槽としてマイクロプレートウェルを利用し
ている場合は、それらの担体を取り出すかまたは測定液
を別の容器に移した後、酵素反応によって生じる発色、
蛍光等を分光ソＣ学的に計測する必要がある。

また、不溶坦体を除去しないで測定できる方法としては
、マイクロプレートのウェルの壁面に。

直接、抗原または抗体を共役結合または非化学的に固定
することにより、担体を除去する等の操作を必要とせず
５そのまま酵素反応によって生じる発色、蛍光または発
光を分光光学的に計測する方法も知られている。

ところで、マイクロプレートのウェル、ポリスチレンボ
ール及びガラスピーズの表面積は大変小さく、有効表面
積もその数倍から数１−倍であるため、抗原または抗体
の結合敬に依存する８［す定感度を増し難いという問題
があった。

一方、有効表面積が数百倍である濾紙、ニトロセルロー
ス、ナイロン繊維膜及びフッ素繊維膜は取り出し等の取
り扱いが難しく、さらにこれらの膜素材は、不透明なの
で光が通過せず、マイクロプレート吸光度読取装置にそ
のまま挿入して計洞することができない。また、洗浄時
に膜が壁面に密着してしまい、膜の表面が洗浄しにくい
という問題がある。洗浄は持ち込み反応等のブランク反
応？少なくするためにＩｆｌ、要な工程であり、収形態
は洗浄効果に大きく影響してくる。

そこで、タンパク質を共有結合させられる機能を有する
膜を１表面を汚すことなくマイクロプレートのウェルの
底面と相似ＪＦｅに裁断し、更に中央部を切りぬいて空
洞とし、そしてこの膜に抗原又は抗体を結合させて被検
血清と反応させたのち酵素！３２抗体液を注入し酵素免
疫反応をおこなうことにより、従来の問題点が解決でき
ることを見い出し、本発明をブこ成した。

すなわち、本発明は、マイクロプレートを用いた酵素免
疫測定法において、マイクロプレートのウェルに抗１ｇ
または抗体が固定され中央部が空洞となっている膜を入
れ、光学装置によって検体濃度を測定する方法に関する
。

本発明で用いられるマイクロプレートとしては市販され
ているものをそのまま用いてもよい。

但し、その底面は光を透過するもので、好ましくは、透
明でかつ・■滑なものがよい。

膜の形状については、マイクロプレートのウェルの底面
の形状と同一のものが好ましく、大きさは１例えば、ウ
ェルが円筒形の場合は、膜の直径がウェルの直径の０．
７０〜０．９５倍のものが好ましい。　　そして、その
材質は、特に限定されないが、例えば、ナイロン膜、フ
ッ素樹脂膜、ろ紙、ニトロセルロース膜等があり、表面
積を大きくするため繊維質から成るものすなわちナイロ
ン繊維膜、フッ素繊維膜等がより好ましい。　　上記の
膜の中央部には、空洞があり、その膜の形状は、測定時
に光路をさまたげないものであれば、特に限定されない
が、好ましくは円形状のものがよい。　例えば、ウェル
の直径７ｍｍで、股の直径が６ｍｍの場合、空洞の直径
は、　　２．５〜；３゜５　ｍ　ｍが、好ましい。

膜に固定する抗原または抗体としては１例えばダニ、ハ
ウスデス１−１花粉類、卵白、ミルク、大α、カビ、動
物の毛等のアレルゲン；　抗血清；黄体ホルモン、イン
シュリン等のホルモン；Ａ　Ｉ　ＤＳ、ΔＴ　Ｉ、　、
肝炎、ヘルペス等のウィルス抗体；　ＨＩ、　Ａ等の白
血球表面抗体；前立腺酸性ホスホツーゼ等の酵素などが
あり、好ましくは、アレルゲンを結合させたものが適し
ている。

測定方法に関しては、通常用いられる酵素免疫測定、発
光免疫測定、蛍光免疫洞室等が用いられる。

また、光学装置については、市販されているマイクロプ
レートリーダ等を用いればよい。

本発明方法を用いた場合の副室′ｆ−順は、例えば以下
のとおりである。

（１）マイクロプレートのウェルに膜を揮人（２）抗原
または抗体を含む体液等の検体を注入（３）洗浄 （４）標識抗体を入れる （５）洗浄 （６）酵素反応 （７）光学装置による固定 本発明方法は、膜に固定する抗原又は抗体の種類を変え
ることによりアレルゲン、抗血清、ホルモン、酵素、ウ
ィルス抗体、白血球表面抗体等の体液中の微量蛋白など
の検出方法に適している。

またモノクローナル抗体のスクリーニングにも応用でき
る。

以Ｅ、本発明方法によれば、膜の中央部を空洞にするこ
とによって光が透過するようになり、痕がウェルの底に
あってもマイクロプレート吸光度読取装置にそのまま挿
入しての測定が可能となりまた、洗浄液、反応液または
検体の注入によって膜が舞い上がり、膜の裏面にまで液
が十分に行きわたるので、バラツキの少ない測定が可能
となった、　すなわち、洗浄時及び測定時に膜を取り出
す必要がないので、操作時間が大幅にＩｉ縮されしかも
８１ツ定の際、膜の有無にかかわらず測定値に差がなく
正確な測定ができ、従来の方法に比してより優れた酵素
免疫測定方法であるといえる。

特に、特別な取り出し操作を必要としないことから、自
動的な測定において非常に有用な方法である。

次に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく　Ｊｌｔ明す
る。

〈実施例１〉 酵素免疫法によるアレルゲンの検出 たんばく質を共有結合させられる機能を有する膜（イモ
ピロン−ミリポア　リミテッドｕ　Ｓ　Ａ　）を、表面
を汚すことなくマイクロプレートウェルの底面と相似形
にａ所し、四に中央部を切り抜いて空洞にする。

この中央部が空洞になっている収をダニ抽出アレルゲン
水溶液に浸し、膜にアレルゲンを結合させる。

このダニアレルゲン結合膜をマイクロプレートのウェル
に装填する（膜はウェルの底にある）。

このウェルにダニアレルギー罹患患者血清５０μｍを入
れ室温で１時間数；δする。

次に、注入した血清を吸引し、洗浄緩衝液で膜及びウェ
ル内を数回洗浄して水切りする。

アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）を標識した抗ヒト
ＩｇＥ抗体１００μｍをウェルに注入し室温で１時間放
置する。

２１人した抗体液を吸引し、洗浄緩衝液で収及びウェル
内を数回洗浄して水切りする。

次にＡ　１．、　Ｐの基質である■】−二トロフェノー
ルリン酸溶液１００μｌを注入し、室温ド正確に３０分
後反応停止液２００μｍを加えてマイクロプレート吸光
度読取装置で計測する。

〈実施＠２〉 二社のプレートリーダを用い、マイクロプレートのウェ
ル中の膜担体の有無による吸光度測定の影響を調べ、そ
の結果を表１に示す。

〈表Ｌ　＞　　（４０５ｎｍ○、　Ｄ、　（＋ＩＴ）表
１かられかるように、膜（ディスク）の有無による測定
値に差はなかった。　また、二社の分光器で分光光学的
測定への妨害等の問題はなかった。

〈実施例３〉 痕に種々のアレルゲンエキスを結合させ、希釈倍率を変
化させた場合の影響を調べ、その結果を図１に示す。

図１において、横軸は、希釈倍率を、縦軸は、吸光度を
表しアレルゲンエキスとしては、卵白、カンジダ、杉花
粉、ダニ、ハウスダストを用い。

それぞれ　、−〇−１−ｘ−５−・− 一ロー、−＋−で示す。

Ｕｉ４ｔから明らかなように１種々の希釈倍率において
、アレルゲンエキスのウェルに膜担体があっても１分光
光学的に正確に測定され、洗浄等の操作には問題なく、
更に、血清で希釈して反応系にかけても、その希釈Ｈ（
ｆ、練性が保たれていることから、測定の定性性は非常
に優れている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、膜に種々のアレルゲンエキスを結合させ、希
釈倍率を変化させた場合の副室における影響を示す図で
、横軸は、希釈倍数を、縦軸は、吸光度を表し、そして
、−０−、−ｘ−、−・−１−ロー、−＋−は、それぞ
れ卵白、カンジダ、杉花粉、ダニ、ハウスダス１−の各
アレルゲンを表す。 手　　続　　補　　正　　３　　（方式）昭和６３年　
８月２５日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）マイクロプレートを用いた酵素免疫測定法におい
   て、マイクロプレートのウェルに、抗原または抗体が固
   定され中央部が空洞となっている膜を入れ、光学装置に
   よって検体濃度を測定する方法。
2. （２）膜にアレルゲン（アレルギー起因物質）を固定す
   ることを特徴とする請求項１記載の測定法。